專利名稱：具有增強的熱穩(wěn)定性和/或減少的鈣依賴性的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的變體的制作方法
具有增強的熱穩(wěn)定性和/或減少的鈣依賴性的地衣芽孢桿
菌Ct -淀粉酶的變體序列表同時附有序列表，該序列表包含SEQ ID NOS :1_6，在此以其整體引入作為參考。 發(fā)明領域公開了核酸和其編碼的多肽。所述多肽具有α-淀粉酶活性，其中的多肽是芽孢 桿菌α -淀粉酶(特別是地衣芽孢桿菌α _淀粉酶)的修飾形式，并且與所述的親本α -淀 粉酶相比，該多肽在至少一種下述性質(zhì)中顯示出改變底物特異性、底物結合、底物切割模 式、熱穩(wěn)定性、PH活性譜、ρΗ穩(wěn)定性譜、氧化穩(wěn)定性、鈣離子依賴性、減少和增加的pi和改善 的清洗表現(xiàn)、比活性、如高溫和/或低PH條件下，尤其是低鈣濃度下的穩(wěn)定性。此處描述的多肽適用于淀粉加工、乙醇生產(chǎn)、洗滌劑開發(fā)、餐具(dish)洗滌、硬表 面清潔、織物脫漿和/或甜味劑生產(chǎn)。背景淀粉由直鏈淀粉(15-30% w/w)和支鏈淀粉(70-85% w/w)的混合物組成。直鏈 淀粉由α-1，4-連接的葡萄糖單元的線性鏈組成，分子量(MW)大約在60000到800000。支 鏈淀粉是含有相同的α-1，4_連接的葡萄糖單元以及每24-30個葡萄糖單元α_1，6分支 點的分支多聚體，其分子量可高達1億。來自淀粉的濃縮葡萄糖漿形式的糖，目前是以酶催化的方法生產(chǎn)，該方法包含(1) 用α “淀粉酶將固態(tài)淀粉液化(或減薄)成平均聚合程度約為7-10的糊精；和(2)用淀粉 葡糖苷酶(又稱葡糖淀粉酶)將所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖漿有高 的葡萄糖含量。許多商業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖漿隨后用酶進行異構化，成為稱作異構糖漿的葡萄 糖/果糖混合物。α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 1)通過隨機切割內(nèi)部的α-1，4_糖苷鍵來水解淀粉、糖原 和相關的多糖。這些酶有一些重要的商業(yè)應用，包括淀粉液化、織物脫漿、紙和紙漿工業(yè)中 的淀粉改性、谷物加工、烘焙和釀造。α-淀粉酶也可使用在自動餐具清洗洗滌劑和洗衣用 洗滌劑制劑(包含含有漂白劑的洗滌劑)里，用于在清洗中去除淀粉污漬。α -淀粉酶可從品種多樣的細菌、真菌、植物和動物來源中分離出來。許多工業(yè)上 很重要的α-淀粉酶分離自芽孢桿菌屬物種(例如地衣芽孢桿菌)，其部分原因是芽孢桿菌 具有很強的將淀粉酶分泌到培養(yǎng)基中的能力。雖然地衣芽孢桿菌α-淀粉酶可以經(jīng)濟地生 產(chǎn)出來，但是在一些應用中這種酶并不像其他α-淀粉酶那樣表現(xiàn)良好，即使地衣芽孢桿 菌α-淀粉酶跟這些α-淀粉酶有顯著的結構同源性。近年來已經(jīng)有一些嘗試，去構建在 特定用途(如淀粉液化和織物脫漿中)有改善性質(zhì)的α-淀粉酶變體。工業(yè)中存在對可應用在包括商業(yè)液化過程等多種用途中的淀粉酶進行鑒定和優(yōu) 化的需要。與如來自地衣芽孢桿菌的工業(yè)標準酶相比，這些第二代酸性淀粉酶將提供改 善的生產(chǎn)和/或性能特征。因此，仍存在對α-淀粉酶變體的需要，該變體與相應的親本 α-淀粉酶(即未突變的α-淀粉酶)相比，具有α-淀粉酶活性，并且在至少一種上面提到的性質(zhì)中，顯示出相對于所述親本α -淀粉酶的改變。概述一方面考慮親本地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的變體，其中該變體具有與SEQ ID NO 4有至少約90%序列同一性的氨基酸序列，并包含與SEQ IDNO :4相應的S239的替換，并且 其中所述的變體顯示出α-淀粉酶活性。該變體可包含SEQ ID NO :2，備選地，該變體可基 本上由SEQ ID NO :2組成或由SEQ ID Ν0:2組成。該變體可以是S239Q或S239A任意一種 的S239替換。另一方面考慮一種變體，該變體與SEQ ID NO :4至少有約95%的序列同一 性或至少有約98%的序列同一性。另一方面考慮與SEQ ID Ν0:4的α -淀粉酶相比，具有改變的熔點的變體。備選地，考慮的變體可不需要額外的鈣。另一方面考慮分離的核酸，該核酸編碼親本地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，其 中所述的變體有與SEQ ID NO :4相應的S239的替換，并且與SEQ ID NO :4有至少約90%的 序列同一性，并且其中所述的變體顯示出α-淀粉酶活性。分離的核酸可包含SEQ ID NO 2，或者是編碼任意一種前面和此處討論的變體的核酸。另一方面考慮載體，該載體含有以 有效連接形式的核酸。在另外的方面，考慮核酸在宿主細胞里，可能在宿主細胞里包含所述 核酸的載體中。宿主細胞可以是細菌或真菌。細菌可以是革蘭氏陽性細菌，其選自枯草芽孢 桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀 粉芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌 和鼠灰鏈霉菌；或者革蘭氏陰性細菌，其中所述的革蘭氏陰性細菌是大腸桿菌和假單胞菌。另一方面考慮用于液化淀粉的組合物，該組合物包含以上或此處討論的變體，其 中所述的組合物在溶液中。另外的實施方案考慮液化淀粉的方法，該方法包含向研磨的玉 米或淀粉漿中施用組合物，維持足夠液化所述淀粉的時間?？梢砸?0-60 μ g/g干固體向研 磨的玉米或淀粉漿添加該組合物。淀粉溶液可以是玉米淀粉溶液。另外的方面考慮在約 85°C到約105°C下液化淀粉漿。備選地或附加地，在約pH 4. 5到約pH 6. 5下液化淀粉漿。 液化物可進一步發(fā)酵來生產(chǎn)乙醇。另外考慮的是發(fā)酵步驟至少比野生型多產(chǎn)生約2. 5% ν/ ν的乙醇。另外，與商業(yè)相關地，所述液化和所述發(fā)酵步驟可在同一反應容器中同時進行。 這可在存在鈣的情況下進行，但也可以在不向反應混合物中添加額外鈣的情況下進行。另一方面，考慮使用任意一種前面或此處討論的變體來糖化淀粉的組合物。糖化 淀粉的方法考慮施用含有變體的組合物，維持足夠糖化所述淀粉的時間。不必須添加額外 的鈣。另一方面考慮洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑可包含以上或此處討論的變 體。洗滌劑添加劑可另外包含酶，該酶選自纖維素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、 羧肽酶、過氧化氫酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、 α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過 氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶 (pectinolyticenzyme)、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核 糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶和角叉菜膠酶或其組合。洗滌劑 添加劑還可以以非粉化顆粒、微粒、穩(wěn)定化液體或受保護酶的形式存在。另一方面考慮洗滌劑組合物(用于清潔表面、洗衣和餐具清洗)?？紤]的洗滌劑組合物可包含以上和此處討論的洗滌劑添加劑。其還可包含一種或多種酶，這些酶選自纖維 素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡聚糖 轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷 酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 氧化酶、果膠分解酶(pectinolytic enzyme)、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧 化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶和角叉菜 膠酶或其組合。洗滌劑組合物可以進一步以上面任意組合包含表面活性劑。洗滌劑組合物 還可包含一種或多種表面活性劑、洗滌劑助洗劑、絡合劑、聚合物、漂白系統(tǒng)、穩(wěn)定劑、起泡 劑、抑泡劑、防蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染料、殺菌劑、水溶助長劑、明亮劑、織物 柔順劑(fabric conditioner)和香料。另一個考慮的方面是水溶液中的織物脫漿組合物，該組合物包含以上或此處討論 的變體，任選地，包含另一種酶。同時考慮的是將織物脫漿的方法，該方法包括施用脫漿組 合物，維持足夠使所述織物脫漿的時間。該方法不需要加入額外的鈣。另外考慮的方面是包含以上或此處討論的變體的淀粉加工組合物。淀粉加工組合 物還可包含葡糖淀粉酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、植酸酶或其組合?？衫玫矸奂庸そM合物 來加工淀粉，可通過施用組合物足夠時間以加工所述淀粉。不需要加入額外的鈣。另外的方面考慮烘焙組合物，該組合物包含以上或此處描述的變體。另一個方面 考慮使用所述組合物的烘焙方法，該方法包括施用烘焙組合物。附圖簡述引入附圖并且其構成本說明書的部分，圖解實施方案。圖中

圖1描述用于產(chǎn)生LAT S239變體的質(zhì)粒pHPLT_LAT。圖2描述在95°C 30分鐘的熱脅迫后LAT S239變體的百分比殘留活性。垂直軸 代表熱脅迫后的殘留活性百分比。虛線代表野生型LAT現(xiàn)有殘留活性標準差以上的2X和 3X。S239Q和S239A變體都顯示出相對于野生型LAT增強的熱穩(wěn)定性。觀察到的熱穩(wěn)定性 增強是統(tǒng)計學上顯著的。圖3描述緩沖液中與親本野生型LAT相比較的LAT S239Q變體的殘留活性。通過 將百分比剩余淀粉酶活性對反應時間和反應PH作圖，來產(chǎn)生該圖。參考實施例3。圖4描述與底物中親本野生型LAT相比較的LAT S239Q變體的殘留活性。通過將 百分比剩余淀粉酶活性對反應時間和反應PH作圖，來產(chǎn)生該圖。參考實施例3。圖5描述與親本野生型LAT相比較的LAT S239Q變體的pH譜。通過將百分比剩 余淀粉酶活性對反應PH作圖來產(chǎn)生該圖。參考實施例3。圖6描述與野生型LAT相比較的LAT S239Q變體的溫度譜。通過將全部還原糖 (作為淀粉酶反應的產(chǎn)物)對反應溫度作圖來產(chǎn)生該圖。參考實施例3。圖7描述108°C和115°C下，與使用Fred相比，使用LAT S239Q變體處理的全研磨 玉米的DE進展。通過將觀察到的DE值對二次液化時間作圖來產(chǎn)生該圖。參考實施例6。圖8描述多種pH下，與使用Fred相比，使用LAT S239Q變體來處理全研磨玉米的 DE進展。通過將觀察到的DE值對二次液化時間作圖來產(chǎn)生該圖。參考實施例6。圖9描述pH5. 6和低鈣條件下，與使用Fred相比，使用LAT S239Q變體來處理全 研磨玉米的DE進展。通過將觀察到的DE值對二次液化時間作圖來產(chǎn)生該圖。參考實施例6。詳述1.定義和縮寫根據(jù)這一詳述，應用以下縮寫和定義。應該注意，如此處所用，除非另有明文說明， 單數(shù)形式包含復數(shù)指代。所以，例如，提及“多肽”包含多種多肽，同時，提及“制劑”包含提 及一種或多種制劑和其中本領域人員已知的其等同物，等等。除非另有定義，此處所用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員的一 般理解相同的意義。以下提供下述術語。1. 1.定義“淀粉”表示包含植物復雜多糖碳水化合物的任意物質(zhì)，該碳水化合物包含分子式 為(C6HltlO5)x (其中X可為任意數(shù)字)的直鏈淀粉和支鏈淀粉。特別地，該術語表示任意基于 植物的物質(zhì)，該物質(zhì)包含但不限于谷物、草、塊莖和根，更特別地，包括但不限于小麥、大麥、 玉米、黑麥、稻、高粱、麩、木薯、粟、馬鈴薯、紅薯和木薯淀粉?！暗矸勖浮北硎灸軌虼呋矸劢到獾拿??！暗矸勖浮卑我獾矸勖?，例如葡糖 淀粉酶、α-淀粉酶、淀粉酶和芽孢桿菌屬，特別是地衣芽孢桿菌的野生型α-淀 粉酶。淀粉酶是切割淀粉中—4)0-糖苷鍵的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC 3.2. 1.1 ;α -D-(1 — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定義為在淀粉分子內(nèi)以隨機方式切割 α-D-(l —4)0-糖苷鍵的內(nèi)部作用酶。相反，外部作用的淀粉分解酶，如β-淀粉酶(EC 3.2. 1.2 ;α -D-(1 — 4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產(chǎn)物特異的淀粉酶(如產(chǎn)麥芽糖的 α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 133))從底物的非還原端切割淀粉分子。β _淀粉酶、α -葡糖苷酶 (EC 3. 2. 1.20 ； α -D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3. 2. 1. 3 ； α -D-(1 — 4)-葡聚 糖葡糖水解酶)和產(chǎn)物特異的淀粉酶可從淀粉產(chǎn)生特定長度的麥芽糖寡糖?！白凅w”是指多肽和核酸兩者。術語“變體”可與術語“突變體”互換使用。變體包 括在親本序列的氨基酸或核苷酸序列的一個或多個位置上的插入、替換、顛換、截短和/或 倒置。變體核酸可包括序列，該序列和能夠與此處給出的核苷酸序列進行雜交的序列是互 補的。例如，變體序列與以下序列互補，該序列在嚴格條件(例如，50°C和0.2Χ SSCilX SSC =0. 15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH 7. 0})下能夠與此處給出的核苷酸序列雜交。更特別 地，術語變體包含序列，該序列和在高度嚴格條件(例如，65°C和0. IX SSC)下能夠與此處 給出的核苷酸序列雜交的序列是互補的。“分離的”表示序列至少基本上沒有至少一種其他組分，該組分與該序列天然結合 并可在自然中找到?！凹兓摹北硎咎幱谙鄬儍魻顟B(tài)的物質(zhì)，例如，至少約90%純、至少約95%純、至 少約98%純或者至少約99%純。“熱穩(wěn)定的”表示酶比參照酶更加熱穩(wěn)定。本申請中，如果在同一實驗條件(例如 同一溫度、底物濃度等)下特定時間間隔后，變體有相對較高的酶活性，那么α-淀粉酶變 體就比野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶更加熱穩(wěn)定。備選地，與參照酶相比更加熱穩(wěn)定的 酶有更高的熱容量，該熱容量用示差掃描量熱法測定。多肽的“解鏈溫度”是50%多肽樣品完全變性時的溫度?！扳}依賴性”表示存在對添加額外的鈣的需要，以便酶在指定應用中工作。
“pH范圍”表示pH值，在該pH值以上或以下酶顯示活性。如此處所用，“pH穩(wěn)定的”表示酶在特定pH下比參照酶更穩(wěn)定。在本申請中，如果 在同一實驗條件(例如同一PH等)下特定時間間隔后，變體有相對較高的活性，那么α-淀 粉酶變體就比野生型地衣芽孢桿菌α "淀粉酶更加PH穩(wěn)定。在涉及細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時使用的“重組”，表示已經(jīng)通過異源核酸或蛋白 質(zhì)的導入或天然核酸或蛋白質(zhì)的改變，修飾了細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體，或者細胞是源自 這樣修飾的細胞。所以，例如，重組細胞表達在天然(非重組)形式的細胞中不能找到的基 因，或表達其他情況下異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。如此處所用，“食品”包括準備好的食品和食品的成分(例如面粉)。如此處所用，“食品成分”包括就是或可加入功能食品或糧食的制劑，并且包括以 低水平使用于品種多樣產(chǎn)品中的制劑，所述產(chǎn)品需要如酸化或乳化。食品成分可以以溶液 或固體的形式存在，這依賴于用途和/或應用方式和/或施用方式。如此處所用，“功能食品”表示食品，該食品不僅能夠提供營養(yǎng)效果和/或味覺滿 足，還能對消費者提供任意進一步的有益效果。如此處所用，“氨基酸序列”與術語“多肽”同義，并可與術語“蛋白質(zhì)”互換使用。 在一些情況下，術語“氨基酸序列”、“肽”和“氨基酸序列”，和“酶”。如此處所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其 變體、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因組、合成或重組來源的，可以是雙鏈或 單鏈的，代表有義鏈或反義鏈。如此處所用，術語“核苷酸序列”包括基因組DNA、cDNA、合成 DNA 禾口 RNA0“載體”是指設計用于將核苷酸引入一種或多種細胞類別的多核苷酸序列。載體包 括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、盒等等。如此處所用的“表達載體”表示DNA構建體，該構建體包含有效連接到合適的控制 序列的DNA序列，該控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA在合適宿主中的表達。這樣的控制序列可以 包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的任選操縱基因序列、編碼mRNA上的合適核糖體結合位 點的序列、增強子和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。“信號序列”表示與蛋白質(zhì)N端部分結合的氨基酸序列，該序列促進細胞外的蛋白 質(zhì)成熟形式進行分泌。信號序列的定義是功能性的。細胞外蛋白質(zhì)的成熟形式缺少信號序 列，該序列在分泌過程中被切除。“基因”是指DNA區(qū)段，該區(qū)段與產(chǎn)生多肽有關，并包括編碼區(qū)域之前和之后的區(qū) 域，以及個體編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。“啟動子”是調(diào)節(jié)序列，該參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉(zhuǎn)錄。啟動子可以是誘 導型啟動子或組成型啟動子。此處所用的示例性啟動子是誘導型啟動子里氏木霉cbh 1?！霸谵D(zhuǎn)錄控制下”是本領域內(nèi)公知的術語，該術語表明多核苷酸序列(通常是DNA 序列)的轉(zhuǎn)錄依賴于其有效連接促進轉(zhuǎn)錄開始或促進轉(zhuǎn)錄的元件?！霸诜g控制下”是本領域內(nèi)公知的術語，該術語表明mRNA形成后發(fā)生的調(diào)控過 程。