專(zhuān)利名稱(chēng)：：洗滌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及衣物洗滌劑組合物，尤其是包含脂解酶的衣物洗滌劑。
背景技術(shù)：
：對(duì)于洗滌劑制造商來(lái)說(shuō)，改善油性污垢去除效果是其不變的目標(biāo)。盡管使用了許多有效的表面活性劑以及表面活性劑的組合，但是基于表面活性劑的產(chǎn)品仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)油脂/油性污垢的完全去除，尤其是當(dāng)產(chǎn)品在低水溫下使用時(shí)。自二十世紀(jì)八十年代后期起脂肪酶就已被用于洗滌劑中，以便通過(guò)將脂肪污垢分解成甘油三酯來(lái)去除脂肪污垢。直至不久前，主要的市售脂肪酶如Lipolase(商品名為Novozymes)才可在洗滌過(guò)程烘干階段的較低水分含量下產(chǎn)生尤其有效的作用。這些酶僅在第二洗滌步驟趨于產(chǎn)生顯著的清潔效果，因?yàn)橹挥性诤娓呻A段洗滌過(guò)的衣物上留下的污垢才會(huì)發(fā)生顯著的脂肪分解，然后在下一個(gè)洗滌步驟中移除分解的脂肪。然而最近已研發(fā)出更高效的脂肪酶，其在清潔過(guò)程的洗滌階段也可有效地起作用。因此除了第二個(gè)洗滌步驟中的清潔作用以外，由于脂肪酶可存在于第一個(gè)洗滌循環(huán)中，因此清潔效果得到了顯著的改善。US6,939,702Bl、WO00/60063和ResearchDisclosureIP6553D中描述了這些酶的實(shí)例。下文中將上述酶稱(chēng)為第一洗滌脂肪酶。此外，消費(fèi)者希望制品(諸如衣服)盡可能的潔凈。這些消費(fèi)者通常將清潔或處理過(guò)的制品的氣味與這些制品的清潔程度相關(guān)聯(lián)。因此，從消費(fèi)者的觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，清潔和/或處理組合物的有效性通常直接與該組合物賦予用該組合物清潔或處理過(guò)的制品的氣味相關(guān)聯(lián)。申請(qǐng)人已認(rèn)識(shí)到，某些物質(zhì)例如酯酶和脂肪酶可產(chǎn)生難聞的脂肪酸氣味，尤其是短鏈脂肪酸氣味，例如丁酸的氣味。然而，這些物質(zhì)可以是尤其有效的清潔劑。遺憾的是，消費(fèi)者通常將使用這些試劑產(chǎn)生的氣味與不潔凈相關(guān)聯(lián)。具有C-末端延伸序列的、減少氣味的變體實(shí)例參見(jiàn)WO02/062973,但是這些脂肪酶變體未表現(xiàn)出第一洗滌脂肪酶的強(qiáng)效洗滌性能，諸如那些WO00/60063中的脂肪酶，包括以商品名Lipex⑧銷(xiāo)售的變體。因此，需要一種包含脂解酶的洗滌劑組合物以獲得優(yōu)異的油脂/油性污垢去除效果，并且不產(chǎn)生任何令人討厭的脂肪酸氣味。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含洗滌劑成分和脂肪酶變體的洗滌劑組合物，所述脂肪酶變體在說(shuō)明書(shū)中的給定測(cè)試條件下具有至少0.8的平均相對(duì)性能(RPavg)和至少1.1的效險(xiǎn)(BR)。序列列表序列標(biāo)識(shí)號(hào)1表示編碼嗜熱真菌脂肪酶的DNA序列。序列標(biāo)識(shí)號(hào)2表示嗜熱真菌脂肪酶的氨基酸序列。序列標(biāo)識(shí)號(hào)3和序列標(biāo)識(shí)號(hào)4表示用于比對(duì)實(shí)例的序列。發(fā)明詳述定義脂肪酶活性:本文中術(shù)語(yǔ)"脂肪酶活性"被定義為催化三酯酰甘油水解形成二酯酰甘油和羧酸酯的羧基酯水解酶活性。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，按照"材料和方法"中的"脂肪酶活性"中所述的方法測(cè)定脂肪酶活性。一單位脂肪酶活性定義為能夠在3CTC,pH7條件下，每分鐘釋放1.0微摩爾丁酸的酶量。本發(fā)明的多肽具有至少70%,至少75%或80%或85%或90%,更優(yōu)選至少95%,甚至更優(yōu)選96%或97%，最優(yōu)選98%或99%,甚至最優(yōu)選至少100%的脂肪酶活性，脂肪酶活性以由氨基酸序列組成的多肽的相對(duì)性能進(jìn)行測(cè)量，所述氨基酸序列顯示為具有T231R+N233R取代的序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的成熟多肽。分離的多肽:在此所用的術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"是指通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的至少20%純化，優(yōu)選至少40%純化，更優(yōu)選至少60%純化，甚至更優(yōu)選至少80%純化，最優(yōu)選至少90%純化，甚至最優(yōu)選至少95%純化的多肽?；炯兓亩嚯?本文所用術(shù)語(yǔ)"基本純化的多肽"表示這樣一種多肽制品它包含按重量計(jì)最多10%,優(yōu)選最多8%,更優(yōu)選最多6%,更優(yōu)選最多5%,更優(yōu)選最多4%,最多3%,甚至更優(yōu)選最多2%，最優(yōu)選最多1%,甚至最優(yōu)選最多0.5%的與其天然結(jié)合的其它多肽物質(zhì)。因此，基本純化的多肽優(yōu)選地按制品中存在的總多肽物質(zhì)重量計(jì)為至少92%純化，優(yōu)選至少94%純化，更優(yōu)選至少95%純化，更優(yōu)選至少96%純化，更優(yōu)選至少96%純化，更優(yōu)選至少97%純^1,更優(yōu)選至少98%純化，甚至更優(yōu)選至少99%,最優(yōu)選至少99.5%純化，甚至最優(yōu)選至少100%純化。本發(fā)明的多肽優(yōu)選以基本純化形式存在。具體地講，多肽優(yōu)選以"基本純化形式"存在，即，多肽制品基本上不含與其天然結(jié)合的其它多肽物質(zhì)。這可以通過(guò)例如熟知的重組方法和經(jīng)典的純化方法制備多肽來(lái)成功完成。本文中術(shù)語(yǔ)"基本純化的多肽"與術(shù)語(yǔ)"分離的多肽，，和"分離形式的多肽"同義。同一性:用參數(shù)"同一性"來(lái)描述兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列間的相關(guān)性。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，通過(guò)使用來(lái)自EMBOSSpackage(http:〃emboss.org)2.8.0版本的Needle程序測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列的比對(duì)。Needle程序使用全局比對(duì)算法，該算法描述于Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453。使用的取代矩陣是BLOSUM62,空位開(kāi)放罰分是10,空位拓展罰分是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列("發(fā)明序列"；例如序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的氨基酸1至269)和差異氨基酸序列("外來(lái)序列")之間的同一性程度通過(guò)以下方法計(jì)算兩個(gè)序列比對(duì)的精確匹配數(shù)目除以"發(fā)明序列"的長(zhǎng)度或"外來(lái)序列"的長(zhǎng)度，無(wú)論哪個(gè)序列的長(zhǎng)度是最短的。結(jié)果表示為同一性百分比。當(dāng)"發(fā)明序列，，和"外源序列"在重疊(在以下的序列比對(duì)實(shí)例中，它用T表示)的相同位點(diǎn)具有相同的氨基酸殘基時(shí)，發(fā)生完全匹配。序列長(zhǎng)度是序列中的氨基酸殘基的數(shù)目(例如序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的長(zhǎng)度是269)。在以下的序列比對(duì)實(shí)例中，重疊是序列A的氨基酸序列"HTWGER-NL";或者序列B的氨基酸序列"HGWGEDANL"。在此實(shí)例中間隙用"-，，表示。序列比對(duì)實(shí)例序歹ijA:ACMSHTWGER—NLimii序列B:HGWGEDANLAMNPS多肽片段:本文術(shù)語(yǔ)"多肽片段，，定義為從序列標(biāo)識(shí)號(hào)2或其同源序列的氨基和/或羧基末端刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽，其中所述片段具有脂肪酶活性。序列:本文術(shù)語(yǔ)"序列，，定義為從序列標(biāo)識(shí)號(hào)1或其同源序列的5'和/或3'末端刪除一個(gè)和多個(gè)核苷酸的核苷酸序列，其中所述子序列編碼具有脂肪酶活性的多肽片段。等位變體:術(shù)語(yǔ)"等位變體"本文是指占用相同染色體位點(diǎn)的基因的任何兩個(gè)或更多個(gè)替代形式。等位變體通過(guò)突變自然產(chǎn)生，可導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)現(xiàn)象?；蛲蛔兛梢允庆o默突變(編碼的多肽無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因等位變體編碼的多肽。基本純化的多核苦酸:在此所用的術(shù)語(yǔ)"基本純化的多核苷酸"是指這樣的多核苷酸制品不含其它外源的和多余的核普酸，并且以適用于遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系的形式存在。因此，基本純化的多核普酸包含按重量計(jì)最多10%，優(yōu)選最多8%,更優(yōu)選最多6%,更優(yōu)選最多5%,更優(yōu)選最多4%,更優(yōu)選最多3%,甚至更優(yōu)選最多2%，最優(yōu)選最多1%,甚至最優(yōu)選最多0.5%的與其天然結(jié)合的其它多核苷酸物質(zhì)。然而，基本純化的多核苷酸可包括天然存在的5，和3，非翻譯區(qū)，諸如啟動(dòng)子和終止子。基本純化的多核苷酸優(yōu)選地按重量計(jì)為至少90%純化，優(yōu)選至少92%純化，更優(yōu)選至少94%純化，更優(yōu)選至少95%純化，更優(yōu)選至少96%純化，更優(yōu)選至少97%純化，甚至更優(yōu)選至少98%純化，最優(yōu)選至少99%,甚至最優(yōu)選至少99.5%純化。本發(fā)明的多核普酸優(yōu)選以基本純化形式存在。具體地講，本文所公開(kāi)的多核苷酸優(yōu)選以"基本純化形式，，存在，即，多核苷酸制品基本上不含與其天然結(jié)合的其它多核苷酸物質(zhì)。本文術(shù)語(yǔ)"基本純化的多核苷酸"與術(shù)語(yǔ)"分離的多核苦酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。多核普酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成來(lái)源的、或它們的任何組合。cDNA:本文術(shù)語(yǔ)"cDNA"定義為能從得自真核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子通過(guò)反轉(zhuǎn)錄制備的DNA分子。cDNA缺乏通常存在于相應(yīng)的基因組DNA中的內(nèi)含子序列。最初的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，它通過(guò)一系列步驟被加工成熟的剪接mRNA。這些步驟包4舌通過(guò)所謂的剪接方法移除內(nèi)含子序列。cDNA衍生自mRNA,因此缺乏任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建:在此所用的術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建"是指單鏈或雙鏈核酸分子，它們分離自天然存在的基因或以某種方式被修飾以含有核酸片段，否則其不會(huì)天然存在。當(dāng)核酸構(gòu)建包含本發(fā)明編碼序列表達(dá)所需的控制序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建與術(shù)語(yǔ)"表達(dá)框"同義。控制序列:術(shù)語(yǔ)"控制序列"在本文中被定義為包括所有對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核普酸表達(dá)所必需的或有利的元件。對(duì)編碼多肽的核苷酸序列來(lái)說(shuō)，每個(gè)控制序列都可以是原有的或外來(lái)的。這些控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄凶钌賾?yīng)包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)。對(duì)照序列可具有接頭序列以引入特異的限制性酶切位點(diǎn)，利于對(duì)照序列與編碼多肽的核普酸序列編碼區(qū)相連4^?？刹僮鞯倪B接:術(shù)語(yǔ)"可操作的連接"本文表示一種構(gòu)造，其中控制序列被置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，以使得控制序列引導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。編碼序列:本文所用術(shù)語(yǔ)"編碼序列"是指直接為其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列編碼的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開(kāi)放讀框決定，開(kāi)放讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子諸如GTG和TTG開(kāi)始。編碼序列可以是DNA、cDNA、或重組核苷酸序列。表達(dá):術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括多肽生產(chǎn)涉及的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。表達(dá)載體:本文術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"定義為包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的線(xiàn)性或環(huán)狀DNA分子，此多核苷酸可操作地與提供其表達(dá)的附加核苷酸相連。宿主細(xì)胞:如本文所用，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括任何易受轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等影響的細(xì)胞類(lèi)型，具有包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建。修飾:術(shù)語(yǔ)"修飾"本文是指多肽的任何化學(xué)修飾，所述多肽由序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的成熟多肽組成，以及編碼多肽的DNA的基因操縱。修飾可以是氨基酸的取代、刪除和/或插入、以及氨基酸側(cè)鏈的替代。人造變體:本文所用術(shù)語(yǔ)"人造變體，，是指具有脂肪酶活性的多肽，所述脂肪酶活性由表達(dá)序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的修飾核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。通過(guò)人工干預(yù)獲得修飾核苷酸序列，人工干預(yù)是通過(guò)修飾本發(fā)明所公開(kāi)的在序列標(biāo)識(shí)號(hào)1中的核苷酸序列。相對(duì)性能(RP):術(shù)語(yǔ)相對(duì)性能反映了當(dāng)用在本說(shuō)明書(shū)實(shí)例2中描述的具體酶變體洗滌紡織物樣本，并以其顏色亮度作測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，酶變體相比參考酶的性能。