專利名稱：具有促進膠原蛋白合成活性的大豆苷元在防皺除皺化妝品中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及化合物大豆苷元的新用途，具體涉及具有促進人皮膚膠原蛋白合成活性的大豆苷元在制備防皺除皺化妝品中的應用。
背景技術：
衰老是任何生物生命過程的必然規(guī)律，隨著世界范圍內(nèi)人口老齡化問題的日益突出，抗衰老領域已成為全球關注的焦點。皮膚是機體衰老過程中最為明顯的器官之一，隨著年齡的增長，皮膚會發(fā)生退行性變化，比如彈性消退、含水量減少、萎縮、起皺紋等。皮膚的老化不僅影響了人體的容貌和形象，而且還妨礙了人的精神狀態(tài)。皮膚中膠原蛋白的含量占75%，皮膚的生長、修復和營養(yǎng)都離不開膠原蛋白。膠原蛋白中富含的親水性基團，其保證皮膚中含有充足的水分，并維持著皮膚的彈性和水潤。皮膚衰老的組織學改變主要為膠原蛋白減少和流失。由于遺傳因素等不可抗內(nèi)因以及紫外線，輻射等外界刺激，皮膚會逐漸發(fā)生老化。人在25歲之后，皮膚中膠原蛋白的合成開始下降，隨著膠原蛋白的流失，膠原蛋白鏈斷裂，其構(gòu)成的網(wǎng)狀支撐體亦會逐漸崩塌，皮膚的彈性與保水度降低，即出現(xiàn)皮膚松弛，產(chǎn)生皺紋等衰老癥狀。衰老皮膚中膠原蛋白的流失主要有兩方面的原因，一方面是皮膚細胞本身合成的膠原蛋白含量減少，另一方面是已有的膠原蛋白被基質(zhì)金屬蛋白酶不斷降解。當人60歲時，皮膚膠原蛋白減少已超過35%。因此補充皮膚中的膠原蛋白，是保持皮膚年輕的關鍵。目前人們常用的補充膠原蛋白的方式有(1) 口服膠原蛋白；(2)皮下注射膠原蛋白；(3)使用含有膠原蛋白的護膚品；(4)在護膚品中添加能刺激皮膚合成膠原蛋白的活性成分。本發(fā)明是公開了將生物活性物質(zhì)大豆苷元直接激活皮膚細胞自身合成膠原蛋白， 從而達到最為有效地促進補充皮膚膠原蛋白含量。本發(fā)明不僅效率高，而且能克服現(xiàn)有技術的缺陷，從根本上提升皮膚自身的活力，激活皮膚細胞合成膠原蛋白，抵抗皮膚衰老。大豆苷元具有廣泛的藥理活性，目前的研究表明，大豆苷元具有抗心律失常、抗氧化，能防止骨質(zhì)疏松還能減輕婦女更年期不適癥及降低冠心病的發(fā)病率等作用。目前，大豆苷元主要作為保健類食品及藥品添加劑用于治療婦女更年期綜合癥、前列腺癌、乳腺癌、心臟病、心血管病、骨質(zhì)疏松等。但對于大豆苷元在皮膚膠原蛋白合成方面的研究，目前尚未見國內(nèi)外相關文獻報道，大豆苷元用于化妝品防皺和除皺方面的研究，也未見國內(nèi)外文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供具有促進膠原蛋白合成活性的大豆苷元在制備防皺除皺化妝品中的應用。本發(fā)明所述膠原蛋白為人皮膚膠原蛋白。本發(fā)明中大豆苷元可以是大豆苷元純品，或包含大豆苷元成分的任何組成物或混合物或復方。其中，所述防皺除皺化妝品中大豆苷元的含量可以是起到有效活性作用的任何比例范圍。較佳的是，本發(fā)明中大豆苷元的含量為質(zhì)量濃度0. 以上。較佳的是，本發(fā)明中大豆苷元的含量為0. 10%質(zhì)量濃度。大豆苷元(7，4' 2 二羥基異黃酮，daidzein)，為異黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于自然界300多種植物中，尤其以豆科植物如葛根、大豆中最多，大豆苷元分子式為C15HltlO4，分子量為254. 24，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示。純化的大豆苷元(HPLC純度>99%)，為白色粉末狀，易溶于乙醇，DMSO等有機溶劑。目前未見有報道公開大豆苷元具有促進人皮膚成纖維細胞膠原蛋白的合成的活性。式(I)本發(fā)明的發(fā)明人設計并構(gòu)建了包含人I型膠原蛋白啟動子調(diào)控序列的 Luciferase報告質(zhì)粒，并通過轉(zhuǎn)染到宿主細胞后檢測熒光素酶的含量來研究藥物對I型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄的影響。