專利名稱：包含pga的新的emd制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含純化的釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的藥物、牙科和/或美容制劑。具體地講，本發(fā)明涉及穩(wěn)定制劑，所述制劑包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和重量平均分子量為至少130 kDa的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)。
背景技術(shù)：
存在于釉基質(zhì) 中的釉基質(zhì)蛋白，作為釉質(zhì)的前體最為人所熟知。在牙骨質(zhì)形成之前，釉基質(zhì)蛋白在發(fā)育中的牙根頂端的齒根表面上沉積。有證據(jù)顯示，沉積的釉基質(zhì)是牙骨質(zhì)形成的引發(fā)因素。此外，牙骨質(zhì)的形成在本質(zhì)上與牙周韌帶和牙槽骨的發(fā)育有關(guān)。釉基質(zhì)蛋白因此可通過模擬牙的天然附著發(fā)育而促進牙周再生(Gestrelius S，LyngstadaasSP, Hammarstrom L.Emdogain - periodontal regeneration based on biomimicry(Emdogain-基于仿生學(xué)的牙周再生).Clin Oral Invest 4:120-125 (2000))。分離的釉基質(zhì)蛋白不僅能夠誘導(dǎo)在釉基質(zhì)附近發(fā)育的組織中天然存在的一個因子，而且能夠誘導(dǎo)精心安排的因子級聯(lián)。它們模擬發(fā)育組織的天然環(huán)境，因此模擬組織再生、細(xì)胞分化和/或成熟的天然刺激。來自豬釉基質(zhì)蛋白質(zhì)的純化的酸提取物形式的釉基質(zhì)衍生物(EMD)，以前曾成功用于恢復(fù)患有嚴(yán)重牙附著喪失的患者的功能性牙周韌帶、牙骨質(zhì)和牙槽骨(HammarstrSm等，1997, Journal of Clinical Periodontology 24,658-668)。已經(jīng)表明釉基質(zhì)衍生物(EMD)制劑促進牙周再生(HammarstrSm等，1997, Journalof Clinical Periodontology 24,669-677)。在該研究中使用不同的制劑，目的是為了弄清楚結(jié)果是否會因所用的制劑而不同。該研究表明，當(dāng)將EMD溶于PGA時，得到最令人滿意的結(jié)果。例如，US 5098891首次描述了用于通過在含有來源于牙釉質(zhì)前體(所謂的釉基質(zhì))的蛋白質(zhì)部分作為活性組分的至少一個部分上再生出礦化組織，而用于誘導(dǎo)礦化組織部分之間的結(jié)合的組合物。此外，在對培養(yǎng)的牙周韌帶細(xì)胞(PDL)的研究中，表明了當(dāng)EMD存在于培養(yǎng)物中時，這些細(xì)胞的附著率、生長和代謝顯著增加。此外，暴露于EMD的細(xì)胞顯示當(dāng)與對照相比時，胞內(nèi)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長因子的自分泌產(chǎn)生增加。另一方面，雖然當(dāng)EMD存在時，cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長因子分泌增加，但是上皮細(xì)胞的增殖和生長兩者被抑制(Lyngstadaas等，2001, Journal of Clinical Periodontology 28, 181-188)。以前在專利文獻中描述了釉基質(zhì)蛋白和釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白能夠誘導(dǎo)硬組織形成(即釉質(zhì)形成，美國專利號4，672，032 (Slavkin));支持硬組織間的結(jié)合(ΕΡ-Β-0337 967和EP-B-O 263 086);促進開放性創(chuàng)傷(例如皮膚和粘膜的開放性創(chuàng)傷)愈合；對感染和炎性疾病的治療具有有益作用(EP-B-1059934和EP-B-1153610);誘導(dǎo)牙質(zhì)再生(W001/97834);促進移植物的接納(take) (W0 00/53197);在腫瘤治療中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(W000/53196);調(diào)節(jié)對全身感染或炎癥的免疫應(yīng)答中的失衡(W0 03/024479)，并且有助于填充手術(shù)(procedure)和/或創(chuàng)傷(例如細(xì)胞減少性手術(shù))后的創(chuàng)傷腔和/或組織缺陷(WO02/080994)。EMD由多種蛋白質(zhì)組成,例如法浪蛋白、釉蛋白(enamelin)、tuft蛋白、蛋白酶和白蛋白?，m瑯蛋白，一種EMD的主要組分，至少高達60%-90%，例如70-90%，是通過可變剪接和受控分泌后加工而可來源于單個基因的疏水蛋白質(zhì)的家族。它們在整個脊椎動物進化中是聞度保守的，在所有已研究的聞等脊椎動物(80%)中顯不聞的序列同源性整體水平。實際上，豬和人法浪蛋白基因轉(zhuǎn)錄物的序列僅在4%的喊基中不同。因此，軸基質(zhì)蛋白和/或EMD蛋白雖然來源于豬，但當(dāng)在人體中遇到時仍被視為是“自身”的，可在不引發(fā)變態(tài)反應(yīng)或其它不良反應(yīng)的情況下促進人的牙再生。釉基質(zhì)衍生物蛋白(EMD)是最有名的釉質(zhì)的前體。其用PGA增稠的水溶液以商品名Straumann Emdogain市售。在Straumann EmdogainPlus中還可找到用PGA增稠的釉基質(zhì)衍生物蛋白(EMD)水溶液。為了將EMD保持在水溶液中，該溶液應(yīng)具有充分低于蛋白質(zhì)等電點(IEP)的pH，對于EMD，IEP為pH 6.5，因此，更優(yōu)選的是溶液的pH〈5.0。為了易以應(yīng)用，該溶液用PGA增稠。在化學(xué)上，PGA是海藻酸的酯，海藻酸來源于海藻(海草)。一些羧基被丙二醇酯化，一些被合適的堿中和，而一些保持游離。PGA本身是酸性的，在將PGA溶于EMD溶液后pH下降。在酸性條件下，由于PGA降解所致pH繼續(xù)下降?；旌衔锏哪途眯匀Q于EMD能夠沉淀在牙齒表面上的PH值。認(rèn)為沉淀發(fā)生在生理條件下，即接近IEP的pH下。牙根環(huán)境和EMD-PGA混合物兩者的pH和緩沖能力影響EMD蛋白的沉淀行為，用PGA配制的EMD溶液的接近IEP的pH和較低的緩沖能力有利于沉淀。D.J.McHugh 在 HYPERLINK http://www.fa0.0rg/docrep/x5822e/x5822e04.htm中描述了藻酸酯的聚合度(DP)是分子的平均分子量的衡量，并且是每平均鏈中糖醛酸單元的數(shù)目。DP和分子量與藻酸酯溶液的粘度直接有關(guān)；貯存時粘度的損失是藻酸酯解聚程度的衡量。PGA以不同等級產(chǎn)生，等級通常描述為低、中和高粘度藻酸酯(是指2%水溶液中的粘度)。PGA藻酸酯的分子量越高，其溶液的粘度越大。生產(chǎn)商可通過改變提取條件的嚴(yán)格性來控制分子量(聚合度，DP)，他們提供范圍為10-1000 mPa.s (1%溶液)，DP范圍為100-1000單位的產(chǎn)品。粘度200-400 mPa.s ( “中等粘度”)的PGA，可能得到最廣泛的應(yīng)用。已知比起具有低DP的PGA，具有高DP的PGA較不穩(wěn)定。將低粘度PGA (至多約50mPa.s)貯存在10-20°C下，3年無可觀察得到的變化。中等粘度藻酸鈉(至多約400 mPa.s)顯示在25°C下I年后損失10%，在33°C下在一年后損失45%，較高粘度藻酸酯甚至更不穩(wěn)定。丙二醇藻酸酯顯示在25°C下在一年后粘度損失約40%，并且還變得較不穩(wěn)定。藻酸銨一般比上述任一種都較不穩(wěn)定。海藻酸是所述產(chǎn)品中最不穩(wěn)定的，且在環(huán)境溫度下在幾個月內(nèi)，任何長鏈材料都降解成較短的鏈。然而，包含短鏈材料的藻酸酯是穩(wěn)定的，且DP為約40單位糖醛酸/鏈的海藻酸在20°C溫度下一年內(nèi)將顯示極少的變化。然而，海藻酸的主要用途，作為藥物片劑中的 崩解劑，取決于當(dāng)浸濕時其膨脹的能力，并且這不受DP變化的影響。市售藻酸酯應(yīng)保存在陰涼處，即在25°C或更低的溫度下，因為高溫可引起顯著解聚，影響商業(yè)上的有益性質(zhì)，例如粘度和膠凝強度。所述藻酸酯通常含有10-13%水分，解聚速率隨水分比例增加而增加，因此忙存區(qū)應(yīng)是干燥的。如上所述，預(yù)先將EMD蛋白在具有PGA的水溶液中配制，其中PGA的降解提供酸性產(chǎn)品，其進而隨時間推移而降低pH。在高溫下，降解加快。為了避免產(chǎn)品酸化加快并因此限制該作用，不得不將產(chǎn)品在低溫下即在2-8°C的溫度范圍內(nèi)運輸和保存。雖然如此，已知市售可獲得的具有PGA的Straumann Emdogain制劑中EMD的穩(wěn)定性仍隨時間推移而快速下降。發(fā)明概述
釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和釉基質(zhì)蛋白因其促進軟組織和硬組織再生并減少炎癥和感染的能力而廣泛用于臨床牙科。Straumann Emdogain是市售可獲得的產(chǎn)品，其由藻酸酯載體、丙二醇藻酸酯(PGA)和豬釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白組成，并用于治療牙周病，而且已被再三證實促進硬組織和軟組織再生，并減少牙周手術(shù)后炎癥。用于制造Straumann Emdogain的PGA的粘度為50-175 mPa.s (在2%水溶液中，22°C Brookf ield粘度)，S卩“較低粘度”。由于pH隨時間推移快速降低所致，該制劑遭受穩(wěn)定性的缺乏。因此，為了避免制劑酸化加快，該制劑不得不在在低溫下即2_8°C范圍的溫度貯存和運輸。 本發(fā)明涉及出人意料的發(fā)現(xiàn)，即包含純化的釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑隨時間推移更穩(wěn)定，尤其制劑的PH隨時間推移更穩(wěn)定，其中所述已滅菌PGA可由對重量平均分子量(MJ介于250-500 kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌而獲得。附圖


圖1.自2002到2009以來未加工PGA和Kelcoloid O (PGA)的重量平均分子量(Mw) 圖2.PGA的酸催化水解的反應(yīng)流程
圖3.Straumann Emdogain的pH對比在2_8°C下的忙存時間 圖4.Straumann Emdogain的pH對比在不同溫度下的忙存時間 圖5.在2-5°C范圍內(nèi)準(zhǔn)一級反應(yīng)速率常數(shù)對PGA濃度的依賴性。圖6.通過Pollulan校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的GPC所測量的，PGA的重量平均分子量的閾值可超過135 kDa (圖6A)和超過140 kDa (圖6B)。圖7.作為滅菌電子束劑量的函數(shù)的比較性Manucol ester B - Kelcoloid
0.摩爾質(zhì)量(Mw)。圖8.該圖顯示PGA濃度和Straumann Emdogain的耐久性之間的關(guān)系一pH規(guī)格(spec) (3.5)決定的Emdogain的保存期限相對已滅菌PGA (即電子束滅菌的PGA)濃度。圖9.該圖顯不當(dāng)已滅菌PGA的Mw大小135 kDa例如185 kDa時已滅菌PGA的分子量(Mw)與Emdogain的貯存穩(wěn)定性之間的關(guān)系。使用MwS 117 kDa的已滅菌PGA作為參比。圖10.該圖顯不當(dāng)已滅菌PGA的Mw為135 kDa時已滅菌PGA的Mw與Emdogain的貯存穩(wěn)定性之間的關(guān)系。定義
ALG在本文中用作未滅菌PGA的縮寫。
ALGS在本文中用作已滅菌PGA的縮寫，所述已滅菌PGA已通過使用電子束滅菌。在本文情況下，“受試者”涉及任何脊椎動物，例如鳥、爬行動物、哺乳動物、靈長類動物和人。PGA有幾個不同的名稱:丙二醇藻酸酯、藻酸羥丙酯、丙烷1，2_ 二醇藻酸酯或E405。在本文情況下，“制劑”可用“組合物”替換。在本文情況下，“e-束”意指電子束，亦稱陰極射線，其為電子流。電子束滅菌用作滅病媒法。在本文情況下，術(shù)語未滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)欲包括食品級PGA、未加工PGA、醫(yī)用級PGA和工業(yè)級PGA。已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)在本文中優(yōu)選獲自對重量平均分子量(Mwtl)為至少250kDa、例如介于250-500 kDa之間的未滅菌PGA進行電子束滅菌。已滅菌PGA可備選地和可替換地獲自對起始重量平均分子量(Mwtl)為至少250 kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌。所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa，例如介于130-500 kDa之間。在本文情況下，可通過制備未滅菌PGA，并使用范圍為約25-30 kGy的劑量進行滅菌，來實現(xiàn)滅菌，所述劑量應(yīng)至少為25 kGy。滅菌方法包括以下步驟:1)選擇無菌保證水平(sterility assurance level, SAL) (10_6), 2)計算待滅菌樣品的總生物負(fù)荷(bioburden), 3)使用電子束對樣品進行滅菌。電子束劑量的選擇根據(jù)步驟2)的計算。該方法按照ISO 11137-2 (2006)的建議。術(shù)語“無菌保證水平”是在滅菌后制品中出現(xiàn)單個活的微生物的概率，而術(shù)語“生物負(fù)荷”是產(chǎn)品上或產(chǎn)品中活的微生物數(shù)目。所述PGA作為粉末被滅菌，并且在無菌 環(huán)境下將所得產(chǎn)品與賦形劑混合。或者，在無菌環(huán)境下將未滅菌PGA粉與賦形劑混合，然后滅菌。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的一樣，可采用其它普遍已知的滅菌方法對未滅菌PGA或包含未滅菌PGA的混合物進行滅菌。在本文整篇中要了解的是，即使給出了確切的值，這些值還包括這些值的推導(dǎo)值(derivations)。在本發(fā)明中，采用Pollulan摩爾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，通過尺寸排阻色譜法測定PGA (已滅菌和未滅菌的兩者)的重量平均分子量，然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的一樣，當(dāng)采用其它方法(例如普適標(biāo)定、特性粘度測定等)測定時，重量平均分子量可用其它術(shù)語指定，并具有其它值。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及出人意料的發(fā)現(xiàn)，即包含純化的釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑隨時間推移更穩(wěn)定，尤其pH隨時間推移更穩(wěn)定，其中所述已滅菌PGA獲自起始重量平均分子量(Mw)介于250-500 kDa之間的未滅菌PGA。所述已滅菌PGA的重量平均分子量大于130 kDa，例如介于130-500 kDa之間。已滅菌PGA可獲自電子束滅菌。用于制造之前已知的包含純化的釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的制劑的PGA的粘度為50-175 mPa.s (2%水溶液，22°CBrookfield粘度)，即它具有“較低粘度”。甚至在低溫下，由于pH隨時間推移快速降低所致，這些制劑遭受穩(wěn)定性的缺乏。因此，為了避免產(chǎn)品酸化加快，產(chǎn)品不得不在低溫即2-8°C范圍的溫度下貯存和運輸。此外，所述PGA的起始重量平均分子量介于210至245 kDa之間，意味著約230 kDa或不超過245 kDa (參見表I)。現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，包含具有高的重量平均分子量的已滅菌丙二醇藻酸酯分子(PGA)的制劑 更穩(wěn)定且具有較少溫度敏感性的pH。這導(dǎo)致隨時間推移貯存更穩(wěn)定的制劑。具有高的重量平均分子量的丙二醇藻酸酯的實例是以商品名Kelcoloid 0.Kelcoloid NF和Manucol Ester M銷售的丙二醇藻酸酯。Kelcoloicf O批號9B02535是具有高的重量平均分子量的丙二醇藻酸酯分子的另一實例。除Kelcoloid O以外,還有可獲得的不同等級的Kelcoloid : s例如具有以下產(chǎn)品名稱的 Kelcoloicf:Kelcoloicf HVF, Kelcoloid LVF 和 Kelcoloid S。按照其產(chǎn)品清單，等級主要因在水溶液中彼此的粘度、酯化度和PH而不同。所述PGA的酯化度高，例如超過70，例如超過80。本發(fā)明基于這樣的出人意料的發(fā)現(xiàn)，即滿足所有藥典要求且具有相同的粘度、相同的起始pH和大致相同的羧基酯化程度的不同PGA(其在StraumanneEmdogain制劑和Straumann Emdogain Plus制劑中被使用或?qū)⒈皇褂?可導(dǎo)致隨時間推移的不同忙存穩(wěn)定性。這種出人意料的發(fā)現(xiàn)是由于(owns to):最終產(chǎn)品的pH穩(wěn)定性取決于所用與PGA的重量平均分子量有關(guān)的PGA的品質(zhì)。因此，出人意料地發(fā)現(xiàn)了酸催化的PGA的水解速率與載體PGA的重量平均摩爾量之間的關(guān)系。因此本發(fā)明基于這樣出人意料的發(fā)現(xiàn)，即可通過仔細(xì)選擇用于所述制劑的PGA等級來獲自較穩(wěn)定和較長保存期限的制劑。