風(fēng)險(xiǎn)OO:本說(shuō)明書(shū)中術(shù)語(yǔ)"風(fēng)險(xiǎn)，，和風(fēng)險(xiǎn)因子可互換使用，它是從脂肪酶變體洗滌樣品釋放的丁酸與從序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的脂肪酶成熟部分洗滌樣品釋放的丁酸量之間的比率，兩個(gè)值都使用從無(wú)脂肪酶的洗滌樣品釋放的丁酸量進(jìn)行校正。效險(xiǎn)因子(BR):效險(xiǎn)因子描述與氣味風(fēng)險(xiǎn)相比的洗滌性能,因此BR=RPavg/R0變體命名規(guī)則在描述如本發(fā)明所述的脂肪酶變體時(shí)，使用以下命名法以利于參考最初氨基酸:位點(diǎn):取代氨基酸。根據(jù)此命名法，例如將位點(diǎn)195處的谷氨酸取代為甘氨酸，表示為G195E。在相同的位點(diǎn)缺失甘氨酸的話(huà)表示為G195*,而插入附加的氨基酸殘基如賴(lài)氨酸表示為G195GK。一個(gè)與其它脂肪酶相比，包含一個(gè)在位點(diǎn)36的"缺失"氨基酸，同時(shí)在此位點(diǎn)插入一個(gè)天冬氨酸的具體脂肪酶表示為*36D。多個(gè)突變用加號(hào)分隔，即R170Y+G195E,表示在位點(diǎn)170和195處分別將酪氨酸和谷氨酸取代為精氨酸和甘氨酸。當(dāng)應(yīng)用所述序列比對(duì)方法時(shí)，X231表示在親本多肽中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)231的氨基酸。X231R表示此氨基酸用R置換。對(duì)序列標(biāo)識(shí)號(hào)2來(lái)說(shuō)X是T,X231R因此表示在位點(diǎn)231處用R取代T。當(dāng)一個(gè)位點(diǎn)(例如231)的氨基酸可以用另一個(gè)選自一組氨基酸的氨基酸取代時(shí)，例如，所述組由R和P和Y組成，用X231R/P/Y表示。在所有情況下，使用公認(rèn)的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫(xiě)。發(fā)明詳述具有脂肪酶活性的多肽本發(fā)明具有脂肪酶活性的分離的多肽選自由下列脂肪酶組成的組在本說(shuō)明書(shū)給定的測(cè)試條件下具有至少0.8的RP和至少1.1的BR的脂肪酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述脂肪酶具有至少0.9的RP,諸如1.0或1.1。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述脂肪酶具有至少1.2的RP,諸如1.3或甚至1.4。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述脂肪酶具有至少1.2的BR,諸如1.3或甚至1.4。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述脂肪酶具有至少1.5的BR，諸如1.6或甚至1.7。在另一方面，本發(fā)明的多肽在本說(shuō)明書(shū)的給定測(cè)試條件下還具有小于1,諸如小于0.95的相對(duì)LU/A280。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，相對(duì)LU/A280小于0.90,諸如小于0.85，或甚至小于0.80。在另一方面，本發(fā)明的分離的多肽具有如下氨基酸序列它被包含在或包含序列標(biāo)識(shí)號(hào)2或其等位變體，并且還具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。在另一方面，本發(fā)明的分離的多肽具有如下氨基酸序列它被包含在或包含序列標(biāo)識(shí)號(hào)2或其等位變體的成熟部分中，并且還具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。在另一方面，本發(fā)明的分離的多肽具有如下氨基酸序列它與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2(即，成熟多肽)的成熟多肽有至少80%,諸如至少85%或90%,或至少95%,優(yōu)選至少97%,最優(yōu)選至少98%,甚至最優(yōu)選至少99%的同一性，所述成熟多肽具有脂肪酶活性(下文中的"同源多肽")。在一個(gè)優(yōu)選的方面，同源多肽具有與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的成熟多肽相差十個(gè)氨基酸，優(yōu)選五個(gè)氨基酸，更優(yōu)選四個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選三個(gè)氨基酸，最優(yōu)選兩個(gè)氨基酸，和甚至最優(yōu)選一個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明具有脂肪酶活性的分離的多肽由如下多核苷酸編碼所述多核苷酸在非常低的嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，更優(yōu)選中嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，更優(yōu)選中-高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，最優(yōu)選非常高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，與以下核苷酸序列雜交(i)核苦酸644至732,序列標(biāo)識(shí)號(hào)1,(ii)包含在核苦酸644至732的cDNA序列，序列標(biāo)識(shí)號(hào)1,(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互外卜鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarbor,NewYork)。序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的子序列包含至少100個(gè)鄰接核苷酸或優(yōu)選地至少200個(gè)鄰接核香酸。此外，子序列可編碼具有脂肪酶活性的多肽片段。序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的核苷酸序列或其子序列，以及序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法從不同屬或種的菌抹中鑒別和克隆編碼具有脂肪酶活性的多肽的DNA。具體地講，這些探針可用于與所關(guān)注的屬或種的基因組或cDNA雜交，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法以鑒別和分離那里相應(yīng)的基因。這些探針可以比整個(gè)序列短的多，但是其長(zhǎng)度應(yīng)為至少14,優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35,最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，核酸探針的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少100個(gè)核苷酸。例如，核酸探針的長(zhǎng)度可以為至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。甚至可以使用更長(zhǎng)的探針，例如，長(zhǎng)度為至少600個(gè)核苦酸，優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸，或更優(yōu)選至少800個(gè)核苦酸的核酸探針。可以使用DNA和RNA探針。探針通常進(jìn)行標(biāo)記以檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素、或親合素標(biāo)記)。本發(fā)明涵蓋了這些探針。因此，可以從這些其它生物體制備的DNA或cDNA基因組文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并編碼具有脂肪酶活性的多肽的DNA?？梢酝ㄟ^(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)從這些其它生物體中分離基因組或其它DNA。來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA可以^皮轉(zhuǎn)移到并固定在硝化纖維或其它合適的載體材料上。為了鑒定與序列標(biāo)識(shí)號(hào)1或其子序列同源的克隆或DNA,在Southern印跡中使用載體材料。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，雜交說(shuō)明核苷酸序列在非常低的至非常高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交到標(biāo)記的核酸探針上，此探針對(duì)應(yīng)在序列標(biāo)識(shí)號(hào)1、其互補(bǔ)鏈、或其子序列中顯示的核苷酸序列。在這些條件下雜交到核酸探針上的分子可以用X射線(xiàn)膠片進(jìn)行檢測(cè)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的變體可以是人造變體，它在序列標(biāo)識(shí)號(hào)2或其成熟多肽上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸保守取代、刪除和/或插入，所述變體具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。優(yōu)選的是，氨基酸改變是較小的本質(zhì)改變，也就是說(shuō)，保守的氨基酸取代或插入不會(huì)顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；小的刪除，通常為一至約30個(gè)氨基酸；小的氨基末端或羧基末端延伸，諸如氨基末端的甲硫氨酸殘基；小的連接肽，最多約20至25個(gè)殘基；或小的延伸，它通過(guò)改變凈電荷或其它功能諸如聚組氨酸片段、抗原決定簇或結(jié)合域，有利于純化。保守取代的實(shí)例包括堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酸鹽和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且被描述于例如H.Neurath和R丄.Hill,1979,TheProteins,AcademicPress,NewYork。發(fā)生的最通常的交換是丙氨酸/絲氨酸、纈氨酸/異亮氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、蘇氨酸/絲氨酸、丙氨酸/甘氨酸、丙氨酸/蘇氨酸、絲氨酸/天冬酰氨、丙氨酸/纈氨酸、絲氨酸/甘氨酸、酪氨酸/苯丙氨酸、丙氨酸/脯氨酸、賴(lài)氨酸/精氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、亮氨酸/異亮氨酸、亮氨酸/纈氨酸、丙氨酸/谷氨酸和天冬氨酸/甘氨酸。除了20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，還可以用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(諸如4-羥脯氨酸、6-N-曱基賴(lài)氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸、和oc-甲基絲氨酸)取代野生型多肽的氨基酸殘基。限制數(shù)目的非保守氨基酸、遺傳密碼不編碼的氨基酸和非天然的氨基酸可以被氨基酸殘基取代。"非天然的氨基酸"在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)被修飾，和/或其側(cè)鏈具有與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然的氨基酸可以被化學(xué)合成，優(yōu)選可商購(gòu)獲得，包括咪咬酸、噻唑羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸、和3,3-二曱基脯氨酸。作為另外一種選擇，氨基酸改變是本質(zhì)的改變，會(huì)導(dǎo)致多肽的物理化學(xué)特性改變。例如，氨基酸改變可改善多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最佳pH等。親本多肽中的原發(fā)性氨基酸可以按照本領(lǐng)域中已知的程序進(jìn)行確定，諸如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(CunninghamandWells,1989,Science244:1081-1085)。在最近的技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基都引入單個(gè)的丙氨酸突變，并測(cè)試所得突變型分子的生物活性(即，脂肪酶活性)以確定氨基酸殘基是否對(duì)分子活性至關(guān)重要。還可參見(jiàn)Hilton等人，1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。也可通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的物理分析來(lái)測(cè)定酶的活性位點(diǎn)或其它生物學(xué)交互作用，用于測(cè)定的這些技術(shù)包括諸如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記，它們與假定的接觸位點(diǎn)氨基酸突變結(jié)合使用。參見(jiàn)，例如deVos等人，1992,Science255:306-312;Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59-64。也可以通過(guò)分析多肽的同一性來(lái)推斷原發(fā)性氨基酸的同一性，所述多肽涉及如本發(fā)明所述的多肽。使用已知的誘變、重組和/或改組方法，以及隨后的相應(yīng)篩選程序，能夠完成和測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，諸如那些在Reidhaar-OlsonandSauer,1988，Science241:53-57;BowieandSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625中公開(kāi)的方法。其它可用的方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等人，1991,Biochem.30:10832-10837;美國(guó)專(zhuān)利5,223,409;WO92/06204)和定位誘變(Derbyshire等人，1986，Gene46:145;Ner等人，1988,DNA7:127)。宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆、誘變多肽可通過(guò)誘變/改組方法結(jié)合高通量自動(dòng)篩選方法來(lái)檢測(cè)活性。(使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法能從宿主細(xì)胞中重新獲得編碼活性多肽的誘變DNA分子并迅速測(cè)序。這些方法可以迅速測(cè)定所關(guān)注的多肽中的各個(gè)氨基酸殘基的重要性，并將其施用于多肽的未知結(jié)構(gòu)。在一個(gè)方面，序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的氨基酸1至291的氨基酸取代、刪除和/或插入的總數(shù)為10,優(yōu)選為9,更優(yōu)選為8,更優(yōu)選為7,更優(yōu)選為最多6,更優(yōu)選為最多5,更優(yōu)選為4,甚至更優(yōu)選為3,最優(yōu)選為2,和甚至更優(yōu)選為1。區(qū)域識(shí)別和取代。下文提到的區(qū)域I至區(qū)域IV的位點(diǎn)是序列標(biāo)識(shí)號(hào)2中的氨基酸殘基位點(diǎn)。