本發(fā)明中采用這種高效可靠的篩選方法和實驗手段，通過該實驗模型能篩選出在細胞轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)I型膠原蛋白含量的活性化合物，首次篩選出大豆苷元在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平均能明顯促進人皮膚成纖維細胞膠原蛋白的合成。本發(fā)明首次公開報道了大豆苷元具有明顯促進人皮膚成纖維細胞膠原蛋白合成的活性，并通過在體和離體實驗，實驗結(jié)果均表明大豆苷元具有顯著增加皮膚膠原蛋白的含量，明顯提高皮膚彈性和水分的作用。本發(fā)明首次公開了大豆苷元在制備防皺除皺化妝品中的應用。本發(fā)明應用中的所述防皺除皺化妝品為外用化妝品，可以化妝品添加劑的形式使用。含有本發(fā)明活性成分大豆苷元的皮膚外用組合物或混合物或復方，可以采用任何適用于皮膚的劑型，如可以制成具有防皺除皺或增強皮膚彈性的霜劑、乳液、面膜、爽膚水、護膚水、軟膏、油劑、凝膠、氣霧劑、溶液劑、或涂膜劑等各類使用劑型。上述各種類型的化妝品可以按照化妝品領域的常規(guī)方法制備。


圖1是大豆苷元對皮膚成纖維細胞Luciferase實驗結(jié)果。圖2是大豆苷元對皮膚成纖維細胞膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響。圖3是大豆苷元對皮膚成纖維細胞I型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響。圖4是大豆苷元對皮膚成纖維細胞III型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響。圖5是大豆苷元對皮膚成纖維細胞膠原蛋白酶以及抑制酶轉(zhuǎn)錄水平的影響。圖6是大豆苷元對皮膚成纖維細胞MMP-I轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較， 女 P < 0. 05，女女 P < 0. 01。圖7是大豆苷元對皮膚成纖維細胞MMP-2轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較， 女 P < 0. 05，女女 P < 0. 01。圖8是大豆苷元對皮膚成纖維細胞TIMP-I轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較， 女 P < 0. 05，女女 P < 0. 01。圖9是大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成I型膠原蛋白的影響，其中，與對照組比較，女 P < 0. 05，女女 P < 0. 01。圖10是大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成III型膠原蛋白的影響，其中，與對照組比較，女 P < 0. 05，女女 P < 0. 01。圖11是大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成MMP-I的影響，其中，與對照組比較，女P
<0. 05，女女 P < 0. 01。圖12是大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成MMP-2的影響，其中，與對照組比較，女P
<0. 05，女女 P < 0. 0。圖13是大豆苷元對裸鼠皮膚彈性的影響，其中，與對照組比較，* P < 0. 05，* * P < 0. 01。圖14是大豆苷元對裸鼠皮膚含水量的影響，其中，與對照組比較，^ P <0.05, ^