此外，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即包含純化的釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有比以前所用PGA高的起始重量平均分子量的PGA的制劑將較穩(wěn)定并具有較長久的耐久性。因此，可通過本發(fā)明的制劑和使用特定品質(zhì)的PGA而避免的一個問題是可保證所述制劑的貯存期和耐久性。從經(jīng)濟觀點來看，指定和測量用于制劑的PGA的分子量是有利的，從而使制劑包裝的有效期限保持長久?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有較高重量平均分子量(Mw)，即當(dāng)滅菌時重量平均分子量超過130kDa、例如重量平均分子量為 130-500 kDa、130_450 kDa、130_420 kDa,200-450 kDa 或130-250 kDa范圍的PGA的品質(zhì)，在包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白的制劑中是合乎需要的。所述重量平均分子量還可為130-550 kDa的范圍。重量平均分子量也可超過130 kDa,例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。pH穩(wěn)定性是包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和PGA的制劑最重要的參數(shù)，并且影響產(chǎn)品的耐久性，而且還對運輸有重大影響，即考慮溫度和時間如何運輸制劑。PH隨時間推移而降低，而且降低的速度將如何影響制劑的耐久性，PH降低得越快，制劑降低其穩(wěn)定性也就越快。此外，還出人意料地發(fā)現(xiàn)，在包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白的制劑中使用具有較高重量平均分子量的PGA，將為所述制劑提供更好的增稠(凝膠形成)性能。此外，使用具有較高重量平均分子量的PGA將為所述制劑提供更好的pH穩(wěn)定性，因為需要較低濃度的PGA。按照本發(fā)明，在所要求保護的制劑中，已滅菌PGA的濃度不超過6重量/體積％ (w/ν%) ο此外，已滅菌PGA的濃度范圍為3-6% w/v,例如3-5% w/v、例如3-4% w/v。此外，已滅菌 PGA 的濃度為例如 3,3.5、4、4.5、5、5.5 或 6% w/v。本發(fā)明因此涉及穩(wěn)定的(例如貯存穩(wěn)定的)包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述制劑包含不超過6重量/體積％ (w/v%)、例如范圍為3% w/v-6% w/v的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mff)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa，例如介于130 -250 kDa的范圍。具體地講，所述藥物、牙科和/或美容制劑是一種制劑，其中釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物蛋白包含至少60-90%琺瑯蛋白，例如至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、80或90%，其具有選自以下的平均分子量:介于18與25 kDa之間、介于20與24 kDa之間、介于20與22 kDa之間以及20 kDa。與目前可獲得的包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的類似制劑相比，本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑隨時間推移更穩(wěn)定，即它在至少18個月、例如至少24 個月、例如 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 和 30 個月的時間內(nèi)，優(yōu)選在 2-8°C的溫度范圍內(nèi)，具有大于PH 3.5的pH值，然而也可采用更高溫度。按照本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑是穩(wěn)定的，即它在至少34個月、例如至少36個月的時間內(nèi)，具有大于pH 3.5的pH值。與目前可獲得的包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的類似制劑相t匕，本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑隨時間推移更穩(wěn)定，即它在至少18個月、例如至少24個月的時間內(nèi)，具有超過pH 3.5的pH值。本發(fā)明的制劑優(yōu)選保持在2_8°C的溫度范圍內(nèi)。然而，本發(fā)明的制劑也可保持在更高溫度下。已滅菌PGA通過對未滅菌PGA進行電子束滅菌而獲得。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明特別涉及包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述已滅菌PGA獲自對起始重量平均分子量(Mwq)為至少250 kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌，例如獲自對具有范圍為250-500 kDa的起始重量平均分子量(Mwtl)的未滅菌PGA進行電子束滅菌。在本文情況下，所施用的電子束滅菌劑量選自約25-30 kGy的劑量范圍，所述劑量至少為25 kGy。此外，本發(fā)明首次公開并因此涉及產(chǎn)生藥物、牙科和/或美容制劑的方法，所述方法的特征在于從發(fā)育中的哺乳動物的牙中分離釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白，對起始重量平均分子量(Mwtl)大于250 kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌，并將兩種組分混合。因此，本發(fā)明還涉及包含軸基質(zhì)蛋白和/或軸基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑，所述已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa，其中所述制劑通過以下方法產(chǎn)生，包括:從發(fā)育中的哺乳動物牙中分離釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白，對起始重量平均分子量(Mwtl)范圍為250-500 kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌，并將兩種組分混合。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)電子束滅菌的起始重量平均分子量(MJ范圍為250-500 kDa的未滅菌PGA在制備包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑中的用途，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa、例如大于或等于135 kDa、例如大于或等于185 kDa，且其中在至少18個月、例如至少24個月、例如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個月的時間內(nèi)，所述制劑具有大于3.5的pH值。該制劑優(yōu)選保持在2-8°C范圍的溫度。然而，也
可使用更高溫度。本發(fā)明還涉及經(jīng)電子束滅菌的起始重量平均分子量(Mwtl)范圍為250-500 kDa的未滅菌PGA在制備包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑中的用途，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa、例如至少135 kDa、例如至少185 kDa，且其中所述制劑在至少18個月、例如至少24個月的時間內(nèi)具有大于3.5的pH值。該制劑優(yōu)選保持在2-8°C范圍的溫度。然而，也可使用更高溫度。以基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌PGA但不包括其它賦形劑的總的組合重量計，本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑包含范圍為93%-約98%、94%-約97%和95%-約96%重量/體積的釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白。本發(fā)明還涉及包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和PGA或者兩種或更多種本文定義的EMD蛋白的組合的藥物制劑，其中滅菌前，PGA的重量平均分子量(MJ范圍為250-500kDa。