專利名稱：用羥胺切割法制備的含胞漿引導(dǎo)肽的人表皮生長因子融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體涉及一種人表皮生長因子的修飾以及修飾的人表
皮生長因子的制備方法。
背景技術(shù)：
天然人表皮生長因子(Human印idermal growth factor簡稱hEGF)是一種廣泛存在于人類和哺乳動物體內(nèi)的小分子多肽，是人生長因子中的一種，由53個氨基酸組成的分子量為6222的小分子多肽。等電點(diǎn)4.6。 hEGF分子具有較高穩(wěn)定性，二硫鍵是hEGF生物活性所必須結(jié)構(gòu)。hEGF 二級結(jié)構(gòu)只有13 _折疊，構(gòu)成殘基1-33的N-端結(jié)構(gòu)域和34-53的C-端結(jié)構(gòu)域。多肽鏈上幾乎所有殘基的芳香側(cè)鏈都在分子表面成簇存在，形成疏水的袋。
hEGF最明顯的生理作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和生長，以及糖、蛋白質(zhì)、DNA、RNA的合成。臨床上用精制的重組hEGF，配合常規(guī)燒傷創(chuàng)面處理，對燒傷淺11、深I(lǐng)I度創(chuàng)面、供皮區(qū)等均具有不同程度的加速愈合的作用。 hEGF對胃腸道的主要作用有3個方面(1)胃腸粘膜保護(hù)作用，(2)抑制胃酸分泌，(3)剌激DNA合成。 hEGF可對呼吸道上皮細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)控，具有抗氧化保護(hù)作用。它還能使成纖維細(xì)胞合成成纖維細(xì)胞促肺細(xì)胞因子，加速肺泡II型細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能分化，從而合成表面活性物質(zhì)，促進(jìn)胎肺成熟。 hEGF促進(jìn)角膜損傷修復(fù)。hEGF作為神經(jīng)營養(yǎng)活性因子，可以保護(hù)神經(jīng)損傷后的背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元。此外，hEGF還是一種腦腸肽神經(jīng)遞質(zhì)。 hEGF還可誘發(fā)表皮干細(xì)胞增多，沿基底層排列成層，在顆粒層和棘層聚集成團(tuán)(干細(xì)胞島)。從而能迅速增加表皮細(xì)胞數(shù)量及表皮層厚度，增強(qiáng)其屏障功能。也加快表皮更新，使表皮細(xì)胞個體年齡年輕化，起到護(hù)膚美容效果，使皮膚"青春常在"。目前EGF已經(jīng)作為化妝品的原料應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。 引導(dǎo)肽CTD是一種胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，去除核定位信號而專一性定位于胞漿的胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，同時，由于其內(nèi)去除了核定位信號，因而能避免在核內(nèi)損傷遺傳物質(zhì)。可以有效地介導(dǎo)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的胞質(zhì)當(dāng)中，與其他蛋白的融合表達(dá)產(chǎn)物能夠高效地進(jìn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，并且表現(xiàn)出生物學(xué)活性。比目前的TAT蛋白的PTD區(qū)段具有更強(qiáng)的介導(dǎo)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的能力，CTD融合蛋白的作用具有速度快、溫度適應(yīng)性廣、濃度依賴性、能夠摻入所有細(xì)胞等特點(diǎn)。CTD融合分子穿越細(xì)胞膜而不損傷細(xì)胞，被CTD帶入細(xì)胞的分子仍保留其原有的性質(zhì)。無活性的分子進(jìn)入細(xì)胞后也能重新折疊，自我復(fù)性，是基因工程藥物經(jīng)濟(jì)、高效利用的有利途徑。用CTD蛋白進(jìn)行介導(dǎo)方法簡單，轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率高，反應(yīng)條件也不嚴(yán)格，而且它轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)部仍具有活性。