女 P < 0. 01。圖15是大豆苷元對裸鼠皮膚組織中I型膠原蛋白含量的影響，用抗I型膠原蛋白抗體的免疫組化照片(100倍)。圖16是大豆苷元對裸鼠皮膚組織中III型膠原蛋白含量的影響，用抗III型膠原蛋白抗體的免疫組化照片(100倍)。圖17是對裸鼠皮膚組織I型和III型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響，隨機選取了三只裸鼠的皮膚組織，每只小鼠(_)為對照組皮膚，(+)為涂抹大豆苷元實驗組皮膚組織。圖18是大豆苷元對裸鼠皮膚組織I型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，女P < 0. 05，女女P < 0. 01。圖19是大豆苷元對裸鼠皮膚組織III型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，女P < 0. 05，女女P < 0. 01。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。實驗材料與方法1、實驗材料大豆苷元粉末(購自同田生物)，純度>99，IOmg溶解于500微升DMSO溶液中，配成濃度為20mg/ml的原液，置于4°C保存。使用時用無血清的培養(yǎng)液將原液稀釋成所需濃度即可。2、細胞培養(yǎng)皮膚成纖維細胞(購自ATCC-2522 cell line)，用含有10%胎牛血清(FRONT)， 雙抗(GIBCO)以及谷氨酰胺的MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，用含有0.01% EDTA的0.25%胰酶
溶液進行細胞消化，培養(yǎng)條件37°C，5% C02。3、動物實驗6周齡的雌性BALB/C裸鼠8只(上海斯萊克動物有限公司，SPF級)喂養(yǎng)于無菌鼠籠內(nèi)，飼喂無菌的標準飼料和生理鹽水，定期更換鼠籠。實驗前適應性預飼養(yǎng)3天，對裸鼠的所有操作均在超凈工作臺上進行。在裸鼠背部皮膚的右半邊涂抹30%甘油配制的 200μ g/ml大豆苷元溶液，左半邊的背部皮膚只涂上30%的甘油溶液作為對照。每天涂抹一次，每次涂抹的體積為100 μ 1。持續(xù)實驗6個星期。4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)加減標準差叉土S表示，組間差異比較采用t檢驗。實施例1、Luciferase實驗模型篩選藥物的結(jié)果設計引物，用PCR法獲取目標片段并純化，將目標片段連接到載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化， 擴增重組質(zhì)粒并純化，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入目標細胞，將細胞做相應處理，檢測熒光素酶，運用 Luciferase實驗系統(tǒng)進行藥物篩選，實驗結(jié)果表明大豆苷元能明顯上調(diào)膠原蛋白啟動子在轉(zhuǎn)錄水平的含量，見圖1。圖1顯示大豆苷元對皮膚成纖維細胞Luciferase實驗結(jié)果，其中，與對照組比較，* P < 0. 05，* * P < 0. 01。實施例2、大豆苷元對皮膚成纖維細胞膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響在體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞中，實驗結(jié)果如圖2、圖3、圖4顯示，表明大豆苷元對皮膚成纖維細胞I型膠原蛋白和III型膠原蛋白mRNA水平都明顯上升，而且這種效果隨著大豆苷元濃度的上升變得更為顯著。圖2顯示大豆苷元對皮膚成纖維細胞膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響。圖3顯示大豆苷元對皮膚成纖維細胞I型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，* P < 0. 05，* * P < 0. 01。圖4顯示大豆苷元對皮膚成纖維細胞III型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，* P < 0.05，* * P < 0.01。實施例3、大豆苷元對皮膚成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶以及抑制酶轉(zhuǎn)錄水平的影響如圖5、圖6、圖7、圖8所示，圖5是大豆苷元對皮膚成纖維細胞膠原蛋白酶以及抑制酶轉(zhuǎn)錄水平的影響；圖6是大豆苷元對皮膚成纖維細胞MMP-I轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，* P < 0. 