專利名稱：在提取發(fā)酵中用于醇移除的來源于油的提取溶劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵性醇如丁醇的生產(chǎn)，并且具體地講，涉及用于提取發(fā)酵的提取溶劑和將來源于生物質(zhì)的油轉(zhuǎn)化成提取溶劑的方法。
背景技術(shù)：
丁醇在工業(yè)和科學(xué)中具有多種用途，例如飲料(S卩，乙醇)、燃料、試劑、溶劑、和防腐敗劑。例如丁醇是一種醇，它是重要的工業(yè)化學(xué)品，具有多種用途，包括用作燃料添加劑，在塑料工業(yè)中用作化學(xué)原料，以及在食品和風(fēng)味劑工業(yè)中用作食品級(jí)的提取劑。因此，高度需求醇如丁醇以及高效環(huán)保的生產(chǎn)方法。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)醇如丁醇是一種這樣的環(huán)保生產(chǎn)方法。在丁醇生產(chǎn)中，具體地講一些生產(chǎn)高產(chǎn)量丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性閥值。當(dāng)丁醇產(chǎn)生時(shí)從發(fā)酵容器中將其移除是一種調(diào)控這些低丁醇毒性閥值的方法。當(dāng)生產(chǎn)丁醇時(shí)可使用原位產(chǎn)物移除(ISPR)(也稱為提取發(fā)酵)從發(fā)酵容器中移除丁醇(或其他發(fā)酵性醇)，從而使得微生物以高產(chǎn)量生產(chǎn)丁醇。本領(lǐng)域已經(jīng)描述過的一種用于移除發(fā)酵性醇的ISPR方法是液-液提取(美國專利公開申請(qǐng)公布2009/0305370)。為了技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上的可行性，液-液提取需要充分接觸提取劑和發(fā)酵液體培養(yǎng)基以高效傳質(zhì)產(chǎn)物醇到提取劑中；提取劑從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中良好的相分離(在發(fā)酵期間和/或發(fā)酵之后)；高效地回收并再利用提取劑；最小化提取劑的劣化能力以提取產(chǎn)物醇(例如通過防止產(chǎn)物醇到提取劑中的分配系數(shù)降低)；以及在長期運(yùn)行期間最小化脂質(zhì)對(duì)提取劑的污染，所述脂質(zhì)降低分配系數(shù)。提取劑的分配系數(shù)會(huì)隨著每次循環(huán)的時(shí)間而降低，例如生物質(zhì)中存在的脂質(zhì)的積聚會(huì)導(dǎo)致其降低，所述生物質(zhì)作為可水解淀粉的原料被輸送進(jìn)發(fā)酵容器。例如，載入發(fā)酵容器的30重量％干玉米固體的液化玉米醪能夠在葡萄糖向丁醇轉(zhuǎn)化期間通過同步糖化和發(fā)酵(SSF)(在發(fā)酵期間通過加入葡糖淀粉酶以產(chǎn)生葡萄糖，糖化液化醪)產(chǎn)生包含約1.2重量％玉米油的發(fā)酵液體培養(yǎng)基。 在ISPR期間用作提取劑的油醇(OA)中溶解的玉米油脂質(zhì)能夠引起脂質(zhì)濃度隨著每個(gè)OA循環(huán)的提高，降低OA中產(chǎn)物醇的分配系數(shù)，因?yàn)镺A中的脂質(zhì)濃度隨著每個(gè)OA循環(huán)而提高。
此外，在提取發(fā)酵期間存在的不溶解的固體能夠?qū)Υ忌a(chǎn)的效率產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，存在的不溶解的固體可降低發(fā)酵容器中的傳質(zhì)系數(shù)，阻止發(fā)酵容器中的相分離，可引起來自提取劑中的不溶解的固體的玉米油積聚，導(dǎo)致提取效率隨時(shí)間降低，可提高溶劑損失，因?yàn)樗c固體一起最后作為干酒糟可溶物(Dried Distillers' Grains withSolubles, DDGS)被移除，可減緩提取劑液滴從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的分離，和/或可導(dǎo)致較低的發(fā)酵容器體積效率。用于減少脂質(zhì)造成提取發(fā)酵中使用的提取劑劣化的多個(gè)方法已經(jīng)包括生物質(zhì)濕磨法、分級(jí)和移除固體。濕磨法是一種昂貴的多步方法，其將生物質(zhì)(例如玉米)分離成它的主要組分(胚芽、果皮纖維、淀粉、和谷蛋白)以分別從每個(gè)共產(chǎn)物獲取價(jià)值。這個(gè)方法提供純化的淀粉流；然而，它是昂貴的并且包括將生物質(zhì)分離成它的非淀粉組分，這對(duì)醇的發(fā)酵生產(chǎn)是不必要的。分級(jí)移除纖維和胚芽，其包含存在于碾磨過的完整玉米中的大部分脂質(zhì)，產(chǎn)生具有較高淀粉(胚乳)含量的玉米。干燥分級(jí)不會(huì)從纖維中分離胚芽，因此它比濕磨法更便宜。然而，分級(jí)不會(huì)移除全部纖維或胚芽，并且不移除全部固體。此外，在分級(jí)過程中存在一些淀粉損失。濕磨玉米比干燥分級(jí)更昂貴，但是干燥分級(jí)比干磨未分級(jí)的玉米更昂貴。如例如提交于2010年6月18日的共同未決的共有美國臨時(shí)申請(qǐng)序列61/356，290所述，在用于發(fā)酵之前從液化醪中移除包括含有脂質(zhì)的胚芽的固體能夠基本上移除不溶解的固體。然而，如果提取劑分配系數(shù)的降低能夠甚至在不分級(jí)或移除不溶解的固體的情況下被減小，這將是有利的。因此，一直需要通過其中提取劑分配系數(shù)的降低被減小的提取發(fā)酵開發(fā)用于生產(chǎn)產(chǎn)物醇如丁醇的較高效的方法和體系。此外，通常將提取劑(例如油醇)加到發(fā)酵過程中，而不是在過程的某個(gè)步驟中產(chǎn)生，因此所述提取劑是一種原材料成本。因?yàn)樘崛┛赡鼙徊豢砂l(fā)酵的固體吸收和/或被加入發(fā)酵過程的脂質(zhì)吸收而導(dǎo)致?lián)p失，醇生產(chǎn)方法的經(jīng)濟(jì)性可能受到提取劑回收和再利用效率的影響。因此，一直需要ISPR的可供選擇的提取劑，其能夠通過降低資金和/或運(yùn)行成本帶來較經(jīng)濟(jì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供生產(chǎn)產(chǎn)物醇如丁醇的方法滿足上述需要，其中生物質(zhì)中的脂質(zhì)被轉(zhuǎn)化成可用于ISPR的提取劑，并且其中降低了與原料一起被輸送進(jìn)發(fā)酵容器和/或在提取劑循環(huán)時(shí)的脂質(zhì)的量。本發(fā)明提供對(duì)用于提取產(chǎn)物醇(例如丁醇)的提取劑劣化能力的解決方法，該方法通過防止產(chǎn)物醇進(jìn)入提取劑中的分配系數(shù)的降低來解決這一問題。本專利申請(qǐng)?zhí)峁?duì)提取劑受甘油三酯污染的解決方法，所述甘油三酯降低提取劑對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。本發(fā)明還提供相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)，所述優(yōu)點(diǎn)將通過下文所述的實(shí)施方案變得顯而易見。將來源于生物質(zhì)的脂質(zhì)催化(例如酶催化)水解成脂肪酸能夠降低ISPR提取劑中的不可取脂質(zhì)積聚的速率。所述脂肪酸可從存在于生物質(zhì)中的脂質(zhì)水解獲得，所述生物質(zhì)提供用于發(fā)酵的可 發(fā)酵碳。將不期望脂肪酸降低產(chǎn)物醇如丁醇進(jìn)入提取劑相的分配系數(shù)的程度與脂質(zhì)相同，因?yàn)橐呀?jīng)測定出丁醇從水到脂肪酸的分配系數(shù)顯著大于丁醇從水到脂肪酸酯或甘油三酯的分配系數(shù)。此外，脂肪酸提取劑可用作ISPR提取劑，其可在醇生產(chǎn)工藝的一個(gè)步驟中產(chǎn)生，并可用于替代、或添加到供應(yīng)的不在所述工藝中生產(chǎn)的外源ISPR提取劑(例如但不限于油醇或油酸)中，從而降低用于ISPR提取劑的原材料費(fèi)用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的方法包括使包含水、可發(fā)酵碳源和油的生物質(zhì)與一種或多種催化劑接觸，從而通過一種或多種催化劑水解所述油的至少一部分以形成提取劑，其中所述可發(fā)酵碳源和所述油均來源于所述生物質(zhì)。所述生物質(zhì)可包括玉米粒、玉米棒、作物殘余物、玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動(dòng)物糞肥、以及它們的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述油可包含甘油酯，并且一種或多種催化劑可水解所述甘油酯以形成脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種催化劑可選自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取劑可包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、或它們的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取劑可包括脂肪酸的混合物或脂肪酸和脂肪酰胺的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取劑對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)可大于所述生物質(zhì)的油對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。本發(fā)明的方法還可包括在水解所述油的至少一部分之后使所述催化劑失活的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還可包括在通過一種或多種催化劑水解之前從所述生物質(zhì)中分離所述油的步驟。 受權(quán)利要求書保護(hù)的方法還可包括以下步驟:在發(fā)酵容器中使所述生物質(zhì)與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸；發(fā)酵所述生物質(zhì)的碳源以產(chǎn)生產(chǎn)物醇；以及通過使所述液體培養(yǎng)基與所述提取劑接觸，從所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中原位移除所述產(chǎn)物醇。所述產(chǎn)物醇可以是丁醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)醇的方法，所述方法包括(a)提供包含水、可發(fā)酵碳源和油的生物質(zhì)；(b)液化所述生物質(zhì)以產(chǎn)生液化的生物質(zhì)；(c)使所述液化的生物質(zhì)與一種或多種催化劑接觸，從而水解所述油的至少一部分以形成提取劑；(d)使所述液化的生物質(zhì)與能夠?qū)⒌途厶寝D(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶接觸；(e)在發(fā)酵容器中使所述液化的生物質(zhì)與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸；(f)發(fā)酵所述液化的生物質(zhì)的碳源以產(chǎn)生產(chǎn)物醇；(g)通過使所述液體培養(yǎng)基與所述提取劑接觸，從所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中原位移除所述產(chǎn)物醇；并且任選地，步驟(c)和(d)同時(shí)發(fā)生。所述生物質(zhì)可包括玉米粒、玉米棒、作物殘余物、玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動(dòng)物糞肥、以及它們的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述油可包含甘油酯，并且一種或多種催化劑可水解所述甘油酯以形成脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種催化劑可選自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取劑可包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、或它們的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取劑可包括脂肪酸的混合物或脂肪酸或脂肪酰胺的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取劑對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)可大于所述生物質(zhì)的油對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。本發(fā)明的方法還可包括在水解所述油的至少一部分之后使所述催化劑失活的步驟。所述產(chǎn)物醇可以是丁醇。本發(fā)明也涉及組合物，所述組合物包含:能夠產(chǎn)生醇的重組微生物；可發(fā)酵碳源；一種或多種能夠?qū)⒏视王ニ獬芍舅岬拇呋瘎?；包含甘油酯的油；和脂肪酸。所述一種或多種催化劑可選自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶，并且所述油可為玉米油、牛脂油、卡諾拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、魚油、霍霍巴油、豬油、亞麻籽油、牛蹄油、奧蒂油、棕櫚油、花生油、油菜籽油、稻米油、紅花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻風(fēng)樹油和植物油共混物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可發(fā)酵碳源和所述油來源于生物質(zhì)。所述生物質(zhì)可包括玉米粒、玉米棒、作物殘余物、玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動(dòng)物糞肥、以及它們的混合物。所述組合物還可包含糖化酶和/或不溶解的固體。所述組合物還可包含甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、甘油、單糖、低聚糖或醇中的至少一種或多種。此外，所述醇可以是丁醇。在一些實(shí)施方案中，從發(fā)酵工藝中除去來源于生物質(zhì)的油的方法包括:使含水生物質(zhì)原料流與催化劑接觸。所述原料流包括水、可發(fā)酵碳和一定量的油，并且所述可發(fā)酵碳和所述油均來源于生物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明所述的方法將所述油的至少一部分水解成脂肪酸以形成催化劑處理的生物質(zhì)原料流，其包括脂肪酸。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生用于原位移除產(chǎn)物醇的提取劑的方法包括:提供包含糖和油的生物質(zhì)，所述油具有一定量的甘油三酯，以及使所述油與包含一種或多種酶的組合物接觸，所述酶能夠?qū)⑺龈视腿ニ獬芍舅?。水解所述油中的甘油三酯以形成發(fā)酵產(chǎn)物提取劑，所述發(fā)酵產(chǎn)物提取劑對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)大于所述生物質(zhì)的油對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。在一些實(shí)施方案中，生產(chǎn)丁醇的方法包括:(a)提供具有淀粉和油的生物質(zhì)，所述油包含一定量的甘油酯；(b)液化所述生物質(zhì)以產(chǎn)生液化的生物質(zhì),所述液化的生物質(zhì)包括從所述淀粉水解得到的低聚糖；(C)使步驟(a)的生物質(zhì)或步驟(b)的液化的生物質(zhì)與具有一種或多種酶的組合物接觸，所述酶能夠?qū)⑺龈视王マD(zhuǎn)化成游離脂肪酸，從而所述游離脂肪酸形成發(fā)酵產(chǎn)物提取劑；(d)使所述液化的生物質(zhì)與能夠?qū)⒌途厶寝D(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶接觸，所述可發(fā)酵糖包括單體葡萄糖；(e)使所述液化的生物質(zhì)與生物催化劑接觸，所述生物催化劑能夠?qū)⑺隹砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成丁醇，從而產(chǎn)生包含丁醇的發(fā)酵產(chǎn)物；以及(f)使所述發(fā)酵產(chǎn)物與所述發(fā)酵產(chǎn)物提取劑接觸，從而從所述發(fā)酵產(chǎn)物中分離出所述丁醇，所述發(fā)酵產(chǎn)物提取劑對(duì)于丁醇的分配系數(shù)大于所述生物質(zhì)的油對(duì)于丁醇的分配系數(shù)。

在一些實(shí)施方案中，方法在從原料生產(chǎn)產(chǎn)物醇的工藝期間的步驟中包括:使所述產(chǎn)物醇與提取劑接觸，所述提取劑包含獲取自天然油酶促水解的游離脂肪酸，其中所述油包含甘油酯。所述提取劑對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)大于所述天然油對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。在一些實(shí)施方案中，從原料生產(chǎn)產(chǎn)物醇的方法包括:(a)液化所述原料以產(chǎn)生原料漿液；(b)離心(a)的原料漿液以產(chǎn)生離心產(chǎn)物，其包括(i)包含糖的含水層，(ii)植物來源的油層，和(iii)固體層；(C)將(b)的含水層輸送進(jìn)發(fā)酵容器；以及(d)發(fā)酵所述含水層的糖以產(chǎn)生所述產(chǎn)物醇。在一些實(shí)施方案中，從原料生產(chǎn)產(chǎn)物醇的方法還包括將所述提取劑加到所述發(fā)酵容器中以形成包含水相和含有產(chǎn)物醇的有機(jī)相的兩相混合物。在一些實(shí)施方案中，天然油是植物來源的油，并且在一些實(shí)施方案中，從原料生產(chǎn)產(chǎn)物醇的方法還包括:從植物來源的油層中獲取所述植物來源的油；以及通過使油與一種或多種將甘油酯水解成游離脂肪酸的酶接觸將所述植物來源的油轉(zhuǎn)化成所述提取劑。在一些實(shí)施方案中，從原料生產(chǎn)產(chǎn)物醇的方法還包括在將所述甘油酯的至少一部分水解成游離脂肪酸之后使所述一種或多種酶失活。在一些實(shí)施方案中，從原料生產(chǎn)產(chǎn)物醇的方法還包括在將所述植物來源的油轉(zhuǎn)化成所述提取劑的步驟之前將植物來源的油輸送進(jìn)發(fā)酵容器。在一些實(shí)施方案中，從原料生產(chǎn)產(chǎn)物醇的方法還包括將第二提取劑加到所述發(fā)酵容器中以形成包含水相和含有產(chǎn)物醇的有機(jī)相的兩相混合物。在一些實(shí)施方案中，在加入第二提取劑的步驟之后將植物來源的油轉(zhuǎn)化成提取劑。在一些實(shí)施方案中，從發(fā)酵工藝中移除來源于生物質(zhì)的油的方法包括:(a)提供包含產(chǎn)物醇和來源于生物質(zhì)的油的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，所述油包含甘油酯；(b)使所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基與第一提取劑接觸以形成包含水相和有機(jī)相的兩相混合物，其中所述產(chǎn)物醇和所述油進(jìn)入所述有機(jī)相以形成含有產(chǎn)物醇的有機(jī)相；(C)將所述含有產(chǎn)物醇的有機(jī)相與所述水相分離；(d)從所述有機(jī)相中分離所述產(chǎn)物醇以產(chǎn)生貧有機(jī)相；以及(e)使所述貧有機(jī)相與包含一種或多種催化劑的組合物接觸，所述催化劑能夠?qū)⑺龈视王ニ獬捎坞x脂肪酸以產(chǎn)生第二提取劑，其包含所述第一提取劑和游離脂肪酸的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基與步驟(e)的第二提取劑接觸來重復(fù)步驟(b)。在一些實(shí)施方案中，原位發(fā)酵提取劑形成組合物包含:(a)由生物質(zhì)形成且包含水、淀粉和油的醪，(b)能夠?qū)⑺龈视腿サ闹辽僖徊糠炙獬捎坞x脂肪酸的催化劑，和(C)游離脂肪酸。所述淀粉和油均來源于生物質(zhì)，并且所述油包含一定量的甘油三酯。在一些實(shí)施方案中，發(fā)酵液體培養(yǎng)基包含:(a)能夠產(chǎn)生丁醇的重組微生物，(b)低聚糖，(C)將甘油酯水解成游離脂肪酸的催化劑，(d)甘油酯，和(e)游離脂肪酸。