融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)使藥物的用量顯著下降，副作用明顯減少，是其它方法所無法比擬的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)含引導(dǎo)肽的人表皮生長因子融合蛋白，并在融合蛋白的N端與his標(biāo)簽之間引入了羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly，羥胺是一種廉價的化學(xué)試劑可以專一性的切割蛋白和多肽中的Asn-Gly肽鍵。從而使生產(chǎn)成本降低，純化工藝簡化。另外，融合蛋白由于引入了引導(dǎo)肽CTD，可以介導(dǎo)無活性人表皮生長因子的分子進(jìn)入細(xì)胞后重新折疊，自我復(fù)性。所以，解決了包涵體復(fù)性的難題，簡化了生產(chǎn)工藝，提高了人表皮生長因子的穩(wěn)定性。 本發(fā)明提供了高效表達(dá)人表皮生長因子融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET-His-CTD-hEGF，其包含一個按大腸桿菌偏愛密碼子人工合成的含引導(dǎo)肽的人表皮生長因子融合蛋白基因，以及N端6個His和T7啟動子。 本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞是E.coli BL21(DE3)plysS，具有氯霉素抗性。 本發(fā)明提供胞內(nèi)表達(dá)CTD-hEGF的工程菌株BHis_CE3，是由表達(dá)質(zhì)粒
pET-His-CTD-hEGF轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)plysS細(xì)胞獲得的最高表達(dá)量的菌株。 本發(fā)明提供了使用羥胺切割法制備CTD-hEGF的方法，并在此基礎(chǔ)上提供了完整
的表達(dá)、分離純化CTD-hEGF融合蛋白的方法。 本發(fā)明還對分離純化CTD-hEGF融合蛋白進(jìn)行了生物活性測定。采用MTT法結(jié)合酶聯(lián)儀在A54。測定CTD-hEGF融合蛋白對SH-SY-5Y細(xì)胞促細(xì)胞增殖活性，在62. 5pg/ml時CTD-hEGF的促增殖活性較hEGF純品高其A54。分別為0. 58和0. 75 (對照不加表皮生長因子或其衍生物的處理為0. 42)，進(jìn)行的顯著性分析表明，CTD-hEGF較hEGF有對SH-SY-5Y細(xì)胞的更好的促增殖活性。 本發(fā)明的CTD-hEGF融合蛋白將可用于EGF相關(guān)疾病的預(yù)防和治療，以及保健品或化妝品的主要組分。 綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是引入了引導(dǎo)肽CTD，解決了包涵體復(fù)性的難題，同時提高了穩(wěn)定性和活性，在融合蛋白的N端與His標(biāo)簽之間引入了羥胺切割位點(diǎn)，即降低了生產(chǎn)成本，又了方便分離純化，使得采用此方法制備的CTD-hEGF融合蛋白具有比其他hEGF或其衍生產(chǎn)品更好促細(xì)胞增殖活性，并且工藝簡單、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。


圖1表達(dá)質(zhì)粒pET-His-CTD-hEGF的結(jié)構(gòu)示意圖 T7P T7啟動子 6His組氨酸標(biāo)簽 CTD胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 hEGF人表皮生長因子 Term終止子 圖2SDS-PAGE電泳分析CTD-hEGF表達(dá) 1表達(dá)質(zhì)粒pET-His-CTD-hEGF在E. coli BL21 (DE3)plysS細(xì)胞中的表達(dá) 2空白質(zhì)粒pET-His在E. coli BL21 (DE3)plysS細(xì)胞中的表達(dá) M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(66，45，35，25， 18， 14. 4，9. 5，6. 5，4. 3)KD 圖3SDS-PAGE電泳分析純化的CTD-hEGF融合蛋白
