專利名稱：抗氧化活性合成肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗氧化活性合成肽及其用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代自由基學(xué)說(shuō)指出自由基是機(jī)體在氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA氧化性退變等氧化損害，引發(fā)糖尿病、動(dòng)脈硬化、癌癥等一系列慢性疾病。在食品中，一些營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)氧化產(chǎn)生氫過(guò)氧化物，降低食品品質(zhì)，甚至?xí)?dǎo)致攝入者的身體發(fā)生疾病。因此，尋找抗氧化劑以抑制氫過(guò)氧化物的產(chǎn)生一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。目前，BHA, BHT、PG等化學(xué)合成抗氧化劑已廣泛的應(yīng)用于食品行業(yè)以防止食品劣性氧化，但是因其潛在危害限制了其應(yīng)用范圍；一些抗氧化肽因其具有清除自由基、淬滅單線態(tài)氧、分解過(guò)氧化物及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等功效，且具有分子量小、易吸收等特點(diǎn)，也已經(jīng)用于化妝品行業(yè)，以抑制皮膚老化及化妝品自身氧化。 抗氧化肽作為抗氧化劑的一個(gè)重要組成，近幾年其相關(guān)研究也越來(lái)越多?？寡趸拇蠖嗍堑鞍踪|(zhì)酶解、分離純化后獲得，但是方法成本高、分離時(shí)間長(zhǎng)、品質(zhì)難以控制、抗氧化活性各有高低，從而限制了抗氧化肽的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。而利用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型可以揭示抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系，并預(yù)測(cè)高活性抗氧化肽的結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種抗氧化活性合成肽。本發(fā)明提供的多肽，為如下I) -3)中任意一種I)序列表中序列I所示的多肽；2)序列表中序列2所示的多肽；3)序列表中序列3所示的多肽。上述三條多肽均為本發(fā)明保護(hù)的范圍，且這幾條多肽具有相同的氨基酸殘基，均自N末端起第一位氨基酸殘基和第二位氨基酸殘基分別為酪氨酸和脯氨酸，且均具有較高的抗氧化活性，一般在多肽篩選和多肽合成中作為一組。上述多肽為具有抗氧化活性的多肽；上述抗氧化活性具體通過(guò)ABTS清除活性、ORAC活性和/或抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性體現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種多肽溶液。本發(fā)明提供的多肽溶液，為將上述多肽溶于醇溶液或酸性溶液中得到的溶液；所述醇溶液具體可為濃度50% (體積百分含量)及其以上的乙醇水溶液；所述酸性溶液具體可為濃度為2-20mM的鹽酸水溶液。上述多肽或多肽溶液在如下I) -3)中任一所述中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍I)制備抗氧化活性產(chǎn)品；2)制備清除自由基產(chǎn)品；3)制備抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)品。在上述應(yīng)用中，清除自由基在本發(fā)明的實(shí)施例中具體通過(guò)清除ABTS自由基和/或淬滅AAPH自由基體現(xiàn)。
上述多肽或多肽溶液在作為抗氧化劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述多肽或多肽溶液在制備化妝品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述多肽或多肽溶液在作為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述多肽或多肽溶液在作為食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述多肽通過(guò)多肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成的，合成肽通過(guò)質(zhì)譜鑒定；具有較高的ABTS清除活性、ORAC活性以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性。本發(fā)明即是在研究抗氧化肽定量構(gòu)效關(guān)系模型的基礎(chǔ)上，預(yù)測(cè)出高活性抗氧化肽的序列，經(jīng)化學(xué)合成后進(jìn)行活性驗(yàn)證，得出的一組結(jié)構(gòu)相似、功能活性相同的序列。這些序列經(jīng)過(guò)與蛋白質(zhì)資源庫(kù)的比對(duì)，存在于天然蛋白質(zhì)序列中。與酶解法制備并分離純化的抗氧化肽相比，本發(fā)明具有高自由基清除率、高抗氧化活性等特征。