這類藥物制劑任選還包含藥學(xué)可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑還包含至少兩種表面穩(wěn)定劑，其可選自陰離子表面穩(wěn)定劑、陽離子表面穩(wěn)定劑、兩性離子表面穩(wěn)定劑和離子型表面穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑可用于醫(yī)學(xué)。對于這類預(yù)期應(yīng)用，可配制所述制劑用于選自以下的任何給藥途徑(administration): 口服、經(jīng)肺、直腸、眼、結(jié)腸、胃腸夕卜、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部、口腔、經(jīng)鼻和局部給藥。按照其預(yù)期的給藥途徑，將制劑配制成選自以下的劑型:液體分散體、口服混懸劑、凝膠劑、氣霧劑、軟膏劑、乳膏劑、控釋制齊IJ、速溶制劑、凍干制劑、片劑、膠囊劑、遲釋制劑、延釋制劑、脈沖釋放制劑及即釋和控釋混合制劑。此外，本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑可包含一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、藥學(xué)上可接受的載體或其組合以及一種或多種非釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白活性劑。在本文情況下，藥物制劑還包含美容組合物以及屬于介于藥物與美容品間的所謂灰色區(qū)域即藥用美容品(cosmeceuticals)的組合物。藥物制劑可呈例如固體、半固體或流體制劑的形式，例如 -遞送裝置、植入物；
-散劑、顆粒劑、細(xì)粒劑、膠囊劑、瓊脂糖或脫乙酰殼多糖珠粒、微球體、納米粒；
-噴霧劑、氣霧劑、吸入裝置；
-凝膠劑、水凝膠、糊劑、軟膏劑、乳膏劑、皂、牙膏；
-溶液劑、分散體、混懸劑、乳劑、合劑、洗劑、漱口劑、洗發(fā)劑、灌腸劑；
-裝有例如兩個獨立容器的藥盒，其中第一容器包括任選與其它活性藥物物質(zhì)和/或藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體和/或稀釋劑 混合的本發(fā)明制劑，第二容器包括為了得到即用型制劑而在使用前欲加入到第一容器中的合適介質(zhì)。
本發(fā)明的制劑可適用于手術(shù)期間，例如適用于局部施用(例如口腔中)，呈凝膠齊U、膜或干的小丸劑的形式或作為沖洗液，或者用糊劑或乳膏劑治療。
制劑可按照常規(guī)藥學(xué)實踐配制，參見例如"Remington’s PharmaceuticalSciences"和"Encyclopedia of Pharmaceutical Technology",由 Swarbrick, J.和 J.C.Boylan 主編，Marcel Dekker, Inc., New York, 1988。
本發(fā)明的制劑可應(yīng)用于例如假牙、假體(prostheses)、植入物和體腔例如口腔、鼻腔和陰道腔，尤其預(yù)期牙科/齒科領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。
藥學(xué)上或美容上可接受的賦形劑、載體和/或稀釋劑是對被給予制劑的個體基本無害的物質(zhì)。這類賦形劑、載體和/或稀釋劑通常滿足國家衛(wèi)生當(dāng)局規(guī)定的要求。法定藥典例如例如英國藥典、美國藥典和歐洲藥典制訂了藥學(xué)可接受的賦形劑的標(biāo)準(zhǔn)。
藥學(xué)可接受的賦形劑是否適用于藥物制劑一般取決于所選劑型的類型。下面給出用于本發(fā)明用途的不同制劑類型的合適的藥學(xué)上可接受賦形劑的實例。
一般無法預(yù)測用于本發(fā)明用途的組合物中藥學(xué)上可接受賦形劑的選擇及其最佳濃度，并且必須根據(jù)最終組合物的實驗評價來確定。然而，藥物制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員可在例如以下文獻中找到指引:"Remington’s Pharmaceutical Sciences〃，第 18 版，MackPublishing Company, Easton,1990。
藥學(xué)可接受的賦形劑可包括溶劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、螯合劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、助懸劑、凝膠形成劑、軟膏基質(zhì)、滲透促進劑、香料和護膚劑。
溶劑的實例為例如水、醇、植物油或海產(chǎn)油(例如食用油，像杏仁油、蓖麻油、可可月旨、椰子油、玉米油、棉籽油、亞麻子油、橄欖油、棕櫚油、花生油、罌粟籽油、菜籽油、芝麻油、大豆油、向日葵油和茶籽油)、礦物油、脂肪油、液狀石蠟、聚乙二醇、丙二醇、甘油、液體聚烷基娃氧燒及其混合物。
緩沖劑的實例為例如檸檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、氫磷酸(hy dr ο genpho sphor i cacid)、二乙胺等。
用于本發(fā)明制劑的防腐劑的合適實例是對羥基苯甲酸酯，例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸異丁酯、對羥基苯甲酸異丙酯、山梨酸鉀、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、溴硝丙二醇、bronidox、MDM乙內(nèi)酰脲、碘代丙炔基氨基甲酸丁酯、EDTA、苯扎氯銨(benzalconiumchloride)和苯甲醇或防腐劑的混合物。
濕潤劑的實例為甘油、丙二醇、山梨醇、乳酸、脲及其混合物。
螯合劑的實例為EDTA鈉和檸檬酸。
抗氧化劑的實例為丁基羥基茴香醚(BHA)、抗壞血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、半胱氨酸及其混合物。
乳化劑的實例為天然存在的樹膠,例如合金歡樹膠(gum acacia)或西黃蓍膠；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；脫水山梨醇單油酸酯衍生物；羊毛脂；羊毛醇；脫水山梨醇酯；單甘油酯；脂肪醇；脂肪酸酯(例如脂肪酸的甘油三酯)及其混合物。
助懸劑的實例為例如纖 維素和纖維素衍生物例如羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素(例如Avicer RC 591、甲基纖維素)；角叉菜膠(carraghenan)、天然存在的樹膠,例如金合歡樹膠、阿拉伯膠、黃原膠或西黃蓍膠及其混合物，例如合金歡樹膠、纖維素，例如藻酸鹽和脫乙酰殼多糖，例如藻酸鈉等。凝膠基質(zhì)、增粘劑或能夠從傷口吸收滲出物的組分的實例為:液狀石蠟、聚乙烯、脂肪油、膠態(tài)二氧化硅或鋁、鋅皂、甘油、丙二醇、西黃蓍膠、羧乙烯基聚合物、硅酸鎂鋁、Carbopol 、親水聚合物例如淀粉或纖維素衍生物例如羧甲基纖維素、羥乙基纖維素和其它纖維素衍生物、水溶脹性水膠體、角叉菜膠(carragenan)、透明質(zhì)酸鹽(例如任選含有氯化鈉的透明質(zhì)酸鹽凝膠)和藻酸酯，包括丙二醇藻酸酯。用于本發(fā)明制劑的凝膠的其它實例包含水凝膠例如PEG (聚乙二醇(PolyEthylene Glycol))、硫酸葡聚糖、葡萄糖、硫酸乙酰肝素、明膠等。軟膏基質(zhì)的實例為例如蜂蠟、石蠟、鯨蠟醇、鯨蠟醇棕櫚酸酯、植物油、脂肪酸的脫水山梨醇酯(Span)、聚乙二醇和脂肪酸的脫水山梨醇酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(Tween)。疏水性或水乳化性軟膏基質(zhì)的實例為石蠟、植物油、動物脂、合成甘油酯、蠟、羊毛脂和液體聚燒基娃氧燒。親水性軟膏基質(zhì)的實例為固體聚乙二醇(macrogol, polyethylene glycol)。軟膏基質(zhì)的其它實例為三乙醇胺皂、硫酸化脂肪醇和聚山梨酯。粉劑組分的實例為:藻酸鹽、膠原、乳糖、當(dāng)施用于傷口時能夠形成凝膠的粉劑(吸收液體/傷口滲出物)。通常，欲施用于大的開放性創(chuàng)傷上的粉劑必須是無菌的，必須使存在的顆粒微粉化。其它賦形劑的實例為聚合物，例如羧甲纖維素(carmelose)、羧甲纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、羥乙 基纖維素、羥丙基纖維素、果膠、黃原膠、刺槐豆膠、金合歡樹膠、明膠、卡波姆、乳化劑樣維生素E、硬脂酸甘油酯、十六烷基葡糖苷、膠原、角叉菜膠、透明質(zhì)酸鹽和藻酸鹽和kitosans。合適的分散劑或濕潤劑為例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂或大豆卵磷脂；環(huán)氧乙烷與例如脂肪酸、長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物或衍生自脂肪酸和己糖醇或己糖醇酐的偏酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯等。正如技術(shù)人員容易理解的一樣，本發(fā)明的藥物制劑中EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白的濃度可隨制劑的預(yù)期用途而變化。