專利名稱：一種天然抗氧化肽Tiannanin-C1及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種具有抗氧化活性的天然抗氧化肽 Tiannanin-Cl及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體處于不良環(huán)境狀態(tài)下，以及隨著年齡的增長，體內(nèi)的自由基將會(huì)產(chǎn)生過多或清除過慢。自由基清除劑也稱為抗氧化劑，可清除體內(nèi)多余的自由基，減輕它們對(duì)機(jī)體的損傷。目前，一直公認(rèn)的自然界生物體中存在著2套抗氧化系統(tǒng)，第一套是蛋白質(zhì)大分子，比如SOD ；第二套為有機(jī)小分子，比如Vc、BHT等?；瘜W(xué)合成的抗氧化劑如BHA、BHT等， 本身具有毒、副作用，各國政府紛紛對(duì)其強(qiáng)制規(guī)定了 ADI值，控制其過量添加?；瘖y品中常見的抗氧化劑，如維生素C、維生素E及SOD等，其氧化活性又有限。而天然蝦青素之類的天然抗氧化劑的添加產(chǎn)品，由于其賣點(diǎn)為“天然”，售價(jià)普遍過高，難以為大眾所接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化活性的多肽Tiarmanin-Cl及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用，用中國特有臭蛙的皮膚中存在的天然抗氧化肽替代傳統(tǒng)的抗氧化劑， 開發(fā)新一代天然，極低毒、高效的抗氧化類化妝品。隨著多肽組學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，本發(fā)明在青蛙皮膚中發(fā)現(xiàn)了第三套抗氧化系統(tǒng)，其由基因編碼的多肽構(gòu)成，這種多肽多由10-20個(gè)氨基酸殘基組成。這種天然抗氧化肽是高原地區(qū)兩棲動(dòng)物的皮膚對(duì)抗紫外損傷有效而強(qiáng)大的武器，對(duì)其生存是至關(guān)重要的，且其來源天然，低毒、高效的特性，更符合現(xiàn)代人對(duì)化妝品的要求。本發(fā)明所獲得的天然抗氧化肽來源于中國特有的臭蛙(Odorrana andersonii)的皮膚分泌物。蛙類，是動(dòng)物從水生生活到陸生生活的重要過渡類型，其皮膚裸露，富含腺體， 能分泌大量的活性物質(zhì)，包括抗菌肽、激肽、鎮(zhèn)痛肽等，其中還有大量未知功能的多肽。臭蛙是蛙類動(dòng)物的“祖先”，因其皮膚在受刺激時(shí)能分泌具有刺激性氣味的混合物而得名。根據(jù)以往工作的經(jīng)驗(yàn)顯示，選取祖先種提取到的有效成分，其活性較強(qiáng)，本發(fā)明選用了蛙類的祖先云南臭蛙，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期的推測。本發(fā)明的抗氧化活性的多肽Tiarmanin-Cl按以下方法制備1、皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mMTris-HCl 緩沖液(PH = 7. 8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于4000rpm離心 15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲(chǔ)存于-80°C備用；2、多肽的純化將凍干的上清液樣品重新溶解，上預(yù)先用25mM Tris-HCl緩沖液 (pH = 7. 8，含有0. IM NaCl)平衡好的S印hadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進(jìn)行洗脫，每IOmin收集一次。洗脫產(chǎn)物用280nm監(jiān)測，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥。之后，用20mM的NaAc-HAc緩沖液(pH =4. 0)溶解樣品，用相同緩沖液平衡好的Resource S分離柱進(jìn)行純化，利用含有IM NaCl 的同一緩沖液、以lml/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液用215nm波長進(jìn)行監(jiān)測，收集到具有抗氧化活性的成分，之后用含0.1% (v/v)TFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進(jìn)行分離， 利用含有0. 1% (v/v)TFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進(jìn)行監(jiān)測，最終獲取抗氧化肽Tiannanin-Cl純品。 抗氧化活性評(píng)估樣品抗氧化活性的評(píng)估反映在其對(duì)自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲(chǔ)存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mMABTS，避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算
(Ablank-Asample) X 100/Ablank。 經(jīng)上述方法制備得到天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl，其為基因編碼產(chǎn)物，N端到C端的序列RLFKCYKPDS，活性0. 05ug/ml的濃度下即可清除20%的自由基，2ug/ml的濃度下可清除98%的自由基，此外，具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)的活性。產(chǎn)品主要技術(shù)指標(biāo)抗氧化肽的活性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)是能發(fā)揮作用的最小濃度(ug/ml 或 umol/ml)。本發(fā)明的天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl應(yīng)用于化妝品的制備，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中去，以純天然、高效且適應(yīng)不同消費(fèi)群體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下優(yōu)點(diǎn)①采自中國特有臭蛙的皮膚，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護(hù)裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害——回歸本源、純天然，符合現(xiàn)如今大眾的消費(fèi)要求。②活性比傳統(tǒng)的抗氧化劑BHT強(qiáng)1000倍。③除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抑制黑色素形成活性。本發(fā)明的應(yīng)用是化妝品行業(yè)的一次創(chuàng)舉，將成為化妝品行業(yè)的新一枝標(biāo)桿。