使用"同源性和序列比對(duì)"部分所述的方法來(lái)發(fā)現(xiàn)不同脂肪酶中對(duì)應(yīng)的(或同源的)位點(diǎn)。區(qū)域I中的取代區(qū)域I由圍繞N-末端殘基El的氨基酸殘基組成。在此區(qū)域優(yōu)選用帶較多正電的氨基酸來(lái)取代親本脂肪酶中的氨基酸。區(qū)域I包含對(duì)應(yīng)以下位點(diǎn)的氨基酸殘基1至11和223至239。以下位點(diǎn)具有特別的意義1、2、4、8、11、223、227、229、231、233、234和236。具體地講，已經(jīng)確認(rèn)了以下取代XlN/*、X4V、X227G、X231R和X233R。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2具有至少80%,諸如85%或90%，諸如至少95%或96%或97%或98%或99%的同一性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2相同。區(qū)域II中的取代區(qū)域II由在?；湹囊幻嫔虾驮诖疾糠值囊幻嫔辖佑|底物的氨基酸殘基組成。在此區(qū)域優(yōu)選用帶較多正電的氨基酸或較低疏水性的氨基酸來(lái)取代親本脂肪酶中的氨基酸。區(qū)域II包含對(duì)應(yīng)以下位點(diǎn)的氨基酸殘基202至211和249至269。以下位點(diǎn)具有特別的意義202、210、211、253、254、255、256、259。具體地講，已經(jīng)確-〖人了以下取代X202G、X210K/W/A、X255Y/V/A、X256K/R和X259G/M/Q/V。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2具有至少80%,諸如85%或90%,諸如至少95%或96%或97%或98%或99%的同一性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2相同。區(qū)域III中的取代區(qū)域III由形成柔性結(jié)構(gòu)，從而允許底物進(jìn)入活性位點(diǎn)的氨基酸殘基組成。在此區(qū)域優(yōu)選用帶較多正電的氨基酸或較低疏水性的氨基酸來(lái)取代親本脂肪酶中的氨基酸。區(qū)域III包含對(duì)應(yīng)以下位點(diǎn)的氨基酸殘基82至102。以下位點(diǎn)具有特別的意義83、86、87、90、91、95、96、99。具體地講，已經(jīng)確認(rèn)了以下取代X83T、X86V和X90A/R。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2具有至少80%,諸如85%或90%,諸如至少95%或96%或97%或98%或99%的同一性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2相同。區(qū)域IV中的取代區(qū)域IV由靜電結(jié)合至表面的氨基酸殘基組成。在此區(qū)域優(yōu)選用帶較多正電的氨基酸來(lái)取代親本脂肪酶中的氨基酸。區(qū)域IV包含對(duì)應(yīng)以下位點(diǎn)的氨基酸殘基27和54至62。以下位點(diǎn)具有特別的意義27、56、57、58、60。具體地講，已經(jīng)確認(rèn)了以下取代X27R、X58N/AG/T/P和X60V/S/G/N/R/K/A/L。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2具有至少80%,諸如85%或90%,諸如至少95%或96%或97%或98%或99%的同一性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2相同。其它位點(diǎn)的氨基酸親本脂肪酶可任選地包含其它氨基酸的取代，尤其是少于10個(gè)和少于5個(gè)這樣的取代。實(shí)施例是在對(duì)應(yīng)親本脂肪酶24、37、38、46、74、81、83、115、127、131、137、143、147、150、199、200、203、206、211、263、264、265、267和269中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的取代。在一個(gè)具體實(shí)施例中，取代發(fā)生在對(duì)應(yīng)81、143、147、150和249位點(diǎn)中的至少一個(gè)位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，至少一個(gè)取4戈選自由下列取代組成的組X81Q/E、X143S/C/N/D/A、X147M/Y、X150G/K和X249R/I/L。變體可包含在限定區(qū)域I至IV之外的取代，在限定區(qū)域I至IV之外的取代數(shù)量?jī)?yōu)選地少于六個(gè)、或少于五個(gè)、或少于四個(gè)、或少于三個(gè)、或少于二個(gè)，諸如五個(gè)、或四個(gè)、或三個(gè)、或二個(gè)或一個(gè)。作為另外一種選擇，變體不包含任何在限定區(qū)域I至IV之外的取代。例如，才艮據(jù)本領(lǐng)域已知的法則，可進(jìn)4亍更多的取代，如WO92/05249、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中所述的取代。親本脂肪變體在一個(gè)方面，當(dāng)與所述親本相比時(shí)，所述變體包含總計(jì)至少三個(gè)取代，所述取代選自以下組的取代中的一組或多組a)區(qū)域I中的至少兩個(gè)、或至少三個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五個(gè)、或至少六個(gè)，諸如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)取4戈，b)區(qū)域II中的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、或至少三個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五個(gè)、或至少六個(gè)，諸如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)取代，c)區(qū)i或III中的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、或至少三個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五個(gè)、或至少六個(gè)，諸如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)取代，d)和/或區(qū)域IV中的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、或至少三個(gè)、或至少四個(gè)、或至少五個(gè)、或至少六個(gè)，諸如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)取代。變體與變體的親本相比可包含取代，所述取代對(duì)應(yīng)下表1中列出的那些取代。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表1:一些具體的變體。在一個(gè)更具體的實(shí)施例中，親本脂肪酶與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2相同，從而表1的變體將會(huì)是<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表2:序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的一些具體變體例如，根據(jù)本領(lǐng)域已知的法則可進(jìn)行更多的取代，如WO92/05249、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中所述的取代。同源性和序列比對(duì)對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，如GCG程序包中所提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage,第8版，1994年8月,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970),"JournalofMolecularBiology",48，443-45),使用具有下列多肽序列對(duì)比設(shè)置的GAP,來(lái)適宜地測(cè)定同源性程度GAP產(chǎn)生罰分為3.0，并且GAP延伸罰分為0.1。在本發(fā)明中，犁頭霉、傘枝犁頭霉、米黑根毛霉、代氏根霉、黑曲霉、塔賓曲霉、尖孢鐮刀菌、異孢鐮刀菌、米曲霉、卡門(mén)柏青霉、臭曲霉、黑曲霉、嗜熱真菌(同物異名高溫毛殼霉)、和Landerinapenisapora脂肪酶序列中對(duì)應(yīng)的(或同源的)位點(diǎn)通過(guò)圖1中顯示的序列比對(duì)確定。為了找到脂肪酶序列中不顯示在序列比對(duì)中的同源位點(diǎn)，將所關(guān)注的序列與圖1中顯示的序列進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)對(duì)GAP程序發(fā)現(xiàn)的同源性最高的序列進(jìn)行GAP序列比對(duì)，將新序列與圖1中的現(xiàn)有序列進(jìn)4亍比對(duì)。GCG程序包(ProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8，August1994,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)'JournalofMolecularBiology,48,443-45)提供GAP。多肽序列比較使用以下設(shè)置GAP產(chǎn)生罰分為3.0，并且GAP延伸罰分為0.1。親本脂肪酶與嗜熱真菌脂肪酶(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)具有至少50%,尤其是至少55%，至少60%,至少75%,至少85%,至少90%,超過(guò)95%或超過(guò)98%的氨基酸同一性。在一個(gè)具體實(shí)施例中，親本脂肪酶與嗜熱真菌脂肪酶(序列標(biāo)識(shí)號(hào)2)相同。-效險(xiǎn)將描述性能與氣味減少風(fēng)險(xiǎn)比的效險(xiǎn)系數(shù)定義為BR=RPavg/R。本文所述的脂肪酶變體可具有大于1,大于1.1,或甚至大于1至約1000的效險(xiǎn)系數(shù)。-平均相對(duì)性能計(jì)算平均相對(duì)性能(RPavg)的程序存在于本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例5中。本文所述的脂肪酶變體可具有至少0.8,至少1.1，至少1.5,或甚至至少2至約1000的平均相對(duì)性能(RPavg)。-相對(duì)LU/A280通過(guò)存在于本發(fā)明實(shí)例4中的LU/A280片企測(cè)分析法來(lái)測(cè)定相對(duì)LU/A280。本文所述的脂肪酶變體可具有小于1.00,小于0.9,小于0.8,或甚至小于1.00至約0.1的相對(duì)LU/A280。具有脂肪酶活性的多肽本發(fā)明的多肽可獲取自任何微生物屬。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，在此所用的術(shù)語(yǔ)"獲取自"當(dāng)與給定來(lái)源相聯(lián)系時(shí)是指核苦酸序列編碼的多肽由來(lái)源產(chǎn)生或由其中插入了來(lái)源核苷酸序列的菌林產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的方面，獲取自給定來(lái)源的多肽被分泌到細(xì)胞外。本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性菌多肽，諸如桿菌多肽，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、凝固芽胞桿菌、燦爛芽胞桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽胞桿菌多肽；或鏈霉菌多肽，例如，變鉛青鏈霉菌或鼠鏈霉菌多肽；或革蘭氏陰性菌多肽，例如，大腸桿菌或假單胞菌屬多肽。本發(fā)明的多肽也可以是真菌多肽，更優(yōu)選地是酵母多肽諸如假絲酵母、克魯維酵母、畢赤酵母、酵母菌、裂殖酵母、或耶氏酵母多肽；或更優(yōu)選地絲狀真菌多肽，例如頂孢霉菌、曲霉菌、短梗霉菌、隱球菌、線(xiàn)黑粉酵母、鐮刀霉菌、腐殖霉菌、稻瘟病菌、毛霉菌、毀絲霉菌、新考瑪脂霉菌、脈孢菌、擬青霉菌、青霉菌、瘤胃真菌、裂褶菌、黃絲曲霉菌、嗜熱子嚢菌、草根霉菌、木霉菌、或木霉菌多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽是卡爾斯伯酵母、哞酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯維酵母、諾氏酵母、或具有脂肪酶活性的卯形酵母多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽是棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、塔賓曲霉、鐮孢擬桿菌、小麥枯萎病菌、鐮孢菌、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮刀菌、黃荊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、網(wǎng)狀鐮刀菌、念珠形鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、膚色鐮孢、擬枝孢鐮刀菌、硫色鐮刀菌、簇嚢鐮刀菌、類(lèi)絲孢鐮刀菌、鐮孢霉、特異腐質(zhì)霉、嗜熱真菌(同物異名高溫毛殼霉)、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、鏈孢霉、產(chǎn)紫青霉、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是嗜熱真菌屬多肽。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所迷多肽是嗜熱真菌多肽，例如，具有突變的序列標(biāo)識(shí)號(hào)2多肽，公開(kāi)于本專(zhuān)利申請(qǐng)中。對(duì)于上述菌種來(lái)說(shuō)，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明涵蓋完全的和不完全的狀態(tài)，以及其它分類(lèi)學(xué)等同物，例如，無(wú)性型，盡管菌種名稱(chēng)是已知的。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將易于認(rèn)識(shí)到適當(dāng)?shù)牡韧锏耐恍?。公眾可容易地在多個(gè)菌種保藏中心獲得這些菌種的菌林，諸如AmericanTypeCultureCollection(ATCC)、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)、CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)、和AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection、NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)。此外，使用上述探針，可以從其它來(lái)源鑒定和獲得這些多肽，包括從自然界分離的微生物(例如，土壤、堆肥、水等等)。用于從自然環(huán)境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后通過(guò)相似地篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫(kù)可獲得聚核苷酸。一旦使用探針檢測(cè)到了編碼多肽的多核香酸序列，可利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)分離或克隆多核苷酸(參見(jiàn)，例如，Sambrook等人，1989,supra)。