專利名稱：小球藻Chlorella sorokiniana CS-01的脂質(zhì)提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從小球藻Chlorella sorokiniana CS-Ol (CCTCC M209220)中提
取脂質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
全球變暖和石油危機(jī)催生著低碳經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，替代能源的研究變得刻不容緩。微藻生物柴油作為一種新型綠色能源，由于能夠減少CO2的排放、脂質(zhì)含量高、產(chǎn)量高、土地占用面積小等優(yōu)點(diǎn)，成為目前世界各國(guó)研究的熱點(diǎn)。微藻生物柴油生產(chǎn)的主要工藝包括微藻選育，微藻培養(yǎng)，微藻采收，脂質(zhì)提取及轉(zhuǎn)化工藝。每一單元都是非常重要的，其中脂質(zhì)提取的成本是影響其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)重要因素。微藻胞壁堅(jiān)韌，細(xì)胞胞體較油料作物小，所以傳統(tǒng)的壓榨法、有機(jī)溶劑提取法往往很難實(shí)現(xiàn)微藻油脂的高效提取。因此探索適合微藻脂質(zhì)提取工藝方法是必要的。細(xì)胞破碎后萃取技術(shù)與其它技術(shù)相比具有經(jīng)濟(jì)、高效、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用于油料作物脂質(zhì)的提取，但是細(xì)胞破碎技術(shù)在微藻脂質(zhì)提取中的應(yīng)用相對(duì)較少。與傳統(tǒng)油脂提取方法和單純氯仿/甲醇法相比，本發(fā)明工藝不僅克服了小球藻 Chlorellasorokiniana CS-Ol (CCTCC M 209220)細(xì)胞壁堅(jiān)韌、細(xì)胞小、難以利用傳統(tǒng)壓榨工藝提取等缺點(diǎn)，且實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞壁的破碎，使得油脂充分釋放，另外脂質(zhì)萃取相位于細(xì)胞碎片固相的下面，易于脂質(zhì)的后續(xù)分離。該方法的脂質(zhì)提取率較索氏提取法、酸熱提取法、氯仿/甲醇提取法分別提高了 1. 4,1. 7和0. 5倍；符合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為提高小球藻Chlorella sorokiniana CS-Ol (CCTCC M 209220) 脂質(zhì)提取率，提供一個(gè)簡(jiǎn)單、高效、低成本的脂質(zhì)提取方法。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的一種小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-Ol的脂質(zhì)提取方法，包括以下步驟1)將所述的小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-Ol的干藻粉與氯仿/甲醇混合溶液按照固液比Ig 6ml Ig 48ml混合，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎 90 450s ；2)再向步驟1)得到的混合溶液中分別加入1/2 2倍于混合溶液體積的蒸餾水和1/3 1倍于混合溶液體積的氯仿，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎90 450s， 離心，提取萃取相；3)向步驟2)所得萃取相中加入質(zhì)量百分比0.1 0.45%的氯化鈉溶液，震蕩洗滌，離心，提取萃取相；干燥至恒重，即得；所述的小球藻(Chlorellasorokiniana CS-01)的保藏編號(hào)為 CCTCC M209220。上述的方法優(yōu)選包括以下步驟1)將所述的小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-01的干藻粉與氯仿/甲醇混合溶液按照固液比Ig 24ml Ig 48ml混合，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎 90 270s ；2)再向步驟1)得到的混合溶液中分別加入1/2 2倍于混合溶液體積的蒸餾水和1/3 1倍于混合溶液體積的氯仿，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎90 270s， 離心，提取萃取相；3)向步驟2)所得萃取相中加入等體積 的質(zhì)量百分比為0. 1 0. 45%的氯化鈉溶液，震蕩洗滌，離心，提取萃取相；干燥至恒重，即得。步驟1)和步驟3)的超聲功率優(yōu)選為240-840W，超聲時(shí)間優(yōu)選90_180s。步驟1)所述的氯仿/甲醇溶液中氯仿與甲醇體積比為1 2。步驟2)或3)所述的離心轉(zhuǎn)速為5000 8000rpm，離心時(shí)間為10 30min。所述的小球藻(Chlorella sorokiniana CS-01)的干藻粉的制備過程為將所述的小球藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，離心收集藻體，用無(wú)菌水清洗藻體，藻泥真空冷凍干燥。結(jié)果表明本發(fā)明超聲輔助有機(jī)溶劑提取脂質(zhì)方法，最適合該藻脂質(zhì)提取。脂質(zhì)提取率與索氏抽提法、酸熱法、氯仿/甲醇提取法相比分別提高了 1. 4,1. 7,0. 5倍；脂質(zhì)萃取相位于細(xì)胞碎片固相下面，易于脂質(zhì)的后續(xù)分離，優(yōu)化了提取工業(yè)流程；該工藝適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本申請(qǐng)人已將本發(fā)明小球藻(Chlorella sorokiniana CS-01)，于2009年10月 13日，在中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為 CCTCC M209220，并申請(qǐng)了中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00910252395. 3。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例11.