變體成麥芽六糖α-淀粉酶變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明所公開的是涉及變體成麥芽六糖α-淀粉酶的組合物和方法。所述變體α-淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化、用于清潔衣物、餐具和其他應用中的含淀粉污漬、用于紡織物處理(例如退漿)、在動物飼料中用于改善消化率以及用于烘培和釀造。
【專利說明】變體成麥芽六糖Cl -淀粉酶變體
[0001]優(yōu)先權(quán)
[0002]本專利申請要求于2011年10月28日提交的序列號為61/552，910的美國臨時申請和于2012年7月5日提交的序列號為61/668，359的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，特此將這兩個臨時專利申請以引用的方式全文并入。
【技術(shù)領域】
[0003]所公開的是涉及成麥芽六糖變體α -淀粉酶。該變體α _淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化、清潔含淀粉污潰、紡織物退漿、烘焙和釀造。
[0004] 背景
[0005]淀粉由直鏈淀粉(15-30% w/w)和支鏈淀粉(70-85% w/w)的混合物組成。直鏈淀粉由α-1,4-連接的葡萄糖單元的直鏈組成，分子量(MW)為約60，000至約800，000。支鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有α -1, 6分支點的支鏈聚合物；其MW可高達一億。
[0006]濃縮右旋糖漿形式的得自淀粉的糖目前通過酶催化法制備，該方法涉及:(1)用α -淀粉酶將固體淀粉液化(或降低粘度)成平均聚合度為約7-10的糊精，以及(2)用淀粉葡糖苷酶(也稱為葡糖淀粉酶或GA)將所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖漿具有高葡萄糖含量。大部分商業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖漿隨后通過酶法異構(gòu)化為稱為異糖漿(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖漿也可用微生物(如酵母)發(fā)酵以產(chǎn)生商品，包括例如乙醇、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸鹽、賴氨酸、其他有機酸、其他氨基酸和其他生物化學品?？赏瑫r進行發(fā)酵和糖化(即SSF工藝)來實現(xiàn)更大的經(jīng)濟性和效率。
[0007]α -淀粉酶通過隨機裂解內(nèi)部的α -1, 4_糖苷鍵來水解淀粉、糖原和相關(guān)的多糖。α-淀粉酶(特別是來自桿菌(Bacilli)的α-淀粉酶)已被用于各種不同的目的，包括淀粉液化和糖化、紡織物退漿、造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性、釀造、烘焙、用于食品工業(yè)的糖漿的生產(chǎn)、用于發(fā)酵工藝的原料的生產(chǎn)以及用于動物飼料中來增加可消化率。這些酶也可用于在餐具洗滌和衣物洗滌過程中除去含淀粉污垢和污潰。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明組合物和方法涉及成麥芽六糖變體淀粉酶多肽以及其使用方法。在以下分別帶編號的段落中概述了本發(fā)明組合物和方法的各方面和實施例。
[0009]1.在一個方面，提供源自親本α-淀粉酶多肽的變體α-淀粉酶多肽，其在有效氨基酸位置(productive amino acid position)包含至少一個可組合突變。其中:(i)所述可組合突變是用一不同的氨基酸殘基置換親本α-淀粉酶中存在的氨基酸殘基，與該親本α-淀粉酶相比，該置換改善了變體α-淀粉酶的至少一種期望的特性，而與該親本α-淀粉酶相比，未顯著降低該變體α-淀粉酶的表達、活性或穩(wěn)定性，(ii)所述有效位置(productive position)是可用多個不同的氨基酸殘基置換的氨基酸位置,該置換的每一者可導致符合(i)的要求的變體α-淀粉酶，并且(iii)所述可組合突變對應于列表A、B、C或D中或表C或D中列出的突變，所述列表和表使用SEQ ID NO:3進行編號。
[0010]2.在段落I的變體淀粉酶的一些實施例中，所述至少一個可組合突變的每一者產(chǎn)生變體淀粉酶，其中關(guān)于(i)蛋白質(zhì)表達、(ii)活性和(iii)洗滌劑穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性，相對于親本淀粉酶的最低性能指數(shù)(PD大于或等于0.9，并且關(guān)于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的PI大于或等于1.0。