圖1是本發(fā)明的抗氧化活性的多肽制備的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式1、皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mM Tris-HCl緩沖液(pH = 7.8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于 4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲(chǔ)存于_80°C備用；2、多肽的純化將凍干的上清液樣品重新溶解，上預(yù)先用25mM Tris-HCl緩沖液 (pH = 7. 8，含有0. IM NaCl)平衡好的S印hadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進(jìn)行洗脫，每IOmin收集一次。洗脫產(chǎn)物用280nm監(jiān)測，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥。之后，用20mM的NaAc-HAc緩沖液 (pH = 4. 0)溶解樣品，用相同緩沖液平衡好的Resource S分離柱進(jìn)行純化，利用含有IMNaCl的同一緩沖液、以lml/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液用215nm波長進(jìn)行監(jiān)測，收集到具有抗氧化活性的成分，之后用含0.1% (v/v)TFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進(jìn)行分離，利用含有0. 1% (v/v)TFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進(jìn)行監(jiān)測，最終獲取天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl純品；其為基因編碼產(chǎn)物，N端到C端的序列 RLFKCYKPDS，活性0. 05ug/ml的濃度下即可清除20%的自由基，2ug/ml的濃度下可清除 98%的自由基，此外，具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)的活性?？寡趸钚栽u(píng)估樣品抗氧化活性的評(píng)估反映在其對(duì)自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲(chǔ)存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mMABTS，避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算 (Ablank-Asample) X 100/Ablank。本發(fā)明的天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl應(yīng)用于化妝品的制備，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中去，以純天然、高效且適應(yīng)不同消費(fèi)群體。
權(quán)利要求
1.一種天然抗氧化肽Tiarmanin-ci，其特征在于該天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl為基因編碼產(chǎn)物，N端到C端的序列RLFKCYKPDS。
2.權(quán)利要求1所述的天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mMTris-HCl 緩沖液pH = 7. 8清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于4000rpm離心 15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲(chǔ)存于-80°C備用；②多肽的純化將凍干的上清液樣品重新溶解，上預(yù)先用25mMTris-HCl緩沖液pH = 7. 8，含有0. IM NaCl平衡好的kphadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進(jìn)行洗脫， 每IOmin收集一次洗脫液；洗脫液用280nm監(jiān)測，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥后，用20mM的NaAc-HAc緩沖液pH = 4. 0溶解樣品，用相同緩沖液平衡好的Resource S分離柱進(jìn)行純化，利用含有IM NaCl的同一緩沖液、以lml/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液用215nm波長進(jìn)行監(jiān)測，收集到具有抗氧化活性的成分后，用含0. 1%V/VTFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進(jìn)行分離，利用含有0. 1% v/vTFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進(jìn)行監(jiān)測，最終獲取天然抗氧化肽 Tiannanin-Cl 純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl的制備方法，其特征在于抗氧化活性評(píng)估具體如下首先配置ABTS儲(chǔ)存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mM ABTS,避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算(Ablank-Asample) X 100/Ablank0
4.權(quán)利要求1所述的天然抗氧化肽Tiarmanin-Cl的應(yīng)用，其特征在于將天然抗氧化肽 Tiarmanin-Cl應(yīng)用于化妝品的制備中，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中。
全文摘要
本發(fā)明是一種天然抗氧化肽Tiannanin-C1及其制備方法和應(yīng)用。該天然抗氧化肽Tiannanin-C1為基因編碼產(chǎn)物，N端到C端的序列RLFKCYKPDS。其采自中國特有臭蛙的皮膚制備而成，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護(hù)裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害，將天然抗氧化肽Tiannanin-C1應(yīng)用于化妝品的制備中。回歸本源、純天然，符合現(xiàn)如今大眾的消費(fèi)要求?；钚员葌鹘y(tǒng)的抗氧化劑BHT強(qiáng)1000倍。除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抑制黑色素形成活性。
文檔編號(hào)A61Q19/08GK102558303SQ201210014560
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者梁醒財(cái) 申請(qǐng)人:梁醒財(cái)