本發(fā)明的多肽也包括融合多肽或可分開(kāi)的融合多肽，其中將另一個(gè)多肽融合在多肽或其片段的N-末端或C-末端。通過(guò)將編碼另一個(gè)多肽的核苷酸序列(或其一部分)融合到本發(fā)明的核苷酸序列(或其一部分)來(lái)生產(chǎn)融合多肽。生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括結(jié)合編碼多肽的編碼序列，以使得它們?cè)诳蚣苤胁⑶胰诤隙嚯牡谋磉_(dá)受相同啟動(dòng)子和終止子的控制。多核苷酸本發(fā)明的脂肪酶優(yōu)選地衍生自具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸，更優(yōu)選地衍生自編碼以下多肽的核苷酸序列所述多肽是序列標(biāo)識(shí)號(hào)2或其成熟多肽的氨基酸序列變體，它由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而與編碼多核苷酸不同。多肽也可衍生自序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的子序列，它編碼具有脂肪酶活性的序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的片段，所述片段具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括從基因組DNA中分離的多核普酸、從cDNA中制備多核香酸、或它們的組合?？梢詮倪@些基因組DNA中獲得的本發(fā)明多核苷酸的克隆，例如，通過(guò)使用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段。參見(jiàn)例如Innis等人的PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork,1990。可以使用其它核酸擴(kuò)增程序諸如連接酶反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核普酸序列的擴(kuò)增(NASBA)?？梢詮氖葻嵴婢鷮倩蛄硪环N或相關(guān)生物體菌抹中克隆多核苷酸。因此，例如多核苷酸可以是多核苦酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因或菌種變體。多肽可以衍生自具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的成熟多肽編碼序列具有至少60%,優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%,甚至更優(yōu)選至少95%,最優(yōu)選至少97%的同一性，它編碼具有脂肪酶活性以及至少1.1的BR和至少0.8的RP的活性多肽。為了合成基本上類(lèi)似于所述多肽的多肽，必須對(duì)編碼本發(fā)明多肽的核香酸序列進(jìn)行修飾。術(shù)語(yǔ)"基本上類(lèi)似于，，所述多肽是指多肽非天然存在的形式。這些多肽可與其天然來(lái)源在某些工程學(xué)方面不同，例如，人造變體在特異活性、熱穩(wěn)定性、最佳pH等方面有所不同。變體序列可以在序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的多肽編碼區(qū)的核苷酸序列基礎(chǔ)上構(gòu)建，例如，其子序列，和/或通過(guò)引入核苷酸取代，所述取代不產(chǎn)生另一種由核苷酸序列編碼的多肽的氨基酸序列，但是其對(duì)應(yīng)趨于產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子使用，或通過(guò)引入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代。核苷酸取4戈的綜述參見(jiàn)例長(zhǎng)口Ford等人的ProteinExpressionandPurification2:95-107,1991。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，可以在分子功能的關(guān)鍵區(qū)域之外進(jìn)行這些取代并仍獲得活性多肽。對(duì)由本發(fā)明分離的多核苷酸編碼的多肽活性至關(guān)重要，并因此優(yōu)選不被取代的氨基酸殘基可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序進(jìn)行鑒定，諸如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(參見(jiàn)例如CunninghamandWells,1989,Science244:1081-1085)。在最近的技術(shù)中在分子的每個(gè)帶正電的殘基中引入突變，并測(cè)試所得突變分子的脂肪酶活性以鑒定對(duì)分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。也可以通過(guò)三維結(jié)構(gòu)分析測(cè)定底物和酶的交互作用位點(diǎn)，三維結(jié)構(gòu)通過(guò)以下技術(shù)測(cè)定核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記(參見(jiàn)例如deVos等人的Science255:306-312,1992;Smith等人的JournalofMolecularBiology224:899-904,1992;Wlodaver等人的FEBSLetters309:59-64,1992)。多肽可以衍生自編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸在非常低的嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，更優(yōu)選中嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，更優(yōu)選中-高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，最優(yōu)選非常高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，與以下核苷酸序列雜交(i)序列標(biāo)識(shí)號(hào)l，(ii)cDNA序列，包含在序列標(biāo)識(shí)號(hào)1中，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；或等位變體和其子序列(Sambrook等人，1989,supra),如本文所定義。多肽可衍生自分離的多核香酸，多核苷酸通過(guò)以下步驟獲得(a)在非常低、低、中、中至高、高、或非常高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下將一組DNA與以下物質(zhì)雜交(i)序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的核苷酸，(ii)序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的核苷酸中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交多核苷酸，它編碼具有脂肪酶活性的多肽。核酸構(gòu)建包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建可被可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)控制序列上，控制序列指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中，在與控制序列相容的條件下表達(dá)?？梢杂枚喾N方法操縱編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。在多核苷酸序列插入載體前對(duì)其進(jìn)行操縱是可取的或必須取決于表達(dá)載體。利用重組DNA方法用于修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)i或熟4口的。對(duì)照序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子序列是宿主細(xì)胞可識(shí)別的、用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核普酸序列。啟動(dòng)子序列包含轉(zhuǎn)錄控制序列，它調(diào)控多肽的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的、雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因中獲得，所述多肽與宿主細(xì)胞是同源的或異源的。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例，尤其在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，是獲取自以下基因的啟動(dòng)子大腸桿菌乳糖操縱元、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌oc-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xy舊基因、和原核p-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria",ScientificAmerican,1980,242:74-94;和Sambrook等人，1989,supra中描述了更多的啟動(dòng)子。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例，在絲狀真菌宿主細(xì)胞中是獲取自以下基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸性穩(wěn)定a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鐮孢霉淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鐮孢霉Daria(WO00/56900)、鐮孢霉Quinn(WO00/56900)、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉P-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶n、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶m、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉P-木糖苷酶、以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性oc-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶基因的雜合啟動(dòng)子)；和其突變的、截短的、和雜合啟動(dòng)子。在酵母細(xì)胞中，可用啟動(dòng)子獲取自以下基因釀酒酵母烯醇酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸鹽脫氬酶(ADH1,ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬石克蛋白(CUP1)、和釀酒酵母3-;粦酸甘油酸鹽激酶。酵母宿主細(xì)胞的其它可用啟動(dòng)子在Romanos等人，1992,Yeast8:423-488中有所描述?？刂菩蛄幸部梢允呛线m的轉(zhuǎn)錄終止子序列，終止子序列是宿主細(xì)胞可識(shí)別的用于終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止序列被可操作地連接到編碼多肽的核苷酸序列的3'末端。本發(fā)明可以使用任何在選擇的宿主細(xì)胞中具有功能的終止子。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲取自以下基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸鹽合成酶、黑曲霉a-葡糖香酶、和尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲取自以下基因釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)、和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸鹽氬化酶。用于酵母宿主細(xì)胞的其它可用終止子在Romanos等人，1992,supra中有所描述。控制序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，前導(dǎo)序列是mRNA的非翻譯區(qū)，它對(duì)宿主細(xì)胞的翻譯是重要的。前導(dǎo)序列被可操作地連接到編碼多肽的核香酸序列的5，末端。本發(fā)明可以使用任何在選擇的宿主細(xì)胞中具有功能的前導(dǎo)序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列獲取自以下基因米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列獲取自以下基因釀酒酵母烯醇酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸鹽激酶、釀酒酵母a-因子、和釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶(ADH2/GAP)。對(duì)照序列可以是聚腺苷酸序列，它是可操作地連接到核苷酸序列的3，末端的序列，并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)宿主細(xì)胞認(rèn)為將聚腺苷酸殘基加到轉(zhuǎn)錄mRNA上是一種信號(hào)。本發(fā)明可以使用任何在選擇的宿主細(xì)胞中具有功能的聚腺苷酸序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺普酸序列獲取自以下基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸鹽合成酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉oc-葡糖苷酶。用于酵母宿主細(xì)胞的可用聚腺苷酸序列在GuoandSherman,1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990中有所描述。控制序列也可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，它編碼連接到多肽氨基末端的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5，末端可固有的包含信號(hào)肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)自然地連接翻i,讀碼框與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段。作為另外一種選擇，編碼序列的5，末端可包含對(duì)編碼序列來(lái)說(shuō)外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)。在編碼區(qū)天然地不包含信號(hào)肽編碼區(qū)的地方，需要外來(lái)信號(hào)肽編碼區(qū)。作為另外一種選擇，外來(lái)信號(hào)肽編碼區(qū)可只是為了增加多肽分泌而置換天然信號(hào)肽編碼區(qū)。然而，本發(fā)明中可以使用任何指導(dǎo)表達(dá)多肽進(jìn)入所選擇宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是獲取自以下基因的信號(hào)肽編碼區(qū)桿菌NCIB11837麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌P-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌prsA。更多的信號(hào)肽在SimonenandPalva，1993,MicrobiologicalReviews57:109-137中有所描述。