[0011]3.在段落I的變體淀粉酶的一些實施例中，所述至少一個可組合突變的每一者產(chǎn)生變體淀粉酶，其中關(guān)于(i)蛋白質(zhì)表達、(ii)活性和(iii)洗滌劑穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性，相對于親本淀粉酶的最低性能指數(shù)(PD大于或等于0.8，并且關(guān)于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的PI大于或等于1.2。
[0012]4.在段落I的變體淀粉酶的一些實施例中，所述至少一個可組合突變的每一者產(chǎn)生變體淀粉酶，其中關(guān)于(i)蛋白質(zhì)表達、(ii)活性和(iii)洗滌劑穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性，相對于親本淀粉酶的最低性能指數(shù)(PD大于或等于0.5，并且關(guān)于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的PI大于或等于1.5。
[0013]5.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，所述至少一個可組合突變的每一者具有適宜性得分+++、++++或+++++,參見表B。
[0014]6.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，所述至少一個可組合突變的每一者具有適宜性得分++++或+++++,參見表B。
[0015]7.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，所述至少一個可組合突變的每一者具有適宜性得分+++++，參見表B。
[0016]8.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，所述至少一個可組合突變的每一者具有有效性得分I或2。
[0017]9.在一些實施例中，前述段落任一者的變體淀粉酶包括多個可組合突變。
[0018]10.在一些實施例中，前述段落任一者的變體淀粉酶還包含對應于選自Arg-181、Gly-182、His-183和Gly-184的殘基的缺失，這些殘基使用SEQ ID N0:3進行編號。
[0019]11.在一些實施例中，前述段落任一者的變體淀粉酶還包含對應于殘基Arg-181和Gly-182的缺失，這些殘基使用SEQ ID N0:3進行編號。
[0020]12.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，親本α-淀粉酶或變體α-淀粉酶與SEQ ID Ν0:3或SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一性，或者其中所述親本α-淀粉酶或變體α-淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
[0021]13.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，親本α-淀粉酶或變體α-淀粉酶與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性，或者其中所述親本α-淀粉酶或變體α-淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
[0022]14.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，親本α-淀粉酶或變體α-淀粉酶與SEQ ID Ν0:3或SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性，或者其中所述親本α-淀粉酶或變體α-淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
[0023]15.在前述段落任一者的變體淀粉酶的一些實施例中，親本α-淀粉酶或變體α-淀粉酶與與SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，或者其中所述親本α -淀粉酶或變體α -淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
[0024]16.在另一方面，提供包含段落1-15中任一者的變體淀粉酶的組合物。
[0025]17.在段落16的組合物的一些實施例中，所述組合物可有效用于從衣物、餐具或紡織品移除含淀粉污潰。
[0026]18.在一些實施例中，段落16或17的組合物還包含表面活性劑。
[0027]19.在段落16-18的組合物的一些實施例中，所述組合物為洗滌劑組合物。
[0028]20.在段落16-19的組合物的一些實施例中，所述組合物是衣物洗滌劑或衣物洗滌劑添加劑。
[0029]21.在段落16-20的組合物的一些實施例中，所述組合物是手動或自動餐具洗滌劑。