通常，藥物制劑中肽的濃度范圍為0.01-100 mg/ml、例如 0.05-90 mg/ml、例如 0.5 - 80 mg/ml、例如 1-70 mg/ml、例如 5-65 mg/ml、例如 10-60mg/ml、例如 15-55 mg/ml、例如 20-50 mg/ml、例如 25-45 mg/ml、例如 25-40 mg/ml、例如26-39 mg/ml、例如 27-36 mg/ml、例如 27、28、29、30、31、32、33、34、35 或 36 mg/ml。體內(nèi)施用于受試者的量通常為約10 ng/cm2-0.1 mg/cm2,例如約I μ g/cm0純化的釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白含有可通過高壓液相色譜法(HPLC)分離的3種主要的蛋白質(zhì)流分。這些流分分別稱為流分A、B和C。分別在20、14和5 kDa的主要蛋白質(zhì)峰之間，分離和/或純化的蛋白質(zhì)的典型重量比為約80/8/12。如上所述，通過SDS PAGE電泳測定，流分C通常具有介于約3.5和5 kDa之間的分子量，例如約5 kDa,4 kDa和3.5 kDa。通過SDS PAGE電泳測定，流分A通常具有約20kDa的分子量。通過SDS PAGE電泳測定，流分B通常具有介于約6 kDa和15 kDa之間，例如約 15 kDa、12 kDa、10 kDa 和 6 kDa 的分子量。EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白由多種蛋白質(zhì)組成，例如法浪蛋白、enamelin、tuft蛋白、蛋白酶和白蛋白。法浪蛋白，其為EMD蛋白和/或軸基質(zhì)蛋白的主要組分(聞達約90%),是通過可變剪接和受控分泌后加工而可來源于單個基因的疏水蛋白質(zhì)的家族。它們在整個脊椎動物進化中是高度保守的，在所有已研究的高等脊椎動物(80%)中顯示高的序列同源性整體水平。實際上，豬和人琺瑯蛋白基因轉(zhuǎn)錄物的序列僅在4%的堿基中不同。因此，釉基質(zhì)蛋白或EMD蛋白雖然來源于豬，但當(dāng)在人體中遇到時仍被視為是“自身”的，并且可在不引發(fā)變態(tài)反應(yīng)或其它不良反應(yīng)的情況下促進人的牙再生。
因此在本文中，純化的釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白可定義為這樣的釉基質(zhì)蛋白，其包含至少60-70%琺瑯蛋白，例如至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%，分子量為約 20-25 kDa、例如 20、21、22、23、24 或 25 kDa，或者例如介于 20_22、20_24 或 20-23 kDa之間?？偟恼f來，分別在流分A、B和C的主要蛋白質(zhì)峰之間，純化和/或分離的釉基質(zhì)蛋白的重量比為約80/8/12、例如75-85/5-12/5-15，或者例如至少80%、至少8%和至少5%。約60-90%,例如至少 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、80、70-90、60-70、70-80 或 80-90%的純化和/或分離的釉基質(zhì)蛋白為琺瑯蛋白和/或琺瑯蛋白的片段或衍生物。
在本發(fā)明中，局部算法程序最適于確定蛋白質(zhì)的同一性。局部算法程序(例如Smith-Waterman)對一個序列中的亞序列與第二序列中的亞序列進行比較，并找出亞序列的組合和所述亞序列的比對，其得到最高的總體相似性評分。如果允許的話，對內(nèi)部空位進行罰分。對于比較共有單個結(jié)構(gòu)域或僅結(jié)合部位的兩種多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，局部算法運行良好。
在公眾可獲取的程序中，對測定同一性和相似性的方法編程。測定兩個序列間的同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(DevereuxJ等(1994))BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul，S.F.等(1990))。BLASTX 程序可公開獲自 NCBI 和其它來源(BLAST Manual, Altschul, S.F.等，Altschul, S.F.等(1990))。另一個優(yōu)選的實例為Clustal W (http://www.eb1.ac.uk/cIustalw/)。各個序列分析程序具有默認(rèn)評分矩陣和默認(rèn)空位罰分?？偟恼f來，分子生物學(xué)者可預(yù)期使用通過所應(yīng)用的軟件程序確立的默認(rèn)設(shè)置。
就化學(xué)、異構(gòu)性(isometry)而言或以任何其它方式,可對EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白中的氨基酸進行進一步修飾，只要該蛋白質(zhì)的序列完整。EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白的氨基酸修飾可增加蛋白 質(zhì)的活性、穩(wěn)定性、生物相容性或臨床性能，或者降低蛋白質(zhì)的毒性和不良反應(yīng)?；瘜W(xué)修飾的實例包括但不限于糖基化和甲基化。氨基酸還可以是立體異構(gòu)形式的所有不同類型，例如氨基酸的D型或L型，或者S或R異構(gòu)體。本發(fā)明的EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白中的氨基酸還可被其合成類似物替換。合成類似物的使用可產(chǎn)生例如更穩(wěn)定和較不易降解的EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白。非天然氨基酸的實例包括α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵化物衍生物例如三氟酪氨酸*、對-Cl-苯丙氨酸*、對-Br-苯丙氨酸*、對-1-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β -丙氨酸*、L-a_氨基丁酸*、L-g_氨基丁酸*、L-a_氨基異丁酸*、L_e_氨基己酸#、7_氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正纈氨酸*、對-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羥脯氨酸#、L_硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr (甲基)*、L-Phe (4-異丙基)*、L-Tic (1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸(4-芐基)*。本文使用符號*說明衍生物的疏水性質(zhì)，而使用#說明衍生物親水性質(zhì)，#*說明兩親性質(zhì)。EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白還可包含N端和/或C端標(biāo)簽，其包含氨基酸His和/或Met。Met含有硫，這在以前被解釋為促進與金屬表面結(jié)合。His對例如Ni和其它金屬具有強的親和力。因此使用這些標(biāo)簽具有能夠使蛋白質(zhì)與以下金屬表面附著的優(yōu)勢:像鈦、鋯、鋁、鉭、金、手術(shù)用鋼和鎳或金屬氧化物氫氧化物和/或氫化物表面等。例如當(dāng)EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白附著于金屬表面時，例如當(dāng)它們被用來改進生物礦化和/或醫(yī)學(xué)假體裝置(medical prosthetic device)的骨整合時,這極為重要。如技術(shù)人員所熟知，C端和/或N端標(biāo)簽還可用于所得蛋白質(zhì)純化的方法。使用N端和/或C端標(biāo)簽還允許蛋白質(zhì)充分暴露，即標(biāo)簽用來使蛋白質(zhì)與表面結(jié)合，而其余蛋白質(zhì)不與例如原子、分子、細(xì)胞和組織相互作用。在蛋白質(zhì)產(chǎn)生期間，在EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白的各端使用一個標(biāo)簽可能是有益的，這允許在從未完全蛋白質(zhì)產(chǎn)物中純化出目的蛋白期間，肽的一端與柱連接，同時蛋白質(zhì)的另一端可用來與目的表面結(jié)合。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案涉及包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白、另還包含N端和/或C端組氨酸標(biāo)簽的制劑。如前所述，這類標(biāo)簽可包含已經(jīng)與本發(fā)明的EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白連接的甲硫氨酸和/或組氨酸殘基。在一個優(yōu)選的實施方案中，該標(biāo)簽包含3個或更多個殘基，例如介于3-5或5-10個殘基之間。