1純化的CTD-hEGF融合蛋白M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(66，45，35，25， 18， 14. 4，9. 5，6. 5，4. 3)KD
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，實(shí)施例不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1 : 化學(xué)合成N端含羥胺切割位點(diǎn)的人表皮生長因子基因 采用兩步法人工合成N端含羥胺切割位點(diǎn)的人表皮生長因子基因核酸序列，所得序列如SEQ ID N0.3(即下面序列的黑體部分)。同時在片段的上下游分別設(shè)計(jì)了BamHI和EcoR I位點(diǎn)，便于基因克隆。下面的序列是CTD-hEGF融合蛋白在表達(dá)載體中的完整編碼序列。 起始密碼子 His標(biāo)簽 羥胺切割位點(diǎn)(下劃線部分)
GTATCGTGATCTGAAATGGTGGGAACTTCGTTAATGAGAATTC
終止密碼子 實(shí)施例2 :表達(dá)載體pET-His-CTD-hEGF的構(gòu)建 取質(zhì)粒pET-His用BamH I和EcoR I酶切后回收；同樣使用BamH I和EcoR I酶切將N端含羥胺切割位點(diǎn)的CTD-hEGF基因片段從PMD-CTD-hEGF質(zhì)粒雙酶切下來并回收。將上述酶切的質(zhì)粒pET-His片段和N端含羥胺切割位點(diǎn)的CTD-hEGF基因連接后轉(zhuǎn)化E. coliT0P10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB+Amp平板，37。C培養(yǎng)過夜；挑取單克隆進(jìn)行PCR篩選，1%瓊脂糖電泳檢測。 2. 1雙酶切反應(yīng)2 ii L反應(yīng)體積，冰浴上操作。
10 X Buffer 2 ii L 限制性內(nèi)切酶EcoR I liiL
限制性內(nèi)切酶BamH I 1 ii L
載體 2 ii g _ 力口 dH20至 20 ii L 37t:水浴，酶切2h，酶切質(zhì)粒的多少視質(zhì)粒濃度而定。 2.2瓊脂糖凝膠電泳 2%或0. 7%濃度瓊脂糖凝膠電泳，1XTAE緩沖系統(tǒng)，70V電壓，約lh時電泳完成后，放入2mg/L的EB染色液中染色10 15min， UVP凝膠成像系統(tǒng)成像。檢測100bp以上1000bp以下的DNA片段用2%膠濃度，1000bp以上用0. 7%膠濃度。制備電泳的上樣量盡可能多，50V電壓電泳。
5
2. 3膠純化DNA 按照瓊脂糖凝膠電泳純化試劑盒說明書操作(天為時代)，最后用30 40 L滅
菌水溶解DNA。 2. 4載體連接 10 ii L反應(yīng)體積，冰浴上操作。 10 X Buffer 1 ii L T4 DNA連接酶 1 ii L CTD-hEGF基因片段 5 7iiL 載亍本 1 L _ 力口 dH20至 10 ii L 16t:水浴，連接16 24h，視連接效果可以延長或縮短時間；在一定范圍內(nèi)，加 大外源片段的量，可使連接效率提高；延長連接時間也可以使連接效率提高；載體一般取 1 ii L。 2. 5PCR篩選重組轉(zhuǎn)化子 取若干O. 5mL滅菌離心管，每管10 y L滅菌水，用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化生長的單克隆 菌落，在滅菌水中充分混勻，然后在預(yù)先準(zhǔn)備好的LB加抗生素的固體平板上劃線保種，對 應(yīng)離心管標(biāo)記好記號。將混有單克隆菌落的離心管在沸水浴中煮10 15min，離心后取上 清為PCR反應(yīng)的模板。保種平板37t:倒置過夜培養(yǎng)。若PCR篩到陽性克隆，再從保種的平 板上挑取相應(yīng)菌落擴(kuò)增培養(yǎng)。PCR反應(yīng)條件如下dH208. 2ii L10XPCR Buffer1. 25ii Ld證(25mM)1. Oil LMg2Cl (25mM)0. 75ii L上游引物(1.25iig/'mL)0. 1 ii L下游引物(1.25iig/'mL)0. 1 ii LTaq DNA聚合酶0. 06ii L模板1. Oil LPCR反應(yīng)總體積12. 5ii L2. 6DNA序列測定 使用通用引物T7promoter primer (5， TAATAC GAC TCACTATAG GG 3，)對陽性克
隆進(jìn)行DNA序列測定(委托上海生工測序)，測序結(jié)果表明，我們構(gòu)建的pET-His-CTD-hEGF
