專利名稱：微生物油脂分離提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程下游過程中目標產(chǎn)物的分離工藝，特別是涉及到一 種微生物油脂的提取方法。
技術(shù)背景微生物油脂，是由某些微生物，如酵母菌，霉菌，藻類等在一定的條件下將 過量的碳水化合物轉(zhuǎn)化為甘油酯并貯存在菌體細胞內(nèi)，有的千菌體含油量能高達60%以上。大部分微生物油脂的脂肪酸組成和常見的植物油脂如菜籽油、大豆油、 棕櫚油等相似，主要含有棕櫚酸，硬脂酸，油酸和多不飽和脂肪酸等，可以在一 定程度上彌補動植物油脂的不足，緩解油脂市場呈現(xiàn)出的供不應(yīng)求的趨勢，為油 脂的來源開辟一條新道路。微生物油脂存在于細胞內(nèi)，屬于胞內(nèi)產(chǎn)物，只有采用適當?shù)姆椒▽ξ⑸锛?胞進行初步破碎，才有利于油脂的提取，如專利02121302.X中采用球磨機破碎 細胞，然后雙水相萃取分離胞內(nèi)目標產(chǎn)物。目前微生物油脂的制取工業(yè)上采用的 方法主要是將濕菌體從發(fā)酵液中分離出來后進行干燥、研磨破碎，然后對菌體粉 末造粒并選用合適的溶劑對油脂進行浸提，該法步驟復雜，能耗較大，從而使得 油脂的生產(chǎn)成本加大。如果對發(fā)酵液中菌體直接進行細胞破碎將有助于簡化工藝流程，降低成本。 用于微生物油脂細胞破碎的方法主要有酸熱法，超聲波破碎和凍融法。酸熱法處 理菌體主要是利用鹽酸對細胞中的糖及蛋白質(zhì)等成分的作用，疏松細胞的結(jié)構(gòu)， 再經(jīng)過沸水、冷凍處理，使細胞達到破碎的效果，破碎細胞油脂得率較高，但會 相應(yīng)生成大量的酸性廢水，污染較為嚴重；超聲波法破碎細胞是利用超聲波產(chǎn)生 獨特的機械振動作用，使細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使細胞破碎。其油脂得率略低 于酸熱法，且在較長時間超聲波作用下產(chǎn)生熱量，使部分油脂進行了分解反應(yīng)， 不利于油脂的提取，目前普遍適用于實驗室。凍融法是通過溫度的突然變化，細 胞在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹破碎，以達到使細胞破碎的 目的。在反復凍融過程中，由于耗時較長，部分酵母細胞產(chǎn)生了自溶使油脂含量 減少，油脂得率較差。除上述方法之外，專利00116051.6還公開了一種從發(fā)酵 液體中分離出菌體，進行干燥、蒸炒、壓榨制取微生物油脂的方法，專利 03139630.5中采用超臨界二氧化碳技術(shù)直接從海藻細胞中萃取分離出微生物油 脂，其周期短，產(chǎn)品品質(zhì)較好。鑒于上述問題，選擇一種處理量大，效率高，且油脂得率理想的細胞破碎技 術(shù)以便于油脂的提取是當前亟待解決的問題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于解決已有技術(shù)中生產(chǎn)過程復雜，能耗高，污染較大以及油 脂得率低等問題，利用將發(fā)酵液濃縮結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)進行細胞破碎，然后采用 兩次萃取收集所含油脂，并相應(yīng)獲得菌體蛋白。本發(fā)明所提供一種微生物油脂分離提取方法，包括如下操作步驟(1) 將微生物菌種接種發(fā)酵；(2) 將所得發(fā)酵液經(jīng)濃縮過程去除發(fā)酵液中45%-55%的水份得到濃縮發(fā)酵液；(3) 然后將濃縮發(fā)酵液通入壓力為70-130MPa的高壓均質(zhì)機中破碎細胞；(4) 加入萃取溶劑，二次浸提，萃取分離收集上層有機溶劑相得混合油；(5) 最后蒸發(fā)回收混合油中的溶劑得到微生物油脂。