標(biāo)簽可包含任何量的殘基，其依然與本發(fā)明的EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白一起提供穩(wěn)定的制齊U，不以負(fù)面方式影響EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白的二級結(jié)構(gòu)。優(yōu)選該組氨酸標(biāo)簽由5個組氨酸殘基組成。在另一個優(yōu)選的實施方案中，EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白包含N端和/或C端甲硫氨酸標(biāo)簽，所述標(biāo)簽優(yōu)選由5個甲硫氨酸殘基組成。在另一個優(yōu)選的實施方案中，包含EMD蛋白和/或軸基質(zhì)蛋白的制劑在其C端或N端包含甲硫氣Ife標(biāo)簽，在另一端包含組氨酸標(biāo)簽。在一個實施方案中，EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白通過例如合成生產(chǎn)或生物合成來產(chǎn)生，而不是從天然來源分離。EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白或其片段可通過用于生產(chǎn)肽的任何已知方法產(chǎn)生，例如通過化學(xué)合成的合成生產(chǎn)。合成生產(chǎn)還允許使用可提高所產(chǎn)生蛋白質(zhì)或片段的穩(wěn)定性的氨基酸類似物。技術(shù)人員了解可用于氨基酸序列合成的方法。
`
優(yōu)選生物生產(chǎn)可用作產(chǎn)生EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白或其片段的方法。生物生產(chǎn)意指氨基酸序列在生物系統(tǒng)例如細(xì)胞培養(yǎng)或微生物細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞中的生產(chǎn)。對于生物生產(chǎn)，必需構(gòu)建編碼特定氨基酸序列的相應(yīng)核酸序列。技術(shù)人員容易了解一旦確定要合成的特定氨基酸序列時如何構(gòu)建這類核酸序列，以及如何產(chǎn)生EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白或其片段并從其生產(chǎn)所用系統(tǒng)中純化出來(參見例如Svensson J, Andersson C，ReselandJE, Lyngstadaas SP, Bulow L.Histidine tag fusion increase expression levels ofactive recombinant Amelogenin in Escherichia coli (大腸桿菌中組氨酸標(biāo)簽融合物提高活性重組琺瑯蛋白的表達水平).(Protein Expr Purif, 48; 134-41 (2006))。在本文情況下，醫(yī)學(xué)假體裝置涉及欲植入脊椎動物、特別是哺乳動物、特別是人體內(nèi)的任何裝置。在本文情況下，醫(yī)學(xué)假體裝置可用來置換解剖結(jié)構(gòu)和/或恢復(fù)機體的任何功能。這類裝置的非限制性實例是置換解剖結(jié)構(gòu)或恢復(fù)機體功能的醫(yī)學(xué)裝置，例如股骨髖關(guān)節(jié)；股骨頭；髖白杯；肘，包括桿(stems)、楔形物(wedges)、關(guān)節(jié)插入物(articularinserts);膝，包括股骨和脛骨組件、桿、楔形物、關(guān)節(jié)插入物或髕骨部件；肩，包括桿和頭(head);腕；踝；手；手指；腳趾；椎骨；脊椎盤；人工關(guān)節(jié)；牙植入物；聽骨鏈成形植入物；中耳植入物，包括砧骨、錘骨、鐙骨、砧骨-鐙骨、錘骨-砧骨、錘骨-砧骨-鐙骨；耳蝸植入物；矯形固定裝置，例如釘子(nails)、螺絲、釘(staples)和托基(plates);心瓣膜；起搏器；導(dǎo)管；脈管(vessel);空隙填充植入物(space filling implant);用于助聽器固位的植入物；用于外固定的植入物；還有子宮內(nèi)裝置(IUD);以及生物電子裝置例如耳蝸內(nèi)或顱內(nèi)電子裝置。本發(fā)明的制劑還可包含顆粒，顆粒的實例為孔徑大小直徑范圍為100-500微米的多孔顆粒。給藥
本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑可用于促進和/或誘導(dǎo)硬組織再生、組織礦化、骨生長和/或骨再生長、牙質(zhì)再生、牙骨質(zhì)發(fā)生和/或活的礦化組織之間的結(jié)合；用于活的礦化組織件與其它活組織件上的粘結(jié)部位的粘結(jié)、用于支持硬組織間的結(jié)合和/或用于填充手術(shù)和/或創(chuàng)傷后礦化傷口的腔和/或組織缺陷。本發(fā)明的藥物、牙科和/或美容制劑可備選和/或另外用于促進和/或誘導(dǎo)軟組織再生和/或用于治療和/或預(yù)防炎癥和/或感染和/或用于治療SIRS。因此，本發(fā)明還涉及包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的藥物、牙科和/或美容制劑在用于制備用于以下方面的藥物組合物中的用途:用于促進和/或誘導(dǎo)硬組織再生、組織礦化、骨 生長和/或骨再生長、牙質(zhì)再生、牙骨質(zhì)發(fā)生和/或活的礦化組織部分之間的結(jié)合、用于活的礦化組織件與其它活組織件上的粘結(jié)部位的粘結(jié)、用于支持硬組織間的結(jié)合和/或用于填充手術(shù)和/或創(chuàng)傷后礦化傷口的腔和/或組織缺陷、以及用于促進和/或誘導(dǎo)軟組織再生和/或用于治療和/或預(yù)防炎癥和/或感染和/或用于治療SIRS，其中所述制劑包含不大于6重量％ (wt)的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)，并且其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDaο此外，預(yù)期用于以下方面的方法:用于促進和/或誘導(dǎo)硬組織再生、組織礦化、骨生長和/或骨再生長、牙質(zhì)再生、牙骨質(zhì)發(fā)生和/或活的礦化組織部分之間的結(jié)合、用于活的礦化組織件與其它活組織件上的粘結(jié)部位的粘結(jié)、用于支持硬組織間的結(jié)合和/或用于填充手術(shù)和/或創(chuàng)傷后礦化傷口的腔和/或組織缺陷、以及促進和/或誘導(dǎo)軟組織再生和/或用于治療和/或預(yù)防炎癥和/或感染和/或用于治療SIRS，所述方法包括將包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的藥物、牙科和/或美容制劑給予有需要的患者，其中所述制劑包含不大于6重量/體積％ (w/v%)的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)，并且其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDaο可將包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑通過任何合適的途徑給予有需要的受試者，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185kDa，所述途徑取決于要給予肽的組織，例如經(jīng)局部(皮膚)、口服、含服、經(jīng)鼻、經(jīng)耳、經(jīng)直腸或陰道給藥，或者通過給予體腔，例如牙根、牙根管或骨折(bone fracture) 0此外，本發(fā)明的制劑可適于與手術(shù)結(jié)合給予，例如與體內(nèi)切口結(jié)合給予。還可通過局部注射、通過以凝膠劑施用或經(jīng)由醫(yī)學(xué)裝置例如醫(yī)學(xué)假體裝置，例如移植物、支架或生物玻璃材料給予本發(fā)明的制劑。經(jīng)由藻酸鹽或脫乙酰殼多糖(緩釋)珠粒、牙膏、以洗發(fā)劑、牙鑲補料給予本發(fā)明的制劑也是可能的。如果將包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高平均分子量的PGA的本發(fā)明藥物制劑局部給予例如骨折、牙周缺陷、拔牙后的牙槽(extractionalveolas)或竇抬高術(shù)，則所述蛋白質(zhì)可改進和/或加快骨愈合。
可將制劑裝入膠囊，并通過攝取而口服遞送、通過吸入經(jīng)鼻腔或肺或者通過注射入血液、脊髓液、關(guān)節(jié)或腹膜內(nèi)遞送作為緩釋貯庫制劑(Cbpot)。