并入本文并成為說明書的一部分的附圖示出了本發(fā)明，并且與說明書一起進(jìn)一步用來解釋本發(fā)明的原理并使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠利用本發(fā)明。圖1示意性地示出了本發(fā)明的示例性方法和體系，其中在發(fā)酵前使液化生物質(zhì)與催化劑接觸以水解脂質(zhì)。圖2示意性地示出了本發(fā)明的示例性方法和體系，其中在發(fā)酵前使液化并糖化的生物質(zhì)與催化劑接觸以水解脂質(zhì)。圖3示意性地示出了本發(fā)明的示例性方法和體系，其中在生物質(zhì)原料流中的脂質(zhì)在液化之前或期間與催化劑接觸以水解脂質(zhì)。圖4示意性地示出了本發(fā)明的示例性方法和體系，其中在發(fā)酵前從液化的生物質(zhì)中除去了不溶解的固體和脂質(zhì)，并且其中使用催化劑將除去的脂質(zhì)水解成游離脂肪酸并將游離脂肪酸供應(yīng)發(fā)酵容器。圖5示意性地示出了本發(fā)明的示例性方法和體系， 其中使用催化劑將來源于天然油的脂質(zhì)水解成游離脂肪酸并將游離脂肪酸供應(yīng)發(fā)酵容器。圖6示意性地示出了本發(fā)明的示例性方法和體系，其中將存在于流出發(fā)酵容器的第一提取劑中的生物質(zhì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)化成作為第二提取劑供應(yīng)發(fā)酵容器的游離脂肪酸。圖7圖示了在發(fā)酵容器中存在的脂肪酸對(duì)產(chǎn)丁醇菌株NGC1-047的葡萄糖消耗的效應(yīng)。圖8圖示了在發(fā)酵容器中存在的脂肪酸對(duì)產(chǎn)丁醇菌株NGC1-049的葡萄糖消耗的效應(yīng)。圖9圖示了在發(fā)酵容器中存在的脂肪酸對(duì)產(chǎn)丁醇菌株NYLA84的葡萄糖消耗的效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式除非另行定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的一樣。如發(fā)生矛盾，以本專利申請(qǐng)(包括其定義)為準(zhǔn)。此外，除非上下文另有所需，單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。為所有目的，所有的出版物、專利、以及本文提及的其它參考資料均全文以引用方式并入本文。為了進(jìn)一步限定本發(fā)明，本文提供了以下術(shù)語和定義。如本文所用，術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它們的任何其它變型將被理解為是指包括指定的整數(shù)或整數(shù)組但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備不必僅限于那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備固有的元素。此外，除非另外特別說明，否則“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，以下任何一個(gè)均表示滿足條件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。同樣，涉及元素或組分實(shí)例(即次數(shù))的數(shù)目在本發(fā)明元素或組分前的不定冠詞“一個(gè)”或“一種”旨在是非限制性的。因此，應(yīng)將“一個(gè)”或“一種”理解為包括一個(gè)或至少一個(gè)，并且元素或組分的詞語單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。如本文所用，術(shù) 語“發(fā)明”或“本發(fā)明”為非限制性術(shù)語，并且不旨在意指本發(fā)明的任何單獨(dú)實(shí)施方案，而是涵蓋如專利申請(qǐng)所述的所有可能的實(shí)施方案。如本文所用，修飾本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的量使用的術(shù)語“約”是指可以通過例如以下方式而發(fā)生的用數(shù)字表示的量的變化:在真實(shí)世界中用于產(chǎn)生濃縮物或溶液的一般測量和液體處理操作；通過這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的制造、來源或純度中的差異；等。術(shù)語“約”還包括由于產(chǎn)生自特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語“約”來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“約”指在報(bào)告數(shù)值的10 %范圍內(nèi)，或者在報(bào)告數(shù)值的5 %范圍內(nèi)。如本文所用，“生物質(zhì)”指包含可水解多糖的天然產(chǎn)物，所述多糖提供可發(fā)酵糖，所述可發(fā)酵糖包括來源于天然來源如玉米、甘蔗、小麥、纖維素或木質(zhì)纖維素材料以及包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、低聚糖、二糖和/或單糖、以及它們的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物質(zhì)也可包含附加組分如蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。生物質(zhì)可來源于單一來源，或者生物質(zhì)可包括來源于一種以上來源的混合物。例如，生物質(zhì)可包括玉米棒和玉米秸桿的混合物，或草和葉片的混合物。生物質(zhì)包括但不限于生物能作物、農(nóng)業(yè)殘余物、市政固體垃圾、工業(yè)固體垃圾、來自造紙的淤渣、庭院垃圾、木材和林業(yè)垃圾。生物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于:玉米粒、玉米棒、作物殘余物如玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、從谷物的研磨中獲得的組分、樹、枝、根、葉、木片、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動(dòng)物糞肥、以及它們的混合物。例如，可通過本領(lǐng)域已知的任何加工方法，利用發(fā)酵加工生物質(zhì)以從生物質(zhì)中形成麥芽漿、果汁、糖蜜或水解產(chǎn)物，所述方法例如研磨、處理和/或液化，并且它們包含可發(fā)酵糖并可包含水。例如，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來加工纖維素和/或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以獲得包含可發(fā)酵糖的水解產(chǎn)物。在美國專利公開申請(qǐng)公布2007/0031918A1中公開了低氨預(yù)處理，該專利申請(qǐng)以引用方式并入本文。纖維素和/或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶促糖化通常利用酶聚生體來降解纖維素和半纖維素以產(chǎn)生包含糖的水解產(chǎn)物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(適用于纖維素和/或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的糖化酶參見Lynd等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506_577，2002)。麥芽漿、果汁、糖蜜或水解產(chǎn)物可包括如本文所述的原料12和原料漿液16。含水原料流可通過本領(lǐng)域已知的任何加工方法，利用發(fā)酵加工生物質(zhì)來源于生物質(zhì)或從生物質(zhì)中形成，所述方法例如研磨、處理和/或液化，并且它們包含可發(fā)酵碳源(例如糖)并可包含水。含水原料流可包括如本文所述的原料12和原料漿液16。如本文所用，“原料”是指發(fā)酵過程中的原料，所述原料包含具有或不具有不溶固體的可發(fā)酵碳源，并且如果適用，所述原料在通過進(jìn)一步加工(例如通過液化、糖化、或其它方法)已經(jīng)從淀粉中釋放可發(fā)酵碳源或從復(fù)糖降解中獲取可發(fā)酵碳源之前或之后包含可發(fā)酵碳源。原料包括或來源于生物質(zhì)。合適的原料包括但不限于黑麥、小麥、玉米、甘蔗、大麥、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、或它們的混合物。如本文所用，“發(fā)酵液體培養(yǎng)基”是指水、糖、溶解固體、任選的微生物產(chǎn)生的醇、產(chǎn)物醇及發(fā)酵容器內(nèi)具有的所有其它物質(zhì)組分的混合物，其中產(chǎn)物醇通過在微生物的存在下使糖反應(yīng)生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有時(shí)，如本文所用，術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”和“發(fā)酵混合物”可與“發(fā)酵液體培養(yǎng)基”同義使用。如本文所用，“可發(fā)酵碳源”或“可發(fā)酵碳底物”是指能夠由本文所公開的微生物代謝以產(chǎn)生發(fā)酵醇的碳源。適宜的可發(fā)酵碳源包括但不限于單糖，如葡萄糖或果糖；二糖如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖如淀粉或纖維素；C5糖如木糖和阿拉伯糖；包括甲烷的一碳底物；以及它們的混合物。如本文所用，“可發(fā)酵糖”是指能夠由本文所公開的微生物代謝以產(chǎn)生發(fā)酵醇的一種或多種糖。如本文所用，“發(fā)酵容器”是指其中進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)的容器，產(chǎn)物醇如丁醇通過發(fā)酵反應(yīng)由糖制備。如本文所用，“液化容器”指其中進(jìn)行液化的容器。液化是其中低聚糖從原料中釋放出來的過程。在其中原料是玉米的一些實(shí)施方案中，低聚糖在液化期間從玉米淀粉內(nèi)容物中釋放出來。如本文所用，“糖化容器”指其中進(jìn)行糖化(即，將低聚糖降解成單糖)的容器。在發(fā)酵和糖化同時(shí)發(fā)生的情況下，所述糖化容器和發(fā)酵容器可為相同容器。如本文所用，“糖”指低聚糖、二糖、單糖、和/或它們的混合物。術(shù)語“糖類”也包括碳水化合物，包括淀粉、右旋糖苷、糖原、纖維素、戊聚糖、以及糖。如本文所用，“糖化酶”指能夠水解多糖和/或低聚糖例如糖原或淀粉的α -1,4-糖苷鍵的一種或多種酶。糖化酶也可包括能夠水解纖維素或木質(zhì)纖維素材料的酶。
如本文所用，“不溶解的固體”指原料的不可發(fā)酵部分，例如胚芽、纖維和谷蛋白。如本文所用，“產(chǎn)物醇”指在發(fā)酵過程中能夠由微生物產(chǎn)生的任何醇，所述微生物利用生物質(zhì)作為可發(fā)酵碳底物的來源。產(chǎn)物醇包括但不限于C1-C8烷醇。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)物醇是C2-C8烷醇。在其他實(shí)施方案中，產(chǎn)物醇是C2-C5烷醇。應(yīng)當(dāng)理解，C1-C8烷醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。同樣地，C2-C8烷醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇?！按肌痹诒疚闹幸灿糜谥府a(chǎn)物醇。如本文所用，“丁醇”特指以單獨(dú)或其混合物形式的丁醇異構(gòu)體1- 丁醇(1-BuOH)、2_ 丁醇(2-BuOH)、叔丁醇、和/或異丁醇(iBuOH或1-BuOH或1-BU0H，也稱為2-甲基_1_丙醇)。當(dāng)涉及丁醇酯時(shí)，術(shù)語“丁酯”和“丁醇酯”常可互換使用。如本文所用，“丙醇”指丙醇異構(gòu)體異丙醇或1-丙醇。如本文所用，“戊醇”指戊醇異構(gòu)體1-戊醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、2，2-二甲基-1-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇、或2-甲基-2-丁醇。如本文所用，術(shù)語“當(dāng)量醇”指通過完全水解醇酯并隨后從一定量醇酯中回收所述
醇將獲得的醇重量。
如本文所用，術(shù)語“水相滴度”是指發(fā)酵液體培養(yǎng)基中特定醇(例如丁醇)的濃度。如本文所用，術(shù)語“有效滴度”指每升發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的特定醇(例如丁醇)總量或醇酯化產(chǎn)生的醇酯的當(dāng)量醇。例如，在單位體積發(fā)酵中的丁醇的有效滴度包括:(i)發(fā)酵培養(yǎng)基中的丁醇量；(ii)由有機(jī)提取劑回收的丁醇量；(iii)如果利用汽提，由氣相回收的丁醇量；和(iv)在有機(jī)相或水相中的丁酯的當(dāng)量醇。如本文所用，“原位產(chǎn)物移除(ISPR) ”是指當(dāng)產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)，從諸如發(fā)酵的生物過程中選擇性移除具體的發(fā)酵產(chǎn)物以控制生物過程中的產(chǎn)物濃度。如本文所用，“提取劑”或“ ISPR提取劑”指用于提取任何產(chǎn)物醇如丁醇或用于提取任何醇酯產(chǎn)物的有機(jī)溶劑，所述醇酯由催化劑從產(chǎn)物醇和羧酸或脂質(zhì)中產(chǎn)生。有時(shí)，如本文所用，術(shù)語“溶劑”可與“提取劑”同義使用。對(duì)于本文所述的方法，提取劑是與水不混溶的。術(shù)語“與水不混溶的”或“不溶解的”是指化學(xué)組分如提取劑或溶劑不能夠以形成
單一液相的形式與水溶液如發(fā)酵液體培養(yǎng)基混合。 如本文所用，術(shù)語“水相”是指通過使發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸與水不混溶的有機(jī)提取劑而獲得的兩相混合物中的水相。在本文所述包括發(fā)酵提取的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“發(fā)酵液體培養(yǎng)基”具體地指在雙相發(fā)酵提取中的水相。如本文所用，術(shù)語“有機(jī)相”是指通過使發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸與水不混溶的有機(jī)提取劑而獲得的兩相混合物中的非水相。如本文所用，術(shù)語“羧酸”指具有一般化學(xué)式-COOH的任何有機(jī)化合物，其中碳原子通過雙鍵與氧原子結(jié)合形成羰基(-C = O)，并且通過單鍵與羥基(-0H)結(jié)合。羧酸可為質(zhì)子化羧酸的形式、羧酸鹽形式(例如銨、鈉、或鉀鹽)、或質(zhì)子化羧酸與羧酸鹽混合物的形式。術(shù)語羧酸可描述單獨(dú)的化學(xué)物質(zhì)(例如油酸)或羧酸的混合物，其可通過例如水解生物質(zhì)來源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和磷脂產(chǎn)生。如本文所用，術(shù)語“脂肪酸”指具有C4-C28碳原子(最常見地為C12-C24碳原子)的羧酸(例如脂族一元羧酸)，其是飽和或不飽和的。脂肪酸也可為支化或非支化的。脂肪酸在動(dòng)物或植物的脂肪、油或蠟中可來源于或包含于酯化的形式。脂肪酸可以甘油酯形式在脂肪和脂肪油中天然存在，或者可通過水解脂肪或通過合成獲得。術(shù)語脂肪酸可描述單獨(dú)的化學(xué)物質(zhì)或脂肪酸的混合物。此外，術(shù)語脂肪酸可涵蓋游離脂肪酸。本文所用術(shù)語“脂肪醇”是指具有C4-C22碳原子的脂肪鏈的醇，其中的脂肪鏈為飽和的或不飽和的。如本文所用，術(shù)語“脂肪醛”是指具有C4-C22碳原子的脂族鏈的醛，所述脂族鏈為飽和的或不飽和的。本文所用術(shù)語“脂肪酰胺”是指具有C4-C22碳原子的長脂肪鏈的酰胺，其中的脂肪鏈為飽和的或不飽和的本文所用術(shù)語“脂肪酸酯”是指具有C4-C22碳原子的長脂肪鏈的酯，其中的脂肪鏈為飽和的或不飽和的。如本文所用，“天然油”指獲取自植物(例如生物質(zhì))或動(dòng)物的脂質(zhì)。如本文所用，“植物來源的油”具體地指獲取自植物的脂質(zhì)?！爸|(zhì)”?？膳c“油”和“酰基甘油酯”同義使用。天然油包括但不限于牛脂油、玉米油、卡諾拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、魚油、霍霍巴油、豬油、亞麻籽油、牛蹄油、奧蒂油、棕櫚油、花生油、油菜籽油、稻米油、紅花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻風(fēng)樹油和植物油共混物。如本文所用，術(shù)語“分離”與“回收”同義，并且是指從初始混合物中移除化合物以獲得純度或濃度比初始混合物中的化合物純度或濃度更高的化合物。如本文所用，“重組微生物”指諸如細(xì)菌或酵母的微生物，它們利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行修改，例如通過工程化宿主細(xì)胞以包含生物合成途徑如生物合成途徑，從而產(chǎn)生醇如丁醇。本發(fā)明提供通過催化水解來源于生物質(zhì)的油甘油酯獲得的提取劑和生產(chǎn)所述提取劑的方法。具體地講，可使用催化劑如酶將生物質(zhì)油中的甘油酯催化水解成脂肪酸。脂肪酸可作為用于從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中對(duì)產(chǎn)物醇(諸如丁醇)進(jìn)行原位移除的提取劑。因此，本發(fā)明還提供了通過使用提取劑進(jìn)行的提取發(fā)酵而制備產(chǎn)物醇(諸如丁醇)的方法，所述提取劑從生物質(zhì)油中產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了在發(fā)酵前將存在于原料漿液中的油催化水解成脂肪酸的方法，從而將所述油轉(zhuǎn)化成脂肪酸，并且可減小ISPR提取劑的分配系數(shù)隨時(shí)間降低(這歸因于在發(fā)酵容器中存在油)的程度。此外，通過水解原料油獲得的脂肪酸可用作ISPR提取劑，其具有的發(fā)酵醇分配系數(shù)大于原料油的發(fā)酵醇分配系數(shù)?？稍谒庵胺蛛x原料油與原料漿液，并將其用作ISPR提取劑，或者可在原料漿液中將油水解成脂肪酸。此夕卜，作為ISPR提取劑的脂肪酸可用于替代、或添加到常規(guī)的外源提取劑(例如油醇或油酸)中，從而降低與外源提取劑相關(guān)聯(lián)的原材料費(fèi)用。本發(fā)明將根據(jù)所述圖進(jìn)行描述。圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案生產(chǎn)發(fā)酵性醇的示例性的工藝流程圖。如圖所示，可將原料12導(dǎo)入液化容器10的入口并進(jìn)行液化以產(chǎn)生原料漿液16。原料12包含提供可發(fā)酵碳源(例如可發(fā)酵糖如葡萄糖)的可水解淀粉，并且可為以下生物質(zhì):例 如但不限于黑麥、小麥、玉米、甘蔗、大麥、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、或它們的混合物，或換句話講可來源于生物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，原料12可為分級(jí)生物質(zhì)的一種或多種組分，并且在其它實(shí)施方案中，原料12可為碾磨過的未分級(jí)生物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，原料12可為玉米，例如干磨的、未分級(jí)的玉米籽粒，并且不溶解的固體可包括胚芽、纖維、和谷蛋白。不溶解的固體是原料12的不可發(fā)酵部分。對(duì)于本文圖示實(shí)施方案討論的目的，原料12將通常被描述為碾磨形成的未分級(jí)玉米，其中不溶解的固體尚未從中分離出來。然而，應(yīng)當(dāng)理解本文所述的示例性方法和體系可經(jīng)修改用于不同的原料，無論其是否經(jīng)過分級(jí)，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。在一些實(shí)施方案中，原料12可為高油酸玉米，使得來源于其中的玉米油是高油酸玉米油，其油酸含量為至少約55重量％的油酸。在一些實(shí)施方案中，在高油酸玉米油中的油酸含量可為至多約65重量％，與之相比在正常玉米油中的油酸含量為約24重量％。高油酸油可提供用于本發(fā)明方法的一些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗馑鲇吞峁┝私佑|發(fā)酵液體培養(yǎng)基的、具有高油酸含量的脂肪酸。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸或它們的混合物包含不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸的存在降低熔點(diǎn)，提供處理方面的優(yōu)點(diǎn)。不飽和脂肪酸中，那些單不飽和脂肪酸，即，具有單個(gè)碳-碳雙鍵的脂肪酸，可提供相對(duì)于不進(jìn)行適當(dāng)加熱的熔點(diǎn)和方法所考慮的氧化穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。液化原料12的方法涉及將原料12中的淀粉水解成包括例如糊精和低聚糖在內(nèi)的糖，并且是一種常規(guī)方法?？墒褂霉I(yè)上通常利用的任何已知的液化方法以及相應(yīng)的液化容器，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法?？蓡为?dú)或組合使用此類方法。在一些實(shí)施方案中，可利用所述酶方法并且可將適用的酶14，例如α -淀粉酶，導(dǎo)入液化容器10的入口。也可將水導(dǎo)入液化容器10。在一些實(shí)施方案中，也可將糖化酶如葡糖淀粉酶導(dǎo)入液化容器10中。在附加的實(shí)施方案中，也可將脂肪酶導(dǎo)入液化容器10以催化油的一種或多種組分轉(zhuǎn)化成脂肪酸。液化原料12產(chǎn)生的原料漿液16包括糖、油26和來源于生物質(zhì)的不溶解的固體，原料12從生物質(zhì)中形成。在一些實(shí)施方案中，所述油的量為約O重量％至至少約2重量％的發(fā)酵液體培養(yǎng)基組合物。在一些實(shí)施方案中，所述油的量為至少約0.5重量％的原料。原料漿液16可從液化容器10的出口排出。在一些實(shí)施方案中，原料12是玉米或玉米籽粒，并且因此原料漿液16是玉米醪漿液?？蓪⒋呋瘎?2加到原料漿液16中。催化劑42能夠?qū)⒂?6中的甘油酯水解成游離脂肪酸(FFA) 28。例如，當(dāng)原料12是玉米時(shí)，則油26是原料的組分玉米油，并且游離脂肪酸28是玉米油脂肪酸(CO FA)。因此，在將催化劑42導(dǎo)入原料漿液16后，油26中的至少一部分甘油酯被水解成FFA28，產(chǎn)生具有FFA 28和催化劑42的原料漿液18。水解油26獲得的酸/油組合物通常為至少約17重量％ FFA。在一些實(shí)施方案中，水解油26獲得的酸/油組合物為至少約20重量％ FFA,至少約25重量％ FFA,至少約30重量％ FFA,至少約35重量％ FFA,至少約40重量％ FFA,至少約45重量％ FFA,至少約50重量％ FFA,至少約55重量％ FFA,至少約60重量％ FFA,至少約65重量％ FFA,至少約70重量％ FFA,至少約75重量％ FFA,至少約80重量％ FFA,至少約85重量％ FFA,至少約90重量％ FFA,至少約95重量％ FFA，或至少約99重量％ FFA。在一些實(shí)施方案中，在發(fā)酵容器中的脂肪酸(例如羧酸)的濃度超出水相中的溶解度限制并導(dǎo)致產(chǎn)生包含有機(jī)相和水相的兩相發(fā)酵混合物。在一些實(shí)施方案中，在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的羧酸(脂肪酸)濃度通常不大于約0.8g/L并且受液體培養(yǎng)基中的羧酸(脂肪酸)溶解度的限制。在一些實(shí)施方案中，催化劑42可為一種或多種酶，例如水解酶如脂肪酶。使用的脂肪酶可來自任何來源，包括例如梨頭霉屬、無色桿菌屬、氣單胞菌屬、產(chǎn)堿菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、無色桿菌屬、出芽短梗霉、芽孢桿菌屬、白僵菌屬、環(huán)絲菌屬、假絲酵母屬、色桿菌屬、鬼傘屬、鐮孢屬、地霉屬、漢遜酵母屬、腐質(zhì)霉屬、Hyphozyma、乳桿菌、綠僵菌屬、毛霉、叢赤殼屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、假單胞菌屬、絲核菌屬、根毛霉屬、根霉、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、糖酵母屬、Sus、擲孢酵母屬、嗜熱真菌屬、Thiarosporella、木霉屬、輪枝孢屬、和/或耶氏酵母屬菌株。在一個(gè)優(yōu)選的方面，脂肪酶的來源選自布氏犁頭霉(Absidia blakesleena)、傘狀犁頭霉(Absidia corymbifera)、解毒無色桿菌(Achromobacter iophagus)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes sp.)