藻種的培養(yǎng)、收集與干燥小球藻Chlorella sorokiniana CS-01 (CCTCC M 209220)，培養(yǎng)條件BG-11 培養(yǎng)基(已公布配方)，光照強(qiáng)度70μπιΟ1 photons πΓ、—1，光照周期10 14(L/D)，溫度 25 士 1°C，通氣量2. 817vvm (利用0. 22 μ m過濾頭，過濾除菌)。利用吸光光度法測(cè)定其生長(zhǎng)曲線(0D_)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，6000rpm離心IOmin收集藻體，用無(wú)菌水清洗藻體2 次。藻泥真空冷凍干燥8h，置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.超聲破碎氯仿/甲醇體積比(1 2)、料液比(Ig 36ml)震蕩抽提(15 45s)，超聲波破碎(440W、180s)，再分別加入1/2倍體積的水和1/3倍體積的氯仿溶液，超聲波破碎(440W、 180s)，兩次超聲處理功率和時(shí)間一樣。3.萃取相分離、洗滌及干燥6000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移萃取相，加入等體積0. 1 %氯化鈉溶液洗滌萃取相， 6000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移萃取相，70°C干燥至恒重，即得到微藻脂質(zhì)，脂質(zhì)含量為26.4%。其它實(shí)施例實(shí)施方式與例1類似，除了具體操作過程中分別改變超聲波功率、超聲波處理時(shí)間、料液比條件外，其他條件與例1相同。具體結(jié)果分別見表1，2，3
表1超聲波功率 對(duì)脂質(zhì)提取效率的影響(其它條件與例1相同)
超聲波功率(w)2404406408401040
脂質(zhì)含量(％)22.8026.4022.2028.9019.00表2超聲波處理時(shí)間對(duì)脂質(zhì)提取效率的影響(其它條件與例1相同)
超聲波時(shí)間(s)90180270360450
脂質(zhì)含量(％)24.9026.8020.5018.6018.00表3料液比對(duì)脂質(zhì)提取效率的影響(其它條件與例1相同)
料液比(w/v)1:481:361:241:121:6
脂質(zhì)含量(％)26.0024.6024.0013.008.00不同方法提取小球藻Chlorellasorokiniana CS-Ol (CCTCC M209220)脂質(zhì)的提取效率見表4不同方法提取小球藻脂質(zhì)的效率比較
方法藻粉干重(g) 脂質(zhì)干重(g) 脂質(zhì)含量(％)時(shí)間(h)
索氏提取法 3.000 0.3675 12.25 ±0.46-12
酸熱法0.25080.032210.84 ±0.91
氯仿/甲醇法0.25010.052518.99 ±0.60.5
本發(fā)明法0.25030.072328.9 ±0.20.權(quán)利要求
1.一種小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-Ol的脂質(zhì)提取方法，其特征在于，包括以下步驟1)將所述的小球藻(Chlorellasorokiniana)CS-Ol的干藻粉與氯仿/甲醇混合溶液按照固液比Ig 6ml Ig 48ml混合，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎90 450s ；2)再向步驟1)得到的混合溶液中分別加入1/2 2倍于混合溶液體積的蒸餾水和 1/3 1倍于混合溶液體積的氯仿，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎90 450s，離心，提取萃取相；3)向步驟2)所得萃取相中加入質(zhì)量百分比0.1 0.45%的氯化鈉溶液，震蕩洗滌，離心，提取萃取相；干燥至恒重，即得；所述的小球藻(Chlorella sorokiniana CS-01)的保藏編號(hào)為 CCTCC M209220。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將所述的小球藻(Chlorellasorokiniana)CS-01的干藻粉與氯仿/甲醇混合溶液按照固液比Ig 24ml Ig 48ml混合，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎90 270s ；2)再向步驟1)得到的混合溶液中分別加入1/2 2倍于混合溶液體積的蒸餾水和 1/3 1倍于混合溶液體積的氯仿，震蕩抽提，然后240 1040W超聲波破碎90 270s，離心，提取萃取相；3)向步驟2)所得萃取相中加入等體積的質(zhì)量百分比為0.1 0. 45%的氯化鈉溶液， 震蕩洗滌，離心，提取萃取相；干燥至恒重，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟1)和步驟3)的超聲功率為 240-840W，超聲時(shí)間 90-180s。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的氯仿/甲醇溶液中氯仿與甲醇體積比為1 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)或3)所述的離心轉(zhuǎn)速為 5000 8000rpm，離心時(shí)間為10 30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的小球藻(Chlorella sorokinianaCS-01)的干藻粉的制備過程為將所述的小球藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，離心收集藻體，用無(wú)菌水清洗藻體，藻泥真空冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小球藻Chlorella sorokiniana CS-01(CCTCC M 209220)的脂質(zhì)提取方法超聲波輔助氯仿/甲醇提取法。其主要的步驟為收集藻體→干燥→氯仿/甲醇抽提→超聲破碎→洗滌→干燥。經(jīng)過驗(yàn)證，該方法的脂質(zhì)提取率較索氏提取法、酸熱提取法、氯仿/甲醇提取法分別提高了1.4、1.7和0.5倍；同時(shí)，由于脂質(zhì)萃取相位于細(xì)胞碎片固體相的下面，有利于后續(xù)的脂質(zhì)直接分離，符合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
文檔編號(hào)C11B1/10GK102199483SQ201110096618
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者夏金蘭, 鞏三強(qiáng), 王斌梁, 聶珍媛, 邱冠周, 閆藝瀛 申請(qǐng)人:中南大學(xué)