另一方面，本發(fā)明涉及包含軸基質(zhì)蛋白和/或軸基質(zhì)衍生物蛋白(EMD)和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑在制備用于誘導(dǎo)生物礦化的藥物中的用途，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。具體地講，本發(fā)明還涉及包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高重量平均分子量的PGA的藥物制劑在制備用于骨形成和/或再生的藥物中的用途。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明還涉及包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高重量平均分子量的PGA的藥物制劑在制備用于軟骨、牙骨質(zhì)和/或牙組織形成和/或再生的藥物中的用途。包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高重量平均分子量的PGA的本發(fā)明藥物制劑還可用于制備治療骨質(zhì)疏松癥、骨折、牙周炎、創(chuàng)傷、骨代謝綜合征、牙髓炎、牙尖病損等的藥物。
包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑還可用于制備用于骨折愈合的藥物，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mff)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。
一方面，本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)生物礦化的包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物蛋白(EMD)和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mff)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。例如包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高平均分子量的PGA的本發(fā)明藥物制劑可用于制備用于軟骨、牙骨質(zhì)和/或牙組織形成和/或再生的藥物。
另一方面，本發(fā)明涉及用于骨形成和/或再生的包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高重量平均分子量的PGA的本發(fā)明藥物制劑。
再一方面，本發(fā)明涉及用于骨折愈合的包含EMD蛋白和/或軸基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高重量平均分子量的PGA的本發(fā)明藥物制劑。
EMD蛋白和/或釉 基質(zhì)蛋白還可與誘導(dǎo)礦物沉淀和/或生物礦化和/或骨形成的天然蛋白質(zhì)(例如BMP)聯(lián)用。也可能使用兩種或多種蛋白質(zhì)的組合，用于誘導(dǎo)和/或刺激礦物沉淀(包括生物礦化)。
包含EMD蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和具有如上定義的高重量平均分子量的PGA的本發(fā)明藥物制劑，還可用于兩種生物礦化結(jié)構(gòu)的融合或生物礦化結(jié)構(gòu)與另一種材料的融合。這類材料的實例包括可植入生物材料，例如鈦和鋼、生物玻璃、磷酸鈣、磷灰石等。其它實例包括柱材料、過濾材料等。
本發(fā)明的補充制劑是還可包含纖維素衍生物和藻酸鹽(例如羧甲基纖維素和PGA)的制劑。
本發(fā)明還涉及由釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白組成(consisting)的制劑，其中至少60-70%，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%的蛋白質(zhì)的分子量介于16-40 kDa之間，例如大于20 kDa，例如16、17、18或19 kDa，且不超過3_6重量/體積％ (w/v%)、例如3、4、5或6% w/v的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。本發(fā)明還涉及基本上由釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白組成的制劑，其中至少60-70%，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%的蛋白質(zhì)的分子量介于16-40 kDa之間，例如大于20 kDa，例如16、
17、18、19或20 kDa，且不超過3-6重量/體積％ (w/v%)、例如3、4、5或6 w/v %的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDaο實驗部分
實施例1
重量平均分子量(Mw)
采用GPC (Agilent)和下列參數(shù)，按照分析方法AM-SOl測定重量平均分子量:
洗脫液:磷酸緩沖液PH 7.0
Precolumn 柱:PSS Suprema 10 μ m 100 A 8 x 50 mmPSS Suprema 10 μ m 100 A 8 x 300 mmPSS Suprema 10 μ m 1000 A 8 x 300 mmPSS Suprema 10 μ m 100 A 8 x 300 mm泵:Agilent 1100流速:1.0 ml/分鐘
自動進樣器=Agilent 1100，注射體積50 μ I 樣品濃度:2.0,3.0 g/L 溫度:23°C
檢測器=Aglient 1100 Rl
計算:PSS WinGPC Unity 7.20 版
根據(jù)用Pollulan摩爾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)校準(zhǔn)進行校準(zhǔn)
自2002到2009以來未滅菌PGA和Kelcoloid O的重量平均分子量公開于表I。表I
權(quán)利要求
1.包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述制劑包含不大于6重量/體積％ (w/v%)的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)，且其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa。
2.權(quán)利要求1的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mff)的范圍介于130 - 250 kDa之間。
3.權(quán)利要求1的藥物、牙科和/或美容制劑，其包含范圍為3重量/體積％(w/v%)至6￥八％且重量平均分子量大于130 kDa的已滅菌PGA。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于或等于135 kDa ο
5.權(quán)利要求1-3中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于或等于185 kDa ο
6.權(quán)利要求1-5中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中通過電子束滅菌對所述已滅菌丙二醇藻酸酯進行滅菌。
7.權(quán)利要求6的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所用電子束滅菌劑量選自25-30kGy范圍內(nèi)的劑量。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白包含至少60-70%具有選自以下平均分子量的琺瑯蛋白:介于18與25 kDa之間，介于20與24 kDa之間、介于20與22 kDa之間和20 kDa。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述制劑在至少24個月時間內(nèi)的pH大于3.5。
10.權(quán)利要求1-8中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述制劑在至少18個月時間內(nèi)的pH大于3.5。
11.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述制劑在2-8°C的溫度范圍內(nèi)的pH大于3.5。
12.包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述已滅菌PGA獲自對起始重量平均分子量(MJ為至少250 kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌。
13.權(quán)利要求12的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述已滅菌PGA獲自對起始重量平均分子量(MJ的范圍為250-500 kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所用電子束滅菌劑量選自25-30 kGy范圍內(nèi)的劑量。
15.前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述制劑還包含一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、藥學(xué)上可接受的載體或其組合。