、蕓苔生鏈格抱(Alternariabrassiciola)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、短小芽抱桿菌(BaciIluspumiIus)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus strearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、Brochothrix thermosohata、柱狀假絲酵母(Candidacylindracea)(皺糟假絲酵母(Candida rugosa))、副解脂假絲酵母(Candidaparalipolytica)、南極假絲酵母(Candida Antarctica)脂肪酶A、南極假絲酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B、歐諾比假絲酵母(Candida ernobii)、畸形假絲酵母(Candida deformans)、粘稠色桿菌(Chromobacter viscosum)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinerius)、尖抱德抱菌(Fusariumoxysporum)、煎病鐮孢(Fusarium solani)、煎病鐮孢(Fusarium solani pisi)、小麥黃色德抱(Fusarium roseun culmorum)、帚狀地霉(Geotricum penicillatum)、異常漢遜酵母(Hansenula anomala)、短小腐質(zhì)霉(Humicola brevispora)、短小腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola brevis var.thermo idea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)、青霉屬 I (Penicillium sp.1)、青霉屬 II (Penicillium sp.1I)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋蔥假單胞菌(與洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)同義)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)、嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)、門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、解脂臭味假單胞菌(Pseudomonasmephitica Iipolytica)、產(chǎn)減假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、苗床假單胞菌(Pseudomonas plantari)、類產(chǎn)減假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcali genes)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假單抱菌(Pseudomonas stutzeri)、和威斯康星假單胞菌(Pseudo monaswisconsinensis)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小抱根霉(Rhizopusmicrosporus)、結(jié)節(jié)根霉(Rhizopus nodosus)、圓紅冬抱酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、紅酵母(Rhodotorula glutinis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、芝谷擲抱酵母(Sporobolomyces shibatanus)、野豬(Sus scrofa)、疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces Ianuginosus (以前稱為 Humicola Ianuginose)) Λ Thiarosporellaphaseolina、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、和解脂耶氏酵母(Yairowia lipolytica)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，脂肪酶選自疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomcyces Ianuginosus)脂肪酶、曲霉屬(Aspergillus sp.)脂肪酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)脂肪酶、南極假絲酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)脂肪酶、婁地青霉(Penicilliumroqueforti)脂肪酶、沙門柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶、爪睡毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)脂肪酶、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes sp.)脂肪酶、皺裙假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶、崎形假絲酵母(Candida deformans)脂肪酶、來自白地霉(Geotrichum candidum)的脂肪酶A和B、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)脂肪酶、赤球叢赤殼(Nectria haematococca)脂肪酶、異抱鍵抱菌(Fusarium heterosporum)脂肪酶、德氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、(Rhizopus arrhizus)脂肪酶、和米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶。適用作酶催化劑42的合適商用脂肪酸制劑包括但不限于Lipolase+ 100L>Lipexk 100L、Lipocleaii"" 2000T、Lipozyme CALB L^Novozyinli CALA L、和 Palatase 20000L,它們購自 Novozymes,或來自突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、米赫毛霉(Mucormiehei)、豬膜(hog pancreas)、柱狀假絲酵母(Candida cylindracea)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、南極假絲酵母(Candida antarctica)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)或曲霉屬(Aspergillus),它們購自 SigmaAldricho磷脂酶是水解磷脂酯鍵的酶，但是多種磷脂酶也能夠水解甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯(酯酰水解酶(LAH)活性)。如本文所用，術(shù)語“磷脂酶”涵蓋具有任何磷脂酶活性的酶，例如裂解甘油磷酸酯鍵(催化甘油磷酸酯鍵的水解)的酶，例如在油如原油或植物油中的酶。本發(fā)明的磷脂酶活性能夠生成水可提取的磷酸化堿和甘油二酯。磷脂酶活性可包括磷脂酶C(PLC)活性；PI_PLC活性、磷脂酶A(PLA)活性如磷脂酶Al或磷脂酶A2活性；磷脂酶B (PLB)活性如磷脂酶BI或磷脂酶B2活性，包括溶血磷脂酶(LPL)活性和/或溶血磷脂酶-轉(zhuǎn)酰基酶(LPT A)活性；磷脂酶D (PLD)活性如磷脂酶Dl或磷脂酶D2活性；和/或馬鈴薯塊莖特異蛋白(Patatin)活性或它們的任何組合。術(shù)語“磷脂酶”也涵蓋具有溶血磷脂酶活性的酶，其中這種酶的兩個(gè)底物是2-溶血磷脂膽堿和H2O,并且其中它的兩個(gè)產(chǎn)物是甘油磷酸膽堿和甲酸酯。磷脂酶Al (PLAl)酶除去1-位脂肪酸以產(chǎn)生游離脂肪酸和1-溶血-2-?；字Ａ字窤2 (PLA2)酶除去2-位脂肪酸以產(chǎn)生游離脂肪酸和1_?；?2-溶血磷脂。PLAl 和PLA2酶可為細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的、膜結(jié)合的或可溶解的。磷脂酶C(PLC)酶除去磷酸部分以產(chǎn)生1，2-二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)酶產(chǎn)生1，2_?；视土姿岷蛪A基。本發(fā)明使用的磷脂酶可獲取自多種生物來源，例如但不限于鐮孢屬內(nèi)的絲狀真菌菌種，如菌株大刀鐮孢(F.culmorum)、異孢鐮孢菌(F.heterosporum)、爺病鐮孢(F.solani)、或尖孢鐮孢菌(F.0xysporum);或者曲霉屬內(nèi)的絲狀真菌菌種,例如菌株泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae) 用于本發(fā)明的還有疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)磷脂酶變體如市售產(chǎn)品Ledtase Ultra (Novozymes A' S, Denmark)。一種或多種磷脂酶也可以凍干粉、固化或水溶液形式施用。在一些實(shí)施方案中，在水解甘油酯的至少一部分之后可使催化劑42失活。本領(lǐng)域已知的任何方法可用于使催化劑42失活。例如，在一些實(shí)施方案中，催化劑42可通過加熱失活，調(diào)節(jié)反應(yīng)物料的PH至其中催化劑42被不可逆的失活的pH下使其失活，和/或加入能夠選擇性地使催化劑活性失活的化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)來使其失活。如圖1的實(shí)施方案所示，例如將加熱q施用于原料漿液18，從而使催化劑42失活。加熱q可在將原料漿液18輸送進(jìn)發(fā)酵容器30之前施用于原料漿液18。熱處理過的原料漿液18 (具有失活的催化劑42)然后與微生物32 —起被導(dǎo)入發(fā)酵容器30,從而被包括在發(fā)酵容器30內(nèi)的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。作為另外一種選擇，將原料漿液18輸送進(jìn)發(fā)酵容器30并當(dāng)其處于發(fā)酵容器中、用微生物32接種發(fā)酵容器之前經(jīng)受加熱q。例如，在一些實(shí)施方案中，可通過用加熱q將原料漿液18加熱到至少約75°C至少約5分鐘，至少約75°C至少約10分鐘，至少約75°C至少約15分鐘，至少約80°C至少約5分鐘，至少約80°C至少約10分鐘，至少約80°C至少約15分鐘，至少約85°C至少約5分鐘，至少約85°C至少約10分鐘，或至少約85°C至少約15分鐘來完成催化劑的失活處理。在一些實(shí)施方案中，在經(jīng)過加熱q后，在導(dǎo)入發(fā)酵容器30之前(或當(dāng)在發(fā)酵容器中施用加熱q的情況下，在接種發(fā)酵容器之前)將原料漿液18冷卻至合適發(fā)酵的溫度。例如，在一些實(shí)施方案中，原料漿液18的溫度在與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸之前為約30。。。當(dāng)希望防止催化劑42在發(fā)酵容器中用脂肪酸28酯化醇時(shí)，催化劑42的失活是優(yōu)選的。在一些實(shí)施方案中，通過用有機(jī)酸(例如脂肪酸)和催化劑(例如脂肪酶)酯化發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)物醇來生產(chǎn)醇酯是所期望的，這在以下共有的、共同未決的申請(qǐng)中進(jìn)行了進(jìn)一步描述:提交于2010年7月28日的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/368，429 ;提交于2010年9月2日的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/379，546 ;和提交于2011年2月7日的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/440，034 ;它們?nèi)咳囊砸梅绞讲⑷氡疚摹＠?，?duì)于丁醇生產(chǎn)，發(fā)酵容器中的活性催化劑42(經(jīng)由漿液18導(dǎo)入)能夠催化丁醇與脂肪酸28 (經(jīng)由漿液18導(dǎo)入)酯化，原位形成脂肪酸丁酯(FABE)。構(gòu)造發(fā)酵容器30以發(fā)酵漿液18，產(chǎn)生產(chǎn)物醇如丁醇。具體地講，微生物32代謝漿液18中的可發(fā)酵糖并分泌 產(chǎn)物醇。微生物32選自細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌和酵母。在一些實(shí)施方案中，微生物32可為細(xì)菌如大腸桿菌。在一些實(shí)施方案中，微生物32可為發(fā)酵重組微生物。所述漿液可包括糖，例如低聚糖和水的形式，并且可包含小于約20g/L的單體葡萄糖，更優(yōu)選地小于約10g/L或小于約5g/L的單體葡萄糖。用于測定單體葡萄糖量的適用方法是本領(lǐng)域熟知的。本領(lǐng)域 已知的此類適用方法包括HPLC。在一些實(shí)施方案中，漿液18經(jīng)受糖化過程以將漿液18中的復(fù)合糖(例如低聚糖)裂解成能夠被微生物32容易地代謝的單糖?？墒褂霉I(yè)上通常利用的任何已知的糖化方法，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。在一些實(shí)施方案中，同步糖化和發(fā)酵(SSF)可如圖1所示在發(fā)酵容器30內(nèi)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，可將酶38如葡糖淀粉酶導(dǎo)入發(fā)酵容器30中的入口以將淀粉或低聚糖裂解成能夠被微生物32代謝的葡萄糖。任選地，可將乙醇33供應(yīng)于發(fā)酵容器30，將其包括在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用具有丁醇生物合成途徑的重組微生物作為產(chǎn)丁醇的微生物32時(shí)，微生物32可能需要補(bǔ)充2-碳底物(例如乙醇)以存活并生長。因此，在一些實(shí)施方案中，可將乙醇33供應(yīng)于發(fā)酵容器30。然而，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)其中游離脂肪酸(例如FFA 28)存在于發(fā)酵容器中的本發(fā)明方法可允許減少乙醇33的量，其通常供應(yīng)于給定的重組微生物，不損害所述重組微生物的活力。此外，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在不補(bǔ)充乙醇的情況下提供的醇(例如丁醇)產(chǎn)率可比得上當(dāng)補(bǔ)充乙醇33時(shí)可達(dá)到的產(chǎn)率。這通過下文實(shí)施例1-14中給出的比較實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步展示，當(dāng)脂肪酸而不是乙醇存在于發(fā)酵容器中時(shí)，丁醇產(chǎn)率可大于當(dāng)既沒有脂肪酸又沒有乙醇存在于發(fā)酵容器中時(shí)的丁醇產(chǎn)率。因此，在一些實(shí)施方案中，補(bǔ)充的乙醇33的量與常規(guī)方法相比減少。例如，加到發(fā)酵容器中用于微生物所需的2-碳底物補(bǔ)充的典型乙醇的量為約5g/L無水乙醇(S卩，每升發(fā)酵培養(yǎng)基5g無水乙醇)。在一些實(shí)施方案中，所述丁醇發(fā)酵未補(bǔ)充任何乙醇33。在后一種情況下，將乙醇33的流從發(fā)酵容器中完全移除。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，減少或消除與補(bǔ)充乙醇33相關(guān)聯(lián)的成本，以及與乙醇33的貯藏罐以及在丁醇發(fā)酵期間將其供應(yīng)于發(fā)酵容器相關(guān)聯(lián)的不便是可能的。此外，無論是否補(bǔ)充乙醇，在一些實(shí)施方案中，利用發(fā)酵期間存在的脂肪酸，本發(fā)明的方法可提供較高的微生物32葡萄糖攝取速率?？蓪⒅舅釋?dǎo)入發(fā)酵容器30作為羧酸
28、從供應(yīng)油26中水解、和/或來源于漿液16的組分生物質(zhì)油的水解。2010年7月28日提交的共同未決的共有美國臨時(shí)專利申請(qǐng)61/368，451中描述了通過發(fā)酵方法生產(chǎn)產(chǎn)物醇的方法，其中在所述方法的步驟中產(chǎn)生了游離脂肪酸并且其在發(fā)酵容器中接觸微生物培養(yǎng)物以改善微生物生長速度和葡萄糖消耗，所述專利申請(qǐng)全文以引用的方式并入本文。在發(fā)酵容器30中，醇由微生物32產(chǎn)生?？衫迷划a(chǎn)物移除(ISPR)來從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中除去產(chǎn)物醇。在一些實(shí)施方案中，ISPR包括液-液提取。可根據(jù)美國專利公開申請(qǐng)公布2009/0305370所述的方法進(jìn)行液-液提取，其公開內(nèi)容全文并入本文。美國專利公開申請(qǐng)公布2009/0305370描述了生產(chǎn)并使用液-液提取從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中回收丁醇的方法，所述方法包括接觸發(fā)酵液體培養(yǎng)基與與水不混溶的提取劑以形成包含水相和有機(jī)相的兩相混合物的步驟。所述提取劑通?？蔀橛袡C(jī)提取劑，其選自飽和的、單不飽和的、多不飽和的(以及它們的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、甘油三酯、以及它們的混合物，其與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸并形成包含水相和有機(jī)相的兩相混合物。所述提取劑也可為有機(jī)提取劑，其選自飽和的、單不飽和的、多不飽和的(以及它們的混合物)C4-C22脂肪醇X4-C28脂肪酸X4-C28脂肪酸酯、C4-C22脂肪醛、C4-C22脂肪酰胺、以及它們的混合物，其與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸并形成包含水相和有機(jī)相的兩相混合物。來自漿液18的游離脂肪酸28也可用作ISPR提取劑28。例如，當(dāng)游離脂肪酸28是玉米油脂肪酸(COFA)時(shí)，ISPR提取劑28是COFA。ISPR提取劑(FFA) 28接觸發(fā)酵液體培養(yǎng)基并形成包含水相34和有機(jī)相的兩相混合物。存在于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)物醇優(yōu)先分配到有機(jī)相中以形成包含醇的有機(jī)相36。在一些實(shí)施方案中，發(fā)酵容器30具有一個(gè)或多個(gè)入口用于接納一種或多種附加的ISPR提取劑29，其形成包含水相和有機(jī)相的兩相混合物、以及分配到有機(jī)相中的產(chǎn)物醇?？蓮陌l(fā)酵容器30中以流39的形式將兩相混合物移出并導(dǎo)入容器35，其中包含醇的有機(jī)相36從水相34中分離出來。利用本領(lǐng)域已知的方法將含醇的有機(jī)相36與兩相混合物流39的水相34分離，所述方法包括但不限于虹吸、抽吸、潷析、離心、利用重力分離器、膜輔助的相分裂等等?？蓪⑷炕虿糠炙?4再循環(huán)到發(fā)酵容器30中用作發(fā)酵培養(yǎng)基(如圖所示)，或者將其棄去并 換用新培養(yǎng)基，或者進(jìn)行處理以移除任何殘余的產(chǎn)物醇并隨后再循環(huán)到發(fā)酵容器30中。然后在分離器50中處理包含醇的有機(jī)相36以回收產(chǎn)物醇54，然后通?？蓪⑺秘毚继崛?7與來自漿液18的新FFA 28 一起和/或與新提取劑29 —起再循環(huán)到發(fā)酵容器30中，進(jìn)一步提取產(chǎn)物醇。作為另外一種選擇，可將新FFA 28(來自漿液18)和/或提取劑29持續(xù)加入發(fā)酵容器以替換在兩相混合物流39中移除的ISPR提取劑。在一些實(shí)施方案中，任何附加的ISPR提取劑29可為外來有機(jī)提取劑例如油醇、二十二醇、鯨蠟醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-1^一醇、油酸、月桂酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、肉豆蘧酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29可為羧酸，并且在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29可為脂肪酸。在一些實(shí)施方案中，羧酸或脂肪酸可具有4至28個(gè)碳，在其它實(shí)施方案中4至22個(gè)碳，在其它實(shí)施方案中8至22個(gè)碳，在其它實(shí)施方案中10至28個(gè)碳，在其它實(shí)施方案中7至22個(gè)碳，在其它實(shí)施方案中12至22個(gè)碳，在其它實(shí)施方案中4至18個(gè)碳，在其它實(shí)施方案中12至22個(gè)碳，并且在其它實(shí)施方案中12至18個(gè)碳。在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29是一種或多種以下脂肪酸:壬二酸、癸酸、辛酸、蓖麻油、椰子油(即，天然存在的脂肪酸的組合，包例如括月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、己酸、花生酸、油酸和亞油酸)、二聚體、異硬脂酸、月桂酸、亞麻籽酸、肉豆蘧酸、油酸、橄欖、棕櫚油、棕櫚酸、棕櫚仁、花生油、壬酸、蓖麻油酸、癸二酸、大豆油、硬脂酸、妥爾油、牛脂油、#12羥基硬脂酸、或任何種子油。在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29是一種或多種二酸、壬二酸、二聚體和癸二酸。因此，在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29可為兩種或更多種不同脂肪酸的混合物。在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29可為脂肪酸，其來源于得自天然油的甘油酯的化學(xué)或酶水解。例如，在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29可為游離脂肪酸28,，其如下文通過圖5的實(shí)施方案所述通過酶水解天然油如生物質(zhì)脂質(zhì)獲得。