專利名稱：一種微藻油脂膜基原位萃取的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和生物能源領(lǐng)域，尤其涉及一種將微藻培養(yǎng)、膜技術(shù)和微藻油脂萃取技術(shù)整合而成的微藻油脂提取方法。
背景技術(shù)：
生物柴油是生物能源的重要產(chǎn)品，但因原料不足使產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到嚴(yán)重制約。在制備生物柴油的原料中(油料作物、林木及產(chǎn)油微藻)，微藻生長(zhǎng)快，油脂含量高，是一種極具前景的生物柴油大宗原料。目前微藻生產(chǎn)生物柴油的瓶頸問(wèn)題在于成本過(guò)高，導(dǎo)致其經(jīng)濟(jì)性得不到保障，特別是微藻油脂提取約占生物柴油成本的50%。常規(guī)微藻油脂提取技術(shù)包括有機(jī)溶劑萃取法、超臨界流體萃取、熱裂解等，這些方法要求藻體為干燥粉末，而藻液中干物質(zhì)含量通常低于1 %，濃縮干燥的預(yù)處理不僅延長(zhǎng)生物柴油生產(chǎn)周期，還影響油脂提取效率。原位萃取法是指建立生物相容性有機(jī)溶劑與藻液共混的兩相體系，使藻體油脂不斷萃取至溶劑相，規(guī)避藻體脫水干燥處理步驟，實(shí)現(xiàn)油脂在線提取和提高產(chǎn)量的雙重目標(biāo)。目前對(duì)微藻油脂的提取方法主要有有機(jī)溶劑萃取、超臨界和亞臨界流體萃取等方法。例如雙溶劑體系萃取(Mixing co-solvent extraction)是指由一種極性溶劑與一種非極性溶劑組成單相體系提取藻體油脂。Bligh和Dyer于1959年(Bligh EG, Dyer WJ. A rapid method of total lipid extractionand purification “——禾中總月旨^ !禾口純化方法”.Canadian Journal ofBiochemistry and Physiology《加拿大生物化學(xué)與生理學(xué)雜志》，1959，37 (8) :911-917)提出的甲醇/氯仿體系仍是最常用的微藻油脂提取方法?；凇跋嗨葡嗳堋痹恚弩w與甲醇/氯仿混合溶劑充分接觸，極性溶劑甲醇與細(xì)胞膜的極性脂結(jié)合，從而破壞脂質(zhì)與蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和靜電作用，使非極性溶劑氯仿進(jìn)入細(xì)胞并溶解胞內(nèi)疏水的中性脂成分，充分萃取后在體系中加入水，甲醇即溶于水相而與含油脂的氯仿相分層，氯仿?lián)]發(fā)后得到粗脂提取物。然而因氯仿有神經(jīng)致毒作用，一些低毒雙溶劑體系也嘗試用于油脂提取，例如正己烷/異丙醇，DMSO/石油醚，正己烷/乙醇等。1996 ip,Richter ^ (Richter BE,Jones ΒΑ,Ezzell JL,Porter NL. Accelerated solvent extraction :a technique for sample preparation "力口速溶劑萃取——禾中樣品制備技術(shù)”.Analytical Chemistry《分析化學(xué)》，1996，68 (6) :1033-1039)提出快速溶劑提取法(Accelerated solvent extraction, ASE)，這是一種在較高溫度(50 200°C )和較大壓力(10. 3 20. 6MPa)條件下用溶劑萃取固體或半固體樣品的處理方法。該方法用于萃取微藻油脂的原理是，高溫高壓有助于增加傳質(zhì)速率使溶劑快速滲入藻細(xì)胞，同時(shí)降低溶劑介電常數(shù)使其極性接近油脂，從而提高溶劑的萃取效率，常用溶劑體系有甲醇/氯仿， 異丙醇/正己烷等。與雙溶劑萃取法相比，ASE法具有作用時(shí)間短(5 IOmin)，溶劑消耗量少，油脂提取率高的優(yōu)點(diǎn)。例如，傳統(tǒng)的i^olch方法(氯仿/甲醇，2 lv/v))對(duì)綠藻 Rhizoclonium hieroglyphicum的油脂提取率為44 55%，而用等量溶劑在壓力10. 3MPa, 120°C時(shí)僅提取5min即可達(dá)到85 95%的油脂提取率。