本發(fā)明上述微生物油脂分離提取過程中，首先選擇微生物菌種，經(jīng)過一、二 級種子培養(yǎng)過程后，接種于發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束后添加吸水劑 5A型分子篩在攪拌下吸收去除發(fā)酵液中45%-55%的水分，提高了菌體的濃度， 從而將設(shè)備的利用效率提高了一倍，通過靜置可以將吸水后的分子篩與菌種分 離，得到濃縮發(fā)酵液，同時避免了干燥等過程所需能耗；再將濃縮發(fā)酵液通入高 壓均質(zhì)機中進行細胞破碎釋放出胞內(nèi)所含油脂，高壓均質(zhì)機工作壓力為 70-130MPa，濃縮發(fā)酵液流量為0.01mVh，根據(jù)破碎情況確定處理次數(shù)，至少處 理2次，保證80%以上的細胞破碎效率；高壓均質(zhì)技術(shù)是以高壓往復泵為動力傳 遞及物料輸送機構(gòu)，將物料輸送至工作閥部分，待處理物料在通過工作閥的過程 中，在高壓下產(chǎn)生強烈的剪切、撞擊和空穴作用，從而使物料得到超微細化。細 胞破碎后，選擇正己烷(也可選擇其它溶劑，如輕汽油或石油醚等，其萃取溫度 選擇低于溶劑沸點5-10。C)作為萃取溶劑，在單口燒瓶中按照lml/g發(fā)酵液的比 例加入正己烷溶劑，在55C下磁力加熱攪拌裝置上浸出lh，結(jié)束后對萃取液進 行離心分離，收集上層的有機溶劑相，并回收菌體在相同的條件下進行二次浸提， 將兩次所得上層溶液合并得混合油，相應(yīng)獲得菌體殘渣，可作為蛋白飼料；最后 將混合油通過蒸發(fā)回收其中的溶劑，最終得到目的產(chǎn)物——微生物油脂，同時回 收的溶劑可重復利用。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在以下幾個方面1、 與現(xiàn)有的微生物油脂提取工藝相比，該方法無需對發(fā)酵液中菌體進行分 離、干燥、粉碎及造粒，直接將發(fā)酵所得產(chǎn)物破碎后再進行溶劑浸提，油脂得率 較高，操作簡便，簡化了工藝步驟，有助于工業(yè)生產(chǎn)中降低加工成本。2、 本發(fā)明將發(fā)酵液進行濃縮去水后再進行高壓均質(zhì)，使設(shè)備的利用效率提 高了一倍，靜置可將分子篩分離出來，避免了干燥等過程所需能耗，分子篩經(jīng)晾 曬可重復使用。3、 本發(fā)明除了適用于微生物油脂的提取外，其它非極性胞內(nèi)產(chǎn)物也可以用 該法破碎并進行分離，應(yīng)用范圍較廣。


圖l是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施方式
實施例1以土生假絲酵母菌作為出發(fā)菌種，依次按照下列步驟進行操作A、 首先在搖瓶中進行二級種子液的制備，然后將制備好的種子液接種于 裝有培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L， 葡萄糖70g/L，在pH5.6， 30°C,通氧狀況下以250r/min的攪拌速度培養(yǎng)7天， 最終獲得所需發(fā)酵液，其中生物量為100g/Kg發(fā)酵液，含0.475g油脂/g干菌體；B、 在發(fā)酵液中添加2.5Kg/Kg發(fā)酵液的5A型分子篩(天津市大茂化學試 劑廠)，攪拌狀態(tài)下去除發(fā)酵液中50%的水分以提高菌體的濃度，靜置分離出分 子篩，經(jīng)晾曬后可重復使用；C、 起動高壓均質(zhì)機(NS3015H，意大利NiroSoavi公司)主電機，緩慢旋 動二級調(diào)壓手柄，使其最終均質(zhì)壓力為130Mpa，將1L混合均勻的濃縮發(fā)酵液 以O(shè).OlmVh的流量連續(xù)加入高壓均質(zhì)機中進行細胞破碎，并且循環(huán)處理3次；D、 選擇正己垸作為萃取溶劑，將20g均質(zhì)發(fā)酵液加入單口燒瓶中，按照 lml/g發(fā)酵液的比例加入溶劑，在55t:下磁力加熱攪拌裝置上浸出lh，結(jié)束后對 其進行離心分離，收集上層的有機溶劑相，并回收菌休在相同的條件下進行二次 浸提，將兩次所得上層溶液合并得混合油；E、在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS-2，上海亞榮生化儀器廠)中回收混合油中的溶 劑，得到油脂1.8g，油脂得率為94.7%。 