在一些實(shí)施方案中，ISPR提取劑29可為脂肪酸提取劑，其選自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸的低級(jí)醇酯、脂肪酸二醇酯、羥基化甘油三酯、以及它們的混合物，如例如提交于2010年7月28日的共有的、共同未決的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/368，436所述，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化天然油如生物質(zhì)脂質(zhì)獲得。在此類實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)提取劑29的生物質(zhì)脂質(zhì)可來自相同或不同的生物質(zhì)來自，原料12從其中獲得。例如，在一些實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)提取劑29的生物質(zhì)脂質(zhì)可來源于大豆，而原料12的生物質(zhì)來源是玉米?？墒褂萌魏慰赡艿奶崛?9對(duì)原料12的不同生物質(zhì)來源的組合，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。在一些實(shí)施方案中，附加的ISPR提取劑29包括 COFA。原位提取 發(fā)酵可以成批模式或連續(xù)模式在發(fā)酵容器30中進(jìn)行。對(duì)于原位提取發(fā)酵，有機(jī)提取劑可在形成兩相發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵開始時(shí)接觸發(fā)酵培養(yǎng)基。作為另外一種選擇，有機(jī)提取劑可在微生物達(dá)到期望的生長量之后與發(fā)酵培養(yǎng)基接觸，其中所述生長量的達(dá)到可通過測定培養(yǎng)物的光密度確定。此外，有機(jī)提取劑可在發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)物醇含量達(dá)到預(yù)選含量時(shí)接觸發(fā)酵培養(yǎng)基。在生產(chǎn)丁醇的情況下，例如ISPR提取劑可在丁醇濃度達(dá)到將對(duì)微生物產(chǎn)生毒性的濃度之前的某一時(shí)間接觸發(fā)酵培養(yǎng)基。在所述發(fā)酵培養(yǎng)基與所述ISPR提取劑接觸之后，丁醇產(chǎn)物分配至所述提取劑，降低了包含所述微生物的水相中的濃度，從而限制了生產(chǎn)丁醇的微生物在抑制性的丁醇產(chǎn)品中的暴露。所使用的ISPR提取劑的體積依賴于多種因素，包括所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積，所述發(fā)酵容器的尺寸，丁醇產(chǎn)物在所述提取劑中的分配系數(shù)，以及發(fā)酵模式的選擇，如下所述。提取劑的體積可為發(fā)酵容器工作容積的約3%至約60%。取決于提取效率，在發(fā)酵培養(yǎng)基中的丁醇的水相滴度可為例如約lg/L至約85g/L，約10g/L至約40g/L，約10g/L至約20g/L,約15g/L至約50g/L或約20g/L至約60g/L。在一些實(shí)施方案中，在酯化醇后的所得發(fā)酵液體培養(yǎng)基可包含游離的(即，未酯化的)醇，并且在一些實(shí)施方案中，當(dāng)產(chǎn)物醇是丁醇時(shí)，在酯化醇后的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的游離醇濃度不大于lg/L、3g/L、6g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、25g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L 或 60g/L，或者當(dāng)產(chǎn)物醇是乙醇時(shí)，在酯化醇后的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的游離醇濃度不大于15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、25g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L 或 100g/L。不受理論的約束，據(jù)信用提取發(fā)酵方法可獲得較高的丁醇滴度，部分地是由于有毒的丁醇產(chǎn)物從發(fā)酵培養(yǎng)基中的移除，從而保持了其水平低于對(duì)所述微生物有毒的水平。在原位提取發(fā)酵的分批模式中，將一定體積的有機(jī)提取劑加入到發(fā)酵容器中并且提取劑在該過程期間不被除去。該模式需要較大體積的有機(jī)提取劑以最小化發(fā)酵培養(yǎng)基中抑制的丁醇產(chǎn)物的濃度。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積相對(duì)更少，所生產(chǎn)的產(chǎn)物的量也比采用上述連續(xù)模式時(shí)所獲得的更少。例如，分批模式中提取劑的體積在一個(gè)實(shí)施方案中可為發(fā)酵容器工作容積的20 %至約60%，并且在另一個(gè)實(shí)施方案中約30 %至約60%。汽提(未示出)可與ISPR提取劑同時(shí)采用以從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去產(chǎn)物醇。在圖1的實(shí)施方案中，從發(fā)酵培養(yǎng)基中原位提取產(chǎn)物醇，分離分離容器35中產(chǎn)生的兩相混合物39。在一些實(shí)施方案中，如下文所述的圖2和3的實(shí)施方案所示，兩相混合物39的分離可發(fā)生在發(fā)酵容器中，其中包含醇的有機(jī)相流36直接從發(fā)酵容器30中排出。水相流34也可直接從發(fā)酵容器30中排出，進(jìn)行處理以移除任何殘余的產(chǎn)物醇并再利用，或者將其棄去并用新的發(fā)酵培養(yǎng)基替換。通過有機(jī)提取劑提取產(chǎn)物醇可在從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中移除微生物或不移除微生物的情況下進(jìn)行。微生物可通過本領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中移除，所述方法包括但不限于過濾或離心。例如，水相流34可包括微生物32如酵母。微生物32可容易地與水相流分離，例如在離心機(jī)(未示出)中分離。然后將微生物32再循環(huán)到發(fā)酵容器30中，其隨著時(shí)間可提高醇生產(chǎn)的產(chǎn)率，從而導(dǎo)致醇生產(chǎn)的效率提高。在連續(xù)模式的原位提取發(fā)酵中，在一個(gè)實(shí)施方案中提取劑的體積可為約3%至約50%的發(fā)酵容器工作體積，在另一個(gè)實(shí)施方案中約3 %至約30%，在另一個(gè)實(shí)施方案中3%至約20% ;在另一個(gè)實(shí)施方 案中3%至約10%。由于產(chǎn)物被不斷地從反應(yīng)器中移除，只需較小體積的提取劑就能允許較大體積的發(fā)酵培養(yǎng)基的使用。作為原位提取發(fā)酵的替代方案，所述產(chǎn)物醇可從發(fā)酵容器30的發(fā)酵液體培養(yǎng)基下游提取得到。在此類情況下，可從發(fā)酵容器30中移出發(fā)酵液體培養(yǎng)基并將其導(dǎo)入容器35。然后可將提取劑28導(dǎo)入容器35并接觸發(fā)酵液體培養(yǎng)基以在容器35中獲得兩相混合物39，然后將其分成有機(jī)相36和水相34。作為另外一種選擇，可將提取劑28加到分離容器(未不出)的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，然后將其導(dǎo)入容器35。作為非限制性的預(yù)示實(shí)例，根據(jù)圖1的實(shí)施方案，可標(biāo)稱包含約4重量％玉米油的碾磨過的完整玉米(作為原料12)的含水懸浮液可用淀粉酶(作為液化酶14)在約85°C至120°C下處理30分鐘至2小時(shí)，并且所得液化醪16冷卻至65°C和30°C之間，并用0.1ppm至10ppm(在一些實(shí)施方案中，0.5ppm至1.0ppm)脂肪酶(作為催化劑42)在pH 4.5至
7.5 (在一些實(shí)施方案中，介于pH 5.5和6.5之間)下處理足夠的時(shí)間以將至少30%至高達(dá)至少99%的脂質(zhì)中的可用脂肪酸內(nèi)容物轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸。任選地，可加熱液化的和經(jīng)脂肪酶處理的醪18以在發(fā)酵之前使脂肪酶42失活。醪18可冷卻至約30°C (例如使用換熱器)并被加載到發(fā)酵容器30中，其量為約25%至30重量％的干玉米固體。在發(fā)酵期間加入葡糖淀粉酶(作為糖化酶38)以糖化液化醪18，這可導(dǎo)致葡萄糖產(chǎn)生。所得發(fā)酵液體培養(yǎng)基可包含比可存在于使用尚未用脂肪酶42處理過的液化醪的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的玉米油量顯著更少的玉米油量(例如約1.2重量％的玉米油)。具體地講，脂肪酶42處理可導(dǎo)致玉米油脂質(zhì)26 (甘油三酯(TG))轉(zhuǎn)化成作為FFA 28的COFA (以及一些甘油二酯(DG)或甘油一酯(MG))，降低脂質(zhì)26在任何ISPR提取劑29 (例如油醇)中的積聚速率，并且在ISPR期間將COFA 28溶解到有機(jī)相36中降低丁醇在有機(jī)相36中的分配系數(shù)的程度將不與將脂質(zhì)(TG)溶解到有機(jī)相36中導(dǎo)致的分配系數(shù)降低程度一樣多。在一些實(shí)施方案中，可修改圖1的體系和方法使得原料衆(zhòng)液16(具有油26)和催化劑42被導(dǎo)入并在發(fā)酵容器30中接觸以產(chǎn)生漿液18(具有FFA28)。然后可提高發(fā)酵容器溫度以使催化劑42熱失活。然后可降低發(fā)酵容器溫度，并且可用微生物32接種發(fā)酵容器，從而可發(fā)酵漿液18的糖以產(chǎn)生產(chǎn)物醇。在一些實(shí)施方案中，可修改圖1的體系和方法使得發(fā)酵容器30中的同步糖化和發(fā)酵(SSF)被在發(fā)酵容器30之前的分離糖化容器60(參見圖2)取代，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。因此，可在SSF方法的發(fā)酵之前或發(fā)酵期間糖化漿液18。用于水解原料油26的催化劑42可在糖化酶38之前、之后、或同時(shí)導(dǎo)入，這一點(diǎn)也將是顯而易見的。因此，在一些實(shí)施方案中，酶38和催化劑42的添加可為分步的(例如先加入催化劑42，然后加入酶38，或者相反地加入它們)或基本上同步的(即，恰好與人或機(jī)器一下添加花費(fèi)的時(shí)間相同的時(shí)間，或者一種酶/催化劑緊接著其他催化劑/酶加入，其時(shí)間為人或機(jī)器兩下添加花費(fèi)的時(shí)間)。例如，如圖2的實(shí)施方案所示，可修改圖1的體系和方法使得發(fā)酵容器30中的同步糖化和發(fā)酵(SSF)被在發(fā)酵容器30之前的分離糖化容器60取代。圖2基本上與圖1相同，不同的是包含分離的糖化容器60，其接納酶38，并且將催化劑42導(dǎo)入液化的糖化原料流62。將原料漿液16與酶38如葡糖淀粉酶一起導(dǎo)入糖化容器60，從而在漿液16中的低聚糖形式的糖可降解成單糖。液化的糖化原料流62流出其中導(dǎo)入催化劑42的糖化容器60。原料流62包括單糖、油26和來源 于原料的不溶解的固體。導(dǎo)入催化劑42以水解油26，產(chǎn)生具有游離脂肪酸28和催化劑42的液化糖化原料漿液64。作為另外一種選擇，在一些實(shí)施方案中，催化劑42可與糖化酶38 —起加入以同步產(chǎn)生葡萄糖并將油脂質(zhì)26水解成游離脂肪酸28。可分步(例如先加入催化劑42，然后加入酶38，或者相反地加入它們)或同步添加酶38和催化劑42。作為另外一種選擇，在一些實(shí)施方案中，可將漿液62導(dǎo)入發(fā)酵容器，同時(shí)將催化劑42直接加到發(fā)酵容器30中。在圖2的實(shí)施方案中，將加熱q施用于原料衆(zhòng)液64,從而使催化劑42失活,并且然后將熱處理過的衆(zhòng)液64與產(chǎn)醇微生物32 —起導(dǎo)入發(fā)酵容器30,所述微生物代謝單糖以產(chǎn)生產(chǎn)物醇(例如丁醇)。作為另外一種選擇，將漿液64輸送進(jìn)發(fā)酵容器30并當(dāng)其處于發(fā)酵容器中、用接種微生物32之前經(jīng)受加熱q。如上文圖1所述，游離脂肪酸28也可用作ISPR提取劑，其優(yōu)先地從水相中分配產(chǎn)物醇。在一些實(shí)施方案中，也可將一種或多種附加的ISPR提取劑29導(dǎo)入發(fā)酵容器30中。兩相混合物的分離在發(fā)酵容器30中發(fā)生，從而包含醇的有機(jī)相流36和水相流34直接排出發(fā)酵容器30。作為另外一種選擇，兩相混合物的分離可在圖1的實(shí)施方案中提供的分離容器35中進(jìn)行。圖2的實(shí)施方案的剩余工藝運(yùn)行與圖1相同，并且因此將不再詳述。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，來源于原料12的油26可在液化之前或期間被催化水解成FFA 28。例如在圖3的實(shí)施方案中，可將具有油26的原料12與催化劑42 —起輸送進(jìn)液化容器10以將油26中的至少一部分甘油酯水解成FFA 28。酶14(例如α -淀粉酶)水解原料12中的淀粉，也可將其導(dǎo)入容器10以產(chǎn)生液化原料?？煞植交蛲竭M(jìn)行酶14和催化劑42的添加。例如，可導(dǎo)入催化劑42，并且然后在已經(jīng)水解了至少一部分油26之后可導(dǎo)入酶14。作為另外一種選擇，可導(dǎo)入酶14，并且然后可導(dǎo)入催化劑42。液化方法可涉及施用加熱q。在此類實(shí)施方案中，優(yōu)選在液化之前或期間導(dǎo)入催化劑42，這時(shí)工藝溫度低于使催化劑42失活所需的溫度，以便油26可被水解。隨后施用加熱q可實(shí)現(xiàn)液化和使催化劑42失活的雙重目的。在任何情況下，在液化容器10中將在原料12中的油26轉(zhuǎn)化成FFA 28，使得兩相原料漿液18流出液化容器10。兩相漿液18包括有機(jī)相FFA 28以及糖、水和水相的不溶解的固體。在一些實(shí)施方案中，水相可包括來自油中的甘油酯類向脂肪酸轉(zhuǎn)化的甘油(glycerin)。在一些實(shí)施方案中，可在引入發(fā)酵容器30前從所述流18中移除這些甘油(如果存在)。參見圖3，兩相流18在發(fā)酵容器30中接觸發(fā)酵液體培養(yǎng)基以形成兩相混合物。在發(fā)酵容器30中，通過SSF產(chǎn)生的產(chǎn)物醇分配到包括FFA 28的有機(jī)相中。作為另外一種選擇，在一些實(shí)施方案中，可修改 所述方法以包括與圖2相關(guān)的討論的分離糖化容器。兩相混合物的分離在發(fā)酵容器30中發(fā)生，從而包含醇的有機(jī)相流36和水相流34直接排出發(fā)酵容器30。作為另外一種選擇，兩相混合物的分離可在圖1的實(shí)施方案中提供的分離容器35中進(jìn)行。任選地，可將一種或多種另外的提取劑29導(dǎo)入發(fā)酵容器30以形成有機(jī)相，其將產(chǎn)物醇從水相中優(yōu)先地分配出來?？蓪⒑加袡C(jī)相36導(dǎo)入分離器50以回收產(chǎn)物醇54并任選地再利用回收的提取劑27，如圖1所示。圖3的實(shí)施方案的其它方法操作與前文所述的附圖相同，并且因此將不再詳述。在包括如圖1-3所示的前文所述實(shí)施方案在內(nèi)的一些實(shí)施方案中，可在將原料漿液導(dǎo)入發(fā)酵容器30之前從其中除去不溶解的固體。例如，如圖4的實(shí)施方案所示，將原料漿液16導(dǎo)入分離器20的入口，將其構(gòu)造用于排放固體相或濕餅24形式的不溶解的固體。例如，在一些實(shí)施方案中，分離器20可包括加壓過濾器、真空過濾器、或用于從原料漿液16中分離不溶解的固體的離心機(jī)。任選地，在一些實(shí)施方案中，也可構(gòu)造分離器20以移除原料漿液16中存在的一些或基本上全部油26。在此類實(shí)施方案中，分離器20可為本領(lǐng)域已知的任何適用的分離器，其用于從含水原料流中移除油，包括但不限于虹吸、潷析、抽吸、離心、使用重力沉降器、膜輔助的相分裂等。剩余的原料包括糖和水，將其以含水流22的形式排放到發(fā)酵容器30中。在一些實(shí)施方案中，分離器20除去油26而不是不溶解的固體。因此，輸送進(jìn)發(fā)酵容器30的含水流22包括不溶解的固體。例如在一些實(shí)施方案中，分離器20包括三相臥螺離心機(jī)20，其攪拌或旋轉(zhuǎn)原料漿液16以產(chǎn)生包含含水層(包含糖和水)(即，流22)、含有不溶解的固體(即，濕餅24)的固體層、和油層(即，油流26)的離心產(chǎn)物。在這種情況下，催化劑42可接觸移除的油26以產(chǎn)生FFA 28的流，其包括催化劑42，如圖4所示。然后可將加熱q施用于FFA 28的流，從而使催化劑42失活。然后可將FFA 28的流和失活的催化劑42與流22及微生物32 —起導(dǎo)入發(fā)酵容器30。作為另外一種選擇，可將FFA 28和活性催化劑42從容器40輸送進(jìn)發(fā)酵容器30，并且隨后在發(fā)酵容器中活性催化劑42可在接種微生物32之前經(jīng)受加熱q并失活。FFA 28可用作ISPR提取劑28并在發(fā)酵容器30中形成兩相混合物。通過SSF產(chǎn)生的產(chǎn)物醇分配到通過FFA 28形成的有機(jī)相36中。在一些實(shí)施方案中，也可將一種或多種附加的ISPR提取劑29導(dǎo)入發(fā)酵容器30中。因此，油26 (例如來自原料的油)可被催化水解成FFA 28，從而降低脂質(zhì)在ISPR提取劑中的積聚速率，同時(shí)也產(chǎn)生ISPR提取劑。有機(jī)相36可在容器35中與兩相混合物39的水相34分離。在一些實(shí)施方案中，如圖2和3所述的實(shí)施方案所示，兩相混合物39的分離可發(fā)生在發(fā)酵容器中，其中包含醇的有機(jī)相流36直接從發(fā)酵容器30中排出?？蓪⒂袡C(jī)相36導(dǎo)入分離器50以回收產(chǎn)物醇54并任選地再利用回收的提取劑27，如圖1所示。圖4的實(shí)施方案的剩余工藝運(yùn)行與圖1相同，并且因此將不再詳述。當(dāng)經(jīng)由離心機(jī)20移除濕餅24時(shí)，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)原料是玉米時(shí)，來自原料12的一部分油如玉米油保留在濕餅24中。一旦已經(jīng)從離心機(jī)20中排出了水溶液22，可用附加的水在離心機(jī)中洗滌濕餅24。洗滌濕餅24將回收存在于濕餅中的糖(例如低聚糖)，并且可將回收的糖和水再循環(huán)到液化容器10中。在洗滌后，可通過任何合適的已知方法干燥濕餅 20 以形成干酒糟可溶物·(Dried Distillers' Grains with Solubles, DDGS)。由在離心機(jī)20中形成的濕餅24形成DDGS具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)椴蝗芙獾墓腆w不進(jìn)入發(fā)酵容器中，提取劑和/或產(chǎn)物醇如丁醇不被捕集在DDGS中，它不經(jīng)受發(fā)酵容器的條件，并且它不接觸發(fā)酵容器中存在的微生物。所有這些有益效果使它更易于加工和銷售DDGS，例如以動(dòng)物飼料形式加工和銷售。在一些實(shí)施方案中，油26不與濕餅24分開排出，而是將油26包括在濕餅24中，作為它的一部分，并且最終存在于DDGS中。在此類情況下，所述油可與DDGS分開并且轉(zhuǎn)化成ISPR提取劑29，隨后用于相同或不同的醇發(fā)酵方法。經(jīng)由離心從原料16中移除不溶解的固體的方法和體系在提交于2010年6月18日的共有的、共同未決的美國專利公開申請(qǐng)61/356，290中詳述，該申請(qǐng)全文以引用方式并入本文。在其他實(shí)施方案中(未示出)，糖化可在分離的糖化容器60 (參見圖2)中發(fā)生，所述容器位于分離器20和液化容器10之間，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。在如圖所示的其他實(shí)施方案中，例如在圖5的實(shí)施方案中，將天然油26'供應(yīng)于容器40，催化劑42也被供應(yīng)于該容器，從而將油26'中的至少一部分甘油酯水解以形成FFA 28'。可隨后使催化劑42失活，例如通過施用加熱q使其失活。然后將來自包含F(xiàn)FA28'和使催化劑42失活的容器40的產(chǎn)物流與其中包含原料油26的含水原料流22 —起導(dǎo)入發(fā)酵容器30，并且在一些實(shí)施方案中，以前已經(jīng)通過分離器20移除了不溶解的固體(參見例如圖4的實(shí)施方案)。也將糖化酶38和微生物32導(dǎo)入發(fā)酵容器30，從而通過SSF產(chǎn)生產(chǎn)物醇。作為另外一種選擇，可將油26'和催化劑42直接輸送進(jìn)發(fā)酵容器30，其中將油26'水解成FFA 28'，而不是使用容器40。隨后活性催化劑42可經(jīng)受加熱q并在接種微生物32之前，在發(fā)酵容器中失活。作為另外一種選擇，可將FFA 28'和活性催化劑42從容器40輸送進(jìn)發(fā)酵容器30，并且隨后在發(fā)酵容器中活性催化劑42可在接種微生物32之前經(jīng)受加熱q并失活。在此類實(shí)施方案中，可將包括油26的原料漿液16，而不是其中移除了油26的流22輸送進(jìn)發(fā)酵容器30并接觸活性催化劑42。因此活性催化劑42可用于將油26水解成FFA 28，從而減少提取劑分配系數(shù)隨時(shí)間的損失和/或降低，這歸因于在發(fā)酵容器中存在油。在一些實(shí)施方案中，可修改圖5的體系和方法使得發(fā)酵容器30中的同步糖化和發(fā)酵被在發(fā)酵容器30之前的分離糖化容器60取代，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的(參見例如圖2的實(shí)施方案)。在一些實(shí)施方案中，天然油26'可為牛脂油、玉米油、卡諾拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、魚油、霍霍巴油、豬油、亞麻籽油、牛蹄油、奧蒂油、棕櫚油、花生油、油菜籽油、稻米油、紅花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻風(fēng)樹油、植物油共混物、以及它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，天然油26'是兩種或更多種天然油的混合物，例如棕櫚油和大豆油的混合物。在一些實(shí)施方案中，天然油26^是植物來源的油。在一些實(shí)施方案中，植物來源的油可來源于發(fā)酵過程中可利用的生物質(zhì)，但這是不一定的。生物質(zhì)可來自從中獲取原料12 (如圖5所示的流22)的相同或不同來源。因此，例如在一些實(shí)施方案中，油26'可來源于玉米，而原料12可為甘蔗。例如，在一些實(shí)施方案中，油26'可來源于玉米，并且原料12的生物質(zhì)來源也是玉米?？