超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction)是一種新興的提取技術(shù)， 它是指超出臨界溫度和壓力時(shí)，流體介于氣態(tài)和液態(tài)之間，同時(shí)具有氣體的擴(kuò)散傳質(zhì)性能和液體的溶解性能，對(duì)藻體油脂的提取效率遠(yuǎn)高于普通的有機(jī)溶劑。(X)2由于臨界條件溫和(壓力7. 4MPa,溫度31. 1 V )、無(wú)毒、化學(xué)惰性等優(yōu)勢(shì)，使用最為廣泛，此外甲醇、乙醇、水、二氧化氮、六氟化硫等使用也有所報(bào)道。超臨界CO2萃取(Supercritical carbon dioxideextraction, SCCO2)微藻油脂的作用條件為40 50°C，24. 1 37. 9MPa，提取后油脂溶解在超臨界液態(tài)(X)2中，回收時(shí)只需控制溫度和壓力使(X)2恢復(fù)氣態(tài)即可分離油脂。超臨界萃取是環(huán)境友好的綠色提取技術(shù)，但是因涉及到溫度和壓力控制，使得處理工藝能耗高，經(jīng)濟(jì)性較差，不適于大宗化學(xué)品的提取。亞臨界水萃取(Subcritical water extraction, SffE)是指水在略低于臨界溫度時(shí)其極性降低，因此具有類似有機(jī)溶劑的性質(zhì)，對(duì)油脂的溶解性也大大提高，同時(shí)利用高壓使水維持在液態(tài)，高溫促使水快速進(jìn)入細(xì)胞，使胞內(nèi)脂質(zhì)萃取至水相，當(dāng)體系冷卻至室溫時(shí)，水的極性升高，溶解在水相的油脂與水迅速分層便于收集。此外，亞臨界乙醇也可用來(lái)于萃取色素，如Haematococcus pluvialis禾口 Dunaliella salina中的古月蘿卜素。該方法的優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)藻液直接處理，在體系中無(wú)需加入有機(jī)溶劑，但是因溫度壓力等高能耗步驟的存在，此法工業(yè)應(yīng)用也有所限制。上述微藻油脂不同提取方法包括藻體干燥、高溫高壓控制等高能耗處理步驟。目前藻體干燥主要方法有日光晾曬法、噴霧干燥和冷凍干燥等，處理大量藻體時(shí)，以晾曬法最具經(jīng)濟(jì)性，但對(duì)攤曬面積和時(shí)間有一定要求，因此在干燥，溫度壓力控制等環(huán)節(jié)的技術(shù)改進(jìn)能有效降低油脂提取能耗。膜技術(shù)的研究自80年代初開(kāi)展以來(lái)，己經(jīng)成為新型分離技術(shù)研究領(lǐng)域的重要組成部分。基于微孔膜的分散萃取過(guò)程兼具膜技術(shù)與萃取過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)，膜介質(zhì)本身對(duì)待處理的混合物無(wú)分離作用，主要利用膜的多孔性，親水性或疏水性，為兩相傳遞提供較大而穩(wěn)定的相接觸面，可克服常規(guī)分離中的液泛、返混等影響，近十年來(lái)深受關(guān)注。利用中空纖維膜促進(jìn)有機(jī)溶劑在藻液中的分散效果，同時(shí)使微藻培養(yǎng)和油脂提取過(guò)程偶聯(lián)，是實(shí)現(xiàn)微藻油脂連續(xù)合成及在線萃取的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明結(jié)合微孔膜技術(shù)，使生物相容性萃取溶劑均勻分散至藻液，促進(jìn)溶劑對(duì)微藻油脂的萃取效率，提出了一種全新的微藻連續(xù)培養(yǎng)及油脂原位萃取的集成技術(shù)。一種微藻油脂膜基原位萃取的方法，包括以下步驟(1)微藻連續(xù)培養(yǎng)將產(chǎn)油藻種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定期，產(chǎn)油藻種的細(xì)胞內(nèi)逐漸積累油脂；(2)原位萃取油脂將積累油脂后的藻液輸入萃取體系，同時(shí)輸入萃取溶劑，利用原位萃取法建立萃取溶劑與藻液共混的兩相體系，藻體油脂不斷萃取至溶劑相；萃取溶劑與藻液逐漸分層，上層萃取溶劑循環(huán)使用，下層藻液循環(huán)至連續(xù)培養(yǎng)步驟；通過(guò)調(diào)節(jié)萃取溶劑與藻液泵入泵出萃取模塊的流速，保持萃取體系內(nèi)萃取溶劑的體積比例不超過(guò)總體積的 10%。