05，* * P < 0. 01 ；圖7是大豆苷元對皮膚成纖維細胞MMP-2轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，* P<0.05，* * P<0.01 ；圖8是大豆苷元對皮膚成纖維細胞TIMP-I轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，* P < 0.05，* * P < 0.01。在體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞中加入0. 5μ g/ml，5l·! g/ml，50l·! g/ml大豆苷元后，MMP1、MMP2的mRNA含量減少了，和對照相比具有極顯著差異(P < 0. 01)，而且這種作用效果和大豆苷元的濃度成正相關。經(jīng)過0. 5 μ g/ml，5 μ g/ml，50 μ g/ml大豆苷元的處理后， TIMPl的mRNA含量則提高了，和對照相比，具有極顯著差異(P < 0. 01)，且mRNA含量的提高效果和藥物的濃度成正相關。實施例4、大豆苷元對皮膚成纖維細胞膠原蛋白翻譯水平的影響通過Elisa實驗，檢測經(jīng)過藥物處理后，分泌到培養(yǎng)液中的膠原蛋白的含量，從而檢驗藥物對膠原蛋白翻譯水平的影響。圖9是大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成I型膠原蛋白的影響，其中，與對照組比較，* P <0.05，* * P <0.01。從圖9可以看出，與對照相比，加入了 0.5 μ g/ml大豆苷元的實驗組，細胞培養(yǎng)液中的I型膠原蛋白含量顯著提高了 (P < 0. 05)；加入5 μ g/ml，50 μ g/ml大豆苷元的實驗組，細胞培養(yǎng)液中的I型膠原蛋白含量極顯著提高(P < 0. 01)。圖10是大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成III型膠原蛋白的影響， 其中，與對照組比較，* P < 0.05，* * P < 0.01。從圖10可以看出，加入了 0. 5 μ g/ml大豆苷元的實驗組，細胞培養(yǎng)液中的III型膠原蛋白的含量沒有明顯變化，加入5μ g/ml大豆苷元的實驗組，III型膠原蛋白含量顯著提高了(P<0.05)；加入50 μ g/ml大豆苷元的實驗組，III型膠原蛋白含量極顯著提高(P < 0. 01)。只加DMSO的對照組，I型膠原蛋白和III型
6膠原蛋白的含量都沒有明顯變化，說明大豆苷元的作用效果與DMSO溶劑無關。實施例5、大豆苷元對皮膚成纖維細胞MMP1、MMP2翻譯水平的影響通過Elisa實驗，檢測經(jīng)過藥物處理后，分泌到培養(yǎng)液中的MMP1、MMP2的含量，從而檢驗藥物對其翻譯水平的影響。與對照相比，加入了 0. 5μ g/ml大豆苷元的實驗組，細胞培養(yǎng)液中MMP1、MMP2的含量顯著減少了，且隨著濃度的減低減來越明顯。圖11是大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成MMP-I的影響，其中，與對照組比較，* P < 0. 05，* * P < 0. 01。 圖12大豆苷元對皮膚成纖維細胞合成MMP-2的影響，其中，與對照組比較，^ P <0.05, ^
女 P < 0. 0。實施例6、大豆苷元對裸鼠皮膚彈性和含水量的影響動物模型持續(xù)給藥6周后，用皮膚彈性水分測試儀(Cutometer MPA 580，德國)分別測量裸鼠背部左右兩側(cè)皮膚的彈性和含水量。實驗結(jié)果如圖13所示，圖13大豆苷元對裸鼠皮膚彈性的影響，其中，與對照組比較，* P < 0. 05，* * P < 0. 01。圖13表明大豆苷元藥物處理實驗組和對照組相比，皮膚的彈性有明顯的增加，顯著差異(P < 0. 05)。大豆苷元藥物處理實驗組與對照組比較，皮膚的含水量也有明顯的提高，差異極顯著(P <0.01)，見圖14，圖14大豆苷元對裸鼠皮膚含水量的影響，其中，與對照組比較， 女 P < 0. 05，女女 P < 0. 01。