如此處所用，在描述蛋白質(zhì)和編碼蛋白質(zhì)的基因時，基因的術語用斜體字標識 (例如，編碼amyL(地衣芽孢桿菌AA)的基因可表示為amyL)。蛋白質(zhì)的術語通常不用斜體字，并且第一個字母通常大寫(例如，amyL基因編碼的蛋白質(zhì)可表示為AmyL或amyL)。術語“源自”包含術語“源于”、“獲得”或“從...獲得”和“從...分離”。“有效連接“是指并置，其中元件的排列容許其功能上相關。例如，如果啟動子控制 編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子有效連接于該編碼序列“選擇標記”是指能夠在宿主中表達的基因，其允許容易地選擇含有引入的核酸或 載體的那些宿主。選擇標記的例子包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博來霉素或氯 霉素)和/或賦予代謝優(yōu)勢(例如對宿主細胞的營養(yǎng)優(yōu)勢)的基因。在將核苷酸序列插入細胞情況下的“引入”表示“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導”，并且 包括提到將核苷酸序列摻入到真核或原核細胞中，其中核酸序列可摻入到細胞基因組(如 染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾鲝椭谱?，或瞬時表達(如轉(zhuǎn)染的mRNA)。如此處所用，“轉(zhuǎn)化的細胞”包括已經(jīng)通過重組DNA技術轉(zhuǎn)化的細胞。典型地，通過 將一個或更多核苷酸序列插入細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列， 即，該序列對將要轉(zhuǎn)化的細胞(如融合蛋白)并不是天然的?！八拗骶辍被颉八拗骷毎北硎緦Ρ磉_載體或DNA構建體合適的宿主，所述的表達 載體或DNA構建體包含編碼根據(jù)本公開內(nèi)容的變體α-淀粉酶的多核苷酸。特別地，宿主 菌株可以是細菌細胞。在本公開內(nèi)容的實施方案中，“宿主細胞”表示細胞和從微生物菌株 特別是芽孢桿菌屬細胞產(chǎn)生的原生質(zhì)體。與另一序列有某一百分比(例如，至少約80%、85%、90%、95%或99% )的 序列同一性的多核苷酸或多肽表示比對時，比較兩個序列中堿基或氨基酸殘基相同的 百分比。可通過本領域內(nèi)任意合適的軟件程序來確定這種比對和百分比同源性或同 一性，例如 CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F. Μ. Ausubel 等· (eds) 1987， Supplement 30，section 7.7.18)中所述的那些程序。這些程序可包括GCG Pileup程 序、FASTA (Pearson 等.(1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85 2444-2448)和 BLAST (BLAST Manual, Altschul 等，Nat，1 Cent. Biotechnol. Inf.，NatlLib.Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda, Md.和 Altschul 等，(1997)NAR25 :3389_3402)。另一比對程序是使用缺省參數(shù) 的 ALIGN Plus(Scientificand Educational Software，PA)。另一有用的序列軟件程序 是在 SequenceSoftware Package Version 6. O (Genetics Computer Group, University offfisconsin, Madison, WI)中可得的 TFASTA 數(shù)據(jù)搜索程序(DataSearching Program) 本領域技術人員將認識到本公開內(nèi)容包含的序列也通過其在嚴格雜交條件下與 示例的amyL序列(如WO 06/002643的SEQ ID NO 7)雜交的能力來定義。在適當?shù)臏囟?和溶液離子強度條件下，核酸的單鏈形式可與另一核酸退火時，核酸與另一核酸序列可以 雜交。雜交和洗滌條件是本領域公知的(如見Sambrook(1989) supra，特別是第9和第11 章)。在一些實施方案中，嚴格條件對應于65 °C的Tm和0. 1XSSC，0. 1% SDS0“培養(yǎng)”是指在合適的條件下在液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物細胞群體。在一個 實施方案中，培養(yǎng)是指含有顆粒淀粉的淀粉底物發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物(典型地，在容器 或反應器中)?！鞍l(fā)酵”是由微生物對有機物質(zhì)進行酶學和厭氧降解，產(chǎn)生更簡單的有機化合物。 發(fā)酵發(fā)生在厭氧條件下時，并不意味著該術語只限制于嚴格的厭氧條件，因為發(fā)酵同樣在 氧存在時發(fā)生。
“接觸”是指將各個酶放置在足夠靠近各自底物的臨近處，使酶能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)變?yōu)?終產(chǎn)物。本領域技術人員將認識到，將酶溶液與各自底物混合可實現(xiàn)接觸?！懊皋D(zhuǎn)化”通常指通過酶作用修飾底物。如此處所用的術語也指通過酶的作用對淀 粉底物進行修飾。如此處所用，“糖化”是指將淀粉酶促轉(zhuǎn)化為葡萄糖?！澳z化”表示通過蒸煮使淀粉分子溶解形成粘稠的懸浮液?！耙夯笔侵傅矸坜D(zhuǎn)化的階段，該階段中膠凝化淀粉水解以提供低分子量的可溶糊 Ib ο“聚合度(DP) ”是指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單元的數(shù)量(n)。DPI的例子是單糖， 如葡萄糖和果糖，DP2的例子是2糖，如麥芽糖和蔗糖。DP > 3表示聚合物的聚合度大于3?！敖K產(chǎn)物”或“期望的終產(chǎn)物”是指源自任意碳源的分子產(chǎn)物，其中分子產(chǎn)物是從淀 粉底物酶促轉(zhuǎn)化而來的。如此處所用，“干固體含量”是指基于干重漿液的總固體(％形式)。術語“漿液” 是指含有不可溶固體的水性混合物。術語“殘留淀粉”是指含有淀粉的底物發(fā)酵后組合物中剩下的殘余淀粉(可溶或 不可溶)?！盎厥詹襟E”是指醪液組分的回收，該組分可包括殘留淀粉、用于發(fā)酵包含淀粉的 底物的酶和/或微生物。術語“醪液”是指用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(例如醇)的水中的可發(fā)酵碳源(碳水化合 物)混合物。在一些實施方案中，術語“啤酒”和“醪液”是互換使用的。“釜餾物”表示非發(fā)酵固體和水的混合物，該混合物是從發(fā)酵醪液中除去醇后的殘 留物。術語“干酒糟”(DDG)和“具有可溶物的干酒糟”(DDGS)是指谷物發(fā)酵的有用副產(chǎn) 物。如此處所用的“產(chǎn)乙醇微生物”是指能夠?qū)⑻腔蚬烟寝D(zhuǎn)變?yōu)橐掖嫉奈⑸?。產(chǎn)乙 醇的微生物產(chǎn)生乙醇，是因為它們能夠表達一個或多個酶，這些酶能單獨或一起將糖轉(zhuǎn)變 為乙醇。如此處所用的“乙醇產(chǎn)生者”或產(chǎn)生乙醇的微生物，是指能夠從己糖或戊糖產(chǎn)生乙 醇的任意生物或細胞。通常，產(chǎn)生乙醇的細胞含有醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產(chǎn)生乙醇的 微生物的例子包含如酵母等真菌微生物。關于多核苷酸或蛋白質(zhì)的“異源”，是指并不天然存在于宿主細胞中的核苷酸或蛋 白質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)。該術語意圖包含由天然存 在基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。關于多核苷酸或蛋白質(zhì)的“內(nèi)源”是指天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或蛋白 質(zhì)。如此處所用，關于細胞的“轉(zhuǎn)化”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)基因的”，表示細胞具有非天然 的(如異源的)核酸序列，該序列整合到其基因組或作為維持多個世代的游離型質(zhì)粒存在。如此處所用，“表達”是指在基因的核酸序列基礎上生產(chǎn)多肽的過程。該過程包括 轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者。
如此處所用，“比活性”表示酶單位，該單位定義為特定條件下單位時間內(nèi)被酶制劑轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)。比活性表示為單位(U)／mg蛋白質(zhì)。
“產(chǎn)率”是指使用本公開內(nèi)容的方法產(chǎn)生的終產(chǎn)物或期望終產(chǎn)物的量。在一些實施方案中，產(chǎn)率比用本領域已知方法產(chǎn)生的高。在一些實施方案中，該術語是指終產(chǎn)物的體積，在其他實施方案中，該術語是指終產(chǎn)物濃度。
如此處所用，“生物學活性”是指序列，該序列具有與天然存在序列相似的結構1調(diào)控或生化功能，雖然不必定是相同程度。
“ATCC”是指位于ManaSSaS，Va．20108的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
“NRRI+”是指伊利諾斯州Pe。ria的國家農(nóng)業(yè)應用研究中心，農(nóng)業(yè)研究局培養(yǎng)物保藏中心(以前稱為USDA北方地區(qū)研究實驗室)。
1．2．縮寫
除非另有說明，應用以下的縮寫
AE醇乙氧基化物
AE。醇乙氧基化物
AE。S醇乙氧基硫酸酯
AES醇乙氧基硫酸酯
AFAU酸性真菌。一淀粉酶單位
AGU葡糖淀粉酶活性單位
A。So一烯屬磺酸酯
AS醇硫酸酯
BAA細菌。一淀粉酶
CI)NA互補I)NA
CMC羧甲基纖維素
DE葡萄糖當量
])NA脫氧核糖核酸
])NS3，5一二硝基水楊酸
DP3三亞基聚合度
DPnn亞基聚合度
DS干物質(zhì)
DSC示差掃描量熱法
DTMPA二乙基三胺五乙酸
EC酶學委員會的酶分類法
EDu乙二胺四乙酸
EDTMPA乙二胺四亞甲基膦酸
F&HC織物和家庭護理
HFCS高果糖谷物糖漿
HFSS高果糖淀粉基糖漿
Ⅲ)AEC—PAD帶脈沖電流測定的高性能陰離子交換層析0126]IPTG
0127]LAS
0128]LU
0129]MES
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
MW
nm
NOBS
NTA
PCR
PEG
Pl
ppm
PVA
PVP
RAU
RMS
RNA
rpm
SAS
IX SSC
SSF
TAED
TNBS
w/v
w/w
異丙基β-D-硫代半乳糖苷
線性烷基苯磺酸酯
脂肪酶單位
2-(N-嗎啉代)乙磺酸
分子量
納米
壬酰氧基苯磺酸酯 次氮基三乙酸 聚合酶鏈反應 聚乙二醇 等電點 百萬分率 聚乙烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 參考淀粉酶單位 均方根 核糖核酸 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) 仲烷烴磺酸鹽
0. 15Μ NaCl，0. 015Μ 檸檬酸鈉，ρΗ 7.0 同時糖化和發(fā)酵
四乙酰基乙二胺 三硝基苯磺酸 重量/體積 重量/重量 野生型 微升
wt μ L 1.3命名法
在本描述和權利要求書中，對氨基酸殘基使用常規(guī)的單字母和三字母代碼。為方
便參考，通過以下命名法的使用來描述本申請的α-淀粉酶變體
0155]原氨基酸位置替換氨基酸
0156]根據(jù)本命名法，例如，位置242上絲氨酸被丙氨酸取代表示為
0157]Ser242Ala 或 S242A。
0158]位置30的丙氨酸缺失表示為
0159]Ala30 女或 A30 女或 ΔΑ30。
0160]額外氨基酸殘基的插入，例如賴氨酸，表示為 0161 ]Ala30AlaLys 或 A30AK。
0162]連續(xù)一段氨基酸殘基缺失，例如氨基酸殘基30-33，表示為
0163](30-33) * 或 Δ (Α30-Ν33)或 Δ 30-33。
兩個連續(xù)氨基酸缺失，例如氨基酸殘基R180-S181，表示為ARS 或 Δ 180-181。與其他α-淀粉酶相比，特定α-淀粉酶含有“缺失”并且在這一位置有插入，表 示為*36Asp 或 *36D表示在位置36插入天冬氨酸。多個突變通過加號分開，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在位置30和34丙氨酸和谷氨酸分別被取代為天冬酰胺和絲氨酸的突變。當 給定位置可以插入一個或更多備選氨基酸殘基時，表示為A30N，E 或 A30N 或 A30E。此外，此處鑒定了適合修飾的位置，且未建議任何特定修飾時，應理解該位置現(xiàn)存 氨基酸殘基可用任意氨基酸殘基替換。因此，例如，提到位置30上的丙氨酸修飾而未指定 時，應理解丙氨酸可以被缺失或被其他任意氨基酸替換，即被以下任一氨基酸替換R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I，L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V。另外，丨‘A30X"表示以下替換的任意一種A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y,或 A30V ；或簡稱A30R, N, D, C, Q, E, G, H, I，L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V。在例如N或V中的一個存在于野生型中的情況下，如果用于編號的親本酶在建議 用于替換的位置上具有所討論的氨基酸殘基，那么使用以下命名法“ X30N"或〃 X30N, V"。因此這表示其他相應的親本酶在位置30中被替換為天冬酰胺或纈氨酸。2. α-淀粉酶變體此處的α -淀粉酶變體從野生型地衣芽孢桿菌α -淀粉酶產(chǎn)生。本變體可以有增 強的比活性、PH譜、熱穩(wěn)定性、溫度范圍譜、鈣離子需要或其他增強的特性。變體通常含有野 生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶氨基酸序列的一個或多個修飾。野生型地衣芽孢桿菌α-淀 粉酶可從任意天然存在的地衣芽孢桿菌菌株中分離出來。為了本公開內(nèi)容的目的，氨基酸替換例如可以稱作Μ15Τ。‘‘Μ15Τ”表示在位置15 上甲硫氨酸(M)被替換為蘇氨酸(T)殘基，其中氨基酸是用本領域公知的單字母縮寫來表 示的。野生型地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生了多種能有改善性質(zhì)的α -淀 粉酶。在一個方面，變體酶的一個或更多氨基酸殘基被隨機修飾，在變體的宿主細胞表達 后，修飾的效應由變體性能特征的后續(xù)分析測定。在另一方面，使用“模式”α-淀粉酶(該 淀粉酶有與野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶非常類似的結構)作為引導，系統(tǒng)性修飾變體 氨基酸序列，以便預測修飾的效果。在一個實施方案中，與野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶 相比，模式α-淀粉酶有一種或更多改善的特性。例如，模式α-淀粉酶可能有更高的比活 性、PH依賴性、穩(wěn)定性、半衰期或鈣結合常數(shù)，或者它可能有特別有用的底物特異性，等等。如果使用模式α-淀粉酶來引導變體α-淀粉酶的氨基酸改變的設計，則不需要
14精確知道模式α-淀粉酶的哪一些殘基對該酶的性能有貢獻。作為替換，變體α-淀粉酶 中一個或更多氨基酸，甚至全套氨基酸，修飾為模式α-淀粉酶相應的氨基酸。這里的“相 應”氨基酸不是由一級氨基酸序列的常規(guī)比對決定的，而是由兩種酶多肽骨架的3D結構比 對決定。因此，變體中修飾的氨基酸可選擇例如酶表面的帶電殘基、活性部位殘基或?qū)δＪ?酶特有的具體二級結構元件有貢獻的殘基。也可能在修飾不會破壞兩個酶間保守3D結構 (特別是保守的二級結構元件，如α-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)角)的基礎上，選擇要被修飾的殘 基。例如，已知改變酶表面上的帶電氨基酸分布通常能改變其酶性質(zhì)。如見Russell 等 人，"Rational modification of enzyme catalysis by engineeringsurface charge, ”Nature 328 =496-500(1987)。同樣地，可修飾地衣芽孢桿菌α -淀粉酶表面上的 一個或更多殘基，來改變變體α-淀粉酶的酶性質(zhì)，此處可用模式α-淀粉酶的表面電荷分 布來引導修飾的選擇。為此目的，用至少部分暴露在溶劑中的氨基酸帶電側鏈來促進“表面 電荷”?？蓪⒆凅wα -淀粉酶殘基分類，可將其歸于三個結構域之一，此處稱A、B和C域。 為本公開內(nèi)容的目的，A域從殘基2延伸至105，和從殘基208延伸至396 ；B域從殘基106延 伸至207 ;C域從殘基397延伸至蛋白C端。氨基酸也可分類為活性部位殘基?；钚圆课粴埢?至少位于位置 49，52，163，167，170，172，187，188，190，238，262，264，293，297 和 332-334。 殘基“位置”編號如地衣芽孢桿菌α-淀粉酶序列(SEQ ID NO 4)所描述。在變體α-淀粉酶中，一個或更多氨基酸可被修飾為模式α-淀粉酶中的相應氨 基酸。修飾按結構域聚簇，和/或按帶電并存在于酶表面的氨基酸聚簇。備選地或附加地， 可對一個或更多活性部位殘基進行修飾。用這種方式，令多重氨基酸修飾成為可能，其中修 飾對變體α-淀粉酶的性能特征有可預測的效應。例如，變體可以將一個或更多域上的每 個表面帶電殘基改變?yōu)槟Ｊ溅?淀粉酶的相應殘基。在另一實施方案中，變體可以有殘基 插入或缺失，如可以有環(huán)插入或缺失，使變體的多肽骨架更近似于模式α-淀粉酶的結構。 相應地，以變體保持α -淀粉酶活性為條件，變體可包含1，2，3，4，5，10，15，20，30，40，50， 60或70個氨基酸替換、缺失或插入，或之間的任何整數(shù)值。變體的表面電荷也可以以任一 數(shù)量改變。例如，酶表面上帶正電的氨基酸殘基數(shù)量可以減少1，2，3，4，5，6，7或8個。除 了別的以外，預期這樣的氨基酸替換會改變變體的等電點(Pl)。變體的其他特征可以不同 于野生型酶，如下述。α -淀粉酶變體可以是融合蛋白、“雜合體”或“嵌合蛋白”，包含非地衣芽孢桿菌內(nèi) 源的多肽序列。在一個實施方案中，多肽序列促進所表達蛋白的純化。在另一實施方案中， 異源序列是源自與地衣芽孢桿菌異屬或異種的α-淀粉酶多肽。例如，α-淀粉酶變體可 包含地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，該變體連接到另一種芽孢桿菌(例如但不限于嗜熱 脂肪芽孢桿菌)α"淀粉酶的信號肽。2. 1. α -淀粉酶變體表征酶變體可通過核酸和多肽序列、如上所述的它們的3D結構和/或它們的比活性表 征。α-淀粉酶變體的其他特征包括半衰期、低水平鈣離子(Ca2+)下的穩(wěn)定性、ρΗ范圍、氧 化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。在一個方面，清潔制劑中的α-淀粉酶變體有更高的比活性，這可用 本領域技術人員已知的標準測定方法進行評價。在另一個方面，變體顯示出其他改善的性能特征，例如高溫(如70-120°C )和/或極端pH(即約pH 4. 0到約6. 0或約pH 8. 0到約 11. 0)和/或低于約60ppm的鈣濃度情況下改善的穩(wěn)定性。改變的Ca2+穩(wěn)定性表示，在Ca2+耗竭的情況下酶的穩(wěn)定性發(fā)生了改變，即增加或減 少。重要的突變包含改變的Ca2+穩(wěn)定性和需要性的突變，特別是在高pH(即pH8. 0到10. 5) 下有降低的Ca2+依賴性的突變。在另一方面，對于用在清潔組合物中，重要的突變顯示出改變的比活性，特別是在 從約10°C到約60°C的溫度下，特別地在約20°C到約50°C下，更特別地在約30°C到約40°C 下。對烘焙產(chǎn)品，重要的突變可以在較高的溫度范圍內(nèi)顯示改變的比活性。與親本α -淀粉酶相比，α -淀粉酶變體也可以有改變的氧化穩(wěn)定性，特別是較高 的氧化穩(wěn)定性。例如，增加的氧化穩(wěn)定性在洗滌劑組合物中有優(yōu)勢，降低的氧化穩(wěn)定性可以 在用于淀粉液化組合物的中有優(yōu)勢。變體α-淀粉酶可以比野生型α-淀粉酶更加熱穩(wěn)定。這樣的α -淀粉酶在烘 焙或其他需要升溫方法的使用中有優(yōu)勢。例如，熱穩(wěn)定的α-淀粉酶變體可在約55°C到約 80°C或更高的溫度下降解淀粉。暴露在高達約95°C的溫度后，熱穩(wěn)定的α-淀粉酶變體可 保持其活性。此處所述的α-淀粉酶變體多肽也可以有突變，該突變相對于親本酶，延長了半 衰期至少約 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90% ,100% ,200% 或更多，特別 是在至少約55°C到約95°C或更高的升高溫度下，特別是在約80°C下。在一個實施方案中， α -淀粉酶變體可在約80°C或更高溫度下加熱約1-10分鐘。α _淀粉酶變體可以有外特異性，例如以外特異性指數(shù)測量。α _淀粉酶變體包含 那些變體，該變體典型地在同一條件下測量時，具有比其源自的親本酶或多肽更高或增加 的外特異性。因此，例如，與其親本多肽相比，α-淀粉酶變體多肽可以有10%，20%，30%， 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 %, 1000 %，5000 %，10，000 %