(3)實(shí)時(shí)檢測(cè)萃取溶劑中的油脂含量，若油脂濃度無(wú)顯著增加，則油脂萃取趨于飽和，移除油脂飽和的萃取溶劑，加入新的萃取溶劑。作為一種優(yōu)選方案，在所述的萃取體系內(nèi)設(shè)置一中空纖維膜組件，藻液沿中空纖維膜組件的殼層流動(dòng)，萃取溶劑進(jìn)入末端封死的中空纖維膜管內(nèi)，再通過(guò)中空纖維膜管壁的微孔分散成微小液滴進(jìn)入殼程的藻液，并與藻液充分混合，使藻體油脂不斷萃取至溶劑相。所述的萃取溶劑為生物相容性有機(jī)溶劑，一般為log P >5. 5的疏水性有機(jī)溶劑， 其中特別以碳鏈長(zhǎng)度為C12 C16的烷烴類溶劑生物相容性良好。本發(fā)明中膜分散原位萃取微藻油脂的方法兼具膜技術(shù)與萃取過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)，是新的高效傳質(zhì)過(guò)程，具有以下主要特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)(1)萃取溶劑通過(guò)膜微孔以極微小的液滴形態(tài)分散進(jìn)入藻液中，萃取溶劑與藻液充分混合，顯著提高萃取效率。( 該方法無(wú)需破碎微藻細(xì)胞，微藻培養(yǎng)可以連續(xù)進(jìn)行。產(chǎn)油藻種選用耐有機(jī)溶劑的藻種時(shí)，由于微藻細(xì)胞和有機(jī)溶劑具有較好的親和性，則有機(jī)溶劑在用膜分散進(jìn)行油脂原位萃取的過(guò)程中，微藻活性幾乎不受影響。(3)當(dāng)控制微藻培養(yǎng)處于穩(wěn)定期內(nèi)，此時(shí)微藻油脂合成旺盛，可以實(shí)現(xiàn)微藻生長(zhǎng)和油脂提取的同時(shí)進(jìn)行，油脂進(jìn)行在線原位提取。該方法可以突破微藻采收、干燥、破碎和提取的冗長(zhǎng)工藝，從而顯著降低生產(chǎn)成本。


圖1為用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的實(shí)施例1使用的膜分散有機(jī)溶劑萃取裝置的示意圖，圖示說(shuō)明①萃取溶劑儲(chǔ)液罐②萃取層③死端中空纖維膜組件④藻液儲(chǔ)瓶⑤氣升式光生物反應(yīng)器⑥蠕動(dòng)泵⑦空氣壓縮泵。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中藻液及萃取劑中油脂含量隨時(shí)間變化結(jié)果。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中膜分散有機(jī)溶劑萃取Botryococcus braunii油脂的細(xì)胞活性變化趨勢(shì)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (1)在容積為7L的氣升式光生物反應(yīng)器⑤中培養(yǎng)產(chǎn)油藻Botryococcus braunii, BGll培養(yǎng)基(淡水藻通用培養(yǎng)基)，在25士 1°C，連續(xù)光照(光強(qiáng)池lux)條件下培養(yǎng)3周
至穩(wěn)定期。(2)氣升式光生物反應(yīng)器⑤內(nèi)藻液經(jīng)蠕動(dòng)泵通入死端PES中空纖維膜組件③的殼層，藻液體積控制為400ml。Botryococcus braunii生物相容性溶劑十四烷以10ml mirT1 的流量通入死端(膜纖維一端封死的組件)PES中空纖維膜組件③的管層，十四烷通過(guò)PES 膜孔分散成微小液滴進(jìn)入藻液，密集的溶劑液滴因密度較小逐漸上浮，在上升過(guò)程中與藻細(xì)胞充分接觸并萃取藻體油脂。萃取層中的十四烷溶劑與藻液分層，上層的溶劑相通過(guò)蠕動(dòng)泵以10ml mirT1的流量抽回入有機(jī)溶劑儲(chǔ)液罐①進(jìn)行循環(huán)使用，為降低溶劑的細(xì)胞毒性，保持萃取層內(nèi)的溶劑體積比不超過(guò)總體積的10%。