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是獲取自以下基因的信號(hào)肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、和嗜熱真菌脂肪酶。用于酵母宿主細(xì)胞的可用信號(hào)肽獲取自以下基因釀酒酵母a-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。其它可用的信號(hào)肽編碼區(qū)在Romanos等人，1992，supra中有所描述?？刂菩蛄幸部梢允嵌嚯木幋a區(qū)，它編碼位置在于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽是已知的酶原或多肽原(或在某些情況下是酵素原)。多肽原通常是無(wú)活性的，它通過(guò)催化或自身催化裂解可轉(zhuǎn)化成熟的活性多肽。多肽編碼區(qū)可從以下基因中獲得枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(叩rT)、釀酒酵母a-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)。信號(hào)肽和肽原都存在于多肽的氨基末端，肽原區(qū)域位置在緊鄰著多肽的氨基末端，信號(hào)肽區(qū)域位置在緊鄰著肽原區(qū)域的氨基末端。也期望加入調(diào)控序列，調(diào)控序列允許調(diào)控多肽相對(duì)于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的表達(dá)。調(diào)控體系的實(shí)例是那些響應(yīng)化學(xué)或物理刺激，包括存在調(diào)控化合物而引起的基因表達(dá)開(kāi)啟或關(guān)閉的調(diào)控。原核體系中的調(diào)控體系包括lac、tac和trp操縱子體系。在酵母中可以使用ADH2體系或GAL1體系。在絲狀真菌中，可以使用TAKAoc-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)控序列。其它調(diào)控序列的實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的調(diào)控序列。在真核體系中，這些調(diào)控序列包括當(dāng)曱氨蝶呤存在時(shí)擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和當(dāng)重金屬存在時(shí)擴(kuò)增的金屬硫因基因。在這些實(shí)例中，編碼多肽的核香酸序列將可操作地與調(diào)控序列連接。表達(dá)載體重組表達(dá)載體通常包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)。上述多種核酸和對(duì)照序列可以接合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述載體可包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制酶切位點(diǎn)以允許編碼多肽的核苦酸序列在這些位點(diǎn)的插入或取代。作為另外一種選擇，本發(fā)明的核苷酸序列可以通過(guò)將核苦酸序列或包含序列的核酸構(gòu)建插入合適的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。在表達(dá)載體制造過(guò)程中，編碼序列位于載體中以使得編碼序列可操作地與合適的對(duì)照序列相連用于表達(dá)。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，它們能方便地經(jīng)受重組DNA程序并能表達(dá)核苷酸序列。載體的選擇將通常取決于載體和引入載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線(xiàn)性的或閉合環(huán)形的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，載體是在染色體外存在的實(shí)體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外因子、微型染色體、或人工染色體。載體可包含用于確保自主復(fù)制的任何元件。作為另外一種選擇，載體可以是這樣一種形式當(dāng)引入宿主細(xì)胞時(shí)，載體整合進(jìn)入基因組，與引入其的基因組一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，它們一起包含總DNA以一皮引入宿主細(xì)胞的基因組，或可以使用轉(zhuǎn)位子。載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記物，該標(biāo)記物使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞容易被選擇。一種選擇性標(biāo)記物是基因，其產(chǎn)物提供抗生素或病毒抗性、重金屬抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷體的原養(yǎng)型等。條件性原發(fā)基因可作為非抗生素選擇性標(biāo)記物使用。細(xì)菌的條件性原發(fā)非抗生素選擇性標(biāo)記物的非限制性實(shí)例是dal基因，得自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、或其它桿菌，它們僅當(dāng)細(xì)菌在缺失D-丙氨酸的情況下培養(yǎng)時(shí)才是原發(fā)性的。當(dāng)細(xì)胞在存在半乳糖的情況下生長(zhǎng)或在導(dǎo)致半乳糖存在的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在UDP-半乳糖代謝中涉及的編碼酶的基因也可用作細(xì)胞中的條件性原發(fā)標(biāo)記物。這些基因的非限制性實(shí)例是那些得自菌林枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的編碼UTP-依賴(lài)性磷酸化酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖-依賴(lài)性尿苦?；D(zhuǎn)移酶(EC2.7.7.12)、或UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶(EC5丄3.2)的基因。也可以使用木糖異構(gòu)酶基因諸如桿菌的xylA,在用木糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中作為細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性標(biāo)記物。也可使用利用葡糖酸鹽、gntK和gntP必需的基因，在用葡糖酸鹽作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中作為細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性標(biāo)記物。其它條件性原發(fā)基因的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的?？股剡x擇性標(biāo)記物授予對(duì)以下抗生素的抗性氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、新霉素、潮霉素或曱氨蝶呤。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸氨基曱酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶)、和trpC(鄰氨基苯曱酸合成酶)、以及其等同物。優(yōu)選用于曲霉菌細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，和吸水鏈霉菌的bar基因。載體優(yōu)選地包含允許載體整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的元件，或允許載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組進(jìn)行自主復(fù)制的元件。為了整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，載體可通過(guò)同源或非同源重組，依靠編碼多肽的多核苦酸序列或載體的任何其它元件整合進(jìn)入基因組。作為另外一種選擇，載體可包含附加的核苷酸序列，該序列用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組，在染色體的精確位置整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選地包含足夠數(shù)量的核酸，諸如100至10,000堿基對(duì)，優(yōu)選400至10,000堿基對(duì)，最優(yōu)選800至10,000堿基對(duì)，所述核酸與對(duì)應(yīng)目標(biāo)序列具有高度同一性以提高同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼的或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以通過(guò)非同源重組將載體整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。對(duì)自主復(fù)制來(lái)說(shuō)，載體可進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，以使得載體能在所考慮的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中發(fā)揮功能的、調(diào)控自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制基因。術(shù)語(yǔ)"復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制基因"本文定義為使得質(zhì)粒或載體能體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184,它們?cè)试S在大腸桿菌中復(fù)制，以及pUB110、pE194、pTA1060、和pAMJM,它們?cè)试S在桿菌中復(fù)制。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、以及ARS4和CEN6的組合。用于絲狀真菌細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANSI(Gems等人，1991,Gene98:61-67;Cullen等人，1987,NucleicAcidsResearch15:9163-9175;WO00/24883)。根據(jù)WO00/24883所7>開(kāi)的方法，可分離AMA1基因并構(gòu)建包含基因的質(zhì)?；蜉d體?？稍谒拗骷?xì)胞中插入多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸拷貝以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。通過(guò)整合至少一個(gè)附加的序列拷貝進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，或通過(guò)在多核苷酸中包括擴(kuò)增選擇性標(biāo)記物基因，細(xì)胞包含選擇性標(biāo)記物基因的擴(kuò)增拷貝，因此多核苷酸的附加拷貝可通過(guò)在合適的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行選擇，從而增加多核苷酸的拷貝量。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等人，1989,supra)。宿主細(xì)月包重組宿主細(xì)胞通常包含本發(fā)明的多核苷酸，在多肽的重組生產(chǎn)中有利地使用這些多核苷酸。將包含本發(fā)明多核普酸的載體《I入宿主細(xì)胞以使得載體保持成為染色體的部分或成為如前所述的自主復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，因?yàn)閺?fù)制期間發(fā)生了突變，后代細(xì)胞并不與親本細(xì)胞相同。親本細(xì)胞的選擇很大程度上取決于編碼多肽和其來(lái)源的基因。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物或非單細(xì)胞微生物，例如，真核生物?？捎玫膯渭?xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)胞，諸如革蘭氏陽(yáng)性菌，包括但不限于桿菌細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽胞桿菌、燦爛芽胞桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽胞桿菌；或鏈霉菌多肽，例如，變鉛青鏈霉菌和鼠鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌諸如大腸桿菌和假單胞菌屬。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，桿菌細(xì)胞是嗜堿桿菌。載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞可受到以下因素影響例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，ChangandCohen,1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)例如，Young和Spizizin,1961,JournalofBacteriology81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)、電穿孔(參見(jiàn)例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)、或結(jié)合(參見(jiàn),例如，Koehler和Thome,1987,JournalofBacteriology169:5771-5278)。宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，諸如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。在此所用的"真菌"包括子嚢菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、瓶菌門(mén)和接合菌門(mén)(由Hawksworth等人定義，In,AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi，第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK)以及卵菌門(mén)(由Hawksworth等人引用，1995,supra,第171頁(yè))和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人,1995，supra)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在此所用的"酵母，，包括產(chǎn)子嚢孢子酵母(內(nèi)孢霉目)、孔生擔(dān)孢子酵母、和屬于不完全菌綱(芽孢綱)的酵母。因?yàn)榻湍阜诸?lèi)將來(lái)可能發(fā)生改變，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，酵母應(yīng)按照BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中描述的方法進(jìn)行定義。