或更高的外特異性指數(shù)。在一個方面，由核酸編碼的α -淀粉酶變體多肽與親本序列有相同的pH穩(wěn)定性。 在另一方面，變體包含了突變，該突變賦予了更大的PH穩(wěn)定范圍或?qū)H范圍轉(zhuǎn)移到酶的 最終商業(yè)目的希望的區(qū)域。例如，在一個實施方案中，變體可在約ΡΗ5. 0到約ρΗΙΟ. 5下降 解淀粉。在同一條件下，與親本多肽相比，α-淀粉酶變體多肽可以有更長的半衰期或更高 的活性(依賴于測定)，或者α-淀粉酶變體可以有和親本多肽相同的活性。同一 pH條件 下與其親本多肽相比，α -淀粉酶變體多肽也可以有約10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %， 70%，80%，90%，100%，200%或更長的半衰期。備選地，或附加地，在同一 pH條件下與親 本多肽相比，酶變體多肽可以有更高的比活性。在另一個方面，提供了核酸，其與此處陳述的編碼任一 α-淀粉酶變體的核酸互 補。另外，提供了能夠與互補核酸雜交的核酸。在另一實施方案中，用于此處描述的方法和 組合物中的序列是合成序列。其包括但不限于以最佳密碼子選擇制備的序列，該最佳密碼 子選擇是為了在宿主生物(例如甲基營養(yǎng)酵母畢赤酵母和漢遜酵母)中進行表達。3. α-淀粉酶變體的生產(chǎn)編碼酶變體的DNA序列(該酶變體用此處描述或本領域中任一其他已知方法進行 生產(chǎn))可以使用表達載體以酶形式表達，所述表達載體典型地包括控制序列，該序列編碼合適的啟動子、操縱基因、核糖體結合部位、翻譯起始信號和典型地阻遏基因或各種活化基 因。3. 1.載體帶有編碼α -淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是能方便地經(jīng)歷重組 DNA操作的任一載體，并且載體的選擇通常依賴于其將要引入的宿主細胞。因此，載體可以 是自主復制載體，即，以染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、 噬菌體或染色體外元件、微染色體或人工染色體。備選地，載體可以是這樣一種載體，它在 引入宿主細胞時，整合進入宿主細胞基因組，且與其整合進去的染色體一起復制。整合的基 因可以通過可擴增的構建體擴增來產(chǎn)生染色體中該基因的多個拷貝，所述構建體是通過抗 生素選擇或其他選擇壓力(例如必需調(diào)控基因，或必需代謝途徑基因的互補)驅(qū)動的。典型地，表達載體包括克隆載體的組分，例如允許載體在所選宿主生物中進行自 主復制的元件，和一個或更多為選擇目的在表型上可檢測的標記。表達載體通常包含控制 核苷酸序列，該序列編碼啟動子、操縱基因、核糖體結合部位、翻譯起始信號和典型地阻遏 基因或者一個或更多活化基因。在一個方面，為了更容易的酶收集和純化，使用的所有信號 序列將物質(zhì)靶向細胞培養(yǎng)基。分別用于連接編碼α-淀粉酶變體、啟動子、終止子和其他元 素的DNA構建體，和將它們插入到含有復制所需信息的合適載體的方法是本領域技術人員 所公知的(如見 Sambrook et al. , MolecularCloning :A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor,1989 and3rd ed. ，2001)。載體中，DNA序列應該有效連接合適的啟動子序列。啟動子可以是在所選宿主細 胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任一 DNA序列，并且可源自編碼宿主細胞同源或異源蛋白的基因。用 于指導編碼α-淀粉酶變體的DNA序列轉(zhuǎn)錄(特別是在細菌宿主中)的合適啟動子的示例 是大腸桿菌Iac操縱子的啟動子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶dagA或celA的啟動子、地衣芽孢 桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的 啟動子、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)的啟動子、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的 啟動子，等等。對真菌宿主中的轉(zhuǎn)錄，有用啟動子的實例是那些源自編碼米曲霉TAKA淀粉 酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉 葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶或構巢曲霉乙 酰胺酶的基因的啟動子。在編碼α-淀粉酶變體多肽的基因在例如大腸桿菌的細菌種類中 表達時，可選擇合適的啟動子，可從例如包括Τ7啟動子和λ噬菌體啟動子的噬菌體啟動子 選擇。適合在酵母種類中表達的啟動子實例，包括但不限于釀酒酵母菌的Gal 1和Gal 10 啟動子，和巴斯德畢赤酵母的AOXl或Α0Χ2啟動子。對在里氏木霉中的表達，也可用CBHII 啟動子。表達載體也可以包含適合的轉(zhuǎn)錄終止子，和有效連接編碼α -淀粉酶變體的DNA 序列的多腺苷酸序列(在真核生物中)。終止和多腺苷酸序列可合適地與啟動子源自相同 來源。載體還可包含DNA序列，該序列使載體能夠在討論中的宿主細胞里復制。這種序列 的例子是質(zhì)粒 PUC19，pACYC177，pUBllO, pE194，pAMBl, pICatH 和 pIJ702 的復制起點。載體也可以包含選擇標記，例如其產(chǎn)物補足宿主細胞中缺陷的基因，如來自枯草 芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗藥性(如氨芐西林、卡那霉素、氯 霉素或四環(huán)素抗藥性)的基因。此外，載體可包含賦予潮霉素抗藥性的曲霉菌屬選擇標記(例如amdS，argB, niaD和xxsC)，或者通過本領域已知的共轉(zhuǎn)化來完成選擇。例如見WO 91/17243。3. 2.變體表達和宿主生物雖然在某些方面，例如在宿主細胞中使用某些細菌或真菌時，細胞內(nèi)表達或固態(tài) 發(fā)酵可以更有優(yōu)勢，但變體表達在細胞外并進入培養(yǎng)基中通常更有優(yōu)勢。一般來說，此處提 到的芽孢桿菌α-淀粉酶包含允許所表達蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中的信號序列。如果需要， 這一信號序列可用不同的信號序列替換，該替換可便利地通過編碼各個信號序列的DNA序 列的替換來完成。信號序列的典型特征是有三個結構域，N端域、H域和C端域，且長度在 18-35個殘基范圍內(nèi)。成熟蛋白可以最初以融合到前蛋白的融合蛋白形式存在，所述前蛋白源自另一種 芽孢桿菌或者與親本序列來自同一物種。為在地衣芽孢桿菌中分泌蛋白，經(jīng)常使用地衣芽 孢桿菌α-淀粉酶的信號肽；然而，也可以替換成其他芽孢桿菌屬α-淀粉酶的信號蛋白。分離的包含DNA構建體或表達載體的細胞，在α -淀粉酶變體重組生產(chǎn)中作為宿 主細胞有利地使用。細胞可以編碼變體的DNA構建體，便利地通過將DNA構建體(一個或 更多拷貝)整合到宿主染色體中來轉(zhuǎn)化。這一整合通常認為是有優(yōu)勢的，因為DNA序列更 有可能保持在細胞中。DNA構建體整合進入宿主染色體可根據(jù)常規(guī)方法進行，如通過同源 或異源重組。備選地，細胞可用表達載體轉(zhuǎn)化，該表達載體如上關于不同類型的宿主細胞所 述。合適的細菌宿主生物的例子是革蘭氏陽性細菌物種，例如芽孢桿菌科，包含枯草 芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌， 解淀粉芽孢桿菌，凝固芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；鏈霉菌 屬，例如鼠灰鏈霉菌；乳酸細菌，包括乳球菌屬，例如乳乳球菌；乳桿菌屬，包含路氏乳桿 菌；明串球菌屬；片球菌屬和鏈球菌屬。備選地，屬于腸桿菌科(包含大腸桿菌)或假單胞 菌科(Pseudomonadaceae)的革蘭氏陰性細菌物種可被選作宿主生物。合適的酵母宿主生物可從生物技術上相關的酵母物種中選擇，例如，但不限于畢 赤酵母屬，漢遜酵母屬，克魯維酵母屬，Yarrowinia sp.，酵母屬，包括釀酒酵母，或?qū)儆诹?殖酵母屬的物種，例如栗酒裂殖酵母。可用甲基營養(yǎng)酵母物種畢赤酵母作為宿主生物。備選 地，宿主生物可以是漢遜酵母物種。絲狀真菌中合適的宿主生物包括曲霉菌屬的種類，如黑 曲霉、米曲霉、Aspergillus tubigensis、泡盛曲霉或構巢曲霉。備選地，鐮孢屬的種類，如 尖鐮孢，或根毛霉菌屬，如米赫根毛霉可用作宿主生物。其他合適的酵母包括Thermomyces sp和毛霉菌屬。通過包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，隨后以本領域已知的方式重新生 成細胞壁的方法轉(zhuǎn)化真菌細胞。例如，歐洲專利號238023描述了轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細胞的合 適步驟。在更進一步的方面，提供了產(chǎn)生α-淀粉酶變體的方法，該方法包括在有助于變 體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)如上所述的宿主細胞并從細胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。用于培養(yǎng)細 胞的培養(yǎng)基可以是適合所述細胞生長并獲得α-淀粉酶變體表達的任意常規(guī)培養(yǎng)基。合 適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基組分可從供貨商獲得，或者根據(jù)例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 目錄所述的已公布配方制備。示例性培養(yǎng)基包括但不限于那些下文提供的實施例中所用 的，在例如三千升(3，000L)攪拌釜發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵所用的培養(yǎng)基。所用培養(yǎng)基會是最適合所培養(yǎng)宿主細胞的，例如下面討論的用于培養(yǎng)地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基。那種情 況下的培養(yǎng)基可由以下物質(zhì)組成作為有機化合物來源的玉米浸提固體和大豆粉，以及作 為鈉、鉀、磷、鎂、硫酸鹽來源的無機鹽和微量元素。典型地，如葡萄糖等糖類來源也是初始 培養(yǎng)基的一部分。如本領域已知，一旦培養(yǎng)確定并開始生長，糖類按量加入發(fā)酵罐來維持培 養(yǎng)物。按規(guī)則間隔從發(fā)酵罐中取出樣品，通過如比色測定方法來測量酶滴定度。根據(jù)測量 結果，酶生產(chǎn)率停止上升時，停止發(fā)酵過程。從宿主細胞分泌的α -淀粉酶變體可便利地通過公知步驟從培養(yǎng)基中回收，所述 公知步驟包括通過離心或過濾將細胞從培養(yǎng)基中分離，并通過例如硫酸銨等鹽的方法沉淀 蛋白質(zhì)性質(zhì)的組分，隨后是使用層析步驟如離子交換層析、親和層析等等。宿主細胞可在允許α -淀粉酶變體蛋白表達的合適條件下培養(yǎng)。蛋白質(zhì)的表達可 以是組成性的，以致其持續(xù)產(chǎn)生，或者可誘導的，需要刺激物來啟動表達。在可誘導表達的 情況下，例如需要的時候向培養(yǎng)基添加誘導物質(zhì)如地塞米松、IPTG或瓊脂糖，可啟動蛋白質(zhì) 的產(chǎn)生。多肽也可以在例如TnT (Promega)兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)等體外無細胞體系中重組產(chǎn) 生。表達α-淀粉酶變體的宿主也可以是在好氧條件下，對宿主合適的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)?？商峁u動或攪拌和通氣的組合，生產(chǎn)發(fā)生在對宿主合適的溫度下，如從約30°C到約 75°C，這取決于宿主和所需α -淀粉酶變體產(chǎn)生的需要。培養(yǎng)可持續(xù)約12到約100小時或 更長(和其中任何小時值)，或更特別地，從約24到約72小時。典型地，培養(yǎng)液ρΗ在約5. 5 到約8. 0，也取決于宿主細胞相對于α -淀粉酶變體產(chǎn)生所需要的培養(yǎng)條件。4. α -淀粉酶變體的純化發(fā)酵、分離和濃縮技術是本領域已知的，且可用常規(guī)方法來制備含有濃縮α-淀 粉酶變體的溶液。發(fā)酵后得到發(fā)酵液，并通過常規(guī)分離技術將微生物細胞以及各種懸浮固 體(包括殘留發(fā)酵原料)去除，得到淀粉酶溶液。通常使用過濾、離心、微濾、旋轉(zhuǎn)真空滾筒 過濾(rotary vacuum drumfiltration)，隨后是超濾、提取或?qū)游龅?。期望對含有?-淀粉酶變體的溶液進行濃縮來優(yōu)化回收率，因為未濃縮溶液的使 用需要增加的溫育時間來收集含有純化α-淀粉酶變體的沉淀物。用常規(guī)技術濃縮溶液， 直到獲得期望的酶水平。含有酶變體的溶液的濃縮可通過以上討論的任意技術得到。在一 個實施方案中，使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)和/或超濾。備選地，可使用超濾。為純化目的的“沉淀劑”意思是可從濃縮酶變體溶液中有效沉淀固體形式(無論 其是何性質(zhì)，也就是說，結晶的，無定形或兩者混合)α-淀粉酶變體的化合物?？捎美缃?屬鹵化物沉淀劑等來進行沉淀。金屬鹵化物沉淀劑包括堿金屬氯化物，堿金屬溴化物和兩 者或更多這些金屬鹵化物的混合物。金屬鹵化物可從由氯化鈉、氯化鉀、溴化鈉、溴化鉀和 兩種或更多這些金屬鹵化物的混合物組成的組中選擇。合適的金屬鹵化物包括氯化鈉和氯 化鉀，特別是還可作為防腐劑使用的氯化鈉。金屬鹵化物沉淀劑按能有效沉淀α -淀粉酶變體的量來使用。在常規(guī)試驗后，能 有效導致酶變體沉淀的金屬鹵化物的至少有效量和最佳量的選擇，以及用于最大回收率的 沉淀條件，包括溫育時間，ΡΗ，溫度和α-淀粉酶變體濃度等的選擇對本領域中普通技術人 員之一是十分明顯的。一般來說，向濃縮酶變體溶液中加入至少約5% w/v (重量/體積)到約25% w/V，通常是至少8% w/v的金屬鹵化物。一般來說，向濃縮酶變體溶液加入不超過約25% w/ ν的金屬鹵化物，通常不超過約20% w/v。除了別的以外，金屬鹵化物沉淀劑的最佳濃度依 賴于特定α-淀粉酶變體的性質(zhì)及其在濃縮α-淀粉酶變體溶液中的濃度。實現(xiàn)酶沉淀的另一備選方案是使用有機化合物，其可向濃縮酶變體溶液中加入。 有機化合物沉淀劑可包括4_羥基苯甲酸，4-羥基苯甲酸的堿金屬鹽，4-羥基苯甲酸的烷 基酯，以及兩種或更多這些有機化合物的混合物。有機化合物沉淀劑的添加可在金屬鹵化 物沉淀劑的添加之前、同時或之后進行，并且這兩種沉淀劑(有機化合物和金屬鹵化物)的 添加可順序或同時進行。例如更進一步的描述，如見美國專利號5，281，526。一般來說，有機化合物沉淀劑從由4-羥基苯甲酸的堿金屬鹽(如鈉或鉀鹽)和 4-羥基苯甲酸線性或分支的烷基酯(其中烷基含有1到12個碳原子)兩種或更多這些有 機化合物的混合物組成的組中選擇。有機化合物沉淀劑可以是例如4-羥基苯甲酸線性或 分支的烷基酯，其烷基含有1到10個碳原子，以及兩種或更多這些有機化合物的混合物。 合適的有機化合物包括4-羥基苯甲酸線性烷基酯，其中烷基含有1到6個碳原子，以及兩 種或更多這些有機化合物的混合物。也可以使用4-羥基苯甲酸甲酯，4-羥基苯甲酸丙酯， 4-羥基苯甲酸丁酯，4-羥基苯甲酸乙酯，以及兩種或更多這些有機化合物的混合物。另外 的有機化合物也包括但不限于也是淀粉酶防腐劑的4-羥基苯甲酸甲酯(甲基PARABEN)和 4-羥基苯甲酸丙酯(丙基PARABEN)。有機化合物沉淀劑的添加提供了關于pH、溫度、α -淀粉酶變體濃度、沉淀劑濃度 和溫育時間的沉淀條件的高靈活性優(yōu)勢。以有效的劑量使用有機化合物沉淀劑，該有效劑量能改善通過金屬鹵化物沉淀劑 對酶變體的沉淀。常規(guī)試驗后，根據(jù)本公開，至少有效劑量和最佳劑量的有機化合物沉淀 劑，以及最大回收率的沉淀條件(包含時間、ΡΗ、溫度和酶變體濃度)的選擇對本領域技術 人員來說是顯而易見。通常，向濃縮酶變體溶液加入至少約0. 01 % w/v的有機化合物沉淀劑，通常至少 加入約0. 02% w/v。通常，向濃縮酶變體溶液加入不超過約0. 3% w/v的有機化合物沉淀 劑，并且常常不超過約0. 2% w/v。調(diào)節(jié)含有金屬鹵化物沉淀劑和(在一個方面)有機化合物沉淀劑的濃縮酶變體溶 液到必定會依賴于待純化酶變體的PH。通常，將pH調(diào)節(jié)到接近淀粉酶等電點(pi)的水平。 例如，可在從Pl以下約2. 5pH單位到pi以上約2. 5pH單位的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)pH。為具體說明， α -淀粉酶變體來自地衣芽孢桿菌時，濃縮酶變體溶液pH通常將被調(diào)至約5. 5到9. 7之間， 特別調(diào)至約PH 6. 5-9. 0之間。如果變體pi與野生型pi不同，pH可相應調(diào)節(jié)。得到純化的酶變體沉淀物所需的溫育時間依賴于特定酶變體的性質(zhì)、酶的濃度、 特定沉淀劑及其濃度。通常，沉淀酶變體的有效時間在約1小時到約30小時之間，常常不 超過約25小時。存在有機化合物沉淀劑時，溫育時間仍可降低到少于約10個小時，大多數(shù) 情況下甚至少于約6個小時。通常，溫育中溫度在約4°C到約50°C之間。通常，方法在約10°C到約45°C之間實 施，特別在約20°C到約40°C間。誘導沉淀的最佳溫度根據(jù)溶液條件和酶變體或所用沉淀劑 而有所不同。純化酶變體沉淀物的總回收率和進行該過程的效率是通過攪拌包含酶變體、所加