(3)萃取過(guò)程中檢測(cè)溶劑相的油脂含量，若油脂濃度無(wú)顯著增加，則油脂萃取趨于飽和，移除油脂飽和的萃取溶劑，加入新的萃取溶劑維持一定的油脂提取率。對(duì)比例除步驟O)中的萃取劑十四烷是直接泵入藻液當(dāng)中、不通過(guò)膜組件外，其余與實(shí)施例1相同。油脂含量測(cè)定部分的具體的操作方式為胞內(nèi)油脂含量的測(cè)定藻液按比例稀釋并用紫外分光光度計(jì)(GS-54，上海棱光)測(cè)定其在680nm處吸光度，0D680保持在0. 5左右，取稀釋藻液3ml加入3 μ 1的尼羅紅染液(濃度Img πιΓ1，溶劑丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，熒光分光光度計(jì)(F96-PR0，上海棱光)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)散波長(zhǎng)580nm，增益10檔。熒光強(qiáng)度/0D680代入下式計(jì)算藻體油
脂含量。Y = O. 16X+12. 49 (X 熒光強(qiáng)度，Y 油脂含量％ )有機(jī)溶劑(十四烷)中油脂含量測(cè)定以十四烷(Aladdin，USA)為溶劑，三油精triolein (Aladdin，USA)為標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度溶液，各取3!111分別加入5 4 1的尼羅紅染液(lmgml-1，溶于丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)散波長(zhǎng)570nm，增益1檔，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)方程如下Y = O. 06X+30. 07 (Y 熒光強(qiáng)度，X 油脂濃度 mg L-1)測(cè)定萃取后十四烷中的油脂含量時(shí)，取3ml十四烷加入5μ1的尼羅紅染液(Img πιΓ1，溶于丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)散波長(zhǎng)570nm，增益1檔。將測(cè)得的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求得其油脂濃度。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞存活率雙醋酸熒光素(FDA)作為活細(xì)胞熒光染料用于表征油脂萃取過(guò)程中的細(xì)胞存活率。當(dāng)活性細(xì)胞具有完整細(xì)胞膜時(shí)，F(xiàn)DA水解的熒光素會(huì)不斷在細(xì)胞內(nèi)積累，使細(xì)胞在藍(lán)色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光。當(dāng)細(xì)胞膜受損，細(xì)胞失去活性時(shí)，F(xiàn)DA水解的熒光素?zé)o法在細(xì)胞內(nèi)累積，而使細(xì)胞無(wú)法發(fā)出熒光。活性高的細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，活性弱的細(xì)胞發(fā)光較弱。當(dāng)熒光物質(zhì)充滿整個(gè)細(xì)胞時(shí)，會(huì)使細(xì)胞發(fā)出亮綠色。Botryococcus braunii藻液經(jīng)300目細(xì)胞篩去除雜質(zhì)和細(xì)胞團(tuán)塊，取Iml藻液離心棄上清，PBS緩沖液(phosphate buffered saline)清洗藻體三次，取適量PBS緩沖液懸浮藻體使藻細(xì)胞密度不小于IO6個(gè)πιΓ1，加入FDA (Sigma，USA)終濃度為IOOyg πιΓ1室溫下避光染色7min，流式細(xì)胞儀分析(Beckman FC 500MCL，USA)，流速100-400細(xì)胞sec—1，數(shù)據(jù)采集時(shí)總細(xì)胞數(shù)大于1000，或者時(shí)間大于2min，測(cè)試完成后，保存分析結(jié)果并作圖。如圖2所示為萃取過(guò)程中有機(jī)溶劑相與Botryococcus braunii胞內(nèi)油脂含量的變化(藻液400ml，十四烷40ml，藻液和有機(jī)溶劑循環(huán)速度均為10ml mirT1)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 實(shí)施例1萃取進(jìn)行2天后萃取劑十四烷中油脂濃度已經(jīng)達(dá)到最大值520mg L—1，對(duì)油脂的提取率達(dá)到了 50. 