表達(dá)載體中的N端含羥胺切割位點(diǎn)的CTD-hEGF的DNA序列與預(yù)期完全一致。 通過以上步驟，表達(dá)載體pET-His-CTD-hEGF構(gòu)建成功。 實(shí)施例3 :利用表達(dá)CTD-hEGF的工程菌株生產(chǎn)CTD-hEGF融合蛋白 3. 1表達(dá)載體pET-Hi s-CTD-hEGF轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 取pET-His-CTD-hEGF質(zhì)粒1 P L，稀釋10倍后直接轉(zhuǎn)化E. coli表達(dá)菌株BL211 (DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Amp平板，37。C倒置過夜培養(yǎng)。
3. 2試表達(dá)篩選表達(dá)CTD-hEGF的工程菌株 從上述LB平板上挑取8個單克隆菌落，2mL LB+Amp液體培養(yǎng)基(其配方為 NaC110g，酵母粉5g，蛋白胨10g，定容至1000ml。然后用10M NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，在15 磅下滅菌20min。然后加入氨芐青霉素至終濃度100 y g/ml) 37。C振蕩過夜培養(yǎng)，次日，取 20 ii L過夜培養(yǎng)液加入到2mL 2XYT+Amp (其配方為NaCl 5g，酵母粉10g，蛋白胨16g，定 容至1000ml。然后用10M NaOH調(diào)節(jié)pH至7. O，在15磅下滅菌20min。然后加入氨節(jié)青霉 素至終濃度100 y g/ml)液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37t:振蕩培養(yǎng)3h，至0D600在0. 5 0. 7之 間，然后加入IPTG至終濃度為0. 3mM，3(TC振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)3_8h。誘導(dǎo)前，隨機(jī)從一個樣 品中取出0. 5mL菌液，電泳檢測時作為誘導(dǎo)對照。表達(dá)完后，各取O. 5mL菌液(視表達(dá)細(xì)菌的量多少而變化， 一般在0. 2 0. 5mL之 間)，5000rpm 5min離心收集細(xì)胞，包括未誘導(dǎo)的樣品，重懸于100 y L去離子水中，以此為 電泳樣品作10X的Tricine-SDS-PGAE。根據(jù)電泳結(jié)果，得到有表達(dá)的菌株。將LB+Amp培 養(yǎng)基中的菌液加入30%甘油后-7(TC保存菌種。
3. 3融合蛋白CTD-hEGF大規(guī)模表達(dá) 挑取表達(dá)菌株單克隆在LB+Amp液體培養(yǎng)基中37。C過夜振蕩培養(yǎng)，次日，按照體積 比1 : 100加入到100mL 2XYTA+Amp培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37。C振蕩培養(yǎng)3h后，再加入IPTG 至終濃度為lmM，再3(TC振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)3-8h。誘導(dǎo)前取出0. 5mL的菌液，作為誘導(dǎo)前對照樣
PR o 以下操作在冰浴或4°C中進(jìn)行。誘導(dǎo)培養(yǎng)完后，取出0. 5mL的菌液作為誘導(dǎo)后對 照，剩下的菌液在合適的離心管中5000rpm 10min離心收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸于5mL預(yù)冷的 1XPBS，加入50iiL 20%的Triton X-IOO，充分混勻后冰浴30min。超聲波破碎細(xì)胞，超聲
循環(huán)為超聲1S ;間隔ls ;全程40s。重復(fù)4次，每次間隙時將菌液在冰浴中混勻，避免局部
溫度太高，使蛋白質(zhì)變性。最后，將破碎后的菌液10000rpm離心15min，收集上清液和沉淀，