20金屬鹵化物和所加有機化合物的溶液來提高的。攪拌步驟在加入金屬鹵化物和有機化合 物，和后續(xù)的溫育期間都進行。合適的攪拌方法包括機械攪拌或搖動、劇烈通氣或任一相似 的技術。溫育階段以后，純化的酶變體隨后從分離的色素和其他雜質(zhì)中分離出來，并用例 如過濾，離心，微濾，旋轉(zhuǎn)真空過濾，超濾，加壓過濾，跨膜微濾，交叉流動膜微濾等等的常規(guī) 分離技術來收集。跨膜微濾可以是所用的一種方法。純化酶變體沉淀物的進一步純化可通 過用水清洗沉淀物得到。例如，純化酶變體沉淀物用含有金屬鹵化物沉淀劑的水洗滌，例 如，用含有金屬鹵化物和有機化合物沉淀劑的水洗滌。在培養(yǎng)時，熱穩(wěn)定的淀粉酶在培養(yǎng)液中在細胞外積累。為了期望的α-淀粉酶變 體的分離和純化，將培養(yǎng)液離心或過濾以除去細胞，所得的無細胞液體用于酶的純化。在一 個實施方案中，無細胞培養(yǎng)液用飽和度約70%的硫酸銨進行鹽析，70%飽和沉淀的級分隨 后在緩沖液中溶解，應用到例如Si^phadex G-100的柱子上，洗脫以回收酶變體活性級分。為 了進一步純化，可使用例如離子交換層析等常規(guī)步驟。純化的酶變體在一般使用酶變體的所有應用中都是有用的。例如，它們可用于洗 衣洗滌劑和污點去除劑、食品工業(yè)、淀粉加工和烘焙，以及藥物組合物中作為消化助劑。它 們可制成液態(tài)(溶液和漿液)或固態(tài)(顆粒和粉末)的最終產(chǎn)品。備選地，酶產(chǎn)物可回收，并且為了在酶不進一步純化的情況下通過過濾或離心來 除去細胞和細胞碎片，向培養(yǎng)基加入絮凝劑。用以上所述方法產(chǎn)生和純化的α -淀粉酶變體可用在多種有用的工業(yè)應用中。變 體具有有價值的性質(zhì)，這些性質(zhì)促進了織物與家庭護理(F&HC)相關的應用。這些變體可用 于從淀粉生產(chǎn)甜味劑和乙醇和/或織物脫漿。變體α-淀粉酶在淀粉轉(zhuǎn)變過程中特別有 用，所述轉(zhuǎn)變包括淀粉液化和/或糖化過程，例如WO 2005/111203和美國公布的申請?zhí)?0 06/0014265 (GenencorInternational，Inc.)中所述。變體也可用作洗滌、餐具清洗和硬表 面清潔洗滌劑組合物中的組分。α“淀粉酶變體的這些多種用途在下面更加詳細地描述。5.淀粉加工組合物和用途在另一方面，具有公開的α-淀粉酶變體的組合物可用于淀粉液化和/或糖化。淀 粉加工用于生產(chǎn)甜味劑，生產(chǎn)用作燃料或飲料(即可飲用乙醇)的乙醇，生產(chǎn)飲料，加工蔗 糖或生產(chǎn)期望的有機化合物，例如檸檬酸，衣康酸，乳酸，葡糖酸，酮類，氨基酸，抗生素，酶， 維生素和激素。淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)楣翘菨{通常由三個連續(xù)的酶過程組成液化過程，糖化過程和 異構化過程。在液化過程期間，變體地衣芽孢桿菌α-淀粉酶在約PH 5.5到約ρΗ6.2之間 的ρΗ，在約95°C到約160°C之間的溫度和約2小時內(nèi)將淀粉降解為糊精。典型地，加入約 ImM的鈣(約40ppm游離鈣離子)，以便優(yōu)化這些條件下的酶穩(wěn)定性。其他α -淀粉酶變體 可以需要不同的條件。液化過程后，可通過添加葡糖淀粉酶(如AMG )和如異構淀粉酶或支鏈淀粉酶 (如Promozyme ))等典型的脫支酶，將糊精轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。這一步驟以前，ρΗ降低到 低于約4. 5的值，保持高溫(高于95°C )，液化α “淀粉酶變體的活性被變性。溫度降低到 約60°C，可添加葡糖淀粉酶和脫支酶。典型地，糖化過程進行約24到約72小時。糖化過程后，ρΗ增加到范圍在約6. 0到約8. 0的值，如pH7. 5，通過離子交換去除 鈣。例如，葡萄糖漿隨后以固定化的葡萄糖異構酶(如Sweetzyme )轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖翘菨{。5. 1.液化組合物和用途美國專利號3，912，590和歐洲專利公布號252，730和63，909 (在此引入作為參 考)中描述了常規(guī)的淀粉轉(zhuǎn)化方法，如液化和糖化。在實施方案中，將淀粉轉(zhuǎn)化為如糖或脂 肪替代物等低分子量糖類組分的淀粉轉(zhuǎn)化過程包括脫支的步驟。在將淀粉轉(zhuǎn)化為糖的情況 下，淀粉被解聚。這樣的解聚過程由預處理步驟和兩個或三個連續(xù)的方法步驟(例如液化 過程、糖化過程，和依賴于期望的最終產(chǎn)物，典型地異構化過程)組成。天然淀粉由顯微顆 粒組成，這些顆粒在室溫下不溶于水。水性淀粉漿液被加熱時，顆粒膨脹并最終爆裂，將淀 粉分子分散到溶液中。在這一“凝膠化”過程期間，粘度急劇上升。由于典型工業(yè)過程中固 體水平在30-40%之間，淀粉必須變稀或“液化”以便于處理。粘度的這一降低當今大部分 通過酶降解得到。在液化步驟中，用α -淀粉酶將長鏈淀粉降解為分支和線性的較短的單元(麥芽 糊精)。液化過程的實施是在約105-110°C 5到10分鐘后在約95°C 1-2小時。pH在約5. 5 和約6. 2之間。為保證這些條件下有最佳的酶穩(wěn)定性，添加ImM鈣(40ppm游離鈣離子)。 這一處理后液化淀粉的“葡萄糖當量”(DE)為約10-15。α -淀粉酶變體可為實施液化過程提供至少一種改善的酶性質(zhì)。例如，變體α -淀 粉酶可以有更高的活性，和/或可以有降低的鈣需要性。典型地，需要加入游離鈣來保證 α -淀粉酶有足夠高的穩(wěn)定性，然而，游離鈣對葡萄糖異構酶的活性有強烈抑制。因此，應 通過昂貴的單元操作，在異構化階段之前將鈣去除到游離鈣水平在3_5ppm以下的程度。因 此，不需要鈣的變體代表了商業(yè)上的費用節(jié)省。所以，不需要鈣離子或?qū)︹}離子的需要降低 的α-淀粉酶變體是特別有利的。例如，鈣依賴性降低的α-淀粉酶變體可用在組合物和 步驟中，所述變體在低游離鈣濃度(<40ppm)下是穩(wěn)定和高活性的。這樣的α-淀粉酶變 體應在例如約4. 5到約6. 5的范圍中有pH最佳值。α -淀粉酶變體可單獨用于提供特異水 解，或與其他淀粉酶組合來提供具有廣譜活性的“混合物”。要加工的淀粉可以是高度精煉的淀粉質(zhì)量，例如，至少90%、至少95%、至少97% 或至少99. 5%純。備選地，淀粉可以是更粗制的淀粉，含有的物質(zhì)包含碾磨的完整谷物，包 括如胚芽殘余物和纖維等非淀粉部分。將如完整谷物等原料碾磨來打開結構，容許進一步 的加工。有兩種適合的碾磨方法濕碾磨和干碾磨。同樣，可應用玉米渣和碾磨的玉米渣。 干的碾磨谷物將除了淀粉以外還包含顯著數(shù)量的非淀粉糖類化合物。用蒸汽加壓鍋蒸煮來 加工這樣的異質(zhì)性物質(zhì)時，常僅僅實現(xiàn)淀粉的部分凝膠化。因此，對非凝膠化淀粉有高活性 的α"淀粉酶變體可有利地用于包括液化和/或糖化蒸汽加壓鍋蒸煮的干碾磨淀粉的方法 中。5. 2.糖化組合物和用途液化過程后，麥芽糖糊精通過葡糖淀粉酶(如，OPTIDEX L_400)和例如異淀 粉酶(美國專利號4，335，208)或支鏈淀粉酶等脫支酶的加入轉(zhuǎn)化為葡萄糖。這一步驟之 前，pH降到4. 5以下的值，維持高溫(95°C以上)使用于液化的α-淀粉酶失活，以減少稱 為“潘糖前體”的短寡糖的形成，所述“潘糖前體”不能被脫支酶恰當水解。溫度降低到約 60°C，加入葡糖淀粉酶和脫支酶。糖化過程進行約24-72小時。一般來說，液化步驟后α -淀粉酶變性時，約0. 2-0. 5 %的糖化產(chǎn)物是不能被支鏈
22淀粉酶降解的分支三糖Glc pa l-6Glc ρ α l_4Glc (潘糖)。如果糖化期間存在來自液化步 驟的活性淀粉酶(即不變性)，這一水平可高達約1_2%，這是非常不合期望的，因為它顯著 降低了糖化產(chǎn)率。期望的最終糖產(chǎn)物是例如高果糖糖漿時，葡萄糖漿可轉(zhuǎn)變?yōu)楣?。糖化過程后PH 上升到約6-8范圍內(nèi)的值，如pH 7. 5，并通過離子交換除去鈣。葡萄糖漿隨后用例如固定化 葡萄糖異構酶(例如Gensweet igi-hf)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖翘菨{。6.乙醇生產(chǎn)方法一般來說，從完整谷物的生產(chǎn)醇(乙醇)可分為4個主要步驟碾磨、液化、糖化和 發(fā)酵。碾磨谷物是為了將結構打開，容許進一步的加工。通常使用的兩種過程是濕碾磨 或干碾磨。干碾磨中，碾磨完整的谷仁并用于過程的剩余部分。濕碾磨給予胚芽和粗粉(淀 粉顆粒和蛋白質(zhì))很好的分離，除了一些例外，濕碾磨應用在存在糖漿平行生產(chǎn)的地方。在液化過程中，通過水解為DP大部分高于4的麥芽糖糊精來溶解淀粉顆粒。可通 過酸處理或α-淀粉酶的酶處理來實施水解。有限地使用酸水解。原料可以是碾磨的完整 谷物或來自淀粉加工的側流。酶液化典型地作為三步熱漿液過程進行。將漿液加熱到在 約60-95°C間，典型地在約80-85°C間，并加入酶。隨后漿液在約95_140°C間(典型地在約 105-125°C )高壓蒸煮，冷卻到約60-95°C，加入更多的酶以得到最后的水解。液化過程在約 PH 4. 5-6. 5下進行，典型地在pH約5. 0到約6. 0間進行。碾磨并液化的谷物也稱為醪液。為了產(chǎn)生能被酵母代謝的低分子糖DP1-3，來自液化的麥芽糖糊精必須被進一步 水解。典型地，水解使用葡糖淀粉酶，備選地α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶酶促進行。完 整的糖化步驟可持續(xù)長達72小時，然而，通常只進行典型40-90分鐘的預糖化，隨后在發(fā)酵 期間進行完全糖化(SSF)。糖化通常進行在pH約4.5，溫度約30-65°C下，典型地在約60°C 下進行。通常將來自酵母菌屬的酵母加入到醪液中，發(fā)酵進行24-96小時，例如典型地 35-60小時。溫度在約26-34°C之間，典型地在約32°C下，且pH在約pH 3-6,典型地在約pH 4-5。注意最廣泛使用的過程是同時糖化與發(fā)酵(SSF)過程，其中沒有糖化的保持階段，表 示酵母和酶是一起加入的。進行SSF時，通常在即將發(fā)酵之前，在溫度50°C以上引入預糖化步驟。發(fā)酵之后，蒸餾醪液以提取乙醇。根據(jù)本公開的方法獲得的乙醇可用作，例如燃料 乙醇；飲用乙醇，即適于飲用的中性酒精或工業(yè)乙醇。發(fā)酵剩余物是谷物，其典型地用作液 體形式或干燥的動物飼料。如何進行液化、糖化、發(fā)酵、蒸餾和乙醇回收的進一步細節(jié)為技 術人員所公知。根據(jù)本公開的方法，糖化和發(fā)酵可同時或分別進行。7.洗滌劑組合物和用途此處討論的α-淀粉酶變體可在洗滌劑組合物中配制，用于洗衣、清潔餐具或其 他清潔組合物中。7. 1.洗衣，清潔和餐具清洗組合物及其用途根據(jù)一個實施方案，一種或更多α -淀粉酶變體可以典型地是洗滌劑組合物的組 分和/或洗滌劑添加劑。像這樣，它可以以非粉化顆粒、穩(wěn)定液體或受保護酶的形式包含 在洗滌劑組合物中。可如美國專利號4，106，和4，661，452中所公開的來產(chǎn)生非粉化顆粒，并且可典型地用本領域已知方法進行包衣。蠟狀包衣物質(zhì)的例子是聚環(huán)氧乙烷產(chǎn)品；平均 摩爾質(zhì)量為1000到20，000的(聚乙二醇，PEG)；具有16到50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基 化壬基酚；乙氧基化脂肪族醇類，其中醇含有12到20個碳原子，并存在15到80個環(huán)氧乙 烷單元；脂肪醇類；脂肪酸；和脂肪酸的甘油單酯、二酯和三酯。適合通過流化床技術應用 的成膜包衣物質(zhì)的例子在例如GB專利號1483591中給出。例如，可以根據(jù)已建立的方法， 通過添加多元醇，例如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸來穩(wěn)定液態(tài)酶制劑。其他酶穩(wěn)定劑是 本領域公知的。可根據(jù)例如美國專利號5，879，920(GenenCor Int' 1，Inc.)或歐洲專利 號238216所公開的方法來制備受保護的酶。很久以來多元醇被認為是蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，并 且提高蛋白質(zhì)溶解性，如見 Kaushik 等人，“Why is trehalosean exceptional protein stabilizer ？ An analysis of the thermal stability ofproteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose” J. Biol. Chem. 278 :26458_65 (2003)禾口其中弓| 用的參考文獻；以及 Μ· Conti 等人，"Capillary isoelectric focusing :the problem of protein solubility, "J. Chromatography 757:237-245(1997)。洗滌劑組合物可以以任意便利的形式存在，例如，作為凝膠劑、粉劑、粒劑、糊劑或 液體。液態(tài)洗滌劑可以是水性的，典型地含有高達約70%的水和0%到約30%有機溶劑，也 可以是以只含有約30%水的致密凝膠類型的形式存在。洗滌劑組合物包含一種或更多種表面活性劑，每一種表面活性劑可以是陰離子 的、非離子的、陽離子的或兼性離子的。洗滌劑通常含有0%到約50%的陰離子表面活性 劑，例如線性烷基苯磺酸鹽(LAS) ； α-烯烴磺酸鹽(AOS)；烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽) (AS)；醇乙氧基硫酸鹽(AE0S或AES)；仲鏈烷磺酸鹽(SAS) ； α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯 基丁二酸；或者肥皂。組合物可含有0%到約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物 (ΑΕ0或AE)，羧化醇乙氧基化物，壬基酚醇乙氧基化物，烷基多苷(alkylpolyglycoside)， 烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)，乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺，脂肪酸單乙 醇酰胺或多羥基烷基脂肪酸酰胺，例如WO 92/06154中所描述的。洗滌劑組合物可額外包含任意組合的一種或多種其他酶，例如脂肪酶、角質(zhì)酶、蛋 白酶、纖維素酶、過氧化物酶和/或漆酶。洗滌劑可含有約到約65%的洗滌劑助洗劑或絡合劑，例如沸石、二磷酸鹽、三 磷酸鹽、膦酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙 酸(DTMPA)、烷基或烯基丁二酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(如來自Hoechst的SKS-6)。 洗滌劑也可以是未助洗的，即基本上不含洗滌劑助洗劑。可以在與酶穩(wěn)定性相容的任意組 合物中使用酶。通過已知的封裝形式，例如通過?；蛩z中隔離，來針對通常有害的組 分保護酶。酶，特別是含有或不含淀粉結合域的α-淀粉酶，并不限于洗衣和餐具清洗的應 用，而可用于表面清潔劑和從淀粉或生物量制取乙醇。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。例子包含羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、和聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚 物和十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可含有漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)可包含例如過硼酸鹽和過碳酸鹽的H2O2源，其通 常與形成過酸的漂白活化劑(如TAED或壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS))組合。備選地，漂白系 統(tǒng)可包含例如酰胺、酰亞胺或砜類型的過氧酸。漂白系統(tǒng)也可以是酶漂白系統(tǒng)，其中過水解酶激活過氧化物，如W02005/056783中所述。洗滌劑組合物的酶可用常規(guī)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定，例如多元醇，如丙二醇或甘油；糖或糖 醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯；可以如W092/19709和WO 92/19708中所描 述的配制組合物。洗滌劑也可含有其他常規(guī)洗滌劑成分，例如，織物柔順劑，包括如粘土、起泡劑、抑 泡劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染料、殺菌劑、明亮劑或香料。PH(水溶液以 使用的濃度測量)常常是中性或堿性的，例如約7. 0到約11. 0的pH。α-淀粉酶變體可以以常規(guī)應用于洗滌劑中的濃度引入?，F(xiàn)在考慮，在洗滌劑組 合物里，以對應于每升洗滌液0. 00001-1. Omg (以純酶蛋白計算)α-淀粉酶變體的量加入 α-淀粉酶變體。包含α-淀粉酶變體的特定形式的洗滌劑組合物可經(jīng)配制而包括(1)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含線性烷基苯 磺酸鹽(按酸計算)約7%到約12%;醇乙氧基硫酸鹽(如，C12_18醇，1-2環(huán)氧乙烷(EO))或 烷基硫酸鹽(如，C16_18)約到約4% ；醇乙氧基化物(如，C14_15醇，7E0)約5%到約9% ； 碳酸鈉(如，Na2CO3)約14%到約20% ；可溶性硅酸鹽約2到約6% ；沸石(如NaAlSiO4)約 15%到約22% ；硫酸鈉(如，Na2SO4) 0%到約6% ；檸檬酸鈉/檸檬酸(如C6H5Na307/C6H807) 約0%到約15% ；過硼酸鈉(如，NaBO3H2O)約11%到約18% ；TAED約2%到約6% ；羧甲基 纖維素(CMC)0%到約2% ；聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP, PEG)0-3% ；酶(按純 酶計算)0. 