實施例2以土生假絲酵母菌作為出發(fā)菌種，依次按照下列步驟進行操作A、 首先在搖瓶中進行二級種子液的制備，然后將制備好的種子液接種于裝 有培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡 萄糖70g/L，在pH5.6， 3CTC，通氧狀況卩以250r/min的攪拌速度培養(yǎng)7天，最 終獲得所需發(fā)酵液，其中生物量為100g/Kg發(fā)酵液，含0.475g油脂/g干菌體；B、 在發(fā)酵液中添加2.5Kg/Kg發(fā)酵液的5A型分子篩，攪拌狀態(tài)下吸收濃縮 去除發(fā)酵液中50%的水分以提高菌體的濃度，靜置分離出分子篩，經(jīng)晾曬后可重 復使用；C、 起動均質(zhì)機主電機，緩慢旋動—級調(diào)壓手柄，使其最終均質(zhì)壓力為 130MPa，將1L混合均勻的濃縮發(fā)酵液以O(shè).OlmVh的流量連續(xù)加入高壓均質(zhì)機中 進行細胞破碎，并且循環(huán)處理2次；D、 選擇正己烷作為萃取溶劑，將20g均質(zhì)發(fā)酵液加入單口燒瓶中，按照lml/g 發(fā)酵液的比例加入溶劑，在55。C下磁力加熱攪拌裝置上浸出lh，結(jié)束后對其進 行離心分離，收集上層的有機溶劑相，并回收菌體在相同的條件下進行二次浸提， 將兩次所得上層溶液合并得混合油；E、在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收混合油中的溶劑，得到油脂1.7g，油脂得率為89.5 %，比實施例1中DOMPa、處理3次的效果相比，得率偏低。 實施例3以土生假絲酵母菌作為出發(fā)菌種，依次按照下列步驟進行操作A、 首先在搖瓶中進行二級種子液的制備，然后將制備好的種子液接種于裝 有培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡 萄糖70g/L，在pH5.6， 3(TC，通氧狀況下以250r/min的攪拌速度培養(yǎng)7天，最 終獲得所需發(fā)酵液，其中生物量為100g/Kg發(fā)酵液，含0.475g油脂/g干菌體；B、 在發(fā)酵液中添加2.5Kg/Kg發(fā)酵液的5A型分子篩，攪拌狀態(tài)下吸收濃縮 去除發(fā)酵液中50%的水分以提高菌體的濃度，靜置分離出分子篩，經(jīng)晾曬后可重 復使用；C、 起動均質(zhì)機主電機，緩慢旋動二級調(diào)壓手柄，使其最終均質(zhì)壓力為 80MPa，將1L混合均勻的濃縮發(fā)酵液以0.01m3/h的流量連續(xù)加入高壓均質(zhì)機中 進行細胞破碎，并且循環(huán)處理3次；D、 選擇正己烷作為萃取溶劑，將20g均質(zhì)發(fā)酵液加入單口燒瓶中，按照lml/g 發(fā)酵液的比例加入溶劑，在55。C下磁力加熱攪拌裝置上浸出lh，結(jié)束后對其進 行離心分離，收集上層的有機溶劑相，并回收菌體在相同的條件下進行二次浸提， 將兩次所得上層溶液合并得混合油；E、 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收混合油中的溶劑，得到油脂1.52g，油脂得率為80.0 %，與實施例1中130MPa的工作壓力相比，效果相對較差。實施例4以土生假絲酵母菌作為出發(fā)菌種，依次按照下列步驟進行操作-A、 首先在搖瓶中進行二級種子液的制備，然后將制備好的種子液接種于裝 有培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡 萄糖70g/L，在pH5.6， 3(TC，通氧狀況下以250r/min的攪拌速度培養(yǎng)7天，最 終獲得所需發(fā)酵液，其中生物量為100g/Kg發(fā)酵液，含0.475g油脂/g千菌體-,B、 在發(fā)酵液中添加2.5Kg/Kg發(fā)酵液的5A型分子篩，攪拌狀態(tài)下吸收濃縮 去除發(fā)酵液中50%的水分以提高菌體的濃度，靜置分離出分子篩，經(jīng)晾曬后可重 復使用；C、 起動均質(zhì)機主電機，緩慢旋動二級調(diào)壓手柄，使其最終均質(zhì)壓力為 80MPa，將1L混合均勻的濃縮發(fā)酵液以0.01m3/h的流量連續(xù)加入高壓均質(zhì)機中 進行細胞破碎，并且循環(huán)處理2次；D、 選擇正己烷作為萃取溶劑，將20g均質(zhì)發(fā)酵液加入單口燒瓶中，按照lml/g 發(fā)酵液的比例加入溶劑，在55。