[0030]22.在一些實施例中，段落16-21的組合物還包含一種或多種另外的酶，所述另外的酶選自:蛋白酶、半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、脂解酶、金屬脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和除了段落1-15中任一者的淀粉酶之外的淀粉酶。
[0031]23.在一些實施例中，段落16的組合物是用于液化淀粉。
[0032]24.在一些實施例中，段落16的組合物是用于糖化包含淀粉的組合物、用于液化后的SSF或用于無預先液化的直接SSF。
[0033]25.在一些實施例中，段落16的組合物是用于制備發(fā)酵飲料。
[0034]26.在一些實施例中，段落16的組合物是用于制備烘培食品。
[0035]27.在一些實施例中，段落16的組合物是用于紡織物退漿。
[0036]28.在另一方面，提供一種用于從表面移除含淀粉污潰或污垢的方法，所述方法包括:在包含有效量的段落1-15任一者的變體淀粉酶的含水組合物的存在下接觸所述表面，以及讓所述多肽水解所述含淀粉污潰中存在的淀粉組分以產(chǎn)生溶解于所述含水組合物中的較小淀粉衍生分子，以及清洗所述表面，從而從所述表面移除所述含淀粉污潰。
[0037]29.在段落28的方法的一些實施例中，所述含水組合物還包含表面活性劑。
[0038]30.在段落28-29的方法的一些實施例中，所述表面是紡織物表面。
[0039]31.在段落28-29的方法的一些實施例中，所述表面是在餐具上。
[0040]32.在段落28-29的方法的一些實施例中，所述表面為有污垢的硬質(zhì)表面。
[0041]33.在段落28-32的方法的一些實施例中，所述組合物還包含至少一種另外的酶，所述另外的酶選自蛋白酶、半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、脂解酶、金屬脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase, β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和除了段落1_15中任一者的淀粉酶之外的淀粉酶。
[0042]34.在另一方面，提供糖化包含淀粉的組合物以制備包含葡萄糖的組合物的方法，其中所述方法包括:(i)使所述溶液與有效量的段落1-15任一者的變體淀粉酶接觸；以及
(ii)糖化包含淀粉的溶液以制備包含葡萄糖的組合物；其中所述變體淀粉酶催化所述淀粉溶液到葡萄糖的糖化。
[0043]35.在段落34的方法的一些實施例中，包含淀粉的組合物包含液化淀粉、糊化淀粉或顆粒淀粉。
[0044]36.在段落34或35的方法的一些實施例中，在約30°C至約75°C的溫度范圍下進行糖化。
[0045]37.在段落36的方法的一些實施例中，所述溫度范圍為47°C - 74°C。
[0046]38.在段落34-37任一者的方法的一些實施例中，在pH2.0-7.5的pH范圍內(nèi)進行糖化。
[0047]39.在段落38的方法的一些實施例中，所述pH范圍是pH3.5 - 5.5。
[0048]40.在段落39的方法的一些實施例中，所述pH范圍是ρΗ3.5 - 4.5。 [0049]41.在一些實施例中，段落34-40任一者的方法還包括使所述葡萄糖組合物發(fā)酵以制備發(fā)酵最終(end of fermentation, EOF)產(chǎn)物。
[0050]42.在段落41的方法的一些實施例中，所述發(fā)酵是同時糖化和發(fā)酵(SSF)反應。
[0051]43.在段落41或42的方法的一些實施例中，在pH2-8下并且在25°C _70°C的溫度范圍內(nèi)進行所述發(fā)酵48 - 70小時。
[0052]44.在段落41-43任一者的方法的一些實施例中，所述EOF產(chǎn)物包含乙醇。
[0053]45.在段落41-44任一者的方法的一些實施例中，所述EOF產(chǎn)物包含8-18% (v/v)的乙醇。
[0054]46.在段落41-45的方法的一些實施例中，所述方法還包括使麥芽衆(zhòng)和/或麥芽汁與淀粉酶接觸。
[0055]47.在段落46的方法的一些實施例中，所述方法還包括:(a)制備麥芽漿；(b)過濾所述麥芽漿以獲得麥芽汁；以及(C)使所述麥芽汁發(fā)酵以獲得發(fā)酵飲料，其中將段落1-16和74-80中的任一者的變體淀粉酶添加至:(i)步驟(a)的麥芽漿和/或(ii)步驟
(b)的麥芽汁和/或(iii)步驟(C)的麥芽汁。
[0056]48.在段落41-47任一者的方法的一些實施例中，所述EOF產(chǎn)物包含代謝物。
[0057]49.在段落48的方法的一些實施例中，所述代謝物是檸檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸S-內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉、Ω-3脂肪酸、丁醇、氨基酸賴氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或異戊二烯。