0001-0. 蛋白質(zhì)；以及次要成分(如抑泡劑，香料，明亮劑，光學漂白劑)0%到 約5%。(2)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含線性烷基苯 磺酸鹽(按酸計算)約6%到約11%;醇乙氧基硫酸鹽(如，C12_18醇，1-2E0)或烷基硫酸鹽 (如，C16_18)約到約3%;醇乙氧基化物(如，C14_15醇，7E0)約5%到約9%;碳酸鈉(如， Na2CO3)約15%到約21% ；可溶性硅酸鹽約到約4% ；沸石(如NaAlSiO4)約24%到約 34% ；硫酸鈉(如，Na2SO4)約4%到約10% ；檸檬酸鈉/檸檬酸(如C6H5Na307/C6H807)約 0%到約15% ；羧甲基纖維素(CMC)0%到約2% ；聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP, PEG) 1-6%;酶(按純酶計算)0. 0001-0. 蛋白質(zhì)；以及次要成分(如抑泡劑，香料)0%到 約5%。(3)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含線性烷基苯 磺酸鹽(按酸計算)約5%到約9% ；醇乙氧基化物(如，C12_15醇，7E0)約7%到約14% ； 作為脂肪酸的肥皂(如，C16-22脂肪酸)約1到約3% ；碳酸鈉(作為Na2CO3)約10%到約 17% ；可溶性硅酸鹽約3%到約9% ；沸石(作為NaAlSiO4)約23%到約33% ；硫酸鈉(如， Na2SO4)0%到約4% ；過硼酸鈉(如，NaBO3H2O)約8%到約16% ；TAED約2%到約8% ；膦酸 鹽(如，EDTMPA)0%到約1%;羧甲基纖維素(CMC) 0%到約2%;聚合物(如，馬來酸/丙烯 酸共聚物，PVP，PEG) 0-3%;酶(按純酶蛋白計算)0.0001-0. 1%;次要成分(如，抑泡劑，香 料，明亮劑)0%到約5%。(4)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含線性烷基苯 磺酸鹽(按酸計算)約8%到約12%;醇乙氧基化物(如，C12_15醇，7E0)約10%到約25%; 碳酸鈉(作為Na2CO3)約14%到約22%;可溶性硅酸鹽約到約5%;沸石(如，NaAlSiO4) 約25%到約35% ；硫酸鈉(如，Na2SO4)0%到約10% ；羧甲基纖維素(CMC)0%到約2% ；聚合物(如，馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1-3% ；酶(按純酶蛋白計算)0. 0001-0. 1% ； 以及次要成分(如，抑泡劑，香料)0%到約5%。(5)水性液體洗滌劑組合物，包含線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)約15%到約 21% ；醇乙氧基化物(如，C12_15醇，7E0或C12_15醇，5E0)約12%到約18% ；作為脂肪酸的 肥皂(如，油酸)約3%到約13% ；烯基丁二酸(C12_14)0%到約13% ；氨基乙醇約8%到約 18% ；檸檬酸約2%到約8% ；膦酸鹽0%到約3% ；聚合物(如，PVP, PEG)0%到約3% ；硼 酸鹽(如，B407) 0%到約2% ；乙醇0%到約3% ；丙二醇約8%到約14% ；酶(按純酶蛋白 計算)0.0001-0. ；以及次要成分(如，分散劑，抑泡劑，香料，明亮劑)0%到約5%。(6)水性結構液態(tài)洗滌劑組合物，包含線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)約15%到 約21 % ；醇乙氧基化物(如，C12_15醇，7E0,或C12_15醇，5E0) 3-9% ；作為脂肪酸的肥皂(如，油 酸)約3%到約10% ；沸石(作為NaAlSiO4)約14%到約22% ；檸檬酸鉀約9%到約18% ； 硼酸鹽(如，B407) 0%到約2%;羧甲基纖維素(CMC)0%到約2%;聚合物(如，PEG，PVP)0% 到約3% ；錨定聚合物(如，十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物)；摩爾比25 1，麗 3800)0%到約3% ；甘油0%到約5% ；酶(按純酶蛋白計算)0. 0001-0. 1% ；以及次要成分 (如，分散劑，抑泡劑，香料，明亮劑)0%到約5%。(7)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含脂肪醇硫酸 酯約5%到約10% ；乙氧基脂肪酸單乙醇酰胺約3%到約9% ；作為脂肪酸的肥皂0-3% ；碳 酸鈉(如，Na2CO3)約5%到約10% ；可溶性硅酸鹽約到約4% ；沸石(如，NaAlSiO4)約 20%到約40% ；硫酸鈉(如，Na2SO4)約2%到約8% ；過硼酸鈉(如，NaBO3H2O)約12%到約 18% ；TAED約2%到約7% ；聚合物(如，馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG)約到約5% ；酶 (按純酶蛋白計算)0. 0001-0. 1%;以及次要成分(如，明亮劑，抑泡劑，香料)0%到約5%。(8)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，包含線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)約8%到 約14% ；乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺約5%到約11% ；作為脂肪酸的肥皂0%到約3% ；碳 酸鈉(如，Na2CO3)約4%到約10% ；可溶性硅酸鹽約到約4% ；沸石(如，NaAlSiO4)約 30%到約50% ；硫酸鈉(如，Na2SO4)約3%到約11% ；檸檬酸鈉(如，C6H5Na3O7)約5%到 約12% ；聚合物(如，PVP，馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG)約到約5% ；酶(按純酶蛋白 計算)0. 0001-0. 1% ；以及次要成分(如，抑泡劑，香料)0%到約5%。(9)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，包含線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)約6%到 約12%;非離子表面活性劑約到約4%;作為脂肪酸的肥皂約2%到約6%;碳酸鈉(如， Na2CO3)約14%到約22% ；沸石(如，NaAlSiO4)約18%到約32% ；硫酸鈉(如，Na2SO4)約 5%到約20% ；檸檬酸鈉(如，C6H5Na3O7)約3%到約8% ；過硼酸鈉(如，NaBO3H2O)約4%到 約9% ；漂白活化劑(如，NOBS或TAED)約到約5% ；羧甲基纖維素(CMC)0%到約2% ； 聚合物(如，聚羧酸酯或PEG)約到約5% ；酶(按純酶蛋白計算)0. 0001-0. ；以及 次要成分(如，明亮劑，香料)0%到約5%。(10)水性液體洗滌劑組合物，包含線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)約15%到約 23% ；醇乙氧基硫酸鹽(如，C12_15醇，2-3E0)約8%到約15% ；醇乙氧基化物(如，C12_15醇， 7E0，或C1HJlSEO)約3%到約9% ；作為脂肪酸的肥皂(如，十二烷酸)0%到約3 % ；氨 基乙醇約到約5% ；檸檬酸鈉約5%到約10% ；水溶助長劑(如，甲苯磺酸鈉)約2%到 約6%;硼酸鹽(如，B407) 0%到約2% ；羧甲基纖維素0%到約1%;乙醇約到約3%;丙
26二醇約2%到約5% ；酶(按純酶蛋白計算)0. 0001-0. 1% ；以及次要成分(如，聚合物，分 散劑，香料，明亮劑)0%到約5%。(11)水性液體洗滌劑組合物，包含線性烷基苯磺酸鹽(按酸計算)約20%到約 32% ；醇乙氧基化物(如，C12_15醇，7E0，或C12_15醇，5E0)6-12% ；氨基乙醇約2%到約6% ； 檸檬酸約8%到約14%;硼酸鹽(如，B4O7)約到約3%;聚合物(如，馬來酸/丙烯酸共 聚物，錨定聚合物，例如十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物)0%到約3% ；甘油約3% 到約8%;酶(按純酶蛋白計算)0. 0001-0. 1%;以及次要成分(如，水溶助長劑，分散劑，香 料，明亮劑)0%到約5%。(12)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含陰離子表 面活性劑(線性烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽、α-烯烴磺酸鹽，α-磺基脂肪酸甲酯，鏈烷 磺酸鹽，肥皂)約25%到約40% ；非離子型表面活性劑(如，醇乙氧基化物)約到約 10% ；碳酸鈉(如，Na2CO3)約8%到約25% ；可溶性硅酸鹽約5%到約15% ；硫酸鈉(如， Na2SO4)0%到約 5% ；沸石(NaAlSiO4)約 15%到約 28% ；過硼酸鈉(如，NaBO3 · 4Η20)0%至Ij 約20%;漂白活化劑(TAED或NOBS)約0%到約5%;酶(按純酶蛋白計算)0. 0001-0. 1 % ； 次要成分(如香料和明亮劑)0 %到約3 %。(13)如以上組合物1)到12)描述的洗滌劑組合物，其中所有或部分的線性烷基苯 磺酸鹽被(C12-C18)烷基硫酸鹽取代。(14)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含(C12-C18) 烷基硫酸鹽約9%到約15%;醇乙氧基化物約3%到約6%;多羥基烷基脂肪酸酰胺約到 約5% ；沸石(如，NaAlSiO4)約10%到約20% ；層狀二硅酸鹽(如，來自Hoechst的SK56) 約10%到約20% ；碳酸鈉(如，Na2CO3)約3%到約12% ；可溶性硅酸鹽0%到約6% ；檸檬 酸鈉約4%到約8% ；過硼酸鈉約13%到約22% ；TAED約3%到約8% ；聚合物(如，聚羧酸 酯和PVP) 0%到約5% ；酶(按純酶蛋白計算)0.0001-0. ；以及次要成分(如，明亮劑， 光學漂白劑，香料，抑泡劑)0 %到約5 %。(15)洗滌劑組合物，其配制為顆粒，具有至少600g/L的堆積密度，包含(C12-C18) 烷基硫酸酯約4%到約8% ；醇乙氧基化物約11%到約15% ；肥皂約到約4% ；沸石MAP 或沸石A約35%到約45% ；碳酸鈉(作為Na2CO3)約2%到約8% ；可溶性硅酸鹽0%到約 4%;過碳酸鈉約13%到約22%;TAED羧甲基纖維素(CMC)0%到約3%；聚合物(如， 聚羧酸酯和PVP)0%到約3%;酶(按純酶蛋白計算)0. 0001-0. 1%;以及次要成分(如，明 亮劑，膦酸酯，香料)0 %到約3 %。(16)如以上1)_15)所描述的洗滌劑制劑，其含有穩(wěn)定的或包囊的過酸，作為額外 的組分，或者作為已指定漂白系統(tǒng)的替代物。(17)如以上1)，3)，7)，9)和12)所描述的洗滌劑組合物，其中過硼酸鹽被過碳酸
鹽替代。(18)如以上1)，3)，7)，9)，12)，14)和15)中描述的洗滌劑組合物，其額外地含有
錳催化劑。(19)洗滌劑組合物，其配制為非水相洗滌劑液體，其包含液態(tài)非離子表面活性劑， 例如線性烷氧基化伯醇，助洗劑系統(tǒng)(如，磷酸鹽)，酶和堿。洗滌劑也可包含陰離子表面活 性劑和/或漂白系統(tǒng)。
在另一實施方案中，2，6- β -D-果聚糖水解酶可摻入洗滌劑組合物，用于存在于家 居和/或工業(yè)織物/衣物上的生物膜的去除/清潔。洗滌劑組合物可以是例如配制為手或機器洗衣洗滌劑組合物，所述組合物包括適 合于玷污織物預處理和沖洗添加的織物柔順劑組合物的洗衣添加組合物，或者是配制為用 于一般家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者是為手或機器餐具清洗操作配制的。在特別的方面，洗滌劑組合物可包含2，6- β -D-果聚糖水解酶，一種或更多α -淀 粉酶變體，一種或更多其他清潔酶，例如蛋白酶，脂肪酶，角質(zhì)酶，糖酶，纖維素酶，果膠酶， 甘露聚糖酶，阿拉伯糖酶，半乳聚糖酶，木聚糖酶，氧化酶，漆酶和/或過氧化物酶，和/或它 們的組合。一般來說，所選酶的性質(zhì)應當與所選洗滌劑相容(如PH最佳值，與其他酶和非 酶成分的相容性等)，并且酶應以有效量存在。蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶?；瘜W修飾 或蛋白質(zhì)工程化的突變體也是合適的。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，如 堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。示例性堿性蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶類，特 別是那些源自芽孢桿菌屬的，如枯草桿菌蛋白酶Novo，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯 草桿菌蛋白酶309(如見美國專利號6，287，841)，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白 酶168(如見W089/06279)。示例性胰蛋白酶樣蛋白酶是胰蛋白酶(如來自豬或牛)，和 鐮孢屬蛋白酶(如見WO 89/06270和WO 94/25583)。示例性蛋白酶也包括但不限于WO 92/19729和wo 98Λ0115中描述的變體。合適的商業(yè)上可得到的蛋白酶包括Alcalase , Savinase ，Primase ，Duralase ，Esperase , and Kannase (Novo Nordisk A/S)； Maxatase , Maxacal ，Maxapem , Properase , Purafect ，Purafect OxP , FN2 ,和 FN3 (Genencorlnternational, Inc.)。脂肪酶合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的酶。包括化學修飾或蛋白質(zhì)改 造的突變體。示例性脂肪酶包含但不限于來自腐質(zhì)霉屬(同義詞Thermomyces)，例如 H. lanuginosa(T. lanuginosus)(例見歐洲專利號 258068 和 305216)和 H. insolens (例 見TO 96/13580)，假單胞菌脂肪酶(例如，來自產(chǎn)堿假單胞菌(P. alcaligenes)或類產(chǎn)堿 假單胞菌(P. pseudoalcaligenes)，例見歐洲專利號218272)，洋蔥假單胞菌(P. cepacia) (例見歐洲專利號331376)，施氏假單胞菌(P. stutzeri)(例見GB 1，372，034)，熒光假 單胞菌(P. f luorescens)，假單胞菌屬菌株 SD 705 (例見 WO 95/06720 和 WO 96/27002)， P. wisconsinensis (例見WO 96/12012)；芽孢桿菌脂肪酶(例如，來自枯草芽孢桿菌，例 見 Dartois 等人，Biochemica Biophysica Acta, 1131 :253_360 (1993))，嗜熱脂肪芽孢桿 菌(例見JP 64/744992)，或短小芽孢桿菌(例見WO 91/16422)。考慮使用在制劑中的額 外脂肪酶變體包括例如以下文件所述的變體WO 92/05249，WO 94/01541，WO 95/35381， W096/00292, WO 95/30744，WO 94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，W097/04079, WO 97/07202，歐洲專利號407225和260105。一些商業(yè)上可得到的脂肪酶包括Lipolase 和 Ivipolase Ultra (Novo Nordisk A/S)。聚酯酶合適的聚酯酶包括但不限于在WO 01/34899 (Genencorlnternational, Inc.)和WO 01/14629 (Geneneor International, Inc.)中所述的那些，且可與此處討論的 其他酶組合被包括在其中。淀粉酶組合物可與其他α-淀粉酶，例如非變體α-淀粉酶組合。這些可包括商業(yè)上可得到的淀粉酶，例如但不限于Duramyl ，Termamyl , Fungamyl 禾口 BAN (Novo Nordisk A/S), Rapidase VX R Purastar (Genencor International, Inc.) 0纖維素酶纖維素酶可加入組合物中。合適的纖維素酶包括來源于細菌或真菌的 那些。包括化學修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬，假單 胞菌屬，腐質(zhì)霉屬，鐮孢屬，梭孢殼屬和支頂孢屬的纖維素酶，例如美國專利號4，435，307； 5，648，263 ；5, 691, 178 ；5，776，757 ；和 WO 89/09259 中公開的產(chǎn)自 Humicola insolens, Myceliophthora thermophila和尖鐮孢的真菌纖維素酶?？紤]應用的示例性纖維素酶是對 織物有顏色護理益處的那些。這些纖維素酶的例子是例如歐洲專利號495257和531372 ； WO 99/25846 (Genencor International, Inc.), WO 96/34108 (Genencor International, Inc.), WO 96/11262 ；WO 96/29397和WO 98/08940中描述的纖維素酶。其他例子是纖維 素酶變體，例如在 WO 94/07998 ；WO 98/12307 ；WO 95/24471 ;PCT/DK98/00299 ；歐洲專利 號 531315 (Novo Nordisk)；美國專利號 5，457，046 ；5，686，593 和 5，763，254 中描述的那 些。商業(yè)上可得到的纖維素酶包括匸6丨11 )^116@和〔3代2丫1116 (Novo Nordisk A/S)； Clazinase 和 Puradax HA(GenencorInternational，Inc.)；以及 KAC-500 (B) (Kao Corporation)。過氧化物酶/氧化酶考慮的用于組合物中的合適過氧化物酶/氧化酶包括來自 植物、細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過氧化物 酶的例子包括來自鬼傘屬(Copr inus)，如，來自灰蓋鬼傘(C. cinereus)的過氧化物酶，以 及它們?nèi)鏦O 93/24618，W095/10602和WO 98/15257所述的變體。商業(yè)上可得到的過氧化 物酶包括例如 Guardzyme (Novo Nordisk A/S)。可通過加入含有一種或更多酶的單獨添加劑，或通過加入包含所有這些酶的組合 添加劑，將洗滌劑酶包括到洗滌劑組合物中。洗滌劑添加劑，即單獨添加劑或組合添加劑， 可配制為顆粒、液體和漿液等。合適的顆粒洗滌劑添加劑制劑包括非粉化顆粒。