采用化學(xué)合成的方法制備這些抗氧化肽，功能活性高且穩(wěn)定、成本較低?！?br> 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明合成3條多肽，其具有抗氧化活性，由于該抗氧化肽具有分子量小，活性高，易于人工合成，成本低等特點(diǎn)，可以廣泛的用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)；具體可作為抗氧化劑用于化妝品、食品保健品、動(dòng)物飼料添加劑、醫(yī)藥等方面?？傊景l(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)發(fā)明了未見(jiàn)報(bào)道的具有高抗氧化活性(ABTS清除活性、ORAC活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性)的肽序列；(2)發(fā)明的多肽是4肽，分子量小，易吸收。(3)發(fā)明的抗氧化肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，人工合成方便，易于工業(yè)化生產(chǎn)，在食品、醫(yī)藥、飼料和化妝品領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的質(zhì)譜2為抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的高效液相色譜圖3為抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的質(zhì)譜4為抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的高效液相色譜圖5為抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的質(zhì)譜6為抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色譜
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、抗氧化活性合成肽的獲得多肽的合成由北京中科亞光生物技術(shù)有限公司提供。多肽的制備采用Apex 396型號(hào)的多肽合成儀，通過(guò)Fmoc固相合成法合成。分別按照三個(gè)不同肽序列Tyr-Pro-Tyr-Trp, Tyr-Pro-Trp-Tyr, Tyr-Pro-Phe-Trp 的特征，由 C 端到 N 端逐步依次將氨基酸連接上。開(kāi)始，將第一個(gè)氨基酸通過(guò)一段對(duì)酸敏感的連接物連接在不溶性的支撐物樹(shù)脂上。用六氫吡啶將Fmoc保護(hù)基去掉后，第二個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸被連接上了上去，連接方法有預(yù)活化或“一鍋煮”等。目標(biāo)序列連接后，用TFA將肽鏈從樹(shù)脂上洗脫得到粗品。所合成的多肽經(jīng)高效液相色譜儀純化，純度達(dá)到90%以上，并經(jīng)過(guò)質(zhì)譜儀鑒定結(jié)構(gòu)。本發(fā)明根據(jù)QSAR模型提供一組具有高抗氧化活性的合成多肽，具體如下
多妝I :Tyr-Pro-Ty;r-Trp (序列 I)；多妝2 :Tyr-Pro-Trp-Tyr (序列 2);多妝3 :Tyr-Pro-Phe-Trp (序列 3);上述3條多肽均為4肽；且每條多肽的NI位置均為酪氨酸、N2位置均為脯氨酸。上述多肽可以人工合成，其質(zhì)譜圖和高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果如圖1-6所示圖I為抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的質(zhì)譜圖，質(zhì)譜圖是通過(guò)Voyager-DE PRO型號(hào)的質(zhì)譜儀測(cè)定得到的，質(zhì)譜參數(shù)正極模式，手工集控；加速電壓為20000V ;采集質(zhì)量范圍為300-2000Da，激光投射的數(shù)量為50/頻譜，激光強(qiáng)度為2753，激光頻率為3. 0HZ。圖2為抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的高效液相色譜，色譜條件分析柱為Agela (250 X 4. 6mmI. D. )C18 ;檢測(cè)波長(zhǎng)為 220nm ;梯度為 30-45%,時(shí)間 15min ;流動(dòng)相 A 為 O. 05%TFA+2%CH3CN,流動(dòng)相 B 為 O. 05%TFA+90%CH3CNo ； 圖3為抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的質(zhì)譜圖,質(zhì)譜圖是通過(guò)Voyager-DE PRO型號(hào)的質(zhì)譜儀測(cè)定得到的，質(zhì)譜參數(shù)正極模式，手工集控；加速電壓為20000V ;采集質(zhì)量范圍為300-2000Da，激光投射的數(shù)量為50/頻譜，激光強(qiáng)度為2753，激光頻率為3. OHZ ;圖4為抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的高效液相色譜,色譜條件分析柱為Agela (250 X 4. 