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母、漢遜酵母、克魯維酵母、畢赤酵母、酵母菌、裂殖酵母、或耶氏酵母細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾斯伯酵母、啤酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯維酵母、諾氏酵母、或具有脂肪酶活性的卵形酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂耶氏酵母細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌，，包括真菌亞門(mén)和卵菌亞門(mén)所有的絲狀形式(由Hawksworth等人定義，1995,supra)。絲狀真菌通常特征在于菌絲體壁由曱殼質(zhì)、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖、和其它復(fù)合多糖組成。菌體生長(zhǎng)通過(guò)菌絲伸長(zhǎng)完成，碳分解代謝必須在有氧條件下進(jìn)行。相反，酵母諸如釀酒酵母，其菌體生長(zhǎng)通過(guò)單細(xì)胞菌體出芽完成，碳分解代謝可以是發(fā)酵性的。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是頂孢霉菌、曲霉菌、短梗霉菌、煙管菌、擬蠟菌、鬼傘菌、采絨革蓋菌、隱球菌、線(xiàn)黑粉酵母、鐮刀霉菌、腐殖霉菌、稻瘟病菌、毛霉菌、毀絲霉菌、新考瑪脂霉菌、脈孢菌、擬青霉菌、青霉菌、白腐菌、射脈菌、瘤胃真菌、側(cè)耳菌、裂褶菌、黃絲曲霉菌、嗜熱子嚢菌、草根霉菌、木霉菌、毛栓菌、或木霉菌細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是鐮孢擬桿菌、小麥枯萎病菌、鐮孢菌、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮刀菌、黃荊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、網(wǎng)狀鐮刀菌、念珠形鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、膚色鐮孢、擬枝孢鐮刀菌、硫色鐮刀菌、簇嚢鐮刀菌、類(lèi)絲孢鐮刀菌、或鐮孢霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是煙管菌、干擬蠟菌、干擬蠟菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa,Ceriporiopsissubrufa、或蟲(chóng)才以蠟菌、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌、特異腐質(zhì)霉、高溫毛殼霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、鏈孢霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、射脈菌、杏鮑菇、太瑞斯梭孢殼霉、長(zhǎng)絨毛栓菌、云芝、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉菌抹細(xì)胞。真菌細(xì)胞可通過(guò)包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的過(guò)程進(jìn)行轉(zhuǎn)化，就其本身而言是已知的方式。用于轉(zhuǎn)化曲霉菌和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等人，1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中有所描述。用于轉(zhuǎn)化鐮刀霉菌種的合適方法在Malardier等人，1989，Gene78:147-156，和WO96/00787中有所描述。酵母可以用以下文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)4亍4爭(zhēng)4匕Becker和Guarente,InAbelson，J.N.和Simon,M.I.,editors,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194，pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等人，1983，JournalofBacteriology153:163;和Hinnen等人，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的多肽可以通過(guò)包括以下步驟的方法進(jìn)行生產(chǎn)(a)培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞是能夠生產(chǎn)多肽的野生型細(xì)胞，在有益于多肽生產(chǎn)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；和(b)重新獲得多肽。細(xì)胞優(yōu)選是曲霉菌，更優(yōu)選是米曲霉。用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法也可包括(a)在有益于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)重新獲得多肽。用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法也可包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，此序列在序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的成熟多肽編碼區(qū)具有至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼脂肪酶多肽，所述脂肪酶被包含在或包含序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的多肽，和(b)重新獲得多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述核苷酸序列編碼脂肪酶多肽，所述脂肪酶被包含在或包含序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的多肽成熟部分，和(b)重新獲得多肽。在此生產(chǎn)方法中，細(xì)胞使用本領(lǐng)域熟知的方法在適于多肽生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。例如，在合適的培養(yǎng)基中以及在允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下，細(xì)胞可通過(guò)搖瓶培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，和在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、加料分批的或固態(tài)發(fā)酵)。使用本領(lǐng)域已知的方法，培養(yǎng)在包含碳源和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。合適的培養(yǎng)基可得自商業(yè)供應(yīng)商或根據(jù)公布的組合(例如,在AmericanTypeCultureCollection目錄中的那些組合)制備。如果多肽被分泌進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，它可從培養(yǎng)基中直接重新獲得。如果多肽不被分泌，它能從細(xì)胞溶解產(chǎn)物中重新獲得?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的，專(zhuān)用于多肽的方法來(lái)檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括使用特異抗體、酶產(chǎn)物形成、或底物消耗。例如，可以使用酶檢測(cè)分析法來(lái)測(cè)定如本文所述的多肽活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法重新獲得。例如，多肽可以通過(guò)以下常規(guī)方法從培養(yǎng)基中重新獲得包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀?？梢酝ㄟ^(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化多肽，包括但不限于色譜法(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排阻)、電泳方法(例如，制備性等電聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提純(參見(jiàn),例如,ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。組合物優(yōu)選地，組合物富集本發(fā)明所述的多肽。術(shù)語(yǔ)"富集的"表示已經(jīng)強(qiáng)化了組合物的脂肪酶活性，例如，使用富集系數(shù)1.1。組合物可包含本發(fā)明的多肽作為主要的酶組分，例如，單組分組合物。作為另外一種選擇，組合物可包含多種酶活性，諸如氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氬酶、纖維素酶、甲殼質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳醣苷酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、P-葡萄糖苷酶、卣素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、縮氨酸谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。附加的酶可由以下微生物生產(chǎn)，例如屬于曲霉菌屬的微生物，優(yōu)選的是棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉,臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；鐮刀菌，優(yōu)選的是鐮孢擬桿菌、小麥枯萎病菌、鐮孢菌、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮刀菌、黃荊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、網(wǎng)狀鐮刀菌、粉紅色鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、膚色鐮孢、硫色鐮刀菌、簇嚢鐮刀菌、類(lèi)絲孢鐮刀菌、或鐮孢霉；腐殖霉菌，優(yōu)選的是特異腐質(zhì)霉或嗜熱真菌；或木霉屬，優(yōu)選的是哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉。多肽組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備，并能夠以液體或干燥組合物的形式存在。例如，多肽組合物能夠以顆?；蛭⒘５男问酱嬖?。組合物中包含的多肽可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法穩(wěn)定。洗滌劑成分在此所用的洗滌劑組合物包括制品和清潔及處理組合物。除非另外指明，如本文所用，術(shù)語(yǔ)"清潔和/或處理組合物"包括片劑、顆粒狀或粉狀多功能洗滌劑或"重垢型"洗滌劑，尤其是衣物洗滌劑；液體狀、凝膠狀或糊狀多功能洗滌劑，尤其是通常所說(shuō)的重垢型液體類(lèi)；液體精細(xì)織物洗滌劑；手洗餐具洗滌劑或輕垢型餐具洗滌劑，尤其是高泡型的那些；機(jī)洗餐具洗滌劑，包括各種在家庭和公共場(chǎng)所使用的片狀、顆粒狀、液體狀和漂洗助劑型洗滌劑。所述組合物也可在單位劑量包裝中，包括本領(lǐng)域已知的那些單位劑量包裝，以及那些水溶性的、水不溶性的和/或水可滲透的單位劑量包裝。本發(fā)明的洗滌劑組合物可包含一種或多種本發(fā)明的脂肪酶變體。除了脂肪酶變體之外，洗滌劑組合物還包含洗滌劑成分。下文說(shuō)明的洗滌劑成分的非限制性列表適用于本發(fā)明的組合物，并且適合將其加入到本發(fā)明的某些實(shí)施例中，例如以促進(jìn)或提高清潔性能，處理待清潔的底物，或通常用著色劑、染料等等改進(jìn)清潔組合物的美觀(guān)性。這些附加組分的明確性質(zhì)及其摻入量將取決于組合物的物理形式以及其應(yīng)用的清潔操作的性質(zhì)。合適的洗滌劑成分質(zhì)包括但不限于表面活性劑、助洗劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、分散劑、酶和酶穩(wěn)定劑、漂白活化劑、過(guò)氧化氫、過(guò)氧化氫源、預(yù)成形過(guò)酸、聚合分散劑、增白劑、抑泡劑、染料、抗腐蝕劑、晦暗抑制劑、香料、結(jié)構(gòu)彈性劑、織物軟化劑、載體、水溶助長(zhǎng)劑、加工助劑、溶劑和/或顏料。典型的洗滌劑將包含按以下成分的任何組合重量計(jì)5%至30%表面活性劑，優(yōu)選陰離子表面活性劑諸如直鏈烷基苯磺酸鹽和羥基環(huán)氧硫酸鹽；0.005%至0.1%蛋白酶活性蛋白，其中所述蛋白酶優(yōu)選選自Coronase,、FNA、FN4或Savinase,0.001%至0.1%淀粉酶活性蛋白,其中所述淀粉酶優(yōu)選選自TermamylNatalase、Stainzyme和Purastar和0.1%至3%的螫合劑，優(yōu)選二亞乙基三胺五醋酸。對(duì)于顆粒型和片劑產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，這些典型的洗滌劑將另外包含按重量計(jì)5%至20%漂白劑，優(yōu)選過(guò)碳酸鈉；1%至4%的漂白活化劑，優(yōu)選TAED和/或0%至30%,優(yōu)選5%至30%，更優(yōu)選少于10%的助洗劑，諸如硅鋁酸鹽沸石A和/或三聚磷酸鹽。漂白劑-本發(fā)明洗滌劑組合物可包含一種或多種漂白劑。通常，當(dāng)使用漂白劑時(shí)，本發(fā)明的組合物可包括按本主題清潔組合物的重量計(jì)約0.1%至約50%,或者甚至約0.1%至約25%的漂白劑。合適漂白劑的示例包括(1)過(guò)氧化氬源，例如無(wú)機(jī)過(guò)氬化合物鹽，包括以下堿金屬鹽如鈉鹽過(guò)硼酸鹽(通常為一水合物或四水合物)、過(guò)碳酸鹽、過(guò)硫酸鹽、過(guò)磷酸鹽、過(guò)硅酸鹽、以及它們的混合物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，無(wú)機(jī)過(guò)氫化合物鹽選自由下列物質(zhì)組成的組過(guò)硼酸鈉鹽、過(guò)碳酸鈉鹽、以及它們的混合物，急；和(2)具有R-(C=0)-L的漂白活化劑，其中R為烷基，任選支鏈烷基。當(dāng)漂白活化劑為疏水時(shí)，其具有6至14個(gè)碳原子或者8至12個(gè)碳原子。當(dāng)漂白活化劑為親水時(shí)，其具有小于6個(gè)碳原子或者甚至小于4個(gè)碳原子；并且L為離去基團(tuán)。合適的離去基團(tuán)的實(shí)例為苯甲酸及其衍生物，尤其是苯磺酸鹽。合適的漂白活化劑包括十二烷酰氧基苯磺酸鹽、癸酰氧基苯磺酸鹽、癸酰氧基苯曱酸及其鹽、3,5,5-三曱基己酰氧基苯磺酸鹽、四乙?；叶?TAED)和壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS)。合適的漂白活化劑還公開(kāi)于WO98/17767中。盡管可釆用任何適宜的漂白活化劑，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本主題的清潔組合物可包含NOBS、TAED或它們的混合物。(3)預(yù)成形的過(guò)酸。如果存在，過(guò)酸和/或漂白活化劑通常以基于所述組合物約0.1至約10%重量，約0.5至約60%重量或者甚至約0.6至約40%重量的含量存在于所述組合物中。其一種或多種疏水前體可與一種或多種親水過(guò)酸或其前體聯(lián)合使用?？蛇x擇過(guò)氧化氫源與過(guò)酸或漂白活化劑的量，使得可用氧(來(lái)自過(guò)氧化物源)與過(guò)酸的摩爾比為1:1至35:1,或者甚至2:1至10:1。表面活性劑-如本發(fā)明所述的洗滌劑組合物可包含表面活性劑或表面活性劑體系，其中所述表面活性劑可選自非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兩性離子表面活性劑、半極性非離子表面活性劑、以及它們的混合物。