墒褂萌魏慰赡艿挠?6'對(duì)原料12的不同生物質(zhì)來源的組合，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。FFA 28;也可用作ISPR提取劑28'以形成包含水相和有機(jī)相的兩相混合物，其中在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生的產(chǎn)物醇優(yōu)先分配到由ISPR提取劑28'構(gòu)成的有機(jī)相中。在一些實(shí)施方案中，如上文圖1所述，也可將一種或多種附加的ISPR提取劑29導(dǎo)入發(fā)酵容器30中。有機(jī)相36可在容器35中與兩相混合物39的水相34分離。在一些實(shí)施方案中，如圖2和3所述的實(shí)施方案所示，兩相混合物39的分離可發(fā)生在發(fā)酵容器中，其中包含醇的有機(jī)相流36直接從發(fā)酵容器30中排出。可將有機(jī)相36導(dǎo)入分離器50以回收產(chǎn)物醇54并任選地再利用回收的提取劑27，如圖1所示。圖5的實(shí)施方案的剩余工藝運(yùn)行與圖1相同，并且因此將不再詳述。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，存在于原料12中的生物質(zhì)油可在醇發(fā)酵后的步驟中轉(zhuǎn)化成FFA 28。然后可將FFA 28導(dǎo)入發(fā)酵容器中作為ISPR提取劑28。例如，在圖6的實(shí)施方案中，液化原料12以產(chǎn)生原料漿液16，其包括來源于原料的油26。原料漿液16也可包括來自原料的不溶解的固體。作為另外一種選擇，不溶解的固體可經(jīng)由分離器如離心機(jī)(未不出)分離自衆(zhòng)液16。原料衆(zhòng)液16包含油26,將其直接導(dǎo)入包含發(fā)酵液體培養(yǎng)基的發(fā)酵容器30，所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基包括糖化酶38和微生物32。產(chǎn)物醇通過發(fā)酵容器30中的SSF產(chǎn)生。作為另外一種選擇,在一些實(shí)施方案中,可修改所述方法以包括與圖2相關(guān)的討論的分離糖化容器。將ISPR提取劑29導(dǎo)入發(fā)酵容器30以形成兩相混合物，并且通過將產(chǎn)物醇分配到ISPR提取劑29的有機(jī)相將其分離。油26也分配到有機(jī)相中。兩相混合物的分離在發(fā)酵容器30中發(fā)生，從而包含醇的有機(jī)相流36和水相流34直接排出發(fā)酵容器30。作為另外一種選擇，兩相混合物的分離可在圖1的實(shí)施方案中提供的分離容器35中進(jìn)行。有機(jī)相流36包括油26，將其導(dǎo)入分離器50以從提取劑29中回收產(chǎn)物醇54。所得貧醇提取劑27包括回收的提取劑29和油26。提取劑27接觸催化劑42，從而水解油26中的至少一部分甘油酯以形成FFA 28。然后可將加熱q施用于包括FFA 28的提取劑27以在再循環(huán)到發(fā)酵容器30中之前使催化劑42失活。此類再循環(huán)的提取劑流27可為獨(dú)立流或與新制備的提取劑流29 —起的混合流。隨后從發(fā)酵容器30中取出包含醇的有機(jī)相36，其除產(chǎn)物醇和來自新導(dǎo)入的原料漿液16的附加油26之外，隨后可包括FFA 28和ISPR提取劑29 (作為新提取劑29和再利用的提取劑27)。然后可以與上述方式相同的方式處理有機(jī)相36以回收產(chǎn)物醇，并且在接觸催化劑42以水解附加的油26后再循環(huán)到發(fā)酵容器30中。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)發(fā)酵方法隨時(shí)間進(jìn)行時(shí)，使用制備的ISPR提取劑29可分階段進(jìn)行，因?yàn)榉椒ū旧砜僧a(chǎn)生FFA 28作為制備的ISPR提取劑，用于提取產(chǎn)物醇。因此，ISPR提取劑可為再循環(huán)的提取劑27與FFA 28的流。因此，圖1-5提供了涉及發(fā)酵方法的方法和體系的多個(gè)非限制性實(shí)施方案、和由水解來源于油26的生物質(zhì)產(chǎn)生的FFA 28、以及由催化水解天然油26'如植物來源的油產(chǎn)生的FFA 28'，它們可用作ISPR提取劑28和28'以在提取發(fā)酵中移除產(chǎn)物醇。在一些實(shí)施方案中，包括如圖1-6所述的任何前述實(shí)施方案,在發(fā)酵容器30中的發(fā)酵液體培養(yǎng)基包括至少一種重組微生物32，其經(jīng)基因修飾(S卩，經(jīng)遺傳工程化)以經(jīng)由生物合成途徑產(chǎn)生丁醇，所述生物合成途徑從至少一種可發(fā)酵碳源產(chǎn)生丁醇。具體地講，重組微生物可在包含合適碳底物的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中生長。附加的碳底物可包括但不限于:單糖如果糖；低聚糖如乳糖、麥芽糖、或蔗糖；多糖如淀粉或纖維素；或它們的混合物，以及來自可再生原料的未純化混合物，例如干酪乳清滲透物、玉米漿、糖用甜菜糖蜜和大麥麥芽。其他碳底物可包括乙醇、乳酸鹽、琥珀酸鹽或甘油。另外，碳底物也可以是已被證明可以被代謝轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵生化中間產(chǎn)物的諸如二氧化碳的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基營養(yǎng)生物體也已知可以利用多種其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代謝活動(dòng)的多種氨基酸。例如，甲基營養(yǎng)酵母已知可利用來自甲胺的碳來形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth Cl Compd.,[Int.Symp.]，第 7 版(1993)，415-32,編輯:Murrell, J.Collin ；Kelly, Don P.Publisher:Intercept,Andover,UK)。類似地,假絲酵母屬的多種菌種將會(huì)代謝丙氨酸或油酸(Suiter等人，Arch.Microbiol.153 =485-489,1990)。因此，預(yù)期本發(fā)明中所利用的碳源可涵蓋各種含碳底物并將僅受限于生物體的選擇。

盡管預(yù)期以上提及的所有碳底物以及它們的混合物均是適用的，但是在一些實(shí)施方案中，對(duì)于經(jīng)過修飾以利用C5糖的酵母細(xì)胞，優(yōu)選的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它們與C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。蔗糖可來源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它們的混合物。葡萄糖和右旋糖可通過糖化淀粉基原料來源于可再生的谷物來源，包括谷物如玉米、小麥、黑麥、大麥、燕麥、以及它們的混合物。此外，可發(fā)酵的糖類可通過預(yù)處理和糖化過程來源于可再生的纖維素的或木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)，例如，如美國專利申請(qǐng)公布2007/0031918 Al中所述，該專利以引用方式并入本文。除適宜的碳源(來自含水流22)外，發(fā)酵液體培養(yǎng)基必需包含適宜的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液和其他成分，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，適宜于培養(yǎng)物的生長和提升酶途徑，其包含二羥酸脫水酶(DHAD)。借助生物合成途徑生產(chǎn)丁醇的重組微生物可包括以下菌屬中的一種:梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、志賀氏菌屬(Shigella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或酵母屬(Saccharomyces)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物可選自大腸桿菌(Escherichia coli),植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物為克拉布特里陽性酵母，其選自酵母屬、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母屬、德克酵母屬(Dekkera)、球擬酵母屬(Torulopsis)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、以及假絲酵母屬的一些菌種。克拉布特里陽性酵母的菌種包括但不限于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、芽殖酵母(Saccharomyces mikitae)、奇異酵母(Saccharomyces paradoxus)、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和光滑假絲酵母(Candida glabrata)。例如，利用微生物以及生產(chǎn)丁醇的微生物的發(fā)酵生產(chǎn)丁醇是已知的并且在例如美國專利公開申請(qǐng)公布2009/0305370中公開，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，微生物包含丁醇生物合成途徑。合適的異丁醇生物合成途徑是本領(lǐng)域已知的(參見例如美國專利公開申請(qǐng)公布2007/0092957，其以引用方式并入本文)。在一些實(shí)施方案中，微生物中的異源性多核苷酸編碼至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、或至少四個(gè)多肽，它們催化途徑中底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，微生物中的異源性多核苷酸編碼所有多肽，它們催化途徑中底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，所述微生物包含減少或消除了的丙酮酸脫羧 酶活性?；旧喜缓崦擊让富钚缘奈⑸镌诿绹鴮＠暾?qǐng)公布2009/0305363中進(jìn)行了描述，其以引用方式并入本文。本文提供了某些菌株的構(gòu)建，包括在實(shí)施例中使用的那些。酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株 BP1083( “NGC1-070，，)的構(gòu)建所述菌株BP1064 來源于 CEN.PK 113-7D (CBS 8340 ；CentraalbureauvoorSchimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Netherlands)并包含下列基因的缺失:URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6 和 GPD2。用質(zhì)粒 pYZ090 (SEQ ID NO:1，如美國臨時(shí)申請(qǐng) 61/246，844 所述)和 pLH468 (SEQID NO:2)轉(zhuǎn)化 BP1064 以形成菌株 NGC1-070 (BP1083,PNY1504)。缺失，即完全移除整個(gè)編碼序列，通過與PCR片段同源重組而創(chuàng)建，所述PCR片段包含靶基因的上游和下游同源區(qū)以及用于選擇轉(zhuǎn)化子的G418抗性標(biāo)記或URA3基因。其側(cè)翼為的G418抗性標(biāo)記，用Cre重組酶移除。通過同源重組移除所述URA3基因以創(chuàng)建無痕缺失，或如果側(cè)翼為1xP位點(diǎn)則用Cre重組酶移除。所述無痕的缺失步驟是改編自Akada等人(Yeast 23:399-405，2006)。一般來講，每個(gè)無痕缺失的PCR盒是通過重疊PCR組合四個(gè)片段A-B-U-C得到的。所述PCR盒包含可選的/反可選的標(biāo)記，URA3(片段U)，其包含原生CEN.PK 113-7D URA3基因，連同啟動(dòng)子r (URA3基因上游250bp)和終止子(URA3基因下游150bp)。片段A和C每個(gè)長500bp，它們對(duì)應(yīng)于緊接靶基因上游的500bp(片段A)和靶基因3'的500bp(片段C)。片段A和C用于通過同源重組將盒整合到染色體中。片段B(500bp長)對(duì)應(yīng)于緊接靶基因下游的500bp并用于通過同源重組，從染色體上切除URA3標(biāo)記和片段C，在盒整合到染色體時(shí)生成作為對(duì)應(yīng)片段B的直接重復(fù)序列使用PCR產(chǎn)物ABUC盒，首先將URA3標(biāo)記整合進(jìn)基因組，然后通過同源重組從基因組中切除。初始整合刪除了除3'的500bp之外的基因。在切除時(shí)，也刪除了所述基因3'的500bp區(qū)域。對(duì)于使用這個(gè)方法的基因整合，將要整合的基因包含在PCR盒的片段A和B之間。URA3 缺失為刪除內(nèi)源URA3編碼區(qū)，ura3:: loxP-kanMX-loxP盒以PCR擴(kuò)增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO:3)。pLA54包含乳酸克魯維酵母TEFl啟動(dòng)子和kanMX標(biāo)記，并且側(cè)翼序列為1xP位點(diǎn)，允許Cre重組酶參與重組并移除標(biāo)記。使用Phusionu DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich, MA)和引物 BK505 與 BK5O6 (SEQ ID NO:4 和 5)完成PCR。所述每個(gè)引物的URA3部分來源于URA3啟動(dòng)子上游5'區(qū)和編碼區(qū)下游3'區(qū)，使得loxP-kanMX-loxP標(biāo)記的整合導(dǎo)致URA3編碼區(qū)的替換。利用標(biāo)準(zhǔn)遺傳學(xué)技術(shù)將所述 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 CEN.PK 113-7D 中(Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,第 201-202 頁)并且轉(zhuǎn)化子在 30°C包含GMSaOOyg/mL)的YPD上選擇。采用PCR驗(yàn)證篩選的轉(zhuǎn)化子的正確整合，所用引物為 LA468 和 LA492 (SEQ IDNO:6 和 7)并命名為 CEN.PK 113-7D Λ ura3:: kanMX。HI S3 缺失用于無痕HIS3缺失的PCR盒的四個(gè)片段的擴(kuò)增使用phusion HighFidelity PCRMaster Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich,MA)并以 CEN.PK 113-7D 基因組 DNA 為模板，用Geiltrak Puregeneli Yeast/Bact 試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)制備。HIS3 片段A使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP452(SEQ ID NO: 14)，和引物oBP453 (SEQ ID NO:15),其包含與HIS3片段B的5'端同源的5'尾。HIS3片段B使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP454 (SEQ ID NO: 16)，其包含與HIS3片段A的:V端同源的5'尾，和引物oBP455 (SEQID NO:17)，其包含與HIS3片段U的5'端同源的5'尾。HIS3片段U使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP456(SEQ ID NO: 18)，其包含與HIS3片段B的3'端同源的5'尾，和引物oBP457 (SEQ ID NO: 19)，其包含與HIS3片段C的5'端同源的5'尾。HIS3片段C使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP458(SEQ ID NO:20)，其包含與HIS3片段U的3'端同源的5'尾，和引物 oBP459(SEQ ID NO:21)。使用 PCR Purification 試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)純化PCR產(chǎn)物。HIS3片段AB通過重疊PCR生成，通過混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物 oBP452(SEQ ID NO:14)和 oBP455 (SEQ ID NO: 17)進(jìn)行擴(kuò)增。HIS3 片段 UC 通過重疊PCR生成，通過混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO:18)和oBP459(SEQ ID NO:21)進(jìn)行擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過GelExtraction試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化。HIS3ABUC盒通過重疊PCR生成，通過混合 HIS3 片段 AB 和 HIS3 片段 UC 并用引物 oBP452(SEQ ID NO:14)和 oBP459 (SEQ ID NO:21)進(jìn)行擴(kuò)增。使用 PCRPurification 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化 PCR 產(chǎn)物。制備CEN.PK 113-7D Λ ura3:: kanMX 的感受態(tài)細(xì)胞，并用 HI S3 ABUCPCR 盒轉(zhuǎn)化，使用 Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(Zymo ResearchCorporation, Irvine,CA)。轉(zhuǎn)化混合物在30°C接種至缺乏尿嘧啶輔以2%的葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上。具有his3敲除的轉(zhuǎn)化子用PCR進(jìn)行篩選，所用引物為oBP460(SEQ ID NO:22)和oBP461(SEQ IDNO:23),所用的基因組DNA用Gentrali Pliregene10Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)制備。正確的轉(zhuǎn)化子被選為菌株 CEN.PK 113-7DAura3::kanMXAhis3::URA3。從Au:T￡i3位點(diǎn)移除KmiMX標(biāo) Ρ,以及從Δ his3位點(diǎn)移除URA3標(biāo) Ρ,所述KanMX 標(biāo)記通過轉(zhuǎn)化 CEN.PK 113_7DAura3:: kanMX Δ hi s3::URA3 與pRS423::PGALl-cre(SEQ ID NO:66，如美國臨時(shí)申請(qǐng)61/290，639中所述)而移除，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(Zymo ResearchCorporation, Irvine, CA)并在30°C接種至缺乏組氨酸和尿嘧啶輔以2%的葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化子在300C的輔以I %的半乳糖的YP上生長 6個(gè)小時(shí)以誘導(dǎo)Cre重組酶和KanMX標(biāo)記切除，并在30°C接種至￥ 0(2%葡萄糖)平板上以復(fù)蘇。分離物過夜生長在Yro中并在30°C接種至包含5-氟-乳清酸(5-F0A，0.1%)的合成完全培養(yǎng)基上，以選擇失去了 URA3標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子的分離物?？?-氟-乳清酸的分離物生長和接種至YPD中以移除pRS423:: PGAL1-ere質(zhì)粒。檢測分離物中KanMX標(biāo)記和URA3標(biāo)記的丟失，并通過在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培養(yǎng)基平板、和缺乏組氨酸的合成完全培養(yǎng)基平板的生長檢測，檢測pRS423::PGAL1-ere質(zhì)粒的丟失。對(duì)G418敏感并為尿嘧啶和組氨酸營養(yǎng)缺陷性的正確的分離物被選為菌株CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Λ his3并命名為BP857。所述缺失和標(biāo)記移除通過PCR和測序確認(rèn)，所用引物為oBP450(SEQ ID NO:24)和oBP451(SEQ ID NO:25)對(duì)于Aura3以及引物 oBP460(SEQ ID NO:22)和 oBP461(SEQ ID NO:23)對(duì)于 Δhis3 所用的基因組 DNA 用Central! Puregene'J Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。PDC6 缺失用于無痕H)C6缺失的PCR盒的四個(gè)片段的擴(kuò)增使用Phusi0丨Vi HighFidelity PCRMaster Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich,MA)并以 CEN.PK 113-7D 基因組 DNA 為模板，用Gentrali Pliregeneu Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。PDC6 片段A使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP440 (SEQ ID NO:26)，和引物oBP441 (SEQ ID NO:27),其包含與H)C6片段B的5'端同源的5'尾。H)C6片段B使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP442 (SEQ ID NO:28)，其包含與TOC6片段A的3'端同源的5'尾，和引物oBP443 (SEQID N0:29)，其包含與H)C6片段U的5'端同源的5'尾。TOC6片段U使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP444(SEQ ID NO:30)，其包含與TOC6片段B的3'端同源的5'尾，和引物oBP445 (SEQ ID NO:31)，其包含與TOC6片段C的5'端同源的5'尾。TOC6片段C使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP446(SEQ ID NO:32)，其包含與TOC6片段U的3'端同源的5'尾，和引物 oBP447(SEQ ID NO:33)。使用 PCR Purification 試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)純化PCR產(chǎn)物。H)C6片段AB通過重疊PCR生成，通過混合TOC6片段A和TOC6片段B并用引物 oBP440(SEQ ID NO:26)和 oBP443 (SEQ ID NO:29)進(jìn)行擴(kuò)增。PDC6 片段 UC 通過重疊PCR生成，通過混合H)C6片段U和H)C6片段C并用引物oBP444(SEQ ID NO:30)和oBP447(SEQ ID NO:33)進(jìn)行擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過GelExtraction試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化。FiDCGABUC盒通過重疊PCR生成，通過混合 PDC6 片段 AB 和 PDC6 片段 UC 并用引物 oBP440 (SEQ ID NO:26)和 oBP447 (SEQ ID NO:
33)進(jìn)行擴(kuò)增。使用 PCR Purification 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化 PCR 產(chǎn)物。
^[J|CEN.PK113_7D Aura3::1οχΡ Λ his3 的感受態(tài)細(xì)胞，并用 PDC6ABUC PCR盒轉(zhuǎn)化，使用 Frozen-ΕΖ Yeast Transformation II 試劑盒(ZymoResearch Corporation,Irvine, CA)。轉(zhuǎn)化混合物在30°C接種至缺乏尿嘧啶輔以2 %的葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上。具有pdc6敲除的轉(zhuǎn)化子用PCR進(jìn)行篩選，所用引物為oBP448(SEQ ID NO:
34)和 oBP449(SEQ ID NO:35)，所用的基因組 DNA 用 Gentrau Puregene" Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。正確的轉(zhuǎn)化子被選為菌株CEN.PK 113-7DΔura3::1oxP Δhis3 Apdc6::URA3。CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6::URA3分離物過夜生長在YPD 中并在30°C接種至包含5-氟-乳清酸(0.1% )的合成完全培養(yǎng)基上，以選擇失去了 URA3標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子的分離物。所述缺失和標(biāo)記移除通過PCR和測序確認(rèn)，所用引物為oBP448(SEQ IDNO:34)和 oBP449 (SEQ ID NO:35)，所用的基因組 DNA 用Geiitrak Puregenek Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。來自分離物的基因的缺乏通過PCR陰性結(jié)果來證明，所用PDC6編碼區(qū)的特異性引物為oBP554(SEQ ID NO:36)和oBP555 (SEQ ID NO:37)。正確的分離物被選為菌株CEN.PK 113-7D Λ ura3::1oxP Λ his3 Λ pdc6并命名為BP891。PDCl 缺失 i ·IvDSm 糖合所述roci基因被刪除并被ilvD替換，其編碼區(qū)來自變異鏈球菌(Str印tococcusmutans) ATCC N0.700610。所述A片段接著ilvD編碼區(qū),其來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans),對(duì)于用于 F1DCl 缺失-1IvDSm 整合的 PCR 盒使用 PllllSjonli High Fidelity PCRMaster Mix (New EnglandBioLabs Inc., Ipswich,MA)進(jìn)行擴(kuò)增并用 NYLA83 (如本文和美國臨時(shí)申請(qǐng)61/246，709所述)基因組DNA作為模板，所述基因組DNA用Gentraii PuregenekYeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。PDCl 片段 A_iIvDSm(SEQ ID NO:141)使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP513(SEQ IDNO:38)，和引物oBP515 (SEQ ID N0:39)，其包含與roCl片段B的5'端同源的5'尾。用于roCl缺失-1lvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段用Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc., Ipswich,MA)
和作為模板的CEN.PK 113-7D基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用GentrauPuregeneli Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。PDCl片段B使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP516 (SEQID NO:40)，其包含與PDCl片段Α-1lvDSm的3'端同源的5'尾，和引物oBP517 (SEQ ID NO:41)，其包含與roci片段U的5'端同源的5'尾。roci片段U使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:弓丨物oBP518(SEQ ID NO:42)，其包含與I3DCl片段B的3'端同源的5'尾，和引物oBP519 (SEQID NO:43)，其包含與roCl片段C的5'端同源的5'尾。I3DCl片段C擴(kuò)增使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP520(SEQ IDNO:44)，其包含與TOCl片段U的3'端同源的5'尾，和引物oBP521(SEQID NO:45)。使用 PCR Purification 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化 PCR產(chǎn)物。PDCl片段A-1 IvDSm-B通過重疊PCR生成，通過混合PDCl片段A_i IvDSm和PDCl片段 B 并用引物 oBP513(SEQ ID NO:38)和 oBP517(SEQ ID NO:41)進(jìn)行擴(kuò)增。PDCl 片段 UC通過重疊PCR生成，通過混合roci片段U和roci片段C并用引物OBP518 (SEQ ID NO:42)和oBP521(SEQ ID NO:45)進(jìn)行擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過GelExtraction試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)純化。PDCl A-1lvDSm-BUC盒(SEQ ID NO: 142)通過重疊PCR生成，通過混合roCl片段A-1 IvDSm-B和I3DCl片段UC并用引物oBP513 (SEQID NO:38)和 oBP521(SEQ ID NO:45)進(jìn)行擴(kuò)增。使用 PCR Purification 試劑盒(Qiagen,Valencia, CA)純化 PCR 產(chǎn)物。制備CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Δpdc6 的感受態(tài)細(xì)胞，并用PDClA-1IvDSm-BUC PCR 盒轉(zhuǎn)化，使用 Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(Zymo Research Corporation, Irvine, CA)。轉(zhuǎn)化混合物在30°C接種至缺乏尿卩密唳輔以2%的葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上。具有pdcl敲除ilvDSm整合的轉(zhuǎn)化子用PCR進(jìn)行篩選，所用引物為oBP511(SEQ ID NO:46)和oBP512 (SEQ ID NO:47)，所用的基因組DNA用Genlra1! Puregene' Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。來自分離物的F1DCl
基因的缺乏通過PCR陰性結(jié)果來證明，所用roCl編碼區(qū)的特異性引物為oBP550 (SEQ IDNO:48)和 oBP551(SEQ ID NO:49)。正確的轉(zhuǎn)化子被選為菌株 CEN.PK113-7D Aura3::loxPΔhis3 Δpdc6 Δpdcl::1lvDSm_URA3。CEN.PK 113-7D Δ ura3::1oxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl::1lvDSm_URA3 過夜生長在YPD中并在30°C接種至包含5-氟-乳清酸(0.1 % )的合成完全培養(yǎng)基上，以選擇失去了 URA3標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子的分離物。所述roCl的缺失、iIvDSm的整合以及標(biāo)記移除通過PCR和測序來確認(rèn)，所用引物為oBP511(SEQ IDNO:46)和oBP512(SEQ ID N0:47)，所用的基因
組 DNA 用GeiilTaI1'丨)uregene'!) Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。正確的分離物被選為菌株CEN.PK 113-7D Δ ura3::1oxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl::1lvDSm并命名為 BP907。PDC5 缺失 sadB 糖合所述PDC5基因被刪除并被sadB編碼區(qū)替換，所述編碼區(qū)來自木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。對(duì)于F1DCS缺失-sadB整合的PCR盒的一個(gè)片段首先克隆到質(zhì)粒PUC19-URA3MCS中。pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含處于多克隆位點(diǎn)(MCS)內(nèi)的URA3基因，其來自釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。pUC19包含pMBl復(fù)制子和一個(gè)編碼β-內(nèi)酸胺酶的基因，該基因負(fù)責(zé)在大腸桿菌中的復(fù)制與選擇。除URA3的編碼序列外，該基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表達(dá)URA3。所述載體能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合載體。所述DNA涵蓋了 URA3編碼區(qū)，連同URA3編碼區(qū)上游250bp和下游150bp，所述序列來自釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae),使用HighFidelity PCR MasterMix (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA), CEN.PK113-7D 基因座 DNA 使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物 oBP438(SEQ ID NO:12)，其包含 BamH1、Asc1、PmeI 和 Fsel，和 oBP439 (SEQ IDNO: 13)，其包含 Xba1、PacI 和 NotI 限制性位點(diǎn)?；蚪M DNA 用Gentra Puregene] Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。在使用BamHI和XbaI消化后，所述PCR產(chǎn)物和pUC19(SEQ ID NO: 143)用T4DNA連接酶連接生成載體pUC19_URA3MCS。所述載體通過PCR 和測序確認(rèn)，所用引物為 oBP264(SEQ ID NO:10)和 oBP265 (SEQ ID NO:11)

所述sadB編碼序列和PDC5片段B克隆到pUC19_URA3MCS生成PDC5A-sadB_BUCPCR盒的sadB-BU部分。所述sadB編碼序列擴(kuò)增以pLH468_sadB (SEQ ID NO:67)作為模板，所用引物為oBP530(SEQ ID NO:50)，其包含AscI限制性位點(diǎn)，和引物oBP531 (SEQ IDN0:51)，其包含與roC5片段B的5'端同源的5'尾。TOC5片段B使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP532(SEQ ID NO:52)，其包含與sadB的3'端同源的5'尾，和引物oBP533 (SEQID NO:53),其包含 PmeI 限制性位點(diǎn)。使用 PCR Purif ication 試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)純化PCR產(chǎn)物。sadB-PDC5片段B通過重疊PCR生成，通過混合sadB片段U和TOC5片段B并用引物oBP530(SEQID NO:50)和oBP533 (SEQ ID NO:53)進(jìn)行擴(kuò)增。在用合適的酶消化后，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)AscI和PmeI消化用T4DNA連接酶連接到pUC19_URA3MCS對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)上。sadB-片段B-片段U擴(kuò)增以所得質(zhì)粒作為模板，所用引物為oBP536(SEQ ID NO:54)和oBP546(SEQ ID NO:55)，其包含與TOC5片段C的Y端同源的Y尾。TOC5片段C使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增:引物oBP547(SEQ ID NO:56)，其包含與roC5sadB_片段B-片段U的3'端同源的5'尾，和引物oBP539(SEQ ID NO:57)。使用PCR Purification試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化PCR產(chǎn)物。PDC5 sadB-片段B-片段U-片段C通過重疊PCR生成，通過混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO:54)和oBP539(SEQ ID NO:57)進(jìn)行擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過GelExtraction 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化。PDC5A-sadB_BUC 盒(SEQ ID NO: 144)通過擴(kuò)增H)C5 sadB-片段B-片段U-片段C生成，所用引物為oBP542 (SEQID NO: 58)，其包含與原生H)C5編碼序列上游50個(gè)核苷酸同源的5'尾，和oBP539(SEQ ID NO:57)。使用PCR Purif ication 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化 PCR 產(chǎn)物。制備CEN.PK 113-7D Δ ura3::1oxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl::1lvDSm 的感受態(tài)細(xì)胞，并用 F1DCSA-SadB-BUC PCR 盒轉(zhuǎn)化，使用 Frozen-EZ YeastTransformation II 試劑盒(Zymo Research Corporation, Irvine, CA)。轉(zhuǎn)化混合物在30°C接種至缺乏尿卩密唳輔以I %乙醇(無葡萄糖)的葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上。具有pdc5敲除sadB整合的轉(zhuǎn)化子用PCR進(jìn)行篩選，所用引物為oBP540(SEQ ID NO:59)和oBP541 (SEQ ID N0:60)，所用的基因組 DNA 用Gentra Puregene Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。
來自分離物的roc5基因的缺乏通過PCR陰性結(jié)果來證明，所用rocs編碼區(qū)的特異性引物為 oBP552(SEQ ID NO:61)和 oBP553(SEQ ID NO:62)。正確的轉(zhuǎn)化子被選為菌株 CEN.PK113-7D Δura3::1oxP Δhis3 Δpdc6Δpdcl::1lvDSmΔpdc5::sadB_URA3。

CEN.PK I I 3 - 7 D Aura3::loxP Δ h i s 3 Δ p d c 6Δ pdcl::1lvDSmΔ pdc5:: sadB_URA3 過夜生長在 YPD (0.1 % 乙醇)中并在 30 °C 接種至合成完全培養(yǎng)基上，輔以乙醇(無葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1% )，以選擇失去了 URA3標(biāo)記的分離物。所述H)C5缺失、sadB整合以及標(biāo)記移除是通過PCR確認(rèn)的，所用引物為 oBP540 (SEQ ID NO:59)和 oBP541 (SEQ IDNO:60)，所用的基因組 DNA 用Gentra1' PuregeneU Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。所述正確的分離物被選為菌株 CEN.PK 113-7D Δ ura3::1oxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl::1lvDSmApdc5::sadB 并命名為 BP913。GPD2 缺失為刪除內(nèi)源的GPD2 編碼區(qū)，gpd2::loxP-URA3-loxP 盒(SEQ ID NO:145)以 PCR擴(kuò)增自 loxP-URA3-loxP模板DNA(SEQ ID NO:68)。1oxP-URA3_1oxP 包含(ATCC N0.77107)URA3標(biāo)記，其側(cè)翼序列為1xP重組酶位點(diǎn)。使用PllllSion'" DNA聚合酶(New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物 LA512 與 LA513 (SEQ ID N0:8 和 9)完成 PCR。所述每個(gè)引物的GPD2部分來源于GPD2編碼區(qū)上游5丨區(qū)和編碼區(qū)下游3丨區(qū)，使得1oxP-URA3_1oxP標(biāo)記的整合導(dǎo)致GPD2編碼區(qū)的替換。所述PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到BP913并且轉(zhuǎn)化子在缺乏尿嘧啶的輔以1%乙醇(無葡萄糖)的合成完全培養(yǎng)基上篩選。采用PCR驗(yàn)證篩選的轉(zhuǎn)化子的正確整合，所用引物為OBP582和AA270 (SEQ ID NO:63和64)。所述URA3標(biāo)記的循環(huán)是通過轉(zhuǎn)化pRS423::PGALl-cre(SEQ ID NO:66)并在30°C接種至缺乏組氨酸，輔以1%的乙醇的合成完全培養(yǎng)基上。將轉(zhuǎn)化子劃線接種至輔以I %的乙醇的，并包含5-氟-乳清酸(0.1 % )的合成完全培養(yǎng)基上，并且在30°C孵育以選擇失去了 URA3標(biāo)記的分離物。抗5-氟-乳清酸的分離物生長在YPE(1 %乙醇)上以移除PRS423:: PGAL1-ere質(zhì)粒。所述缺失和標(biāo)記移除通過PCR確認(rèn)，所用引物為oBP582 (SEQ ID NO:63)和 oBP591 (SEQ ID NO:65)。正確的分離物被選為菌株 CEN.PK113-7D Δ ura3::1oxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl::1lvDSm Δ pdc5:: sadB Δ gpd2::1oxP 并命名為 PNY1503(BP1064)。用質(zhì)粒pYZ090(SEQ ID NO:1)和 pLH468 (SEQ ID NO:2)轉(zhuǎn)化 BP1064 以形成菌株NGC1-070(BP1083 ；PNY1504)。菌株NYLA74、NYLA83 和 NYLA84 的構(gòu)律釀酒酵母內(nèi)源roci和roc6基因的插入失活。pdc1、pdcs和roc6基因編碼丙酮酸脫羧酶的三種主要異構(gòu)酶，如下文所述:pRS425::GPM~sadB 的構(gòu)律克隆編碼來自木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)的丁醇脫氫酶(SEQ ID NO:70)的DNA片段( 公開于美國專利公開申請(qǐng)公布2009/0269823)。這個(gè)基因編碼區(qū)稱為sadB，用于仲醇脫氫酶(SEQ ID NO:69)，它使用來自木糖氧化無色桿菌(A.xylosoxidans)基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行擴(kuò)增，所述基因組DNA使用CentraK Puregene 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA),按照用于革蘭氏陰性菌生物的推薦規(guī)程，分別使用正向和反向引物Ν473和N469(SEQ ID NO:74和75)進(jìn)行制備。將PCR 產(chǎn)物 TOPO -Blunt 克隆至pCR 4BLUNT (Invitrogen , Carlsbad, CA),從而得到pCR4Blunt:: sadB,然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Mach-1細(xì)胞。隨后從四個(gè)克隆中分離質(zhì)粒并確認(rèn)序列。sadB編碼區(qū)從pCR4Blunt:: sadB中PCR擴(kuò)增得到。PCR引物包含附加的5’序列，其將與酵母GPMl啟動(dòng)子和ADHl終止子(N583和N584，以SEQ ID NO:76和77提供)重疊。然后使用“缺口修復(fù)”方法在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (Ma等人，Gene58:201-216,1987)中如下克隆PCR產(chǎn)物。包含GPMl啟動(dòng)子(SEQ ID N0:72)、來自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的 kivD 編碼區(qū)(SEQ ID NO: 71)、和 ADHl 終止子(SEQ ID NO:73)的酵母-大腸桿菌穿梭載體pRS425::GPM::kivD::ADH(描述于美國專利公開申請(qǐng)公布2007/0092957A1的實(shí)施例17中)用BbvCI和PacI限制性酶消化以釋放kivD編碼區(qū)。將大約Iyg剩余的載體片段與I μ gsadB PCR產(chǎn)物一起轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株BY4741中。在缺乏亮氨酸的合成完全培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。生成pRS425::GPM-sadB的合適重組事件通過使用引物N142和N459(SEQ ID N0:108和109)的PCR來確認(rèn)。pdc6::PGPMl~sadB整合盒和PDC6缺失的構(gòu)津:
通過將來自pRS425::GPM-sadB(SEQ ID NO:78)的 GPM-sadB-ADHt 片段(SEQ IDNO:79)與來自 pUC19-URA3r 的 URA3r 基因相連制備 pdc6::PGPMl-sadB-ADHlt-URA3r 整合盒。pUC19-URA3r(SEQ ID NO:80)包含來自 pRS426 (ATCC N0.77107)的 URA3 標(biāo)記，該標(biāo)記偵_為75bp的同源重復(fù)序列，以允許體內(nèi)同源重組和URA3標(biāo)記移除。以pRS425:: GPM-sadB和 pUC19_URA3r 質(zhì)粒 DNA 作為模板，使用 Pluisioilie DNA 聚合酶(New England BioLabsInc., Ipswich, MA)和引物 114117-11Α 至 114117-11D (SEQ ID NO:81、82、83 和 84)，以及114117-13A和114117-13B(SEQ ID NO:85 和 86)，通過重疊延伸 PCR(S0E PCR)(如 Horton等人，Gene 77:61_68所述，1989)將上述兩種DNA片段相連。SOE PCR 的外側(cè)引物(114117-13A 和 114117-13B)包含 5'和 3' 50bp 分別與H)C6啟動(dòng)子和終止子的上游和下游區(qū)域同源的區(qū)域。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methods inYeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY,第201-202頁)，將完整的盒PCR片段轉(zhuǎn)入了 BY4700(ATCC N0.200866)，并且將轉(zhuǎn)化體在30°C培養(yǎng)于不含尿嘧啶且補(bǔ)充了 2%葡萄糖的合成的完全培養(yǎng)基上。使用引物112590-34G和 112590-34H(SEQ ID NO:87 和 88)，以及 112590-34F 和 112590-49E (SEQID N0:89 和 90)通過PCR篩選轉(zhuǎn)化體，以確定在帶有H)C6編碼區(qū)的缺失的H)C6基因座的整合。通過按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在30°c涂布于補(bǔ)充2%葡萄糖和5-F0A的合成完全培養(yǎng)基上，對(duì)所述URA3r標(biāo)記進(jìn)行回收利用。通過將來自上述5-F0A平板的菌落接種至SD-URA培養(yǎng)基上，生長的被抑制確認(rèn)了標(biāo)記移除。得到的經(jīng)過鑒定的菌株具有下列基因型:BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADHlt。pdcl::PPDCl-1lvD糖合盒和PDCl缺失的構(gòu)律:利用SOE PCR(如 Horton 等人，Gene 77 =61-68,1989 所述)，通過將來自pLH468 (SEQ ID NO:2)的 ilvD-FBAlt 片段(SEQ ID NO:91)與來自 pUC19_URA3r 的 URA3r基因相連制備pdcl::PPDCl-1lvD-FBAlt-URA3r整合盒，其中所述SOE PCR以pLH468和pUC19_URA3r 質(zhì)粒 DNA 作為模板，使用 PliusicniK DNA 聚合酶(New England BioLabs Inc.,Ipswich, MA)和引物 114117-27A 至 114117-27D(SEQ ID NO:111、112、113 和 114)進(jìn)行。SOE PCR 的外側(cè) 引物(114117-27A 和 114117-27D)包含 5 '和 3' 50bp 與PDCI啟動(dòng)子的下游區(qū)域和roci編碼序列的下游區(qū)域同源的區(qū)域。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold SpringHarbor, NY,第 201-202 頁)，將完整的盒PCR片段轉(zhuǎn)入了 BY4700 pdc6:: PGPMl-sadB-ADHlt，并且將轉(zhuǎn)化體在30°C培養(yǎng)于不含尿嘧啶且補(bǔ)充了 2%葡萄糖的合成的完全培養(yǎng)基上。使用引物 114117-36D 和 135 (SEQ ID NO:92 和 93)，以及引物 112590-49E 和 112590_30F(SEQID NO:90和94)通過PCR篩選轉(zhuǎn)化體，以確定在帶有I3DCl編碼序列的缺失的I3DCl基因座的整合。通過按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在30°C涂布于補(bǔ)充2%葡萄糖和5-F0A的合成完全培養(yǎng)基上，對(duì)所述URA3r標(biāo)記進(jìn)行回收利用。通過將來自上述5-F0A平板的菌落接種至SD-URA培養(yǎng)基上，生長的被抑制確認(rèn)了標(biāo)記移除。得到的經(jīng)過鑒定的菌株“NYLA67”具有下列基因型:BY4700 pdc6::PGPMl-sadB-ADHlt pdcl::PPDCl_ilvD_FBAlt。HI S3 缺失為了刪除內(nèi)源HIS3編碼區(qū)，his3::URA3r2盒以PCR擴(kuò)增自URA3r2模板DNA(SEQID NO:95)。URA3r2 包含來自 pRS426 (ATCC N0.77107) URA3 標(biāo)記，該標(biāo)記側(cè)翼為 500bp 的同源重復(fù)序列，以允許體內(nèi)同源重組和URA3標(biāo)記移除。使用Phusion DNA聚合酶(NewEngland BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物 114117-45A 與 114117_45B(SEQ ID NO:96和97)完成PCR，其產(chǎn)生 2.3kb的PCR產(chǎn)物。所述每個(gè)引物的HIS3部分來源于HIS3啟動(dòng)子上游5'區(qū)和編碼區(qū)下游3'區(qū)，使得URA3r2標(biāo)記的整合導(dǎo)致HIS3編碼區(qū)的替換。利用標(biāo)準(zhǔn)遺傳學(xué)技術(shù)(Methods in Yeast Genetics, 2005, ColdSpring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY,第 201-202 頁)，將 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 NYLA67 中，并將轉(zhuǎn)化體在30°C培養(yǎng)于不含尿嘧啶且補(bǔ)充了 2%葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上。通過在30°C下將轉(zhuǎn)化子重復(fù)接種至缺乏組氨酸并補(bǔ)充有2%葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上來篩選轉(zhuǎn)化子以驗(yàn)證整合正確。通過按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在30°C下置于補(bǔ)充有2%葡萄糖和5-F0A的合成完全培養(yǎng)基上再利用URA3r標(biāo)記。通過將來自上述5-F0A平板的菌落接種至SD-URA培養(yǎng)基上，生長的被抑制確認(rèn)了標(biāo)記移除。得到的經(jīng)過鑒定的菌株NYLA73具有下列基因型:BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADHlt pdcl::PPDCl_ilvD_FB Alt Ahis3。pdc5:: kanMX整合倉和PDC5缺失的構(gòu)建:利用Pliusion l! DNA 聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich, MA)和引物PDC5::KanMXF 與 PDC5::KanMXR(SEQ ID NO:98 和 99)，從菌株 YLRl34W 染色體 DNA (ATCCN0.4034091)PCR擴(kuò)增了 pdc5::kanMX4盒，產(chǎn)生了 2.2kb PCR產(chǎn)物。所述每個(gè)引物的TOC5部分來源于roC5啟動(dòng)子上游5'區(qū)和編碼區(qū)下游3'區(qū)，使得kanMX4標(biāo)記的整合導(dǎo)致roC5編碼區(qū)的替換。利用標(biāo)準(zhǔn)遺傳技術(shù)(Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold SpringHarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，第 201-202 頁)將 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 NYLA73中，并且在補(bǔ)充I %乙·醇和遺傳霉素(200yg/mL)的YP培養(yǎng)基上，在30°C下選擇轉(zhuǎn)化體。使用引物PDC5kofor和N175(SEQ IDN0:100和101)，通過PCR篩選轉(zhuǎn)化體以驗(yàn)證在帶有PDC5編碼區(qū)替換的PDC基因座的正確整合。經(jīng)過鑒定的正確的轉(zhuǎn)化體具有下列基因型:BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADHlt pdcl::PPDCl_ilvD_FBAlt Ahis3 pdc5::kanMX4。該菌株命名為NYLA74。將質(zhì)粒載體pRS423:: CUPl-alsS+FBA-budA 和 pRS426::FBA-budC+GPM-sadB 轉(zhuǎn)化進(jìn)NYLA74以產(chǎn)生產(chǎn)丁二醇菌株(NGC1-047)。將質(zhì)粒載體pLH475-Z4B8 (SEQ ID NO:140)和pLH468轉(zhuǎn)化進(jìn)NYLA74以產(chǎn)生產(chǎn)異丁醇菌株(NGC1-049)。HXK2(己糖激酶II)的缺失:利用Pliusion* DNA聚合酶(New England BioLabs Inc., Ipswich,MA)和引物 384與 385 (SEQ ID NO: 102 和 103)，從 URA3r2 模板(如上所述)PCR 擴(kuò)增了 hxk2::URA3r 盒，產(chǎn)生了 2.3kb PCR產(chǎn)物。所述每個(gè)引物的HXK2部分來源于HXK2啟動(dòng)子上游Y區(qū)和編碼區(qū)下游3'區(qū)，使得URA3r2標(biāo)記的整合導(dǎo)致HXK2編碼區(qū)的替換。利用標(biāo)準(zhǔn)遺傳技術(shù)(Methods in YeastGenetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, NY,第201-202頁)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到NYLA73中，并且在缺乏尿嘧啶且補(bǔ)充2 %葡萄糖的合成完全培養(yǎng)基上，在30°C下選擇轉(zhuǎn)化體。使用引物N869和N871(SEQ ID NO:104和105)，通過PCR篩選轉(zhuǎn)化體以驗(yàn)證在帶有HXK2編碼區(qū)替換的HXK2基因座的正確整合。通過按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在30°C涂布于補(bǔ)充2%葡萄糖和5-F0A的合成完全培養(yǎng)基上，對(duì)所述URA3r2標(biāo)記進(jìn)行回收利用。通過將來自上述5-F0A平板的菌落接種至SD-URA培養(yǎng)基上，生長的抑制確認(rèn)了標(biāo)記移除，并且使用引物N946和N947(SEQ ID NO:106和107)，通過PCR來驗(yàn)證正確的標(biāo)記移除。得到的經(jīng)過鑒定的菌株命名為NYLA83，其具有下列基因型:BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADHlt pdcl::PPDCl_ilvD_FBAlt Ahis3 Ahxk2。pdc5:: kanMX糖合盒和PDC5缺失的構(gòu)律:如上所述通過PCR擴(kuò)增pdc5::kanMX4盒。將PCR片段轉(zhuǎn)化到NYLA83中并如上所述選擇和篩選轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過鑒定的正確的轉(zhuǎn)化體命名為NYLA84，其具有下列基因型:BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADHlt pdcl::PPDCl-1IvD-FBAlt Δhis3 Δhxk2 pdc5::kanMX4。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methodsin Yeast Genetics, 2005, Cold SpringHarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY),將質(zhì)粒載體 pLH468 和 pLH532 同時(shí)轉(zhuǎn)入了菌株 NYLA84(BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADHltpdcl::PPDCl-1lvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2pdc5::kanMX4)，并將所得“產(chǎn)丁醇菌株NYLA84”在30°C培養(yǎng)于不含組氨酸和尿嘧啶且補(bǔ)充了 I %乙醇的合成完全培養(yǎng)基上。表汰裁體dLH468構(gòu)建了用于在酵母中表達(dá)DHAD、KivD和HADH的pLH468質(zhì)粒(SEQID NO:2)并在美國專利公開申請(qǐng)公布2009/0305363中進(jìn)行了描述，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。構(gòu)建PLH486以包含:嵌合基因，其具有來自變異鏈球菌(Streptococcus mutans)的ilvD基因編碼區(qū)(nt位置3313-4849)，所述表達(dá)DHAD編碼區(qū)從釀酒酵母FBAl啟動(dòng)子(nt 2109-3105)接著FBAl終止子(nt 4858-5857);嵌合基因，其具有密碼子優(yōu)化的馬肝乙醇脫氫酶編碼區(qū)(nt 6286-7413)，所述表達(dá)ADH編碼區(qū)從釀酒酵母GPMl啟動(dòng)子(nt7425_8181)接著ADHl終止子(nt 5962-6277);以及嵌合基因,其具有來自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的密碼子優(yōu)化的kivD基因編碼區(qū)(nt9249-10895)，所述表達(dá)KivD基因編碼區(qū)從TDH3啟動(dòng)子(nt 10896-11918)接著 TDH3 終止子(nt 8237-9235)?；谠卺劸平湍钢械谋磉_(dá)優(yōu)化的密碼子，由DNA2.0, Inc.(Menlo Park, CA)合成乳酸乳球菌酮異戊酸脫羧酶(Ki vD)和馬肝臟醇脫氫酶(HADH)編碼區(qū)(分別是SEQ ID NO:71和118)，并且提供于質(zhì)粒pKivDy-DNA2.0和pHadhy_DNA2.0中。所編碼的蛋白質(zhì)分別為SEQ ID N0:117和119。構(gòu)建了 KivD和HADH單獨(dú)的表達(dá)載體。為了裝配pLH467 (pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t)，用 AscI 和 SfiI 酶消化載體 pNY8 (SEQID NO:121 ;也稱為 pRS426.GPD-ald-GPDt，描述于美國專利公開申請(qǐng)公布2008/0182308的實(shí)施例17中，該申請(qǐng)以引用方式并入本文)用AscI和SfiI酶消化，從而切除GH)啟動(dòng)子和aid編碼區(qū)。用5’引物0T1068 和 3’引物 0T1067(SEQ ID NO:123 和 124)對(duì)來自 pNY8 的 TDH3 啟動(dòng)子片段(SEQIDNO:122)進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增，以在5’端加上一個(gè)AscI位點(diǎn)，并在3’端加上一個(gè)SpeI位點(diǎn)。將所述經(jīng)Ascl/Sfil消化的pNY8載體片段，與經(jīng)AscI和SpeI消化的TDH3啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物，以及分離自載體pKivD-DNA2.0的包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的kivD編碼區(qū)的Spe1-SfiI片段相連接。這種三方連接產(chǎn)生了載體pLH467(pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t)。通過限制性圖譜和測序?qū)LH467進(jìn)行驗(yàn)證。pLH435 (pRS425:: PGPMl-Hadhy-ADHlt)來源于載體 pRS425:: GPM-sadB (SEQ IDNO:78)，它在美國臨時(shí)申請(qǐng)61/058，970的實(shí)施例3中進(jìn)行了描述，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。pRS425::GPM-sadB是具有嵌合基因的pRS425載體(ATCC N0.77106)，該嵌合基因包含 GPMl 啟動(dòng)子(SEQ ID NO:72)、來自木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)的丁醇脫氫酶編碼區(qū)(sadB ；DNA SEQ ID NO:69 ;蛋白質(zhì)SEQID NO:70:公開于美國專利公開申請(qǐng)公布 2009/0269823)、和 ADHl 終止子(SEQ ID NO:73)。pRS425::GPMp_sadB 在所述sadB編碼區(qū)的5'和3'端分別包含BbvI和PacI位點(diǎn)。通過利用引物0T1074和0T1075(SEQ ID NO: 126和127)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，在上述sadB編碼區(qū)的5’端加上了一個(gè)NheI位點(diǎn)，從而產(chǎn)生載體pRS425-GPMp-sadB-NheI，該載體通過測序驗(yàn)證。用NheI和PacI消化pRS425:: PGPMl-sadB-Nhel以釋放出sadB編碼區(qū)，并將來自載體pHadhy_DNA2.0的包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的HADH編碼區(qū)的Nhe1-PacI片段與上述經(jīng)消化的質(zhì)粒連接，從而得到pLH435。用SacI和NotI消化了酵母載體pRS411 (ATCC N0.87474)，并在三方連接反應(yīng)中，將上述經(jīng)消化的載體與來自PLH467的包含PTDH3-kivDy-TDH3t盒的Sac1-SalI片段和來自pLH435的包含PGPMl-Hadhy-ADHlt表達(dá)盒的Sal1-NotI片段相連接，以將KivD和HADH表達(dá)盒組合于同一載體中。這樣就產(chǎn)生了載體PRS411:: PTDH3-ki vDy-PGPMl-Hadhy (pLH441)，該載體經(jīng)過了限制性圖譜驗(yàn)證。為了構(gòu)建下游的異丁醇途徑:ilvD、kivDy和Hadhy中的全部三種基因的一種共表達(dá)載體，使用描述于美國專利申請(qǐng)公布2010/0081154中的pRS423FBA ilvD(鏈球菌的)(SEQ ID NO:128)作為IlvD基因的來源。這種穿梭載體包含在大腸桿菌中共生所需的Fl復(fù)制起點(diǎn)(nt 1423至1879)和在酵母中復(fù)制所需的2微米起點(diǎn)(nt 8082至9426)。該載體含有 FBAl 啟動(dòng)子(nt 2111 至 3108 ；SEQ ID NO:120)和 FBA 終止子(nt 4861 至 5860 ；SEQ ID NO: 129) ο此外，它還攜帶用于在酵母中進(jìn)行選擇的His標(biāo)記(nt 504至1163)和用于在大腸桿菌中進(jìn)行選擇的氨芐青霉素抗性標(biāo)記(nt 7092至7949)。來自變異鏈球菌(Streptococcus mutans) UA159 (ATCC#700610)的 ilvD 編碼區(qū)(nt 3116 至 4828 ;SEQ IDNO:115 ;蛋白質(zhì)SEQ ID NO:116)位于上述FBA啟動(dòng)子和FBA終止子之間，從而構(gòu)成了一個(gè)用于表達(dá)的嵌合基因。此外，ilvD編碼區(qū)還融合了 Iumio標(biāo)簽(nt 4829-4849)。第一步是用SacI 和 SacII 將 pRS423FBA iIvD(Strep)(也叫做pRS423_FBA (SpeI)-1lvD (變異鏈球菌(Streptococcus mutans)) -Lumio)線性化(并利用T4 DNA聚合酶將SacII位 點(diǎn)平末端化)，從而得到全長為9，482bp的載體。第二步是用SacI和KpnI (利用T4DNA聚合酶將KpnI位點(diǎn)平末端化)從pLH441分離出kivDy-hADHy盒，得到6，063bp的片段。將該片段與來自pRS423_FBA(SpeI)-1lvD(變異鏈球菌(Streptococcus mutans))-Lumio的9，482bp載體片段相連接。如此產(chǎn)生了載體pLH468(pRS423::PFBAl-1IvD(Strep)Lumio-FBAlt-PTDH3-kivDy-TDH3t-PGPMl-hadhy-ADHIt)，該載體經(jīng)過了限制性圖譜和測序確認(rèn)。PLH532 的構(gòu)律構(gòu)建pLH532質(zhì)粒(SEQ ID NO:130)以在酵母中表達(dá)ALS和KARI。