6mm I. D.)C18 ;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;梯度為28_43%，時(shí)間15min ;流動(dòng)相A為O. 05%TFA+2%CH3CN,流動(dòng)相 B 為 O. 05%TFA+90%CH3CNo圖5為抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的質(zhì)譜圖,質(zhì)譜圖是通過(guò)Voyager-DE PRO型號(hào)的質(zhì)譜儀測(cè)定得到的，質(zhì)譜參數(shù)正極模式，手工集控；加速電壓為20000V ;采集質(zhì)量范圍300-2000Da,激光投射的數(shù)量為50/頻譜，激光強(qiáng)度為2753，激光頻率為3. 0HZ。圖6為抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色譜,色譜條件分析柱為Agela (250 X 4. 6mm I. D.)C18 ;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;梯度為28_48%，時(shí)間20min ;流動(dòng)相A為O. 05%TFA+2%CH3CN,流動(dòng)相B為O. 05%TFA+90%CH3CN ;圖6的具體結(jié)果如下表I : 表I為抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色譜結(jié)果
Rank Time Cone.AreaHeight
19. 787 3.174 107912 6972
211.513 1.597 5428333143 11.972 1.996 678667531
412.281 92.23 3135119 167261
512.968 1.01343333192
Total1003399513 188270實(shí)施例2、抗氧化活性合成肽的活性檢測(cè)將上述多肽1、2、3分別溶于50%的乙醇水溶液中，得到多肽I溶液、多肽2溶液、多肽3溶液,母液濃度為10mM，然后用去離子水稀釋至下面所需濃度。I、用TEAC法測(cè)定抗氧化肽的ABTS清除活性將7mmol/L ABTS(水溶液)與終濃度為2. 45mmol/L的過(guò)硫酸鉀混合反應(yīng)產(chǎn)生ABTS+ ，混合液在黑暗室溫(25°C)下放置16h，得到ABTS+ ·溶液。ABTS+ ·溶液用無(wú)水乙醇稀釋，至在734nm下的吸光值為O. 7±0.02。取該溶液4ml與40 μ 10. 5mM的待測(cè)多肽溶液混合，30°C下在734nm下測(cè)定吸光度，用蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)平行3次。采用系列Trolox (中文名水溶性維生素E)溶液代替待測(cè)多肽溶液，測(cè)定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表示為待測(cè)多肽溶液相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的濃度。ABTS+ ·清除率的計(jì)
算公式如下
權(quán)利要求
1.一種多肽，為如下I)-3)中任意一種 1)序列表中序列I所不的多妝； 2)序列表中序列2所的多妝； 3)序列表中序列3所示的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于所述多肽為具有抗氧化活性的多肽。
3.一種多肽溶液，為將權(quán)利要求I或2所述多肽溶于醇溶液或酸性溶液中得到的溶液。
4.權(quán)利要求I或2所述多肽或權(quán)利要求3所述的多肽溶液在如下I)-3)中任一所述中的應(yīng)用 1)制備抗氧化活性產(chǎn)品； 2)制備清除自由基廣品； 3)制備抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)品。
5.權(quán)利要求I或2所述多肽或權(quán)利要求3所述的多肽溶液在作為抗氧化劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I或2所述多肽或權(quán)利要求3所述的多肽溶液作為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I或2所述多肽或權(quán)利要求3所述的多肽溶液作為食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I或2所述多肽或權(quán)利要求3所述的多肽溶液在制備化妝品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗氧化活性合成肽及其用途。本發(fā)明提供的多肽，為如下1)-3)中任一一種1)由序列表中序列1所示的多肽；2)由序列表中序列2所示的多肽；3)由序列表中序列3所示的多肽。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明合成3條多肽，其具有抗氧化活性，由于該抗氧化肽具有分子量小，活性高，易于人工合成，成本低等特點(diǎn)，可以廣泛的用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)；具體可作為抗氧化劑用于化妝品、食品保健品、動(dòng)物飼料添加劑、醫(yī)藥等方面。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK102898504SQ20121040744
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者李博, 劉珊珊, 李耀旺 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)