非粉化顆?？扇缑绹鴮＠?，106，991和4，661，452所公開的進行生產(chǎn)，并且典 型地可通過本領域已知的方法進行包衣。蠟狀包衣材料的例子是平均摩爾質(zhì)量為1000到 20，000的聚環(huán)氧乙烷產(chǎn)品(例如聚乙二醇，PEG)；具有16到50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基 化壬基酚；乙氧基化脂肪族醇類，其中醇含有12到20個碳原子，并存在15到80個環(huán)氧乙 烷單元；脂肪族醇類；脂肪酸；和脂肪酸的甘油單-和二-和三酯。適合通過流化床技術應 用的成膜包衣材料的例子，在例如GB 1483591中給出。例如，可以根據(jù)已建立的方法，通過 添加多元醇，例如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸，來穩(wěn)定液態(tài)酶制劑。受保護的酶可根據(jù)歐 洲專利號238216中公開的方法制備。洗滌劑組合物可以是任一便利的形式，例如，棒狀，片劑，凝膠，粉末，顆粒，糊劑或 液體。液態(tài)洗滌劑可以是水相的，典型地含有高達約70 %的水和O %到約30 %的有機溶劑。 也考慮含有30%或更少水的致密洗滌劑凝膠。洗滌劑組合物包含一種或更多種表面活性 劑，其可以是非離子的，包括半極性的，陰離子的，陽離子的或兼性離子的，及其任一組合。 表面活性劑典型地以按重量計0. 到60%的水平存在。此處包括時，洗滌劑典型地將含有從約到約40%的陰離子表面活性劑，例如 線性烷基苯磺酸鹽；α -烯烴磺酸鹽；烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)；醇乙氧基硫酸鹽；仲鏈烷磺酸鹽；α “磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基丁二酸；或者肥皂。此處包括時，洗滌劑通常含有從約0. 2%到約40%的非離子表面活性劑，例如 醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基多苷，烷基二甲基氧化胺，乙氧基化脂肪酸單乙 醇酰胺，脂肪酸單乙醇酰胺，多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-?；?N-烷基衍生物 ("glucamides，，)。洗滌劑可含有0%到約65%的洗滌劑助洗劑或絡合劑，例如沸石、二磷酸鹽、三磷 酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙 酸、烷基或烯基丁二酸、可溶性硅酸鹽或如來自Hoechst的SKS-6的層狀硅酸鹽。洗滌劑可包含一種或更多聚合物。例子是羧甲基纖維素(CMC))、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚乙烯咪唑、聚羧酸 酯，如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可含有漂白系統(tǒng)，該漂白系統(tǒng)可包含H2O2源，例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，所 述鹽可與產(chǎn)生過酸的漂白活性劑(如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸鹽)組合。備選 地，漂白系統(tǒng)可包含過氧酸(如酰胺類、酰亞胺類或砜類過氧酸)。漂白系統(tǒng)也可以是酶漂 白系統(tǒng)。可使用常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定洗滌劑組合物的酶，所述穩(wěn)定劑為例如多元醇(如丙二醇 或甘油)，糖或糖醇，乳酸，硼酸，硼酸衍生物(如芳香硼酸酯)，或苯基硼酸衍生物(如4-甲 ?；交鹚?。組合物可按WO 92/19709和WO 92/19708所描述的配制。洗滌劑也可含有其他常規(guī)洗滌劑成分，例如，包括粘土的織物柔順劑、起泡劑、抑 泡劑、防蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染料、殺菌劑、明亮劑、水溶助長劑、晦暗抑制 劑或香料?？紤]到在洗滌劑組合物中，添加的酶變體的量相應于約0. 01到約IOOmg酶蛋白/ 升洗滌液，特別地，約0. 05到約5. Omg酶蛋白/升洗滌液，或更特別地，0. 1到約1. Omg酶蛋
白/升洗滌液。例如，此處討論的α -淀粉酶變體可配制在洗滌劑組合物中，用于清潔餐具或其 他清潔組合物。這些組合物可為凝膠、粉末或液體。組合物可包含單獨的α-淀粉酶變體、 其他淀粉酶、其他清潔酶和其他清潔組合物中常有的組分。因此，餐具清洗洗滌劑組合物可包含表面活性劑。表面活性劑可以是陰離子的、非 離子的、陽離子的、兩性的或這些類型的混合物。洗滌劑可含有0%到約90%重量的非離子 表面活性劑，如低泡沫到無泡沫的乙氧基化丙氧基化直鏈醇類。在洗滌劑應用中，通常在含有丙二醇的液體組合物中使用α-淀粉酶變體。可通 過在含有10%氯化鈣的25%體積/體積丙二醇溶液中循環(huán)，來將α -淀粉酶變體溶解于例
如丙二醇中。餐具清洗洗滌劑組合物可含有無機和/或有機類型的洗滌劑助洗劑鹽。洗滌劑助 洗劑可細分為含磷和不含磷的類型。洗滌劑組合物通常含有約到約90%的洗滌劑助洗 劑。存在時，含磷無機堿性洗滌劑助洗劑的例子包括水溶性鹽，特別是堿金屬焦磷酸鹽、正 磷酸鹽和多磷酸鹽。存在時，含磷有機堿性洗滌劑助洗劑的例子包括水溶性膦酸鹽。存在 時，無磷無機助洗劑的例子包括水溶性堿金屬碳酸鹽、硼酸鹽和硅酸鹽，以及各種水溶性晶 體或無定形鋁硅酸鹽，其中最為人所知的代表是沸石。
合適的有機助洗劑的例子包括堿金屬、銨和取代銨、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、丙二酸 鹽、脂肪酸磺酸鹽、羧基甲氧基琥珀酸鹽、聚乙酸銨、羧酸鹽、聚羧酸鹽、氨基聚羧酸鹽、聚乙 酰羧酸鹽和聚羥基磺酸鹽。其他合適的有機助洗劑包括已知具有助洗劑性質(zhì)的高分子量聚合物和共聚物，例 如適當?shù)木郾┧?、聚馬來酸和聚丙烯酸/聚馬來酸共聚物，及其鹽。清潔組合物可含有氯/溴型或氧型漂白劑。無機氯/溴型漂白劑的例子是鋰、鈉 或鈣的次氯酸鹽和次溴酸鹽，以及氯化磷酸三鈉。有機氯/溴型漂白劑的實例是雜環(huán)N-溴 或N-氯酰亞胺，例如三氯異氰脲酸，三溴異氰脲酸，二溴異氰脲酸和二氯異氰脲酸，及其帶 有水溶性陽離子的鹽(例如鉀和鈉)。乙內(nèi)酰脲化合物也是合適的。清潔組合物可含有氧漂白劑，例如以無機過鹽酸的形式，典型地含有漂白前體或 作為過氧酸化合物。合適的過氧酸漂白化合物的典型例子是堿金屬過硼酸鹽的四水合物和 一水合物，堿金屬過碳酸鹽，過硅酸鹽和過磷酸鹽。合適的活化劑材料包括四乙?；鶃喴一?二胺(TAED)和三乙酸甘油酯。也存在酶漂白活化系統(tǒng)，例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，三乙酸 甘油酯和過水解酶，如WO 2005/056783所公開。清潔組合物可用酶的常規(guī)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定，例如多元醇如丙二醇；糖或糖醇；乳酸； 硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯。清潔組合物也可含有其他常規(guī)洗滌劑成分，例如反絮 凝劑，填充劑，抑泡劑，抗腐蝕劑，污物懸浮劑，掩蔽劑，抗污物再沉積劑，脫水劑，染料，殺菌 劑，熒光劑，增稠劑和香料。最后，α -淀粉酶變體可用在常規(guī)餐具清洗洗滌劑，如以下專利出版物描述的 任一洗滌劑中所述，考慮此處公開的α-淀粉酶變體用于替代或附加于所列專利和公布 的申請所公開的任一 α-淀粉酶CA 2006687，GB2200132, GB 2234980，GB 2228945，DE 3741617，DE 3727911，DE 4212166，DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651， WO 93/18129， W093/04153, WO 92/06157， WO 92/08777， WO 93/21299， WO 93/17089， W093/03129,歐洲專利號 481547，530870，533239，554943，429124，346137，561452，318204， 318279，271155，271156，346136，518719，518720，518721,516553，561446，516554，516555， 530635，and 414197，and U. S. Patent Nos. 5，112，518 ；5，141，664 和 5，240，632。7. 2.評估洗滌劑組合物的方法存在為數(shù)眾多的α _淀粉酶清潔測定法。測試清潔的示例性描述包括以下的。“樣 品”是一塊材料，如織物，有污漬附在其上。材料可以是，例如用棉、聚酯或天然和合成纖維 的混合物制造的織物。備選地，材料可以是紙，例如濾紙或硝酸纖維素，或一塊硬物，例如陶 瓷，金屬或玻璃。對α-淀粉酶，污漬是基于淀粉的，但可包括血，奶，墨水，草，茶，酒，菠菜， 肉汁，巧克力蛋，乳酪，粘土，色素，油或這些化合物的混合物。在一個實施方案中，α-淀粉 酶變體在BMI (血/奶/墨水)測定法中測試。“較小樣品”是一塊樣品，該樣品已經(jīng)用例如單孔穿孔機或者定制的96孔穿孔機切 割過(其中多孔穿孔機的式樣與標準96孔微量滴定板相配)，或者以別的方式從樣品上去 除。樣品可以是織物，紙，金屬或其他合適的材料。較小樣品可在其置入24-，48-或96-孔 微量滴定板的孔之前或之后將污漬附著上去。也可以通過將污漬應用到一小片材料上來制 作較小樣品。例如，較小樣品可以是帶有直徑5/8"或0.25'污漬的一塊織物。定制的穿 孔機是以這樣的方式設計的，其將96塊樣品同時遞送到96孔板的所有孔中。這一裝置通過簡單地裝載同一 96孔板數(shù)次，允許遞送每孔多于一個樣品。可構想多孔打孔裝置，用于 將樣品同時遞送到任一形式的板上，包括但不限于24孔，48孔和96孔板。在另一構想的方 法中，弄臟的測試平臺可以是用污漬底物涂布的金屬、塑料、玻璃、陶瓷或其他合適材料制 作的小珠。一個或更多經(jīng)涂布的小珠隨后被置于96-，48-或24-孔板或形式更大板上的孔 中，所述孔含有合適的緩沖液和酶。在這種情況下，可通過直接吸收測量或在二次顯色反應 后檢查上清液中釋放的污物。釋放的污物的分析也可通過質(zhì)譜分析進行。在一個實施方案中，處理方案提供了對污漬固定程度的控制。因此，可能產(chǎn)生這樣 的樣品，其例如在不含所測酶時清洗時釋放不同量的污漬。已固定樣品的使用導致清洗測 定中的信噪比顯著提高。此外，通過改變固定化程度，可產(chǎn)生在多種清洗條件下給出最佳結 果的污漬。在多種類型材料上具有已知“強度”污漬的樣品可通過商業(yè)途徑獲得(EMPA， St.Gallen, Switzerland ；Testgewebe GmbH, Krefeld Germany ； 或 Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands)禾口 / 或可由從業(yè)者制作(Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4) =280-286,1982) 樣品可包含，例如，含有用血 / 奶 / 墨 水(BMI)、菠菜、草或巧克力/奶/煤煙制作的污漬的含棉織物。例如BMI污漬可用0. 0003% 到0. 3%的過氧化氫固定到棉上。其他組合包括用0. 001%到戊二醛固定的草或菠菜， 0. 001%到戊二醛固定的明膠和考馬斯污漬，或者用0.001%到戊二醛固定的巧克 力、奶和煤煙。也可在用酶和/或洗滌劑制劑溫育期間攪動樣品。清洗性能數(shù)據(jù)依賴于孔中樣品 的朝向(水平對垂直)，特別是在96孔板中。這會表明溫育期間混合是不足夠的。雖然有 一些保證溫育期間足夠攪拌的方法，可制作板固定器，其中微量滴定板夾在兩塊鋁板之間。 這可像放置一樣簡單，例如，孔上的粘性板密封器，隨后用任一類型的適當?shù)目缮虡I(yè)得到的 夾子，將兩塊鋁板夾住96孔板。隨后可將其安裝到商業(yè)培養(yǎng)箱振蕩器上。設置振蕩器到約 400rpm,導致非常有效的混合，同時固定器有效避免了泄露或交叉污染。也可使用三硝基苯磺酸(TNBS)來定量清洗液中氨基的濃度。這可作為對從樣品 中除去的蛋白質(zhì)的量的測量(如見 Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249 184-200, 1997)。然而，如果洗滌劑或酶導致了異常的小肽片段的形成(例如來自樣品中肽酶的存 在)，則會得到更大的TNBS信號，即更多“噪音”。測量血/奶/墨水清洗性能的另一種方法是建立在可通過測量清洗液吸光度來定 量墨水釋放的基礎上?？稍?50和SOOnm間的任一波長測量吸光度。在一個實施方案中， 波長在410nm或620nm處測量。也可檢測清洗液以測定對含有草，菠菜，明膠或考馬斯污跡 的污漬的清洗性能。這些污漬的合適波長包括，對菠菜或草670nm，對明膠或考馬斯620nm。 例如，移出等分試樣的清洗液(典型地，例如從96孔微量培養(yǎng)板中移出100-150 μ L)，置入 比色皿或多孔微量培養(yǎng)板。隨即將其置入分光光度計，在適當?shù)牟ㄩL讀出吸光度。也可用 該系統(tǒng)來測定用于餐具清洗(例如在諸如布、塑料或陶瓷的合適基質(zhì)上使用血/奶/墨水 污漬)的合適的酶和/或洗滌劑組合物。在一個方面，通過在25°C下對BMI/棉樣品應用0. 3%過氧化氫30分鐘，或在60°C 下對BMI/棉樣品應用0. 03%過氧化氫30分鐘，將BMI污漬固定到棉上。從BMI/棉樣品上 切下約0.25"的較小樣品，置于96孔微量滴定板的孔中。向每個孔放置洗滌劑組合物與
32例如變體蛋白的酶的已知混合物。將粘性板密封器置于微量滴定板頂上以后，將微量滴定 板夾到鋁板，在有軌振蕩器上以約250rpm搖動約10到60分鐘。這一時間結束時，將上清 液轉(zhuǎn)移到新的微量滴定板的孔中，測量620nm處的墨水吸光度。對于通過在25°C下向菠菜 /棉樣品或草/棉樣品應用0. 01 %戊二醛30分鐘將菠菜污漬或草污漬固定在棉上的情況， 也可以進行相似的測試。也可用巧克力、奶和/或煤灰污漬做相同的測試。8.織物脫漿組合物和用途還考慮的是用一種或更多種α -淀粉酶變體處理織物(例如使織物脫漿)的 組合物和方法。α-淀粉酶變體可在本領域公知的任一織物處理方法(如見美國專利號 6,077,316)中使用。例如，在一個方面，通過包括將織物與溶液中的酶變體接觸的方法，改 善織物的手感和外觀。在一個方面，在壓力下用溶液處理織物。在一個方面，可在紡織品織造期間或以后，或在脫漿階段中或一個或更多附加的 織物處理步驟中應用酶。在紡織品織造期間，線暴露在可觀的機械應力之下。在機械織機 上紡織以前，常常用上漿淀粉或淀粉衍生物涂布經(jīng)紗，以增加其拉伸強度和避免斷裂?？蓱?用α-淀粉酶變體去除這些上漿淀粉或淀粉衍生物。在織物完成紡織后，織物可進入脫漿 階段。隨之而來的是一個或更多額外的織物加工步驟。脫漿是從織物上去除漿料的行為。 紡織以后，漿料涂料應在進一步加工織物以前除去，以便確保均一和防水的結果。同時提供 了脫漿方法，所述方法包括通過酶變體的作用進行漿料的酶水解。為了使包括含棉織物的織物脫漿，α -淀粉酶變體可作為如在水性組合物中的洗 滌劑添加劑單獨使用或與其他脫漿化學試劑和/或脫漿酶一起使用。α-淀粉酶變體也可 用于組合物，和用于在靛藍染的牛仔布織物和衣服上產(chǎn)生石洗外觀的方法。為了生產(chǎn)衣物， 織物可裁剪并縫進衣服或衣物，其之后進行整理。特別地，對牛仔褲的生產(chǎn)，發(fā)展了不同的 酶整理方法。牛仔布衣物的整理通常以酶脫漿步驟開始，脫漿步驟期間衣物經(jīng)受淀粉分解 酶的作用，以便為織物提供柔軟性，并使棉在后續(xù)酶整理步驟中更容易接近。α “淀粉酶變 體可用在整理牛仔布衣物(例如“生物石化方法”)、酶脫漿和向織物提供柔軟性和/或整 理加工的方法中。本公開包括以下例子的進一步細節(jié)，其無論如何不意圖限制權利要求的范圍。所 附的圖是所提供說明書和描述的整體部分。引用的所有參考資料在此明確引入作為對其中 所述所有內(nèi)容的參考。因此提供下述實施例是用于說明，但不限制權利要求。9.生物膜去除組合物和用途組合物可包含一種作為主要酶組分的α-淀粉酶變體，例如，用于去除生物 膜的單組分組合物。備選地，組合物可包含多種酶活性，例如多種淀粉酶或者包括以 下酶的混合物氨肽酶，淀粉酶(β _或α -或葡糖淀粉酶)，糖酶，羧肽酶，過氧化氫 酶，纖維素酶，殼多糖酶，角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α "半乳 糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶 (haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰 胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或 木聚糖酶或其任一組合用于去除生物膜。額外的酶可以是通過微生物能生產(chǎn)的，所述 微生物屬于曲霉菌屬，例如棘孢曲霉(A. aculeatus)，泡盛曲霉(A. awamori)，黑曲霉 或米曲霉；或者屬于木霉屬和腐質(zhì)霉屬，例如H. insolens ；或者鐮孢屬，如桿孢狀鐮孢(F. bactridioides), F. cerealis, F. crookwellense,大刀鍵抱(F. culmorum),禾本禾斗鍵 孢(F. graminearum),禾赤鐮孢(F. graminum),異孢鐮孢(F. heterosporum),合歡木鐮孢 (F. negundi),尖鐮孢(F. oxysporum),多枝鐮孢(F. reticulatum),粉紅鐮孢(F. roseum), 接骨木鍵抱(F. sambucinum)，膚色鍵抱(F. sarcochroum)，F(xiàn). sulphureum, F. toruloseum, F.trichothecioides,或 F. venenatum。包含α-淀粉酶變體的組合物可依據(jù)本領域已知方法制備，且可以是液態(tài)或干組 合物的形式。例如，含有α-淀粉酶變體的組合物可以是顆?；蛭⒘５男问??？梢罁?jù)本領 域已知方法穩(wěn)定組合物中將要包括的多肽。下面給出多肽組合物用途的例子。含有α-淀粉酶變體組合物的劑量和該組合 物使用的其他條件，可在本領域已知方法的基礎上確定。進一步考慮將α-淀粉酶與2， 6- β -D-果聚糖水解酶或其變體在組合物中一起使用。一個方面是生物膜的崩解和/或去除。此處所用的術語“崩解”應理解為，將生物 膜中個體微生物細胞連接和結合在一起的生物膜基質(zhì)中的多糖的水解，從而微生物細胞可 從生物膜上釋放并去除。生物膜可在表面存在；生物膜的崩解可通過將表面與水性培養(yǎng)基 接觸來實現(xiàn)，例如，通過浸漬、覆蓋或飛濺，此處，水性培養(yǎng)基包含α "淀粉酶變體，任選地， 包含一種或更多負責水解生物膜的其他酶，例如但不限于2，6-β -D-果聚糖水解酶。組合 物可用于水解粘土，例如在制漿和造紙工業(yè)的白水中。α -淀粉酶變體可以以 0. 0001 到 10000mg/L, 0. 001-1000mg/L，0. Ol-lOOmg/L，或 者甚至0. l-10mg/L的量存在。另外的酶和酶變體可以以相似或較少的量存在。該方法可在 從大約室溫到約70°C的溫度下進行。