用于秈稻地方品種遺傳完整性分析的引物組合及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及遺傳完整性分析引物，具體地說，設(shè)及用于釉稻地方品種遺傳完整性 分析的SSR分子標(biāo)記核屯、引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 種質(zhì)是指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)庫(kù)保存的種質(zhì) 材料一般可分為兩類：遺傳上同質(zhì)種質(zhì)（genetically homogeneous accessions)，指在一 份種質(zhì)內(nèi)，其個(gè)體之間基本上具有相同的遺傳結(jié)構(gòu)，如自花授粉作物育成品種、異花授粉作 物自交系等；遺傳上異質(zhì)種質(zhì)（genetically heterogeneous accession)，指在一份種質(zhì) 內(nèi)，其個(gè)體之間不具有相同的遺傳結(jié)構(gòu)，如野生種、原始地方品種、異花授粉的栽培品種等。
[0003] 遺傳完整性是指群體的遺傳結(jié)構(gòu)得到完全的保持，包括基因型頻率分布及等位基 因頻率分布和其原始群體一樣，保持不變。維持種質(zhì)的遺傳完整性就是在繁殖過程中要有 最大的遺傳相似性，在保存過程中表現(xiàn)最低程度的遺傳變異。
[0004] 水稻地方品種蘊(yùn)藏著豐富的抗逆、抗病蟲等優(yōu)異基因，在水稻育種中具有重要的 作用。云南是公認(rèn)的亞洲栽培稻的遺傳多樣性中屯、，部分云南地方品種稻種資源已經(jīng)在育 種和生產(chǎn)中得到應(yīng)用，并取得一定成效。
[0005] 準(zhǔn)確評(píng)價(jià)地方品種稻種資源的遺傳多樣性和完整性，對(duì)于其在育種、生產(chǎn)中的應(yīng) 用具有重要的作用。傳統(tǒng)方法是采用表型多樣性鑒定法，即通過調(diào)查多項(xiàng)農(nóng)藝性狀，反映種 質(zhì)的遺傳多樣性和完整性。但是該方法容易受氣候、人為等因素影響。近年來分子標(biāo)記技術(shù) 在種質(zhì)遺傳多樣性和完整性研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用。分子標(biāo)記技術(shù)中有多項(xiàng)技術(shù)參 數(shù)會(huì)影響評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。USSR分子標(biāo)記為例，其關(guān)鍵的技術(shù)瓶頸包括引物的 篩選、群體量的大小等。
[0006] 因此，亟需獲得可用于釉稻地方品種遺傳完整性分析的SSR核屯、引物，并建立釉稻 地方品種遺傳完整性分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于釉稻地方品種遺 傳完整性分析的引物組合及其應(yīng)用。
[000引為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 本發(fā)明提供一套用于釉稻地方品種遺傳完整性分析的SSR核屯、引物組合與方法， 所述方法是基于SSR分子標(biāo)記原理，采用經(jīng)過前期大量篩選工作所獲得的16對(duì)多態(tài)性核屯、 引物，對(duì)150~200個(gè)單株的釉稻地方品種基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，利用生物分析軟件統(tǒng)計(jì)分析 群體的遺傳多樣性指數(shù)，反映群體的遺傳完整性保持情況。
[0010] 第一方面，本發(fā)明提供用于釉稻地方品種遺傳完整性分析的引物組合，其由如下 16個(gè)引物對(duì)組成：
[0011]55301:正向引物如沈910^.1所示;反向引物如沈910^.2所示；
[0012] SSR02:正向引物如沈Q ID NO. 3所示;反向引物沈Q ID NO.4所示；
[0013] SSR03:正向引物如沈Q ID NO.5所示;反向引物如沈Q ID NO.6所示；
[0014] SSR04:正向引物如沈Q ID NO.7所示;反向引物如沈Q ID NO.8所示；
[0015] SSR05:正向引物如沈Q ID NO.9所示;反向引物如沈Q ID NO. 10所示；
[0016] SSR06:正向引物如沈Q ID NO. 11所示;反向引物如沈Q ID NO. 12所示；
[0017] SSR07:正向引物如沈Q ID NO. 13所示;反向引物如沈Q ID NO. 14所示；
[001引 SSR08:正向引物如沈Q ID NO. 15所示;反向引物如沈Q ID NO. 16所示；
[0019] SSR09:正向引物如沈Q ID NO. 17所示;反向引物如沈Q ID NO. 18所示；