16.前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中以基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌PGA而不包括其它賦形劑的總的組合重量計，所述釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的量的范圍為93%-約98%、94%-約97%和95%-約96%重量/體積。
17.前述權(quán)利要求中任一項的藥物、 牙科和/或美容制劑，其還包含一種或多種非釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白活性劑。
18.前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其包含至少兩種表面穩(wěn)定劑。
19.前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中所述表面穩(wěn)定劑選自陰離子表面穩(wěn)定劑、陽離子表面穩(wěn)定劑、兩性離子表面穩(wěn)定劑和離子型表面穩(wěn)定劑。
20.用于藥物的前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑。
21.前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其中配制所述制劑用于選自以下途徑的給藥:口服、經(jīng)肺、直腸、眼、結(jié)腸、胃腸外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部、含月艮、經(jīng)鼻和局部給藥。
22.前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑，其被配制成選自以下的劑型:液體分散體、口服混懸劑、凝膠劑、氣霧劑、軟膏劑、乳膏劑、控釋制劑、速溶制劑、凍干制齊IJ、片劑、膠囊劑、遲釋制劑、延釋制劑、脈沖釋放制劑和即釋和控釋混合制劑。
23.用于以下方面的前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑:促進和/或誘導(dǎo)硬組織再生、組織礦化、骨生長和/或骨再生長、牙質(zhì)再生、牙骨質(zhì)發(fā)生和/或活的礦化組織部分之間的結(jié)合、活的礦化組織件與其它活組織件上的粘結(jié)部位的粘結(jié)、支持硬組織間的結(jié)合和/或填充手術(shù)和/或創(chuàng)傷后礦化傷口的腔和/或組織缺陷。
24.用于以下方 面的前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑:促進和/或誘導(dǎo)軟組織再生和/或治療和/或預(yù)防炎癥和/或感染和/或治療SIRS。
25.權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑在制備用于以下方面的藥物組合物中的用途:促進和/或誘導(dǎo)硬組織再生、組織礦化、骨生長和/或骨再生長、牙質(zhì)再生、牙骨質(zhì)發(fā)生和/或活的礦化組織部分之間的結(jié)合、活的礦化組織件與其它活組織件上的粘結(jié)部位的粘結(jié)、支持硬組織間的結(jié)合和/或填充手術(shù)和/或創(chuàng)傷后礦化傷口的腔和/或組織缺陷。
26.權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑在制備用于以下方面的藥物組合物中的用途:促進和/或誘導(dǎo)軟組織再生和/或治療和/或預(yù)防炎癥和/或感染和/或治療 SIRS。
27.一種方法，所述方法用于促進和/或誘導(dǎo)硬組織再生、組織礦化、骨生長和/或骨再生長、牙質(zhì)再生、牙骨質(zhì)發(fā)生和/或活的礦化組織部分之間的結(jié)合、活的礦化組織件與其它活組織件上的粘結(jié)部位的粘結(jié)、支持硬組織間的結(jié)合和/或填充手術(shù)和/或創(chuàng)傷后礦化傷口的腔和/或組織缺陷，所述方法包括將前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑給予有需要的患者。
28.一種用于促進和/或誘導(dǎo)軟組織再生和/或用于治療和/或預(yù)防炎癥和/或感染和/或用于治療SIRS的方法，所述方法包括將前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑給予有需要的患者。
29.—種生產(chǎn)前述權(quán)利要求中任一項的藥物、牙科和/或美容制劑的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: a.從發(fā)育中的哺乳動物的牙中分離釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白， b.對初始重量平均分子量(Mwtl)大于250kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌，和 c.將獲自a.的制品和獲自b.的制品混合。
30.包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑，所述已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130kDa，其中所述制劑通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生: a.從發(fā)育中的哺乳動物牙中分離釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白， b.對初始重量平均分子量(Mwtl)范圍為250-500kDa的未滅菌PGA進行電子束滅菌，和 c.將獲自a.的制品和獲自b.的制品混合。
31.電子束滅菌的初始重量平均分子量(MJ的范圍為250-500kDa的未滅菌PGA在制備包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑中的用途，其中所述電子束滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130kDa,且其中所述制劑在至少18個月、例如至少24個月的時間內(nèi)的pH值大于3.5。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述制劑在2-8°C的溫度范圍內(nèi)的pH值大于3.5。
33.一種為了獲得所需PGA穩(wěn)定性而確定已滅菌PGA的最大濃度的方法,其特征在于所述方法包括以下步驟: a)測量已滅菌PGA的初始pH; b)確定制劑的耐用期；` 將得自a)和b)的結(jié)果用于下列方程式中:
34.一種用于確定已滅菌丙二醇藻酸酯是否可用于包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的藥物、牙科和/或美容制劑的方法，其特征在于所述方法根據(jù)權(quán)利要求33的方法。
35.權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的方法，其中通過電子束滅菌對所述已滅菌PGA進行滅菌。
36.一種含有包含釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白的藥物、牙科和/或美容制劑的制劑，其中所述制劑包含不大于6重量/體積％ (w/v%)的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)，且其中所述已滅菌PGA的濃度通過采用權(quán)利要求31的方法選擇，且其中滿足下列條件:在至少18個月、例如至少24個月的時間內(nèi)制劑的pH大于3.5，且所述已滅菌PGA的重量平均分子量(Mw)大于130 kDa ο
37.一種由釉基質(zhì)蛋白和/或釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白組成的制劑，其中至少60-70%的蛋白質(zhì)的分子量介于16-40 kDa之間，且不超過3-6重量/體積％ (w/v%)的已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130 kDa ο
38.權(quán)利要求36或37的制劑，其中所述已滅菌PGA通過電子束滅菌進行滅菌。
全文摘要
釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和釉基質(zhì)蛋白因其促進軟組織和硬組織再生并降低炎癥和感染而廣泛用于臨床牙科。本發(fā)明涉及意料不到的發(fā)現(xiàn)，即包含純化的釉基質(zhì)衍生物(EMD)蛋白和/或釉基質(zhì)蛋白和已滅菌丙二醇藻酸酯(PGA)的藥物、牙科和/或美容制劑隨時間推移更穩(wěn)定，尤其pH隨時間推移更穩(wěn)定，其中所述已滅菌PGA獲自重量平均分子量(MW0)介于250-500kDa的未滅菌PGA。
文檔編號A61Q11/00GK103153334SQ201180032934
公開日2013年6月12日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者L.加拉姆切吉, A.維塔爾 申請人:斯特勞曼控股公司