合適的溫度范圍是從約30°C到約60°C，例如，約40°C 到約50 0C ο對水解生物膜合適的pH在從約3. 5到約8. 5之間。特別合適的pH范圍是從約 5. 5到約8，例如從約6. 5到約7. 5。酶變體能有效去除生物膜的接觸時間或反應時間可以 差異相當大，其依賴于生物膜的性質(zhì)和單獨用酶變體或與其他酶(例如2，6-i3-D-果聚糖 水解酶)組合處理表面的頻率，但是合適的反應時間在約0. 25到約25小時之間。特別合 適的反應時間是從約1到約10小時，例如約2小時?？蓪⒘硗獾拿概cα -淀粉酶變體和2，6_β -D-果聚糖水解酶組合，所述另外的酶 包括但不限于纖維素酶，半纖維素酶，木聚糖酶，其他淀粉酶，包括其他α -淀粉酶，脂肪 酶，蛋白酶和/或果膠酶。酶可進一步與抗微生物劑例如酶或非酶殺生物劑組合。酶殺生物 劑可以是包含氧化還原酶的組合物，所述氧化還原酶例如漆酶或過氧化物酶，特別是鹵素 過氧化物酶，任選地增強劑，例如烷基丁香酸酯，例如WO 97/42825和DK 97/1273中所述。生物膜將要從其上去除和/或清除的表面可以是硬表面，該硬表面在定義上涉及 微生物基本不能滲透的任何表面。例子是金屬制作的表面，例如不銹鋼合金，塑料/合成聚 合物，橡膠，板材，玻璃，木頭，紙，織物，混凝土，巖石，大理石，石膏和陶瓷材料，其任選地可 用涂料，搪瓷，聚合物等涂布。相應地，表面可以是保持，運輸，加工或接觸水溶液的系統(tǒng)的 一員，例如供水系統(tǒng)，食品加工系統(tǒng)，冷卻系統(tǒng)，化學加工系統(tǒng)，藥物加工系統(tǒng)或木材加工系 統(tǒng)，例如在制漿和/或造紙工業(yè)中發(fā)現(xiàn)的。相應地，酶變體和含有酶變體的組合物在常規(guī)定 置洗凈(C-I-P)系統(tǒng)中有用。表面可以是系統(tǒng)單元的一員，例如管，槽，泵，膜，濾器，熱交換 器，離心機，蒸發(fā)器，攪拌器，噴淋塔，閥門和反應器等。表面也可以是用于醫(yī)學和工業(yè)的器具或其一部分，例如被污染的內(nèi)窺鏡，假肢裝置或醫(yī)學植入物。也考慮將用于生物膜去除的組合物用于避免金屬表面(如管道)被微生物生物膜 攻擊時發(fā)生所謂的生物腐蝕。組合物崩解生物膜，從而避免生物膜的微生物細胞形成會腐 蝕其附著的金屬表面的生物膜環(huán)境。9. 1. 口腔護理組合物抗-生物膜組合物的額外應用包括口腔護理。因此表面包括帶有牙菌斑的牙齒。 相應地，變體酶可用于組合物例如牙膏和制備藥物的方法，所述藥物包含用于崩解人或動 物牙齒上所存在牙菌斑的酶變體。進一步的用途是從粘膜上崩解生物膜，例如患囊性纖維 化病人肺中的生物膜。表面也可以是生物來源的其他表面，例如皮膚，牙齒，頭發(fā)，指甲或可 以是污染的隱形眼鏡。其他在口腔護理組合物中有用的酶包括但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶；葡 聚糖酶；齒斑葡聚糖酶(mutanases)；氧化酶，例如葡萄糖氧化酶；L-氨基酸氧化酶；過氧 化物酶，例如WO 95/10602中描述的鬼傘屬(Coprinus sp.)過氧化物酶或乳過氧化物 酶；鹵素過氧化物酶，特別是來自彎孢屬(Curvularia sp)的鹵素過氧化物酶，特別是來自 C. verruculosa和不等彎孢(C. inaequalis)的鹵素過氧化物酶；漆酶；蛋白酶，例如木瓜蛋 白酶；酸性蛋白酶(例如WO 95/02044中描述的酸性蛋白酶)；內(nèi)切葡糖苷酶；脂肪酶；淀粉 酶，包括淀粉葡糖苷酶，例如AMG (來自NovoNordisk A/S)；抗微生物酶及其混合物?？谇?護理產(chǎn)品可任選包含淀粉結合域，例如美國專利號6，207，149所公開的?？谇蛔o理組合物可以具有任一合適的物理形式，S卩，粉劑，糊劑，凝膠劑，液體劑， 軟膏劑，片劑等等?！?口腔護理組合物”包括可通過預防齲齒、預防牙菌斑和牙垢形成、去除 牙菌斑和牙垢、預防和/或治療牙病等，用于維持或改善人和動物嘴里口腔衛(wèi)生的組合物。 口腔護理組合物也包括清潔義齒、假牙等等的產(chǎn)品。口腔護理組合物的例子包括牙膏，牙霜 (dentalcream)，凝膠或牙粉，牙漱口劑，刷牙前或刷牙后沖洗制劑，口香糖，錠劑和糖果。牙 膏和牙膠典型地包括摩擦磨光材料，起泡劑，調(diào)味劑，保濕劑，粘合劑，增稠劑，甜味劑，增白 /漂白/除漬劑，水，和任選地酶。漱口劑，包括去除牙菌斑的液體，典型地包含水/醇溶液， 香料，保濕劑，甜味劑，起泡劑，著色劑，和任選地酶。摩擦磨光材料也可以摻入到口腔護理復合物中。相應地，摩擦磨光材料可包括氧 化鋁及其水合物，例如α -氫氧化鋁；三硅酸鎂；碳酸鎂；高嶺土 ；鋁硅酸鹽，例如煅燒硅酸 鋁和硅酸鋁；碳酸鈣；硅酸鋯；和粉末塑料，例如聚氯乙烯；聚酰胺；聚甲基異丁烯酸酯；聚 苯乙烯；酚醛樹脂；三聚氰胺甲醛樹脂；尿素甲醛樹脂；環(huán)氧樹脂；粉狀聚乙烯；硅石干凝 膠；水凝膠和氣凝膠等等。也適合作為摩擦劑的是焦磷酸鈣；不溶于水的堿性偏磷酸鹽；磷 酸二鈣和/或其二水化物，磷酸氫鈣；磷酸三鈣；顆粒羥基磷灰石等等。也可以使用這些物 質(zhì)的混合物。依賴于口腔護理組合物，摩擦產(chǎn)品可以以約0%到約70%的重量存在，例如， 從約到約70%。對于牙膏，摩擦材料含量通常占最終牙膏重量的10%到70%之間。使用保濕劑來避免例如水從牙膏的損失。用于口腔護理組合物的合適保濕劑包括 甘油；多元醇；山梨醇；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；1，3_丙二醇；1，4_ 丁二醇；氫化的部分水 解多糖等及其混合物。保濕劑在重量上一般占牙膏的0 %到約80 %，或者約5 %到約70 %。硅石，淀粉，黃蓍膠，黃原膠，鹿角菜提取物，藻酸鹽，果膠，纖維素衍生物，例如羥 乙基纖維素，羧甲基纖維素鈉和羥丙基纖維素，聚丙烯酸及其鹽，聚乙烯吡咯烷酮是幫助穩(wěn)定潔齒劑產(chǎn)品的合適增稠劑和粘合劑的例子。牙膏乳膏和凝膠中的增稠劑重量上占約 0. 到約20%，而粘合劑占最終產(chǎn)品重量的約0. 01到約10%?？墒褂闷鹋輨ǚ试?，陰離子的、陽離子的、非離子的、兩性和/或兼性離子的 表面活性劑。這些起泡劑存在的水平按重量計可以為最終產(chǎn)品的0%到約15%，約0. 1到 約13%，或者甚至約0. 25%到約10%。表面活性劑僅僅在其不會使現(xiàn)有酶失活的程度上是 合適的。表面活性劑包括脂肪醇硫酸鹽，具有10到20個碳原子的磺酸化單甘油酯或脂肪 酸的鹽，脂肪酸_白蛋白縮合產(chǎn)物，脂肪酰胺和?；撬岬柠}和/或羥乙磺酸脂肪酸酯的鹽。合適的甜味劑包括用在制劑中的糖精。香料，例如綠薄荷，也通常以較低的量存 在，例如按重量計約0. 01%到約5%，特別是從約0. 到約5%。增白/漂白劑包括H2O2， 并且按終產(chǎn)物重量計算，可以以少于約5 %或從約0. 25 %到約4%的量添加。增白/漂白劑 可以是酶，例如氧化還原酶。合適的牙齒漂白酶的例子描述在WO 97/06775 (Novo Nordisk A/S)中。通常以賦予組合物(如牙膏)可流動形式的量來添加水。也可以包括水溶性抗細 菌劑，例如氯己定二葡糖酸，海克替啶，雙胍啶，三氯生 ，季銨抗細菌化合物，和特定金屬離 子如鋅，銅，銀和二價錫(如氯化鋅，氯化銅和氯化亞錫，以及硝酸銀)的水溶性來源?？捎?的其他化合物包括氟化物源，染料/著色劑，防腐劑，維生素，PH調(diào)節(jié)劑，抗齲劑和脫敏劑等寸。酶在如上所述的口腔護理組合物中也是有用的。用于清潔口腔時，酶提供了幾個 優(yōu)勢。蛋白酶分解唾液蛋白，其被吸附到牙齒表面的并形成菌膜(所得牙菌斑的第一層)。 蛋白酶與脂肪酶一起通過裂解形成細菌細胞壁和細胞膜結構組分的蛋白質(zhì)和脂類來破壞 細菌。葡聚糖酶和其他糖酶，例如2，6-β-D-果聚糖水解酶分解為細菌粘附形成基質(zhì)的細 菌所產(chǎn)生的有機骨架結構。蛋白酶和淀粉酶不僅防止牙菌斑形成，也通過分解結合鈣的糖 類_蛋白復合物來避免礦化的發(fā)展。牙膏可典型地包含以下成分(按最終牙膏組合物的重量％ )摩擦材料到約70%; 保濕劑0%到約80%;增稠劑約0. 到約20%;粘合劑約0. 01%到約10%;甜味劑約 0. 到約5% ；起泡劑到約15% ;±曾白劑到約5% ；和酶約0. 0001%到約20%. 在一個實施方案中，牙膏具有約6. 0到約8. 0的ρΗ，且包含約10 %到約70 %摩擦材料；0 % 到約80%保濕劑；0. 到約20%增稠劑；0. 01%到約10%粘合劑；約0. 到約5%甜味 劑；0%到約15%起泡劑；0%到約5%增白劑；和約0. 0001%到約20%的酶。這些酶包括 α -淀粉酶變體單獨或和其他酶組合，例如與2，6-β -D-果聚糖水解酶，任選地上面提到的 其他類型酶組合。漱口劑典型地可包含以下成分(按最終漱口劑組合物的重量％計)0%到約20% 保濕劑；0%到約2%表面活性劑；0%到約5%酶；0%到約20%乙醇；0%到約2%其他成分 (如香料，甜味劑，活性成分例如氟化物)。組合物也可含有從約0%到約70%的水。漱口 劑組合物可用適當?shù)木彌_劑(例如在約6.0到約7. 5ρΗ范圍內(nèi)的檸檬酸鈉或磷酸鈉)來緩 沖。漱口劑可以是非稀釋形式的，也就是說，在使用前應稀釋。口腔護理組合物可用口腔護 理領域內(nèi)已知的任一常規(guī)方法來產(chǎn)生。
實施例實施例1-變體的構建
野生型LAT序列的S239Q突變是用位點定向誘變法構建的。誘變的模板是通過使 用 New England Biolabs (Beverly, ΜΑ)的 dam_ 甲基化酶得到的甲基化 pHPLT-LAT (圖 1)。 5個最初的帶有互補序列的磷酸化正向和反向弓丨物是通過Integrated DNA Technologies， Coralville, IA 合成的，在 TE 緩沖液中稀釋到 50 μ Μ。以 Stratagene QuikChange Multi Site-DirectedMutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)，使用側翼為 239 殘基上游和 下游序列的谷氨酰胺突變含有CAA密碼子的寡核苷酸引物，來產(chǎn)生突變體。將239位的絲 氨酸⑶殘基突變成谷氨酰胺(Q)。用于誘變的引物是LAT-S239Q-F :GTCAAACACATTAAATT TCAATTTTTGCGGGATTGGGLAT-S239Q-R :CCCAATCCCGCAAAAATTGAAATTTAATGTGTTTGAC反應如下進行QuikChange 反應反應液共25yL，由以下成分組成13yL無菌蒸餾水，來自試劑盒的2. 5yL IOX 緩沖液，來自試劑盒的IyL dNTPs，0. 25yL正向引物(50 μ M貯存液)，0. 25uL反向引物 (50 μ M貯存液)，7 μ L作為模板的pHPLT-LAT質(zhì)粒DNA (約98ng)，和1 μ L來自試劑盒的酶 混合物。循環(huán)條件循環(huán)條件是在DNA Engine Dyad 熱循環(huán)儀(Bio-Rad，Hercules, CA)中，95O 1 分 鐘一次，隨后95°C 1分鐘，55°C 1分鐘，65°C 10分30秒，進行30個循環(huán)。進行QuickChange反應后向反應混合物加入1 μ L的Dpn I (10U/ μ 1)，37°C下溫育 18小時，隨后另加入0. 5 μ 1溫育3小時。使用2微升Dpn I消化反應物作為用Templiphi擴增試劑盒(GEHealthcare, Piscataway, NJ)進行滾環(huán)擴增的模板，根據(jù)制造商說明書進行反應。1微升滾環(huán)DNA轉(zhuǎn)化 進入100 μ 1的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞(缺失2個蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株(AaprE， AnprE, degUHy32, ορρΑ, Δ spoIIE3501, amyE: :xylRPxylAcomK-phleo))中，在 37°C下?lián)u動 1小時。然后整個轉(zhuǎn)化物接種在LA+10ppm新霉素+1%不溶淀粉平板(一個平板上25 μ L， 另一個平板上 75yL)上。用 Illustra PureTaq Ready-To-GoPCR 珠(GE Healthcare, Piscataway, NJ)和基5’和3’端側翼的寡核苷酸引物PCR來進行菌落PCR。菌落PCR的 引物在 TE 緩沖液(Integrated DNATechnologies, Coralville, ΙΑ)中稀釋到 50 μ Μ。菌落 PCR所用引物是pHPLT-Fl TACATATGAGTTATGCAGTTTGpHPLT-Rl GTTATGAGTTAGTTCAAATTCG反應液由24 μ L無菌蒸餾水，0.5μ L正向引物(50 μ M貯存液)，0. 5 μ L反向引物 (50 μ M貯存液)，非常少量的目的菌落在單獨的1.5mL管中混合在一起組成。將這一混合 物加入到PCR珠。菌落PCR的循環(huán)條件循環(huán)條件是在DNA Engine Dyad 熱循環(huán)儀(Bio-Rad，Hercules，CA)中，95°C 10 分 鐘一次，隨后95°C 1分鐘，53°C 1分鐘，72°C2分鐘進行25個循環(huán)，隨后最后步驟為72°C下 1分鐘。使用ExoSAP-IT (USB Corp.，Cleveland, 0H)，通過將 10 μ L PCR 產(chǎn)物與 4 μ L 的 ExoSAP混合，隨后在37°C溫育15分鐘，80°C溫育15分鐘，來凈化PCR產(chǎn)物以便除去過量的dNTPs。 白勺胃IPCRQuintara Biosciences (Berkeley, CA) flj·。LAT-S239SEL 用DNA 2. O(Menlc) Park, CA)合成制備對位置239的絲氨酸殘基的位點評價庫 (SEL)。在pHPLT-LAT質(zhì)粒中產(chǎn)生突變體，并轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主(2個蛋白酶缺失 (AaprE, AnprE, AspoIIE, amyE: xylRPxylAcomK-phleo))中。進行的氨基酸替換是A， C, D, Ε, G，H，I，K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V, W 禾口 Y。實施例2-變體的表達，純化和表征挑選LAT S239變體進入含有125 μ ILB和IOppm新霉素的96孔微量滴定板，并 與對照排列成四方形式。排列好的微孔滴定板在37°C 250rpm下培育6小時。使用復制 工具(Enzyscreen，Leiden, The Netherlands)，微量滴定培養(yǎng)板用于接種新的微量滴定 板(來自Enzyscreen，Leiden, TheNetherlands的微量滴定板和板蓋)，其中新板含有 用于蛋白質(zhì)表達(G. Vogtentanz et al, A Bacillus subtilis fusion protein system to producesoybean Bowman-Birk protease inhibitor, Prot.Expr.& Purif.,55: 40-52(2007))的175μ1 MBD培養(yǎng)基，并補充IOppm新霉素和5mM氯化鈣。表達板在37°C、 25rpm和70%濕度下培育64小時。表達培養(yǎng)物隨后通過微濾板(0. 22 μ m，Millipore， Billerica, ΜΑ)過濾以便掃描。淀粉酶的發(fā)酵在500mL搖瓶里發(fā)生，在含有1 % (w/v)大豆胨(Soytone)的基 本 MOPS 培養(yǎng)基中 37°C 下培育 60 小時(Neidhardt 等人，J. Bacteriol. , 119(3) :736_747， 1974)。用Phenyl SEPHAR0SE 6 Fast Flow(high sub) (GE healthcare，17-0973-05)，使 用疏水作用層析從發(fā)酵液中純化S239Q變體和野生型α-淀粉酶(分別是SEQ ID NOS :2和 4)。簡言之，發(fā)酵液濃縮10倍，隨后用50mM MES, 2mM CaCl2, pH 6. 8 (含IM硫酸銨)稀釋，并 用12. 5cm玻璃纖維濾器(Watman，1825-125)進行過濾除菌。隨后樣品裝載到已用相同緩沖 液預平衡的苯基瓊脂糖 FF 高密度柱(20 χ 95mm ；Amersham, GEHealthcare Bio-Sciences, Sweden)。用10個柱體積的不含硫酸銨的相同緩沖液，隨后用5個柱體積的水洗除非淀粉 酶蛋白。最后，目的酶用PH 6.8，含有40%丙二醇的50福MES, 2mM CaCl2進行稀釋。通過標準定量SDS page凝膠光密度測定法，或通過來自Megazyme (Wicklow， Ireland)的標準淀粉酶測定試劑盒的活性測定方法測定蛋白質(zhì)濃度。實施例3-改變性質(zhì)的測定這一實施例顯示，此處描述的變體可以相對于野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶具 有改變的性質(zhì)。進行了變體的高通量熱穩(wěn)定性篩選。研究并選擇了熱脅迫條件，使得在熱脅迫后，起始的野生型酶(SEQ IDNO 4)顯示 出其未脅迫活性的約40% (也就是說，熱脅迫后活性/熱脅迫前活性約為0.4)。突變體文 庫以一式四份篩選，那些在熱脅迫后顯示出比初始野生型酶的平均殘留活性高至少兩個標 準差的殘留活性的酶被鑒定為潛在的勝利者。表達板的培養(yǎng)上清液中淀粉酶表達約為lOOpprn。在增濕振蕩器里(250rpm和70% 相對濕度)37°C下培養(yǎng)60-65小時后，用濾板澄清培養(yǎng)上清液以去除細胞物質(zhì)。澄清的上 清液稀釋 10 倍進入含有 50mM Na0Ac,2. 6mM CaCl2,0. 002% TffEEN 20,pH 5. 8 的緩沖液，至 大約IOppm的終濃度。一等分試樣的上清液進一步稀釋到0. 02ppm,使用熒光標記玉米淀粉底物(Invitrogen，San Diego CA, E33651)如下所述測定酶變體的活性。上清液的另一 等分試樣在熱循環(huán)器中95°C下在接受30分鐘的熱脅迫，隨后在50mM Na0Ac,2. 6mM CaCl2, 0. 002% TffEEN 20，pH 5. 8中稀釋到0. 02ppm，用如下所述相同的熒光底物和測定法測定殘