[0020] SSR10:正向引物如沈Q ID NO. 19所示;反向引物如沈Q ID NO.20所示；
[0021] SSR11:正向引物如沈Q ID NO.21所示;反向引物如沈Q ID NO.22所示；
[0022] SSR12:正向引物如沈Q ID NO.23所示;反向引物如沈Q ID NO.24所示；
[0023] SSR13:正向引物如沈Q ID NO.25所示;反向引物如沈Q ID NO.26所示；
[0024] SSR14:正向引物如沈Q ID NO.27所示;反向引物如沈Q ID NO.28所示；
[0025] SSR15:正向引物如沈Q ID NO.29所示;反向引物如沈Q ID NO.30所示；
[0026] SSR16:正向引物如沈Q ID NO.31所示;反向引物如沈Q ID NO.32所示。
[0027] 上述16對(duì)核屯、引物是從550對(duì)SSR引物中，經(jīng)篩選獲得。引物篩選方法為，W200個(gè) 單株的釉稻地方品種"香谷"DNA為模板，分別用550對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙締 酷胺凝膠電泳、凝膠銀染、統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果。針對(duì)每對(duì)引物在200個(gè)單株中的擴(kuò)增結(jié)果，剔除不 具備多態(tài)性的引物，保留具有多態(tài)性的引物，最終篩選獲得16對(duì)多態(tài)性核屯、引物。篩選得到 的引物相對(duì)未被選擇引物，在體現(xiàn)種質(zhì)的遺傳多樣性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。
[0028] 第二方面，在上述引物組合存在的前提下，任何含有該引物組合的產(chǎn)品均在本發(fā) 明的保護(hù)范圍內(nèi)，例如含有上述引物組合的試劑或試劑盒。原因在于，其在應(yīng)用時(shí)利用的是 本發(fā)明所述引物組合的特殊性，且得到的結(jié)果取決于本發(fā)明所述引物組合的特殊性。
[0029] 第Ξ方面，本發(fā)明提供前述引物組合在分析釉稻地方品種遺傳完整性方面的應(yīng) 用。由于前述引物組合能夠針對(duì)釉稻地方品種的遺傳多樣性進(jìn)行鑒定，所得結(jié)果可用于判 斷種質(zhì)遺傳完整性的保持情況。因此，本發(fā)明提供前述引物組合可用于釉稻地方品種遺傳 完整性分析。
[0030] 第四方面，本發(fā)明提供一種分析釉稻地方品種遺傳完整性的方法，W待分析樣本 的基因組DNA為模板，利用前述引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn) 物，利用生物學(xué)軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。
[0031] 進(jìn)一步地，所述待分析樣本的樣本量(群體量)為150~200。原因在于，經(jīng)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì) 發(fā)現(xiàn)，群體量越小，特異性單株平均頻率越低，其標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)很大，表明采用過小 的群體量，取樣誤差十分明顯。群體量增加至150單株時(shí)，特異單株頻率逐步穩(wěn)定趨近10%， 變異系數(shù)控制在15% W內(nèi)，基本可W代表200單株的多樣性。因此在進(jìn)行釉稻地方品種遺傳 完整性分析時(shí)，需要保證150株W上的群體量。
[0032] 作為優(yōu)選，所述基因組DNA提取自釉稻葉片，因幼嫩葉片中次生代謝物質(zhì)含量低， 易于獲得高質(zhì)量DNA，優(yōu)選幼嫩葉片。
[0033] 優(yōu)選地，所述種子來自云南釉稻地方品種。
[0034] 作為優(yōu)選，為了更好的觀察擴(kuò)增結(jié)果，可采用6%聚丙締酷氨凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn) 物，電泳結(jié)束后采用銀染法染色。
[0035] 更進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10 X PCR緩沖液(含Mgh) 2.0化，2.5mmol/ L dNTP 1.5化，511/化 Taq 0.5化，2皿ol/LSSR引物2.0yL，20ngAiL DNA 2.0化，(1 地2〇 12.0 化。
[0036] 所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;95°C變性3〇3,60。(：退火3〇3,72。(：延伸 Imin，38個(gè)循環(huán);72 °C延伸1 Omin。待溫度降至10°C后，于4 °C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 基于上述優(yōu)選方案，本發(fā)明提供一個(gè)完整具體的實(shí)施方式，包括如下步驟：