pLH532是一種包含下列嵌合基因的PHR81載體(ATCC N0.87541):1) CUPl啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 139)，來自枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合酶編碼區(qū)(AlsS ;SEQ ID NO:137 ;蛋白質(zhì)SEQ ID NO: 138)和CYCl 終止子 2 (SEQID NO: 133) ;2)ILV5 啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 134)，Pf 5.1lvC 編碼區(qū)(SEQIDNO: 132)和 ILV5 終止子(SEQ ID NO: 135);以及 3) FBAl 啟動(dòng)子(SEQID NO: 136)，釀酒酵母KARI 編碼區(qū)(ILV5 ；SEQ ID NO:131);和 CYCl 終止子。所述Pf5.1lvC編碼區(qū)系一段編碼來自熒光假單胞菌的KARI的序列，其被描述于美國專利申請(qǐng)公布2009/0163376中，該專利以引用方式并入本文。上述Pf5.1lvC編碼區(qū)是基于針對(duì)在釀酒酵母中的表達(dá)優(yōu)化的密碼子，利用DNA2.0, Inc.(Menlo Park, CA ；SEQ ID NO:132)合成的。PYZ090 的構(gòu)律pYZ090 (SEQ ID NO:1)基于pHR81 (ATCC N0.87541)主鏈被構(gòu)建成包含具有得自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的alsS基因編碼區(qū)的嵌合基因(nt位點(diǎn)457-2172)，它從酵母CUPl啟動(dòng)子(nt 2-449)開始表達(dá)并后接CYCl終止子(nt 2181-2430)以表達(dá)，并且具有得自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的ilvC基因編碼區(qū)的嵌合基因(nt 3634-4656)，它從酵母ILV5啟動(dòng)子(2433-3626)開始表達(dá)并后接ILV5終止子(nt4682-5304)以表達(dá) KARI。PYZ067 的構(gòu)律構(gòu)建pYZ067以包含以下嵌合基因:I)得自變異鏈球菌(S.mutans) UA159的ilvD基因編碼區(qū)(nt位點(diǎn)2260-3971)，該標(biāo)記從酵母FBAl啟動(dòng)子(nt 1161-2250)開始表達(dá)，后接FBA終止子(nt 4005-4317)，用于表達(dá)二羥酸脫水酶(DHAD)，2)馬肝ADH(nt4680-5807)編碼區(qū)，它從酵母GPM啟動(dòng)子(nt 5819-6575)開始表達(dá)，后接ADHl終止子(nt 4356-4671),用于表達(dá)醇脫氫酶，和3)得自乳酸乳球菌(Lacrococcus lactis) (nt7175-8821)的KivD基因編碼區(qū)，它從酵母TDH3啟動(dòng)子(nt 8830-9493)開始表達(dá)，后接TDH3終止子(nt 5682-7161)，用于表達(dá)酮異戊酸脫羧酶。pRS423:: CUPl-alsS+FBA-budA和 dRS426::FBA-budC+GPM_sadB和 dLH475_Z4B8 的構(gòu)建pRS423:: CUPl-alsS+FBA-budA和 pRS426::FBA-budC+GPM_sadB和 pLH475_Z4B8 的構(gòu)建在美國專利公開申請(qǐng)公布2009/0305363中進(jìn)行了描述，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。此外，盡管本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案已如上描述，但是應(yīng)當(dāng)理解它們僅以舉例的方式存在并不受限制。對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見的是能夠在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍下能夠?qū)ζ溥M(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的多種變型。因此，本發(fā)明的廣度和范圍應(yīng)不受任何上述示例性實(shí)施方案的限制，但應(yīng)僅僅根據(jù)以下權(quán)利要求及其等同物限定。在本說明書中提及的所有公布、專利和專利申請(qǐng)均指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平，并且以引用方式并入本文至如同每個(gè)單獨(dú)的公布、專利或?qū)＠暾?qǐng)被具體且單獨(dú)地指明為以引用方式并入的相同程度。實(shí)施例以下非限制性實(shí)施例將進(jìn)一步示出本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，雖然以下實(shí)施例涉及作為原料的玉米和作為羧酸的C0FA，在不脫離本發(fā)明的前提下，可使用其他生物質(zhì)來源作為原料和除COFA之外可用作羧酸的酸。此外，雖然以下實(shí)施例涉及丁醇和丁酯生產(chǎn)，在不脫離本發(fā)明的前提下，可生產(chǎn)其他醇包括乙醇和醇酯。如本文所用，使用的縮寫含義如下:如本文所用，使用的縮寫含義如下:“g”指克，“kg”指千克，“L”指升，“mL”指毫升，“ μ L”指微升，“mL/L”指毫升每升，“mL/min”指毫升每分鐘，“DI ”指去離子，“uM”指微米，“nm”指納米，“w/v”指重量/體積，“0D”指光密度，"OD600"指在波長600nM的光密度，“dew”指干細(xì)胞重量，“rpm”指每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“ V ”指攝氏度，“℃/min”指每分鐘攝氏度，“slpm”指標(biāo)準(zhǔn)升每分鐘，“ppm”指每百萬份數(shù)，“pdc”指丙酮酸脫羧酶酶數(shù)。一般方法
種子瓶牛.長釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株經(jīng)工程化以從碳水化合物源中產(chǎn)生異丁醇，該菌株缺失pdcl、缺失pdc5、并且缺失pdc6,它在種子燒瓶中從冷凍培養(yǎng)物生長至 0.55-1.lg/L 干細(xì)胞重量(0D_ 1.3-2.6-ThermoHelios a Thermo Fisher ScientificInc., Waltham,Massachusetts)。所述培養(yǎng)物在以300rpm旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)箱中在26°C下生長。所述冷凍培養(yǎng)物之前在-80°C貯存。第一種子燒瓶培養(yǎng)基的組成是:3.0g/L 右旋糖3.0g/L無水乙醇3.7g/L ForMedium Synthetic Complete Amino Acid(Kaiser)Drop-Out:無HIS，無 URA(參考號(hào) DSCK162CK)6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base,無氛基酸(N0.291920)將來自第一種子燒瓶培養(yǎng)物的十二毫升樣品轉(zhuǎn)移到2L燒瓶中并在30°C下以300rpm旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)箱中生長。第二種子燒瓶具有220mL的以下培養(yǎng)基:30.0g/L 右旋糖 5.0g/L無水乙醇3.7g/L ForMedium Synthetic Complete Amino Acid(Kaiser)Drop-Out:無HIS，無 URA(參考號(hào) DSCK162CK)6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base,無氛基酸(N0.291920)0.2M MES 緩沖液滴定至 pH 5.5-6.0所述培養(yǎng)物生長至0.55-1.lg/L干細(xì)胞重量(0D_ 1.3-2.6)。在這一細(xì)胞濃度加入30mL包含200g/L蛋白胨和100g/L酵母提取物的溶液。然后加入300mL 0.2uM過濾除菌的Cognis，將90-95%油醇加到燒瓶中。所述培養(yǎng)物在收獲之前繼續(xù)生長至> 4g/L干細(xì)胞重量(OD6qq > 10)并加到發(fā)酵中。發(fā)酵準(zhǔn)備初始發(fā)酵容器準(zhǔn)備向帶玻璃夾套的2L 發(fā)酵容器(Sartorius AG,Goettingen,Germany)加水至 66%的液化重量。pH 探針(Hamilton Easyferm Plus K8,部件號(hào):238627, Hamilton BonaduzAG, Bonaduz, Switzerland)通過 Sartorius DCU-3 ControlTower Calibration 菜單進(jìn)行校準(zhǔn)。零在pH = 7時(shí)校準(zhǔn)?？缍仍趐H = 4時(shí)校準(zhǔn)。然后通過不銹頂板將探針置于發(fā)酵容器中。也將溶解氧探針(PO2探針)通過頂板置于發(fā)酵容器中。用于遞送營養(yǎng)素、種子培養(yǎng)物、提取溶劑、和堿的管與頂板相連并且末端被箔封。T將整個(gè)發(fā)酵容器置于Steris (SterisCorporation, Mentor, Ohio)高壓爸中并在液體循環(huán)中滅菌30分鐘。從高壓釜中移出發(fā)酵容器并置于負(fù)載傳感器上。將夾套水供應(yīng)和回流管線分別連接到殼水和清潔排水上。將冷凝器冷卻水的進(jìn)水管和排水管連接到7°C運(yùn)行的6-L再循環(huán)溫浴上。將從發(fā)酵容器中導(dǎo)氣的排氣管連接到傳送管上，所述傳送管與Thermo質(zhì)譜儀(Prima dB, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts)相連。將噴灑管與供氣管相連。將加入營養(yǎng)素、種子培養(yǎng)物、提取溶劑、和堿的管向下通過泵或夾住閉合。用熱電偶和室水循環(huán)環(huán)流反應(yīng)器將發(fā)酵容器溫度控制在55°C。潤濕的玉米籽粒(#2馬齒種黃玉米)用帶1.0mm篩網(wǎng)的錘磨機(jī)碾碎，然后將所得碾碎的全玉米籽粒加入發(fā)酵容器，其加入量為29-30% (干玉米固體重量)的液化反應(yīng)物料。液化前的脂肪酶處理將脂肪酶原液加到發(fā)酵容器中使最終脂肪酶濃度為lOppm。將發(fā)酵容器保持在55°C，300rpm，并且用0.3slpm N2填充上部空間6小時(shí)以上。在完成脂肪酶處理后，如下所述進(jìn)行液化(液化)。ML將α -淀粉酶按照其說明書表單加入發(fā)酵容器，同時(shí)該發(fā)酵容器以300-1200rpm無菌混合，可通過噴射器將罐裝N2以0.3slpm加入。溫度設(shè)置點(diǎn)從55°C變?yōu)?5°C。當(dāng)溫度為80°C以上時(shí)，開始液化烹煮并將液化循環(huán)保持在80°C以上90-120分鐘。在完成液化循環(huán)后將發(fā)酵容器溫度設(shè)置點(diǎn)設(shè)為30°C的發(fā)酵溫度。將隊(duì)從噴射器中再導(dǎo)入頂部空間以防止起泡，不加入化學(xué)消泡劑。液化后的脂肪酶處理在液化循環(huán)結(jié)束后將發(fā)酵容器溫度設(shè)為55°C而不是30°C。通過當(dāng)需要時(shí)成塊加入酸或堿將PH人工控制在pH = 5.8。將脂肪酶原液加到發(fā)酵容器中使最終脂肪酶濃度為IOppm0將發(fā)酵容器保持在55°C，300rpm，并且用0.3slpm N2填充上部空間6小時(shí)以上。在完成脂肪酶處理后，將發(fā)酵容器溫度設(shè)為30°C。脂肪酶加熱失活處理(加熱失活處理方法)將發(fā)酵容器溫度保持在80°C以上15分鐘以上以使脂肪酶失活。在完成熱失活處理后，將發(fā)酵容器溫度設(shè)為30°C。接種前的 營養(yǎng)物質(zhì)添加在接種之前將乙醇(6.36mL/L，接種后體積，200proof，無水)加入發(fā)酵容器。在接種之前加入硫胺素，其最終濃度為20mg/L，并且在接種之前還加入100mg/L煙酸。在接種前加入油醇或S米油脂肪酸在接種后立即加入1L/L(接種后體積)油醇或玉米油脂肪酸。發(fā)酵容器接種當(dāng)將N2加入發(fā)酵容器時(shí)，將發(fā)酵容器p02探針校準(zhǔn)至零。用以300rpm噴射的無菌空氣對(duì)發(fā)酵容器PO2探針的跨度進(jìn)行校準(zhǔn)。在第二種子燒瓶為> 4g/L干細(xì)胞重量后接種發(fā)酵容器。從培養(yǎng)箱/振蕩器中移出搖瓶5分鐘，以使油醇相和水相發(fā)生相分離。將水相(IlOmL)轉(zhuǎn)移到無菌的接種瓶中。將種菌通過蠕動(dòng)泵泵送到發(fā)酵容器中。發(fā)酵容器運(yùn)行條件在整個(gè)生長和生產(chǎn)階段所述發(fā)酵容器在30°C下運(yùn)行。在不加入任何酸的情況下允許pH從5.7-5.9下降至對(duì)照設(shè)置點(diǎn)5.2。用氫氧化銨控制pH用于pH = 5.2的殘留物生長和生產(chǎn)階段。通過噴射器將無菌空氣以0.3slpm加入發(fā)酵容器中以供殘留物的生長和生產(chǎn)階段。通過Sartorius DOJ-3 Control BoxPID控制環(huán)流反應(yīng)器，使用最低設(shè)置在300rpm和最高設(shè)置在2000rpm的攪拌器設(shè)置p02以控制在3.0%。通過加入α -淀粉酶(葡糖淀粉酶)進(jìn)行液化玉米醪的同步糖化和發(fā)酵來供應(yīng)葡萄糖。一旦淀粉可用于糖化，葡萄糖保持過量(l_50g/L)狀態(tài)。分析氣體分析
在 Thermo Prima(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts)質(zhì)譜儀上分析過程氣體。這是相同的工藝氣體，它是無菌的，并且然后被加到每個(gè)發(fā)酵容器中。在相同質(zhì)譜儀上分析每個(gè)發(fā)酵容器的廢氣。這個(gè)ThermoPrima dB在每周一早上6: OOam具有校準(zhǔn)檢查運(yùn)行。通過與質(zhì)譜儀相關(guān)聯(lián)的Gas Works vl.0 (Thermo Fisher ScientificInc., Waltham, Massachusetts)軟件進(jìn)行定期的校準(zhǔn)檢查。校準(zhǔn)氣體用于:
權(quán)利要求
1.方法，包括: 使包含水、可發(fā)酵碳源和油的生物質(zhì)與一種或多種催化劑接觸，從而通過一種或多種催化劑水解所述油的至少一部分以形成提取劑，其中所述可發(fā)酵碳源和所述油均來源于所述生物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物質(zhì)包括玉米粒、玉米棒、作物殘余物、玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動(dòng)物糞肥、以及它們的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述油包含甘油酯，并且其中所述一種或多種催化劑水解所述甘油酯以形成脂肪酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述提取劑包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、或它們的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種催化劑選自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述提取劑對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)大于所述生物質(zhì)的油對(duì)于所述產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括: 在水解所述油的至少一部分之后使所述催化劑失活。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法 ，還包括: 在通過一種或多種催化劑水解之前從所述生物質(zhì)中分離所述油。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括: 在發(fā)酵容器中使所述生物質(zhì)與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸； 發(fā)酵所述生物質(zhì)的碳源以產(chǎn)生產(chǎn)物醇；以及 通過使所述液體培養(yǎng)基與所述提取劑接觸，從所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中原位移除所述產(chǎn)物醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述產(chǎn)物醇是丁醇。
11.生產(chǎn)醇的方法，包括: (a)提供包含水、可發(fā)酵碳源和油的生物質(zhì)； (b)液化所述生物質(zhì)以產(chǎn)生液化的生物質(zhì)； (C)使所述液化的生物質(zhì)與一種或多種催化劑接觸，從而水解所述油的至少一部分以形成提取劑； (d)使所述液化的生物質(zhì)與能夠?qū)⒌途厶寝D(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的糖化酶接觸； (e)在發(fā)酵容器中使所述液化的生物質(zhì)與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸； (f)發(fā)酵所述液化的生物質(zhì)的碳源以產(chǎn)生產(chǎn)物醇； (g)通過使所述液體培養(yǎng)基與所述提取劑接觸，從所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中原位移除所述產(chǎn)物醇； 并且任選地，步驟(C)和(d)同時(shí)發(fā)生。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生物質(zhì)包括玉米粒、玉米棒、作物殘余物、玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動(dòng)物糞肥、以及它們的混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述油包含甘油酯，并且其中所述一種或多種催化劑水解所述甘油酯以形成脂肪酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述提取劑包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、月旨肪酯、甘油三酯、或它們的混合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一種或多種催化劑選自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述提取劑對(duì)于所述產(chǎn)物醇的分配系數(shù)大于所述生物質(zhì)的油對(duì)于所述產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，還包括: 在水解所述油的至少一部分之后使所述催化劑失活。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述產(chǎn)物醇是丁醇。
19.組合物，包含: (a)能夠產(chǎn)生醇的重組微生物； (b)可發(fā)酵碳源； (C) 一種或多種能夠?qū)⒏视王ニ獬芍舅岬拇呋瘎? (d)包含甘油酯的油；和` (e)脂肪酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述一種或多種催化劑選自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述油是玉米油、牛脂油、卡諾拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、魚油、霍霍巴油、豬油、亞麻籽油、牛蹄油、奧蒂油、棕櫚油、花生油、油菜籽油、稻米油、紅花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻風(fēng)樹油和植物油共混物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述可發(fā)酵碳源和所述油來源于生物質(zhì)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述生物質(zhì)包括玉米粒、玉米棒、作物殘余物、玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動(dòng)物糞肥、以及它們的混合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，還包含糖化酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，還包含不溶解的固體。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，還包含甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、甘油、單糖、低聚糖或醇中的至少一種或多種。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述醇是丁醇。
全文摘要
在醇發(fā)酵方法中，將來源于生物質(zhì)的油水解成提取劑，其可用于從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中原位移除產(chǎn)物醇如丁醇?？蓪⒂椭械母视王ゴ呋?例如酶催化)水解成游離脂肪酸，其形成發(fā)酵產(chǎn)物提取劑，所述發(fā)酵產(chǎn)物提取劑對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)大于所述生物質(zhì)的油對(duì)于產(chǎn)物醇的分配系數(shù)。來源于醇發(fā)酵過程的原料的油可通過以下方法水解使所述包含油的原料與一種或多種酶接觸，從而將所述油的至少一部分水解成游離脂肪酸以形成發(fā)酵產(chǎn)物提取劑，或在將原料輸送進(jìn)發(fā)酵容器之前，能夠從所述原料中分離所述油，并且所述分離的油能夠與所述酶接觸以形成所述發(fā)酵產(chǎn)物提取劑。所述發(fā)酵產(chǎn)物提取劑可與發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸以原位移除產(chǎn)物醇。
文檔編號(hào)C11C1/04GK103119172SQ201180035164
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者K.H.布盧, R.迪科斯莫, M.C.格拉蒂 申請(qǐng)人:布特馬斯先進(jìn)生物燃料有限責(zé)任公司