如果存在的話(huà)，表面活性劑通常以按本主題組合物的重量計(jì)約0.1%至約60%,約0.1%至約40%,約0.1%至約12%,約1%至約50%,或者甚至約5%至約40%的含量存在。如果存在的話(huà)，所述洗滌劑通常將包含約1%至約40%的陰離子表面活性劑，諸如直鏈烷基苯磺酸鹽、oc烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、羥基環(huán)氧硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、a磺基脂肪酸曱酯、烷基或烯基丁二酸或鳥(niǎo)。所述洗滌劑可任選地包含約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，諸如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基氧化胺、乙氧基化脂肪酶一乙醇酰胺、脂肪酸一乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺N-酰基N-烷基衍生物("葡糖酰胺")。助洗劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物可包括一種或多種洗滌劑助劑或助洗劑體系。當(dāng)使用助洗劑時(shí)，本主題組合物將通常包含按本主題組合物的重量計(jì)至少約1%,約5%至約60%,或者甚至約10%至約40%的助洗劑。助洗劑包括但不限于堿金屬、銨和鏈烷醇銨的聚磷酸鹽、堿金屬硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}、堿土和堿金屬碳酸鹽、珪鋁酸鹽助洗劑和各種堿金屬、多元乙酸(如乙二胺四乙酸和氨三乙酸)的各種銨鹽和取代銨鹽，以及聚羧酸酯(如苯六甲酸、琥珀酸、檸檬酸、氧聯(lián)二琥珀酸、多元馬來(lái)酸、苯-l,3,5-三羧酸、羧曱基氧代琥珀酸)以及它們的可溶性鹽。螯合劑-本文的洗滌劑組合物可包含螯合劑。合適的螯合劑包括銅、鐵和/或錳螯合劑、以及它們的混合物。當(dāng)使用螯合劑時(shí)，本主題組合物可包含按本主題組合物的重量計(jì)約0.005%至約15%,或者甚至約3.0%至約10%的螯合劑。增白劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物也可包含能改變待清潔制品外觀(guān)的附加組分，諸如焚光增白劑。這些增白劑吸收紫外光并發(fā)出可見(jiàn)光。合適的熒光增白劑含量包括從約0.01%重量，約0.05%重量，約0.1%重量，或甚至約0.2%重量的較低含量至0.5%重量或甚至0.75%重量的較高含量。分散劑-本發(fā)明的組合物還可包含分散劑。合適的水溶性有機(jī)物包括均聚或共聚酸或其鹽，其中多元羧酸包含至少兩個(gè)相隔不超過(guò)兩個(gè)碳原子的羧基。鱉-除了本發(fā)明的脂肪酶變體外，洗滌劑組合物還可再包含一種或多種酶以提供清潔性能和/或織物護(hù)理有益效果，諸如蛋白酶、另一種脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或過(guò)氧化物酶。通常選擇的酶的特性應(yīng)與選擇的洗滌劑相容，(即，最佳pH與其它酶和非酶成分相容等等)，并且酶應(yīng)為有效量。合適的蛋白酶包括那些動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的蛋白酶。優(yōu)選微生物來(lái)源。包括化學(xué)改性的或蛋白質(zhì)工程的突變型。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選微生物堿性蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶，尤其是那些衍生自桿菌的蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草菌溶素、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)、序列標(biāo)識(shí)號(hào)4和序列標(biāo)識(shí)號(hào)7，描述于WO05/103244中。其它合適的絲氨酸蛋白酶包括那些獲取自微球菌亞目某些種，尤其是公開(kāi)于Cellulonas種的絲氨酸蛋白酶及其變體，公開(kāi)于WO2005052146中。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如豬或牛來(lái)源的胰蛋白酶)和鐮刀霉蛋白酶，描述于WO89/06270和WO94/25583中?？捎玫鞍酌傅膶?shí)例是WO92/19729,WO98/20115、WO98/20116、和WO98/34946中描述的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)以下位點(diǎn)具有取4戈的變體27、36、57、68、76、87、97、101、104、106、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、245、252和274,以及具有以下突變的其它變體(K27R、V104Y、N123S、T124A),(N76D、S103A、V104I),或(S101G、S103A、V104I、G159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D、N252K)。其它可用蛋白酶的實(shí)例是WO05/052146中描述的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)以下位點(diǎn)具有取代的變體14、16、35、65、75、76、79、123、127、159和179優(yōu)選的可商購(gòu)獲得的蛋白酶包括Alcalase、Savinase、Primase、Duralase、EsperaseTM、Coronase、PolarzymeandKannase(NovozymesA/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafbct、PurafbctPrime、PurafectOxPTM、FNA、FN2、FN3和FN4(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的脂肪酶。包括化學(xué)改性的或蛋白質(zhì)工程的突變型?？捎弥久傅膶?shí)例包括獲取自腐殖霉菌(同物異名嗜熱真菌)的脂肪酶，例如獲取自高溫毛殼霉(同物異名嗜熱真菌)的脂肪酶，描述于EP258068和EP305216中，或獲取自特異腐質(zhì)霉的脂肪酶，描述于WO96/13580中，假單胞菌屬脂肪酶，例如獲取自產(chǎn)堿假單胞菌或類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(EP218272)、洋蔥假單胞菌(EP331376)、司氏假單胞菌(GB1,372,034)、螢光假單胞菌、假單胞菌屬菌林SD705(WO95/06720和WO96/27002))、威州齒盤(pán)假單胞菌(WO96/12012)的脂肪酶，桿菌脂肪酶，例如獲取自菌株枯草芽孢桿菌(Dartois等人，(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(WO91/16422)的脂肪酶。其它實(shí)例是諸如那些在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的脂肪酶變體。其它可商購(gòu)獲得的脂肪酶包括Lipolase、LipolaseUltra和Lipex(NovozymesA/S)。合適的淀粉酶(a和/或(3)包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的淀粉酶。包括化學(xué)改性的或蛋白質(zhì)工程的突變型。淀粉酶包括例如a-得自桿菌的淀粉酶，例如一種特殊的地衣芽孢桿菌菌抹，該菌林在GB1,296,839中有更詳細(xì)的描述?？捎玫矸勖傅膶?shí)例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)以下位點(diǎn)具有取^的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444?？缮藤?gòu)獲得的淀粉酶是Duramyl、TermamylTM、Stainzyme、StainzymeUltra、FungamylTM和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase和Purastar(得自GenencorInternationalInc.)。合適的纖維素酶包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的纖維素酶。包括化學(xué)改性的或蛋白質(zhì)工程的突變型。合適的纖維素酶包括獲取自桿菌屬、假單胞菌屬、腐殖霉屬、鐮刀霉屬、草根霉屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如產(chǎn)自特異腐質(zhì)霉、嗜熱黃毀絲霉和尖孢鐮刀菌的真菌纖維素酶，它們公開(kāi)于US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WO89/09259中。尤其合適的纖維素酶是具有顏色護(hù)理有益效果的堿性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實(shí)例是EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實(shí)例是諸如那些在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的纖維素酶變體。可商購(gòu)獲得的纖維素酶包括Renozyme、Celluclean、Endolase、Celluzyme、和Carezyme(NovozymesA/S)、Clazinase、和PuradaxHA(GenencorInternationalInc.)、和KAC-500(B)(KaoCorporation)。過(guò)氧化物酶/氧化酶合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的酶。包括化學(xué)改性的或蛋白質(zhì)工程的突變型?？捎玫倪^(guò)氧化物酶實(shí)例包括獲取自鬼傘菌的過(guò)氧化物酶，例如獲取自灰蓋鬼傘的過(guò)氧化物酶，其變體描述于WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中?？缮藤?gòu)獲得的過(guò)氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。當(dāng)存在于清潔組合物中時(shí)，上述酶可以按所述組合物的重量計(jì)約0.00001%至約2%,約0.0001%至約1%或者甚至約0.001%至約0.5%酶蛋白的含量存在。酶穩(wěn)定劑-用于洗滌劑中的酶可使用多種技術(shù)來(lái)穩(wěn)定。本發(fā)明使用的酶可由最終組合物中存在的釣和/或鎂離子水溶性源來(lái)穩(wěn)定，最終產(chǎn)物將這種離子提供給酶。也可使用其它常規(guī)穩(wěn)定劑，例如多元醇，諸如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸書(shū)t生物例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物諸如4-苯甲酰硼酸，所述組合物可以按照例如WO92/19709和WO92/19708描述的方法配制。溶劑-合適的溶劑包括水與其它溶劑如親脂性流體。合適的親脂性流體的實(shí)例包括硅氧烷、其它硅氧烷、烴、二元醇醚、甘油衍生物如甘油醚、全氟胺、全氟化和氫氟醚溶劑、低揮發(fā)性無(wú)氟有機(jī)溶劑、二醇溶劑、其它對(duì)環(huán)境友好的溶劑、以及它們的混合物。洗滌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明包括一種清潔和/或處理某一部位，特別是表面或織物的方法，上述方法包括以下步驟將申請(qǐng)人的清潔組合物實(shí)施例(以純物質(zhì)形式或稀釋在洗滌液體中)與至少部分表面或織物接觸，然后任選地漂洗上述表面或織物?？稍谏鲜銎床襟E之前對(duì)所述表面或織物進(jìn)行洗滌步驟。對(duì)本發(fā)明而言，洗滌包括但不限于擦洗和機(jī)械攪拌。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，本發(fā)明的清潔組合物可理想地用于洗衣用途。因此，本發(fā)明包括一種用于洗滌織物的方法，所述方法包括以下步驟將待洗滌的織物與所述清潔洗滌溶液接觸，所述洗滌溶液包含申請(qǐng)人的清潔組合物、清潔助劑或它們的混合物的至少一個(gè)實(shí)施例。織物可包括任何能夠在正常消費(fèi)者使用條件下洗滌的大部分任何織物。所述溶液優(yōu)選具有約8至約10.5的pH。所述組合物采用的溶液濃度為約100ppm，優(yōu)選500ppm至約15,000ppm。水溫通常為約5°C至約90°C。本發(fā)明在低水溫如30°C以下或25°C或20°C以下是尤其有益的。水與織物的比率通常為約1:1至約30:1。脂肪酶變體實(shí)例用作緩沖劑和底物的化學(xué)物質(zhì)是至少試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。-培養(yǎng)基和溶液LAS(SurfacPSTM)和沸石A(WessaHthP)。所用的其它成分是標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室試劑。-材料EMPA221，來(lái)自EMPASt.Gallen，Lerchfeldstrasse5，CH-9014St.Gallen，Switzerland實(shí)施例1:酶生產(chǎn)使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，構(gòu)建一個(gè)包含編碼脂肪酶的基因的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞。使用恒溫34°C,起始體積1.2升的培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。培養(yǎng)基的最初pH設(shè)為6.5。一旦pH升至7.0,通過(guò)加入10%H3P04來(lái)保持此值恒定。培養(yǎng)基中的溶解氧水平通過(guò)改變攪拌速率以及使用每升培養(yǎng)基每分鐘i.o升空氣的固定通風(fēng)速率進(jìn)行控制。在整個(gè)補(bǔ)料分批發(fā)酵階段進(jìn)料速率維持在一個(gè)恒定的水平。分批培養(yǎng)基包含麥芽糖漿作為碳源，尿素和酵母提取物作為氮源，以及痕量金屬和鹽的混合物。在補(bǔ)料分批發(fā)酵階段連續(xù)加入的進(jìn)料包含麥芽糖漿作為碳源，然而加入尿素和酵母提取物是為了確保充足的氮源供應(yīng)。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行脂肪酶的純化，例如通過(guò)過(guò)濾發(fā)酵上清液和后續(xù)的疏水色譜和陰離子交換液，例如實(shí)例3中EP0851913EP所述的方法。實(shí)例2:AMSA-自動(dòng)機(jī)械應(yīng)力檢測(cè)分析法-用于計(jì)算相對(duì)性能(RP)。使用自動(dòng)機(jī)械應(yīng)力檢測(cè)分析法(AMSA)測(cè)試本專(zhuān)利申請(qǐng)的酶變體。通過(guò)AMSA測(cè)試，能檢測(cè)大量小體積酶-洗滌劑溶液的洗滌性能。AMSA板具有多個(gè)用于測(cè)試溶液的狹槽，以及一個(gè)牢固擠住織物樣品以使其在所有狹槽開(kāi)口處被洗滌的封蓋。在洗滌期間，劇烈搖動(dòng)所述板、測(cè)試溶液、織物和封蓋以使得測(cè)試溶液接觸織物，并施加積4成應(yīng)力。更詳細(xì)的描述可參見(jiàn)WO02/42740,尤其是第23至24頁(yè)的段落"Specialmethodembodiments"。包含洗滌劑測(cè)試溶液的容器由在一個(gè)金屬^1中的圓柱形孔洞(直徑6mm,深10mm)組成。臟污的織物(測(cè)試物質(zhì))位于金屬板的頂部，用作在容器上的封蓋和密封件。另一個(gè)金屬板位于臟污織物的頂部以避免從任何一個(gè)容器溢出任何液體。兩個(gè)金屬板連同臟污織物一起以30Hz的頻率和2mm的振幅上下振動(dòng)。