C下磁力加熱攪拌裝置上浸出lh，結(jié)束后對其進 行離心分離，收集上層的有機溶劑相，并回收菌體在相同的條件下進行二次浸提， 將兩次所得上層溶液合并得混合油；E、 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收混合油中的溶劑，得到油脂1.4g，油脂得率為73.7%，與實施例3中處理3次相比，得率較低。 實施例5以土生假絲酵母菌作為出發(fā)菌種，依次按照下列步驟進行操作A、 首先在搖瓶中進行二級種子液的制備，然后將制備好的種子液接種于裝 有培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡 萄糖70g/L，在pH5.6， 30°C，通氧狀況下以250r/min的攪拌速度培養(yǎng)7天，最 終獲得所需發(fā)酵液，其中生物量為100g/Kg發(fā)酵液，含0.475g油脂/g干菌體；B、 在發(fā)酵液中添加2.5Kg/Kg發(fā)酵液的5A型分子篩，攪拌狀態(tài)下吸收濃縮 去除發(fā)酵液中50%的水分以提高菌體的濃度，靜置分離出分子篩，經(jīng)晾曬后可重復使用； 一C、 起動均質(zhì)機主電機，緩慢旋動二級調(diào)壓手柄，使其最終均質(zhì)壓力為70Mpa， 將1L混合均勻的濃縮發(fā)酵液以0.01m3/h的流量連續(xù)加入高壓均質(zhì)機中進行細胞 破碎，并且循環(huán)處理3次；D、 選擇正己烷作為萃取溶劑，將20g均質(zhì)發(fā)酵液加入單口燒瓶中，按照lml/g 發(fā)酵液的比例加入溶劑，在55。C下磁力加熱攪拌裝置上浸出lh，結(jié)束后對其進 行離心分離，收集上層的有機溶劑相，并回收菌體在相同的條件下進行二次浸提， 將兩次所得上層溶液合并得混合油；E、 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收混合油中的溶劑，得到油脂1.33g，油脂得率為70.0 %，與實施例3中80MPa工作壓力相比，結(jié)果較差。實施例6:以黏紅酵母作為出發(fā)菌種，依次按照下列步驟進行操作A、 首先在搖瓶中進行二級種子液的制備，然后將制備好的種子液接種于裝 有培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉15g/L,蛋白胨15g/L，葡 萄糖70g/L，在pH5.6， 30°C，通氧狀況下以250r/min的攪拌速度培養(yǎng)7天，最 終獲得所需發(fā)酵液，其中生物量為105g/Kg發(fā)酵液，含0.58g油脂/g干菌體；B、 在發(fā)酵液中添加2.5Kg/ Kg發(fā)酵液的5A型分子篩，攪拌狀態(tài)下吸收濃縮 去除發(fā)酵液中50%的水分以提高菌體的濃度，靜置分離出分子篩，經(jīng)晾曬后可重 復使用；C、 起動均質(zhì)機主電機，緩慢旋動二級調(diào)壓手柄，使其最終均質(zhì)壓力為 130MPa，將1L混合均勻的濃縮發(fā)酵液以0.01m3/h的流量連續(xù)加入高壓均質(zhì)機中 進行細胞破碎，并且循環(huán)處理3次；D、 選擇正己烷作為萃取溶劑，將20g均質(zhì)發(fā)酵液加入單口燒瓶中，按照lml/g 發(fā)酵液的比例加入溶劑，在55。C下磁力加熱攪拌裝置上浸出lh，結(jié)束后對其進 行離心分離，收集上層的有機溶劑相，并回收菌體在相同的條件下進行二次浸提， 將兩次所得上層溶液合并得混合油；E、 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收混合油中的溶劑，得到油脂2.3g，油脂得率為94.8 %，與土生假絲酵母菌在同樣條件下所得結(jié)果相比，效果幾乎一樣。權(quán)利要求