留活性。用淀粉酶EnzCheck測定法，基本如生產(chǎn)商(Invitrogen，San Diego, CA)所述，測 定α _淀粉酶活性。測定中淀粉酶的終濃度是約0. 02ppm。測定緩沖液是50mM Na0Ac,2. 6mM CaCl2,0. 002% TffEEN 20，pH 5.8。底物是來自玉米(Invitrogen, Eugene, OR)的 BODIPY 熒光染料結合的 100μ g/mLDQ 淀粉。用 Spectomax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)來測量增加的熒光，其表明淀粉酶活性。在室溫下監(jiān)測反應5分鐘，用儀器記錄動力學 模式。激活波長是485nm ；用515nm處的截斷濾光片來監(jiān)測520nm處的發(fā)射。在95°C受熱脅迫30分鐘后，野生型LAT顯示了約43_55%的殘留活性。在同樣的 熱脅迫條件下LAT S239Q變體(LAT-Q可與S239Q或239Q互換使用)保持了約73-75%的 殘留活性。在相同熱脅迫條件下LAT S239A變體保持了約61%的殘留活性。見圖2。這些 殘留活性測量結果表明S239Q和S239A變體兩者均比野生型α -淀粉酶更加熱穩(wěn)定。表1 在95°C受熱脅迫30分鐘后每種變體樣品的百分比殘留活性 另外，生化表征了 LAT S239變體。典型的生化測定如下所述。酶制備為在50mM乙 酸鈉，pH 5. 8中0. 2mg/mL。通過將40 μ L來自土豆的7. 5% (w/v)支鏈淀粉(Sigma-Fluka 10118)與IOyL 250mM乙酸鈉，pH5. 8在0. 2ml PCR型管條中混合制備底物。通過向預溫 育的底物加入10 μ L稀釋的酶樣品，以渦旋快速混合來開始酶反應。在帶有加熱蓋(80°C ) 的PCR型熱循環(huán)加熱塊(Mastercycler Gradient, Eppendorf)上50°C進行溫育。剛好4分 鐘后，通過加入60μ 1 0. IN NaOH并以渦旋快速混合來終止反應。所有反應一式兩份進行。 反應物中存在的總還原糖如下所述用DNS法測定20μ 1樣品與4(^1^水在0. 2mL管PCR型 96孔板中混合。60微升DNS試劑(2. 5N NaOH, 43. 8mM 3-5 二硝基水楊酸[Sigma D-0550]， 1.06M酒石酸鉀鈉[Sigma S6170])通過上下移液完全混合到每個管中。用PCR型熱循環(huán)加 熱塊，96孔板在95°C下溫育2分鐘，隨后快速冷卻到25°C。從每個管中轉(zhuǎn)移100微升混合 物到96孔平底微量滴定板，在543nm測定整個板的光密度。不同緩沖液中測量LAT S239Q變體和野生型LAT的殘留活性。將pH3. 5,4. 0,4. 5， 5.0,5. 25,5.5,5. 75和6. 25的10微升等分試樣的300mM乙酸鈉緩沖液分別置入PCR型管條 的8個0. 2mL管的各管中。為每種酶準備了 4個這樣的條(一共8個條)，并置入冰浴中。 用含有0. 005% TWEEN80的水制備0. 12mg/ml的酶。50微升每種酶等分到4個管條中，蓋 好，以渦旋快速混合。對每一種酶，放置3個條在預熱的85°C加熱塊(如上所述)上。剛好 30，60和120秒后，代表各酶的一個條從加熱塊上移出，并返回冰浴。所有管中存在的活性 使用以上所述方法，50°CpH 5. 8下從5%支鏈淀粉中釋放的總還原糖的方法來測定。熱處理過的管中存在的活性據(jù)報告與留在冰上的管中存在的活性成比例。盡管0. lmg/ml的兩 種酶在85°C pH5或更高pH時，在緩沖液中溫育長達2分鐘后有相似的穩(wěn)定性/殘留活性， 但是LAT S239Q變體顯示了較低pH值下更大的殘留活性(圖3)。LAT S239Q變體和野生型LAT在底物中的殘留活性是準確按上面測定的，具有以 下例外每種酶準備了 5個管條(共10個)。在所有管中40微升7. 5%支鏈淀粉與緩沖 液等分試樣混合。向所有管加入并混合10微升含有0. 005% TffEEN 80的水中的0. 6mg/ml 酶，并置于冰浴中。管如上進行熱處理，只是每種酶4管置于85°C下1. 25，2. 5，5，10分鐘。 如生產(chǎn)商的說明(Invitrogen)用Bodipy測定法測定活性之前，所有管中的物質(zhì)在pH5. 8 的50mM乙酸鈉中按1 10稀釋。與以上結果相似，在5%支鏈淀粉，0. lmg/ml總蛋白質(zhì)中 溫育時，較低PH值下LAT S239Q變體有更高的殘留活性。支鏈淀粉的存在似乎增加了穩(wěn)定 性/殘留活性(圖4)。為比較S239Q變體和野生型LAT之間的pH譜，將10微升如上所述范圍的300mM 緩沖液置入8管PCR型管條的各個管中。向所有管加入40微升7. 5%支鏈淀粉，快速混合， 隨后如上所述在85°C進行預溫育。通過快速添加IOyL 0. 15mg/ml的酶，隨后以渦旋快速 混合開始反應。如上所述在45秒后終止反應。所有反應一式三份進行。如上所述通過DNS 測定來決定總還原糖。結果顯示，LAT S239Q變體似乎在pH < 5. 0下有比野生型LAT更多 的活性(圖5)。評估了 LAT S239Q變體和野生型LAT兩者的溫度譜。10微升250mM乙酸鈉，pH 5. 8置入PCR型0.2ml管條的所有六個管。準備了 12個條。將40微升7. 5%支鏈淀粉混 合到所有管中。給梯度PCR加熱塊(Mastercycler Gradient, Eppendorf)編程到在大約 45-99°C的溫度范圍內(nèi)為5°C增量。酶制備為在50mM乙酸鈉，pH 5. 8中0. 15mg/ml ；各酶取 200 μ L置于0. 2mL管條的6個管的3個中，用作酶貯庫。含有底物/緩沖液混合物的管在 期望的溫度下預溫育1-2分鐘。通過從加入來自貯庫的10 μ 1各酶(得到3個平行反應)， 并快速短暫混合開始酶反應。如上在30秒后終止反應。用前面所述的DNS測定法來測定 存在的總還原糖。在分辨各溫度(在似乎對于穩(wěn)定性的最佳ρΗ，ρΗ5.8)下酶穩(wěn)定性和反應 速率的持續(xù)努力中，使用30秒的短暫溫育時間。不幸的是，這樣短暫的溫育可導致重復數(shù) 據(jù)的較高偏差。反應一式三份進行，標準差顯示在報告數(shù)據(jù)的誤差線中(圖6)。兩種酶在 它們的溫度譜中幾乎相互反映，LAT S239Q變體似乎有更高的比活性(雖然這可能是由于 它是純的，且酶以相同蛋白質(zhì)水平使用的事實)。重要的是兩者在90°C下活性有顯著提高。 900C以上，LATS239Q變體看來也比野生型LAT保持了更多的相對活性。實施例4-改變性質(zhì)的測定DSCS239Q變體和野生型α -淀粉酶(分別是SEQ ID NOS 2和4)是用疏水作用層析 從搖瓶發(fā)酵液(見例2)中純化出來的。pH 6. 8，含有40%丙二醇和2mM CaCl2的50mM MES 從柱中洗脫純化形式的蛋白質(zhì)。用超靈敏掃描高通量微量熱計VP-Cap DSC(MicroCal, Inc.，Northampton, ΜΑ) 來測量過熱容量曲線。DSC測量的標準步驟和技術原理先前已經(jīng)發(fā)表(Freire，Ε. (1995) Differential Scanning Calorimetry，Methods. Mol. Biol. 41，191-218)。存在多種濃度 氯化鈣(0，0. 1，0. 15，0. 2，0. 5，1 和 2mM)的情況下，約 500 μ L 的 0. 5mg/ml LAT，LAT S239Q 和SPEZYME Fred (Genencor)在30_125°C的溫度范圍下進行掃描。同一樣品隨后重新掃描以檢查該過程的可逆性。對α-淀粉酶，熱解折疊過程是不可逆的。所用緩沖液是 IOmM乙酸鈉，ρΗ5. 5。使用200°C /小時的掃描速度使可以由聚集產(chǎn)生的任何假象最小化。 用DSC曲線的熱中點(Tm)作為熱穩(wěn)定性的指征。此外，LAT S239Q變體和野生型LAT的熱解折疊譜在鈣缺失、存在2mM氯化鈣和 存在2mM阿卡波糖的情況下進行比較。α _淀粉酶的底物類似物阿卡波糖能夠模擬結合到 α-淀粉酶上底物的潛在穩(wěn)定化效應。表2顯示所測淀粉酶蛋白的熱熔點。在缺失和存在2mM氯化鈣的情況下S239Q變體的熱解折疊顯示，與野生型LAT相 比，變體的熔點顯著提高。不存在添加的氯化鈣時，LAT熱熔點為90. rc ；S239Q變體的Tm 為109. 1°C。因此，S239Q替換導致Tm上升19°C。2mM氯化鈣存在時，表征的LAT具有102. 1°C的熱熔點，而S239Q變體的Tm是 110. 2°C。因此，2mM氯化鈣存在時，兩種蛋白都顯示了提高的Tm值。LAT和S239Q變體的 Tm提高分別是12°C和1. 1°C。這顯示了 S239Q變體的穩(wěn)定性較少依賴于鈣。2mM阿卡波糖存在時，表征的LAT具有95. 2°C的熱熔點。S239Q的Tm是109. 8°C。 因此，2mM阿卡波糖存在時，兩種蛋白都顯示了提高的Tm值，表明阿卡波糖能夠在結構上穩(wěn) 定α -淀粉酶。LAT和S239Q變體的Tm提高分別是5. 1°C和0. 7°C。這說明S239Q變體的 熱穩(wěn)定性較少受阿卡波糖存在的影響。這說明S239Q變體的熱動力學性質(zhì)與LAT的不同，并與S239Q變體在應用研究中 的增強性能相一致(見例5-6)。Tm改變和鈣結合曲線表明LAT S239Q變體內(nèi)在地比野生 型LAT更加熱穩(wěn)定，并且與野生型LAT相比其熱穩(wěn)定性較少依賴于鈣。表2 由Tm (°C )反映的熱解折疊譜 實施例5_活性譜這一實施例表明S239Q變體(SEQ ID NO 2)不僅相對于野生型α -淀粉酶(SEQ ID NO :4)，也相對于工業(yè)標準SPEZYME Fred(GenenCor)有改變的活性譜。蛋白質(zhì)測 定是用純化的或平板樣品進行的。實驗變體和野生型α-淀粉酶兩者都是以相同蛋白質(zhì)濃 度施用的。平板或純化的變體之任一種用ρΗ 5. 6的蘋果酸緩沖液稀釋到大約20ppm。底物 是由PH 5. 6的相同的50mM蘋果酸緩沖液中的15%玉米淀粉組成的。四百微升淀粉懸浮 液平衡在70°C下2. 5分鐘。隨后7 μ L稀釋的酶快速添加到平衡的淀粉(最終蛋白濃度約 0. 36ppm)中。反應混合物隨后置于預熱的85°C搖動加熱塊，以300rpm混合。在預設的時 間間隔下，用50 μ L的125mM NaOH來淬滅反應。隨后旋轉(zhuǎn)反應管，上清液10倍稀釋到IOmM NaOH中，以便用HPAEC-PAD分析DP譜，所述HPAEC-PAD是分辨和定量大小在約DP1-DP40范圍內(nèi)的糖聚合物的靈敏方法。反應設定為4，10和20分鐘。將從DP2到HPLC運行結束的總峰面積積分，將面積 除以總蛋白質(zhì)和反應時間，產(chǎn)生任意單位的代表相對活性的值。4分鐘的反應提供了對酶開始分解底物有多快的指示；10分鐘的反應提供了酶的 熱活性的指示，20分鐘的反應提供了酶的熱穩(wěn)定性的指示。結果在表3提供。Table 3 野生型LAT、LAT S239Q變體和FRED的活性譜 實施例6-蒸煮鍋中的液化35% DC淀粉漿液用20%碳酸鈉溶液調(diào)至pH 5. 8。加入沒有鈣的IOOppm 二氧化 硫。在夾層鍋中用水和蒸汽將漿液加熱到70°C (158° F)。加入液化酶LAT S239Q變體 (SEQ ID NO 2)和SPEZYME Fred (Genencor)到漿液以實現(xiàn) 10LUs/g 的 DS。在約 10 分鐘內(nèi)加熱混合物到85°C (185° F)。在85°C下再溫育10分鐘后，用大的中試噴嘴(large pilot plan jet)(配備來自 Hydro-thermal Corp. ,Waukesha,Wisconsin 的M103 hydro力口 熱器)，漿液穿過維持在108. 4°C的蒸煮鍋，維持時間3分鐘。液化物從噴嘴中收集并放置 在85°C水浴中。在噴射后加入第二劑液化酶。液化物持續(xù)攪拌，在95°C下維持120分鐘。 在0、30、60、90和120分鐘收集樣品。在噴射后測試所有樣品的DE和粘度。DE用Schoorls 的方法測試(有方法備索)。LAT S239Q變體的DE進展斜率與Fred是可比較的，F(xiàn)red是比野生型LAT明顯更 加熱穩(wěn)定的工業(yè)標準酶。臺式鍋溫度上升到115°C，來研究LAT S239Q變體和Fred的熱穩(wěn) 定性。對Fred，DE進展下降，LAT S239Q變體也以相似比例下降(基于達到10DE的時間， Fred下降50%，LATS239Q變體66% )，顯示出其與Fred相當?shù)臒岱€(wěn)定性。見圖7。在3個不同ρΗ5· 8、5. 5和5. 2下通過臺式鍋比較LAT S239Q變體和Fred的DE形 成。以上pH值下未觀察到LAT S239Q和Fred在DE進展上的不同，證實了它們在較低pH 下相等的穩(wěn)定性。見圖8。為測量淀粉漿液中鈣濃度的效應，在ρΗ5. 6下通過臺式鍋比較LATS239Q和Fred 的DE形成。所用淀粉漿液在ρΗ3. 0下清洗3次來降低鈣和鈉含量，并回調(diào)到ρΗ5. 6用于測試。約90%的游離鈣被這一清洗步驟去除，得到的游離鈣水平在約3ppm。結果如圖9所示， 表明LAT S239Q變體在耐受低鈣和較低pH(5. 6)(對野生型LAT性能非常有害的條件，數(shù)據(jù) 未顯示)方面與Fred —樣好。
權利要求
親本地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，其中該變體具有與SEQ IDNO4有至少約90％的序列同一性的氨基酸序列，并包含對應于SEQ IDNO4的S239的替換，并且其中所述變體顯示出α-淀粉酶活性。
2.權利要求1的變體，其中該變體包含SEQID NO :2。
3.權利要求1的變體，其中所述變體由SEQID NO 2組成。
4.權利要求1的變體，其中S239替換是S239Q。
5.權利要求1的變體，其中S239替換是S239A。
6.權利要求1的變體，其中所述變體與SEQID NO :4有至少約95%的序列同一性。
7.權利要求6的變體，其中所述變體與SEQID NO :4有至少約98%的序列同一性。
8.權利要求1的變體，其中所述變體與SEQID Ν0:4的α -淀粉酶相比具有改變的解鏈溫度。
9.權利要求8的變體，其中所述變體與SEQID Ν0:4的α -淀粉酶相比具有提高的解鏈溫度。
10.權利要求9的變體，其中所述變體的提高的解鏈溫度不需要額外的鈣。
11.分離的編碼親本地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的變體的核酸，其中所述變體具有對應 于SEQ ID Ν0:4的S239替換，并且與SEQ ID NO :4有至少約90%的序列同一性，并且其中 所述變體顯示出α-淀粉酶活性。
12.權利要求11的分離的核酸，其中所述變體包含SEQID NO :2。
13.分離的核酸，其編碼權利要求1到10任一項的變體。
14.載體，其包含權利要求11到13任一項的分離的核酸。
15.分離的宿主細胞，其包含權利要求11到13任一項的分離的核酸。
16.分離的宿主細胞，其包含權利要求14的載體。
17.權利要求15或16任一項的分離的宿主細胞，其中該宿主細胞是細菌或真菌。
18.權利要求17的分離的宿主細胞，其中所述細菌是革蘭氏陽性細菌，所述革蘭氏陽 性細菌選自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、 嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢 桿菌、淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌；或者革蘭氏陰性細菌，其中所述革蘭氏陰性細菌是大腸 桿菌或假單胞菌。
19.用于液化淀粉的組合物，其包含權利要求1到10任一項的變體，其中所述組合物在 溶液中。
20.液化淀粉的方法，該方法包括向經(jīng)碾磨的玉米或淀粉漿液施用權利要求19的組合 物，維持足夠液化所述淀粉的時間。
21.權利要求20的方法，其中所述組合物以約40-60μg/g干固體加入經(jīng)碾磨的玉米或 淀粉漿液。
22.權利要求20的方法，其中所述經(jīng)碾磨的玉米是玉米淀粉溶液。
23.權利要求20的方法，其中所述經(jīng)碾磨的玉米或淀粉漿液在約85°C到約105°C下液化。
24.權利要求20的方法，其中經(jīng)碾磨的玉米或淀粉漿液在約pH4. 5到約pH 6. 5下液化。
25.權利要求20的方法，該方法進一步包括發(fā)酵液化物來產(chǎn)生乙醇。
26.權利要求25的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)生比野生型多至少約2.5% ν/ν的乙醇。
27.權利要求25的方法，其中所述液化和所述發(fā)酵在同一反應容器中同時進行。
28.權利要求20的方法，其中不加入額外的鈣。
29.用于糖化淀粉的組合物，該組合物包含溶液中的權利要求1到10任一項的變體。
30.用于糖化淀粉的方法，該方法包括施用權利要求29的組合物，維持足夠糖化所述 淀粉的時間。
31.權利要求30的方法，其中不添加額外的鈣。
32.洗滌劑添加劑，其包含權利要求1到10任一項的變體。
33.權利要求32的洗滌劑添加劑，進一步包含選自以下的酶纖維素酶、蛋白酶、氨肽 酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖 核酸酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、 鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、 過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支鏈 淀粉酶、異淀粉酶和角叉菜膠酶或其任一組合。
34.權利要求32的洗滌劑添加劑，以為非粉化顆粒、微粒、穩(wěn)定化液體或受保護酶的形 式存在。
35.包含權利要求32的洗滌劑添加劑的洗滌劑組合物。
36.權利要求35的洗滌劑組合物，其進一步包含選自以下的一種或多種酶纖維素酶、 蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移 酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、 β “葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽 谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木 聚糖酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、角叉菜膠酶和其任一組合。
37.洗滌劑組合物，其包含權利要求1到10任一項的變體和表面活性劑。
38.洗衣洗滌劑組合物，其包含權利要求32的洗滌劑添加劑，并且進一步包含以下的 一種或多種表面活性劑、洗滌劑助洗劑、絡合劑、聚合物、漂白系統(tǒng)、穩(wěn)定劑、起泡劑、抑泡 劑、防蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染料、殺菌劑、水溶助長劑、明亮劑、織物柔順劑 和香料。
39.織物脫漿組合物，其在水溶液中包含權利要求1到10任一項的變體，任選地包含至 少一種額外的酶。
40.織物脫漿方法，其包括施用權利要求39的織物脫漿組合物，維持足夠使所述織物 脫漿的時間。
41.權利要求40的方法，其中不添加額外的鈣。
42.包含權利要求1到10任一項的變體的淀粉加工組合物。
43.權利要求42的淀粉加工組合物，進一步包含葡糖淀粉酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、 植酸酶或其組合。
44.加工淀粉的方法，其包括施用權利要求42的淀粉加工組合物足夠加工所述淀粉的 時間。
45.權利要求44的方法，其中不添加額外的鈣。
46.烘焙組合物，其包含溶液或凝膠中的權利要求1到10任一項的變體。
47.烘焙方法，其包括施用權利要求46的烘焙組合物。
全文摘要
地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的變體顯示出改善的酶學性能，包括增強的熱穩(wěn)定性和減少的鈣依賴性。包含所述變體的組合物可用于淀粉加工、淀粉液化、發(fā)酵、淀粉糖化、清潔、洗衣、織物脫漿、烘焙和生物膜去除的方法中。還公開了編碼所述變體的核酸。
文檔編號C11D3/386GK101883841SQ200880114770
公開日2010年11月10日 申請日期2008年11月3日 優(yōu)先權日2007年11月5日
發(fā)明者A·肖, B·保爾森, D·沃德, J·K·舍蒂, S·D·鮑爾, S·拉默, V·夏爾馬 申請人:丹尼斯科美國公司