所述檢測(cè)分析法在下文指定的試驗(yàn)條件下進(jìn)行<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表3通過(guò)在50°C下混合5g(SantaMaria,Denmark)姜黃和100g(380/0脂肪，Aria,Denmark)霜膏來(lái)制備霜膏姜黃樣品，混合物在此溫度下保留約20分鐘并過(guò)濾(50。C)移除任何不溶解的顆粒?；旌衔锢鋮s至20°C，將棉紡樣品，EMPA221，浸入此霜膏姜黃混合物，然后在室溫下干燥過(guò)夜并冷凍直至使用。在2005年5月27日提交的專(zhuān)利申請(qǐng)PA200500775中公開(kāi)了霜膏姜黃樣品的制備方法。酶變體的性能可通過(guò)用具體酶變體洗滌的織物樣品的顏色亮度進(jìn)行測(cè)量。亮度也可用白光照明時(shí)從織物樣品反射的光強(qiáng)度表示。當(dāng)織物臟污時(shí)，其反射光的強(qiáng)度比清潔織物的反射光強(qiáng)度低。因此反射光的強(qiáng)度可用于測(cè)量酶變體的洗滌性能。使用一種專(zhuān)業(yè)的平面掃描器(PFUDL2400pro)進(jìn)行顏色測(cè)量，此掃描器用于獲取洗滌織物樣品的圖象。掃描分辨率為200dpi,輸出色深24位。為了獲得精確的結(jié)果，用Kodak反射IT8色卡頻繁校準(zhǔn)掃描儀。使用一個(gè)特別設(shè)計(jì)的應(yīng)用軟件(NovozymesColorVectorAnalyzer)來(lái)從掃描圖象中提取光強(qiáng)度值。所述程序從圖象中檢索24位像素值并將其轉(zhuǎn)化成紅、綠和藍(lán)(RGB)值。通過(guò)將RGB值相加作為載體，然后提取所得載體的長(zhǎng)度來(lái)計(jì)算強(qiáng)度值(Int):變體的洗滌性能(P)根據(jù)以下公式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>其中Int(v)是用測(cè)試酶洗滌的織物表面的光強(qiáng)度值，和Int(r)是不用測(cè)試酶洗滌的織物表面的光強(qiáng)度值。根據(jù)定義，規(guī)定相對(duì)性能得分是AMSA洗滌的結(jié)果相對(duì)性能得分(RP)是測(cè)試酶變體的性能(P)之和與參考酶性能的比值RP=P(測(cè)試酶)/P(參考酶)RPavg是指在所有四種酶濃度下(0.125，0.25,0.5,l.Omgep/l)與參考酶相比較的平均相對(duì)性能RPavg=avg(RP(0.125)，RP(0.25)RP(0.5),RP(l.O))如果變體性能優(yōu)于參考酶，則認(rèn)為它表現(xiàn)出改善的洗滌性能。在本發(fā)明的情況下，參考酶是序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的脂肪酶，它具有T231R+N233R的取代。實(shí)施例3:用于計(jì)算效險(xiǎn)的GC-氣相色譜-。通過(guò)固相微萃取氣相色譜法(SPME-GC),使用以下方法測(cè)量脂肪酶洗滌樣品中的丁酸釋放。將在包含lmg/L脂肪酶的表1指定溶液中洗滌的四個(gè)織物片(直徑5mm)轉(zhuǎn)移至氣相色譜(GC)瓶。在一個(gè)配有一個(gè)Stabilwax-DAw/Integra曙Guard柱(30m,0.32mm內(nèi)徑和0.25micro隱mdf)和一個(gè)CarboxenPDMSSPME纖維(75micro國(guó)m)的Varian3800GC上分析樣品。每個(gè)樣品在40°C預(yù)培養(yǎng)10分鐘，然后用SPME纖維在織物片上的頂部空間中取樣20分鐘。隨后將樣品注入色語(yǔ)柱(進(jìn)樣口溫度=250°(3)。柱流量=2mL氦/分鐘。柱溫箱溫度梯度0分鐘=40°C,2分鐘=40°C,22分鐘=240°C,32分鐘=240°C。用FID檢測(cè)器檢測(cè)丁酸，并基于丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算丁酸的量。脂肪酶變體的風(fēng)險(xiǎn)性能氣味(R)是從脂肪酶變體洗滌樣品釋放的丁酸與從序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的脂肪酶成熟部分洗滌樣品釋放的丁酸量之間的比率，兩個(gè)值都使用從無(wú)脂肪酶的洗滌樣品釋放的丁酸量進(jìn)行校正。根據(jù)以下公式計(jì)算變體的風(fēng)險(xiǎn)(R):氣味=lmg酶蛋白測(cè)得的微克丁酸/1空白校正ot測(cè)試酶=4測(cè)試酶-^自oc參考酶二14參考酶^自R=oc測(cè)試醉/cc參考醉如果一個(gè)變體的R系數(shù)小于1,即認(rèn)為它表現(xiàn)出比參考減少的氣味。實(shí)施例4:相對(duì)于在280nm的吸光度的活性(LU)通過(guò)以下4企測(cè)分析法LU/A280測(cè)定脂肪酶相對(duì)于在280nm的吸光度的活性使用阿拉伯樹(shù)膠作為乳化劑，乳化三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)來(lái)制備脂肪酶底物。然后在pH-恒定滴定試驗(yàn)中，在30°C,pH7或pH9條件下水解三丁酸甘油酯。一單位脂肪酶活性(1LU)相當(dāng)于能夠在pH7條件下，每分鐘釋放1微摩爾丁酸的酶量。測(cè)量純化脂肪酶在280nm的吸光度(A280)并計(jì)算LU/A280比率。變體的LU/A280除以參考酶的LU/A280來(lái)計(jì)算相對(duì)LU/A280。在本發(fā)明的情況下，參考酶是序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的成熟部分，它具有T231R和N233R的突變。實(shí)施例5:BR-效險(xiǎn)將描述性能與氣味減少風(fēng)險(xiǎn)比的效險(xiǎn)系數(shù)因此定義為BR=RPavg/R如果一個(gè)變體的BR系數(shù)高于1,即認(rèn)為它表現(xiàn)出改善的洗滌性能和減少的氣^^木。應(yīng)用以上方法獲得的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>WO2000/060063描述了表4中的參考脂肪酶和變體7和8。實(shí)施例6BR-效險(xiǎn)測(cè)量表5中列出的變體的效險(xiǎn)。用與實(shí)施例5中所述方法相同的方法測(cè)量效險(xiǎn)系數(shù)，所有列出的變體其效險(xiǎn)系數(shù)都大于1。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表5在WO2000/060063中描述了參考脂肪酶。洗滌劑實(shí)例用于實(shí)例的縮寫(xiě)組分的確認(rèn)如下所示:LAS直鏈C.13烷基笨磺酸鈉。CxyASC^-C^y烷基硫酸鈉CxyEzS與平均z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的Clx-Cly烷基硫酸鈉CxyEyClx-Cly醇，具有平均乙氧基化度zQASR2.N+(CH3)2(C2H4OH)，其中R2=C10-C12硅酸鹽無(wú)定形硅酸鈉(Si02:Na20的比率為1.6:1至3.2:1)。沸石A分子式為Na12(A102Si02)12.27H20的水合硅鋁酸鈉，具有0.1至10微米范圍內(nèi)的原生粒度(重量基于無(wú)水表述)。(Na-)SKS-6結(jié)晶層狀硅酸鹽，分子式為5-Na2Si205。檸檬酸鹽二水合檸檬酸三鈉檸檬酸無(wú)水檸檬酸。碳酸鹽無(wú)水碳酸鈉。好u酸鹽無(wú)水辟u(mài)酸鈉。MA/AA4:1丙烯酸酯/馬來(lái)酸酯的無(wú)》見(jiàn)共聚物，平均分子量為約70,000至80,000。AA聚合物聚丙烯酸鈉聚合物，平均分子量為約4，500。PB1/PB4無(wú)水過(guò)硼酸鈉一水合物/四水合物。PC3無(wú)水過(guò)碳酸鈉[2.74Na2C03.3H202]TAED四乙?；叶?。NOBS壬酰羥苯-黃酸鈉。DTPA亞乙基三胺五醋酸。HEDP羥乙烷二膦酸鹽EDDS1,2-乙二胺-N,N'-二琥珀酸的鈉鹽，(S,S)異構(gòu)體STPP三聚磷酸鈉蛋白酶蛋白分解酶，以商品名Savinase、Alcalase、Everlase、Coronase、Polarzyme售自NovozymesA/S,以商品名Properase、Purafect、PurafectMA和PurafectOx售自Genencor，以及在專(zhuān)利WO91/06637和/或WO95/10591和/或EP0251446中描迷的蛋白酶諸如FNA、FN3和/或FN4。淀粉酶以商品名Purastar、Purafect0xam售自Genencor;Termamyl、FungamylDuramyl、Stainzyme和Natalase售自NovozymesA/S的淀粉分解酶。脂肪酶在表2的實(shí)例5中描述了脂肪酶變體1至5中的任何一種、以及它們的組合。甘露聚糖酶售自Novozymes的MannawayCMC或HEC羧曱基或羥基乙基或酯改性的纖維素或EMCSS附聚物抑泡劑附聚物12%硅氧烷/二氧化硅，18%硬脂醇，70%淀粉，為顆粒形式。TEPAE四亞乙基五胺乙氧基化物PH值20°C時(shí)在1%的蒸餾水溶液中測(cè)定。實(shí)施例A由下列制劑舉例說(shuō)明具有顆粒狀衣物洗滌劑形式的漂白洗滌劑組合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>在25°C下，實(shí)例A中用于洗滌織物的任何組合物在水中的濃度為600ppm至lOOOOppm,典型的中間條件為2500ppm，并且水與織物的比率為25:1。典型的pH為約10,但可通過(guò)改變酸與烷基笨石黃酸的鈉鹽形式的比例來(lái)調(diào)節(jié)pH。實(shí)施例B由下列制劑舉例說(shuō)明具有顆粒狀衣物洗滌劑形式的漂白洗滌劑組合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>在20。C至90。C下，實(shí)例B中用于洗滌織物的任何上述組合物在水中的濃度為10,000ppm，并且水與織物的比率為5:1。典型的pH為約10，但可通過(guò)改變酸與烷基苯磺酸的鈉鹽形式的比例來(lái)調(diào)節(jié)pH。實(shí)施例C<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*以mg酶/100g計(jì)的凄W直!如US4,597,898中所述。2以商品名LUTENSIT購(gòu)自BASF,以及如WO01/05874中所述的那些在發(fā)明詳述中引用的所有文件都在相關(guān)部分中引入以供參考；對(duì)于任何文件的引用不應(yīng)當(dāng)解釋為承認(rèn)其是有關(guān)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。當(dāng)本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)的任何含義或定義與引入以供參考的文件中術(shù)語(yǔ)的任何含義或定義矛盾時(shí)，應(yīng)當(dāng)服從在本發(fā)明中賦予該術(shù)語(yǔ)的含義或定義。雖然已經(jīng)舉例說(shuō)明和描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的情況下可以做出多個(gè)其他改變和變型。因此，權(quán)利要求書(shū)意欲包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這樣的改變和變型。權(quán)利要求1.一種洗滌劑組合物，所述組合物包含洗滌劑成分和多肽，所述多肽具有脂肪酶活性，并且在所述說(shuō)明書(shū)中給定的測(cè)試條件下還具有至少0.8的平均相對(duì)性能和至少1.1的效險(xiǎn)。2.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽在所述說(shuō)明書(shū)的給定測(cè)試條件下具有小于1.00的相對(duì)LU/A280。3.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是細(xì)菌多肽。4.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是真菌多肽。5.如權(quán)利要求4所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是嗜熱真菌屬多肽。6.如權(quán)利要求5所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是嗜熱真菌多肽。7.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是包含在序列標(biāo)識(shí)號(hào)2中的脂肪酶的變體。8.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是包含在序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的多肽的成熟部分中的脂肪酶的變體。9.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是包含序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的脂肪酶的變體。10.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是包含序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的多肽的成熟部分的脂肪酶的變體。11.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽由多核普酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的644至732核普酸或其互補(bǔ)鏈雜交。12.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑成分是0.1%至40%,優(yōu)選0.1%至12%的陰離子表面活性劑。13.如權(quán)利要求12所述的洗滌劑組合物，其中所述陰離子表面活性劑是烷氧基化的烷基硫酸鹽。14.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑成分是5%至30%的硅鋁酸鹽和/或磷酸鹽助洗劑。15.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑成分是過(guò)氧化物源和漂白活化劑，優(yōu)選地四乙?；叶贰?6.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑，其中所述洗滌劑是液體洗滌劑組合物或固體洗滌劑組合物。17.如權(quán)利要求16所述的洗滌劑，其中所述洗滌劑是顆粒狀洗滌劑組合物。18.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑，其中所述洗滌劑是固體片劑或用可溶性膜包封的液體的單位劑量組合物。19.一種洗滌方法，所述方法包括在包含如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物的水溶液中洗滌紡織品。20.如權(quán)利要求19所述的洗滌方法，其中所述方法包括以下步驟(a)任選地用權(quán)利要求1的組合物預(yù)處理所述污垢和污漬以形成-波任選地預(yù)處理過(guò)的表面；(b)將有效量的權(quán)利要求1的組合物加入到水中，以形成包含約500至約10000ppm的所述組合物的洗滌水溶液；(c)使所述洗滌水溶液與被任選地預(yù)處理過(guò)的表面接觸，和拌。'。、:、'、、曰、21.如權(quán)利要求19所述的洗滌方法，其中所述水溶液的溫度低于30°C。全文摘要本發(fā)明涉及包含洗滌劑成分和具體脂肪酶變體的洗滌劑組合物，所述脂肪酶變體趨于產(chǎn)生減少的氣味并且與親本脂肪酶相比具有更好的相對(duì)性能。文檔編號(hào)C11D3/386GK101374935SQ200780003343公開(kāi)日2009年2月25日申請(qǐng)日期2007年1月22日優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日發(fā)明者A·斯文森,J·A·伯迪斯,J·溫德,K·博奇,M·米克爾森,N·J·蘭特,P·F·蘇特申請(qǐng)人:寶潔公司