上清液和沉淀分別留樣、備用。 3. 4融合蛋白CTD-hEGF純化和裂解 將NTA樹脂在原包裝中充分混勻，裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的 NTA-OBuffer (20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl， 10% Glycerol)洗。將樣品加到NTA層析柱 中，流速控制在0. 3ml/min左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。層 析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在0. 5，用的NTA-10Buffer (20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl， 10% Glycerol20mM Imidazole)洗5倍NTA體積，流速控制在0. 5ml/min 左右，去除未結(jié)合雜蛋白。最后用NTA-500Buffer (20mM Tris-HCl pH7. 9，0. 5M NaCl，10% Glycerol20mM Imidazole)洗脫，直到檢測不到蛋白為止，流速控制在0. 3ml/min左右。留 出100 ii L電泳檢測純度，其余-2(TC保存。 Tricine-SDS-PAGE檢測純度采用10 %的Tricine-SDS-PAGE電泳，取誘導(dǎo)前、誘 導(dǎo)后、上清液、沉淀、流通液、GST、洗脫液各100mL上樣前處理，60ii L上樣；其中上清液和流 通液稀釋5倍，沉淀稀釋10倍后，各取100i! L樣品處理。 CTD-hEGF裂解取上述經(jīng)過純化NTA樹脂的融合蛋白溶液，加入鹽酸羥胺至1-4M， 調(diào)pH值至7-9. 5，在35-5(TC下切割1_12個小時，釋放出完整的CTD-hEGF蛋白。透析后再次利用NTA樹脂回收未完全切割的帶有His標(biāo)簽融合蛋白，流通液中所含蛋白則是我們所 需CTD-hEGF。 通過上述方法，我們可以得到高純度的重組CTD-hEGF。
實(shí)施例4促細(xì)胞增殖活性測定 將商品化標(biāo)準(zhǔn)hEGF和純化后的融合蛋白CTD-hEGF使用不含胎牛血清蛋白的 1640稀釋，采用MTT法結(jié)合酶聯(lián)儀在A54。測定CTD-hEGF融合蛋白對SH-SY-5Y細(xì)胞促細(xì) 胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)在30-500pg/ml時，CTD-hEGF的促增殖活性較hEGF標(biāo)準(zhǔn)品有明顯偏高， 如在62. 5pg/ml時CTD-hEGF的促增殖活性較hEGF純品高其A54。分別為0. 58和0. 75，在 31. 25pg/ml時其A54。分別為0. 626和0. 754 (對照不加表皮生長因子或其衍生物的處理為 0. 42)，進(jìn)行的顯著性分析表明，CTD-hEGF較hEGF有對SH-SY-5Y細(xì)胞的更好的促增殖活性。
本發(fā)明提供了一種新型人表皮生長因子融合蛋白以及相應(yīng)的表達(dá)方式和化學(xué)切 割制備的方法。它具有以下優(yōu)點(diǎn)l、在hEGF的N端引入了引導(dǎo)肽CTD提高了人表皮生長 因子可利用活性和穩(wěn)定性；2、使用廉價的化學(xué)試劑鹽酸羥胺作為融合蛋白的切割劑，同時 避免了使用異源蛋白切割造成的污染；3、由上述兩個特點(diǎn)決定了本工藝純化方便且成本低 廉，產(chǎn)品活性高穩(wěn)定性好。所以，本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新和工藝先進(jìn)性，適用于工業(yè)化 生產(chǎn)。 序列表 〈110〉山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)中心 〈120〉用羥胺切割法制備含引導(dǎo)肽的人表皮生長因子的技術(shù)方法與工藝 〈160>3 〈210>1 〈211>162 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉人工合成的大腸桿菌偏愛密碼子的編碼人表皮生長因子的核酸分子 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (162) 〈400>1AACAGCGAIA GCGAATGCCC GCTGAGCCAT GATGGCTATT GCCTGCATGA TGGCGTGTGC 60
ATGTATATTG AAGCGCTGGA TAAATATGCG TGCAACTGCG TGGTGGGCTA TATTGGCGAA 120
CGTTGCCAGT ATCGTGATCT GAAATGGTGG GAACTTCGTT AA 162
〈210>2
〈211>39
〈212>DNA
〈213>人工序列