[003引（1)采用CTAB法提取釉稻地方品種待分析樣本葉片的基因組DNA，樣本為150~200 單株釉稻；
[0039] (2)W步驟(1)提取的DNA為模板，用前述引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0040] (3)采用6%聚丙締酷氨凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后采用銀染法染 色；
[0041] (4)利用生物學(xué)軟件分析電泳結(jié)果。
[0042] 其中，所述步驟(4)具體為:統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增譜帶類型，參照DNAmarker(pBR322)估計(jì)片段 大小。使用P0PGE肥等軟件對(duì)不同釉稻地方品種種質(zhì)群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，比較不同種質(zhì) 等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)等指標(biāo)。采用SPSS或SAS等軟件， 分析群體間各指數(shù)差異，若無顯著差異則認(rèn)為群體遺傳完整性得到有效保持，若差異達(dá)到 顯著水平，則認(rèn)為群體遺傳完整性發(fā)生了改變。
[0043] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0044] 本發(fā)明W云南地方稻種為材料，通過大量實(shí)驗(yàn)研究，篩選出了一批可用于釉稻地 方品種遺傳完整性分析的SSR核屯、引物，建立了用于釉稻地方品種遺傳完整性分析的引物 組合，并基于此，建立了分析方法。
[0045] 本發(fā)明提供的分析方法適用于釉稻地方品種種質(zhì)遺傳完整性的分析。所篩選的引 物組合和最少150個(gè)單株的群體量，為準(zhǔn)確分析釉稻地方品種種質(zhì)保存和繁殖更新過程中 遺傳完整性檢測(cè)提供了標(biāo)準(zhǔn)方法。
【附圖說明】
[0046] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中引物SSR02對(duì)部分單株"香谷"的擴(kuò)增結(jié)果。左起第5泳道為 Marker，其它泳道為"香谷"單株DNA擴(kuò)增結(jié)果。
[0047] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中不同大小群體量多態(tài)性單株差異。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是W下實(shí) 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0049] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0050] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051] 實(shí)施例1釉稻地方品種種質(zhì)的遺傳完整性分析
[0化2] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0053] W云南釉稻地方品種"香谷"為試材，種子育苗后移栽至大田進(jìn)行常規(guī)管理。隨機(jī) 選取200個(gè)單株，取其幼嫩葉片，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0化4] 2.基因組DNA提取:采用CTAB法分別提取200個(gè)單株葉片的基因組DNA。
[0055] 3.引物合成及篩選
[0056] (1)合成引物：參考水稻SSR引物序列，隨機(jī)選擇550對(duì)引物，經(jīng)生工生物工程（上 海)股份有限公司合成引物。
[0057] (2)引物篩選:采用200個(gè)單株DNA模板，利用全部550對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 聚丙締酷胺凝膠電泳、凝膠銀染，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，剔除不具多態(tài)性的引物，共篩選出16對(duì)特 異多態(tài)性引物，其中引物SSR02的擴(kuò)增結(jié)果見圖1，引物的序列信息見表1:
[005引表1釉稻地方品種SSR特異多態(tài)性引物序列
[0化9]
[0060] (3)適宜樣本量：W引物SSR02的擴(kuò)增結(jié)果為例，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，200單株