15%,而對(duì)照組提取率為38. 05%。2天之后十四烷中油脂含量變化不大，而藻液中油脂含量逐漸恢復(fù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可以得出，膜孔分散能有效促進(jìn)溶劑與藻液的混合，增加了藻體與溶劑的接觸面積，提高了油脂提取率。 如圖3所示為膜鼓泡有機(jī)溶劑萃取葡萄藻油脂細(xì)胞活性檢測(cè)(IOOugmr1FDA染色 IOmin, C2象限為FDA染色的活細(xì)胞區(qū)。實(shí)施例1中流式細(xì)胞儀檢測(cè)原位萃取過(guò)程中， 細(xì)胞存活率保持在90%以上，結(jié)果說(shuō)明在體系中引入PES有機(jī)膜對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響，適用于油脂的連續(xù)萃取過(guò)程。
權(quán)利要求
1.一種微藻油脂膜基原位萃取的方法，包括以下步驟(1)微藻連續(xù)培養(yǎng)將產(chǎn)油藻種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定期，產(chǎn)油藻種的細(xì)胞內(nèi)逐漸積累油脂；(2)原位萃取油脂將經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)積累油脂后的藻液輸入萃取體系，同時(shí)輸入萃取溶劑與藻液共混形成兩相體系，藻體油脂不斷萃取至溶劑相；萃取溶劑與藻液逐漸分層，上層萃取溶劑循環(huán)使用，下層藻液循環(huán)至連續(xù)培養(yǎng)步驟；(3)實(shí)時(shí)檢測(cè)萃取溶劑中的油脂含量，若油脂濃度無(wú)顯著增加，則油脂萃取趨于飽和， 移除油脂飽和的萃取溶劑，加入新的萃取溶劑。
2.如權(quán)利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的產(chǎn)油藻種為耐有機(jī)溶劑的藻種。
3.如權(quán)利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的溶劑為生物相容性有機(jī)溶劑。
4.如權(quán)利要求3所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的生物相容性有機(jī)溶劑為疏水值IogP > 5. 5的烷烴類。
5.如權(quán)利要求4所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于其所述的生物相容性有機(jī)溶劑為C12 C16的烷烴類溶劑。
6.如權(quán)利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的萃取體系內(nèi)含有的溶劑體積不超過(guò)總體積的10%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種微藻油脂膜基原位萃取的方法，將產(chǎn)油藻種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定期，積累油脂后的藻液輸入萃取層，利用原位萃取法建立萃取溶劑與藻液共混的兩相體系，使藻體油脂不斷萃取至溶劑相，萃取溶劑與藻液逐漸分層澄清，上層有機(jī)溶劑循環(huán)使用，萃取層內(nèi)的藻液循環(huán)回連續(xù)培養(yǎng)步驟。本發(fā)明將微藻連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)、膜技術(shù)與微藻油脂提取技術(shù)相結(jié)合，提出了一種微藻油脂原位萃取的集成化方法，規(guī)避了收集、干燥和破碎微藻細(xì)胞等流程，與常規(guī)的微藻油脂提取技術(shù)相比，本發(fā)明工藝具有程簡(jiǎn)單、油脂提取率高、過(guò)程成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C11B1/10GK102505026SQ201110350428
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者周成, 張芳, 徐新華, 程麗華, 陳歡林 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)