〈220〉 〈223〉含羥胺切割位點(diǎn)的胞漿引導(dǎo)肽CTD編碼核酸序列
8
〈222〉 (1) (39) 〈400〉 AACGGGTATG GCCGTCGCGC GCGCCGTCGC CGTCGCCGT 39 〈210>3 〈211>201 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉含羥胺切割位點(diǎn)和胞漿引導(dǎo)肽CTD融合蛋白的核酸序列 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (201) 〈400>3 AACGGGTATG GCCGTCGCGC GCGCCGTCGC CGTCGCCGTA ACAGCGATAG CGAATGCCCG 60 CTGAGCCATG ATGGCTATTG CCTGCATGAT GGCGTGTGCA TGTATATTGA AGCGCTGGAT 120 AAATATGCGT GCAACTGCGT GGTGGGCTAT ATTGGCGAAC GTTGCCAGTA TCGTGATCTG 180 AAATGGTGGG AACTTCGTTA A 20權(quán)利要求
一種含胞漿引導(dǎo)肽的人表皮生長因子的融合蛋白，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO.3所述的核酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的含胞漿引導(dǎo)肽的人表皮生長因子的融合蛋白，其特征在于其包括一個按大腸桿菌偏愛密碼子人工合成的的人表皮生長因子和含羥胺切割位點(diǎn)的胞漿引導(dǎo)肽CTD，并分別具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的核酸序列。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的含胞漿引導(dǎo)肽的人表皮生長因子的融合蛋白的表達(dá)載體，其特征在于引導(dǎo)肽CTD位于人表皮生長因子的N-端，并直接相連；在融合蛋白的N端引入6個組氨酸的標(biāo)簽作為純化的附加序列；在融合蛋白的N端與his標(biāo)簽之間引入了羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly。
4. 一種用羥胺切割法制備含胞漿引導(dǎo)肽的人表皮生長因子的技術(shù)方法，其特征在于在融合蛋白的N端與6個組氨酸的標(biāo)簽引入一個羥胺位點(diǎn)Asn-Gly，從而使大腸桿菌表達(dá)融合蛋白可以使用羥胺來切割釋放CTD-hEGF。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種用羥胺切割法制備含胞漿引導(dǎo)肽的人表皮生長因子的技術(shù)方法，其特征在于在下面條件下切割釋放CTD-hEGF :羥胺濃度l-4M，反應(yīng)pH為7. 0_9. 5，反應(yīng)時間1-12小時，反應(yīng)溫度35-50度。
6. 如權(quán)利要求1所述的含胞漿引導(dǎo)肽的人表皮生長因子的融合蛋白的用途，其特征在于用于制備藥物、保健品及化妝品中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含引導(dǎo)肽(CTD)的人表皮生長因子融合蛋白(CTD-hEGF)以及使用羥胺切割制備含引導(dǎo)肽人表皮生長因子融合蛋白的工藝方法。利用羥胺可以專一性地切割蛋白中Asn-Gly肽鍵，我們在融合蛋白和附加序列(His標(biāo)簽)的連接部引入Asn-Gly位點(diǎn)，并用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)上述融合蛋白，經(jīng)親和層析純化后使用羥胺進(jìn)行切割，獲得重組的CTD-hEGF，再經(jīng)分離純化后獲得純化的人表皮生長因子融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白可以作為藥物、保健品和化妝品的活性成分或添加劑。
文檔編號A61Q19/00GK101759806SQ20091001728
公開日2010年6月30日 申請日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者孫曼霽, 扈進(jìn)冬, 李紀(jì)順, 楊合同, 魏艷麗 申請人:山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心