1、一種微生物油脂分離提取方法，其特征是包括如下步驟(1)將微生物菌種接種發(fā)酵；(2)將所得發(fā)酵液經(jīng)濃縮過程去除發(fā)酵液中45％-55％的水分得到濃縮發(fā)酵液；(3)將濃縮發(fā)酵液通入壓力為70-130MPa的高壓均質(zhì)機中破碎細胞；(4)加入萃取溶劑，二次浸提，萃取分離收集上層有機溶劑相得混合油；(5)最后蒸發(fā)回收混合油中的溶劑得到微生物油脂。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述去水濃 縮過程是將吸水劑5A型分子篩置于發(fā)酵液中，濃縮去除發(fā)酵液中的水分，然后 將吸水后的分子篩與菌體分離。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述發(fā)酵液 添加吸水劑5A分子篩在攪拌狀態(tài)下濃縮去除發(fā)酵液50%的水分。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述高壓均 質(zhì)機工作壓力為80MPa。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述高壓均 質(zhì)機工作壓力為130MPa。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的微生物油脂分離提取方法，其 特征是所述濃縮發(fā)酵液以流量0.01m3/h通入高壓均質(zhì)機，至少處理2次。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述萃取溶 劑是正己烷或輕汽油或石油醚。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述萃取溶 劑的萃取溫度選擇低于溶劑沸點5-l(TC。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述萃取溶 劑為正己垸按照lml/g發(fā)酵液的比例加入，在55。C下磁力加熱攪拌裝置上浸出 lh。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂分離提取方法，其特征是所述將微 生物菌種接種發(fā)酵是指在搖瓶屮進行二級種子液的制備，然后將制備好的種子液 接種于裝有培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉15g/L，蛋白胨 15g/L，葡萄糖70g/L，在pH5.6， 30°C;通氧狀況下以250r/min的攪拌速度培養(yǎng) 7天，最終獲得所需發(fā)酵液。
全文摘要
一種微生物油脂分離提取方法，包括如下步驟(1)將微生物菌種接種發(fā)酵；(2)將所得發(fā)酵液經(jīng)濃縮過程去除發(fā)酵液中45％-55％的水分得到濃縮發(fā)酵液；(3)將濃縮發(fā)酵液通入壓力為70-130MPa的高壓均質(zhì)機中破碎細胞；(4)加入萃取溶劑，二次浸提，萃取分離收集上層有機溶劑相得混合油；(5)最后蒸發(fā)回收混合油中的溶劑得到微生物油脂。它是將發(fā)酵液濃縮結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)進行細胞破碎，然后采用兩次萃取收集所含油脂，并相應(yīng)獲得菌體蛋白。該過程改進了原有的需經(jīng)過菌體分離、干燥、粉碎、造粒等步驟，大大簡化了工藝，提高了效率，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明將發(fā)酵液進行濃縮后再進行高壓均質(zhì)，提高了設(shè)備的利用效率，降低了能耗。
文檔編號C11B1/00GK101323865SQ200810138499
公開日2008年12月17日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者立 孫, 杰 張, 張曉東, 巖 李, 許海朋 申請人:山東省科學院能源研究所