實施例7、大豆苷元對裸鼠皮膚組織膠原蛋白免疫組化影響圖15是使用抗I型膠原蛋白抗體進行孵育的免疫組化實驗結(jié)果圖，圖中的黃色部分即為由抗體所標識的I型膠原蛋白。實驗結(jié)果表明在大豆苷元實驗組的皮膚組織中染色比較深，I型膠原蛋白的含量比對照組明顯增高。實驗結(jié)果直觀的表明了大豆苷元能夠顯著促進裸鼠皮膚組織I型膠原蛋白的合成。圖16是使用抗III型膠原蛋白抗體進行孵育的免疫組化實驗結(jié)果圖，實驗結(jié)果表明在大豆苷元實驗組的裸鼠皮膚組織中，III型膠原蛋白的含量也明顯比對照組高，說明大豆苷元能促進裸鼠的皮膚合成III型膠原蛋白，提高皮膚中III型膠原蛋白的含量。實施例8、大豆苷元對裸鼠皮膚中膠原蛋白表達的影響在經(jīng)過6周的動物皮膚給藥處理后，隨機選取三只裸鼠皮膚組織，通過RT-PCR檢測了皮膚組織中I、III型膠原蛋白的表達量，實驗組與自身對照相比，都極顯著地提高I、 III型膠原蛋白的表達量，顯著差異(P <0.01)，見圖17。圖18表明大豆苷元對裸鼠I型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，*Ρ < 0. 05，< 0. 01。圖19表明大豆苷元對裸鼠III型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響，其中，與對照組比較，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01。實施例9、大豆苷元對人體皮膚的實驗效果 將大豆苷元按0. 1 %的質(zhì)量比加入普通化妝品乳劑中，共10人參與實驗，男女各5 人，實驗前用皮膚彈性水分測試儀(Cutometer MPA 580，德國)檢測每個人左右手的皮膚彈性、水分基礎值，沒有顯著差異。然后開始實驗，左手手背只涂普通乳劑作為對照，右手手背涂抹加過大豆苷元的乳劑，每天一次，每次Iml，實驗二周后，再檢測左右手背皮膚的彈性和水分情況。實驗結(jié)果表明，大豆苷元涂抹沒有任何皮膚過敏癥狀。實驗結(jié)果還表明， 涂抹過大豆苷元實驗組的手背與對照組進行比較，皮膚彈性、水分均明顯增加，差異顯著(P < 0. 05)，見表1。說明大豆苷元在化妝品中的應用，是具有明顯的促進膠原蛋白合成活性， 能起到提高皮膚組織的彈性，保持水分，并具有防皺除皺的作用。
表1大豆苷元對人體皮膚彈性和水分的影響
權(quán)利要求
1.具有促進膠原蛋白合成活性的大豆苷元在制備防皺除皺化妝品中的應用。
2.如權(quán)利要求1所述的應用，其中，所述膠原蛋白為人皮膚膠原蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的應用，其中，所述防皺除皺化妝品為外用化妝品。
4.如權(quán)利要求1所述的應用，其中，所述防皺除皺化妝品是霜劑、乳劑、面膜、爽膚水、 護膚水、軟膏、油劑、凝膠、氣霧劑、溶液劑、或涂膜劑。
5.如權(quán)利要求1所述的應用，其中，所述防皺除皺化妝品中的大豆苷元含量為0. 10%質(zhì)量濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有促進人皮膚膠原蛋白合成活性的大豆苷元在防皺除皺化妝品中的應用。本發(fā)明設計并構(gòu)建了包含人Ⅰ型膠原蛋白啟動子調(diào)控序列的Luciferase報告質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)錄水平建立了促進膠原蛋白合成的化合物篩選模型，篩選的大豆苷元在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白翻譯水平等均明顯促進人皮膚成纖維細胞膠原蛋白的合成。本發(fā)明在化妝品中的應用，可以化妝品添加劑的形式使用，可以制成具有防皺除皺或增強皮膚彈性的霜劑、乳劑、面膜、爽膚水、護膚水、軟膏、油劑、凝膠、氣霧劑、溶液劑、或涂膜劑等各類劑型。
文檔編號A61Q19/08GK102283787SQ20101020400
公開日2011年12月21日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者劉明耀, 史佳卉, 葉希韻, 李貽娟, 翁宇靜 申請人:華東師范大學