[0058]50.在一些實施例中，段落34-49任一者的方法還包括將葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、磷酸酶、植酸酶、支鏈淀粉酶、β -淀粉酶、不是所述變體α-淀粉酶的α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、異淀粉酶、氧化還原酶、酯酶、轉(zhuǎn)移酶、果膠酶、α-葡糖苷酶、β_葡糖苷酶或它們的組合添加至所述淀粉溶液。
[0059]51.在段落50的方法的一些實施例中，添加所述葡糖淀粉酶達到0.1 -2葡糖淀粉酶單位(GAU)/g dso
[0060]52.在段落34-51任一者的方法的一些實施例中，所述淀粉酶由宿主細胞表達和分泌。[0061]53.在段落52的方法的一些實施例中，使所述包含淀粉的組合物與所述宿主細胞接觸。
[0062]54.在段落52或53的方法的一些實施例中，所述宿主細胞還表達和分泌葡糖淀粉酶或其他酶。
[0063]55.在段落52-54任一者的方法的一些實施例中，所述宿主細胞能使所述組合物發(fā)酵。
[0064]56.在另一方面，提供通過段落34-55中任一者的方法制備的包含葡萄糖的組合物。
[0065]57.在另一方面，提供通過段落34-55中任一者的方法制備的液化淀粉。
[0066]58.在另一方面，提供通過段落34-55中任一者的方法制備的發(fā)酵飲料。
[0067]59.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制備包含葡萄糖的組合物中的用途。
[0068]60.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制備液化淀粉中的用途。
[0069]61.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制備發(fā)酵飲料中的用途。
[0070]62.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在清潔含淀粉污潰中的用途。
[0071]63.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在紡織物退漿中的用途。
[0072]64.在根據(jù)段落34-55中任一者的方法、段落58的發(fā)酵飲料或段落61的用途的一些實施例中，所述發(fā)酵飲料或發(fā)酵最終產(chǎn)物選自(i)啤酒，所述啤酒選自全麥芽啤酒、根據(jù)“Reinheitsgebot(純凈法)”釀造的啤酒、愛爾啤酒、IPA、拉格啤酒、苦啤酒、低麥芽啤酒(Happoshu)(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒(stout)、麥芽酒、無酒精啤酒和無酒精麥芽酒；和(ii)谷物或麥芽飲料，選自水果味麥芽飲料、酒味麥芽飲料和咖啡味麥芽飲料。
[0073]65.在另一方面，提供制備食品組合物的方法，包括將:(i) 一種或多種食品成分與(ii)段落1-15任一者的變體α-淀粉酶合并，其中其變體α-淀粉酶催化所述食品成分中存在的淀粉組分水解而產(chǎn)生葡萄糖。
[0074]66.在段落65的方法的一些實施例中，所述食品組合物選自食品、烘焙組合物、食品添加劑、動物食品、飼料產(chǎn)品、飼料添加劑、油、肉和豬油。
[0075]67.在段落65-66中任一者的方法的一些實施例中，所述一種或多種食品成分包含烘培成分或添加劑。
[0076]68.在段落65-67中任一者的方法的一些實施例中，所述一種或多種食品成分選自:面粉；抗變陳淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麥芽α -淀粉酶或其具有生麥芽α -淀粉酶活性的變體、同源物或突變體；烘培食品用木聚糖酶；和脂肪酶。
[0077]69.在段落65的方法的一些實施例中，所述一種或多種食品成分選自:(i)來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophi lus)的生麥芽α_淀粉酶、(ii)來自芽孢桿菌(Bacillus)、曲霉(Aspergillus)、嗜熱絲抱菌(Thermomyces)或木霉(Trichoderma)的烘焙食品用木聚糖酶、(iii)來自異孢鐮孢菌(Fusarium heterosporum)的糖脂酶。
[0078]70.在段落65-69中任一者的方法的一些實施例中，所述食品組合物包含生面團或生面團產(chǎn)品，優(yōu)選經(jīng)加工的生面團產(chǎn)品。
[0079]71.在一些實施例中，段落65-70中任一者的方法還包括烘焙所述食品組合物以制備烘焙物。
[0080]72.在一些實施例中，段落65-70中任一者的方法還包括:(i)提供淀粉介質(zhì)；
(ii)向所述淀粉介質(zhì)添加淀粉酶；以及(iii)在步驟(b)期間或之后給所述淀粉介質(zhì)加熱以制備烘焙產(chǎn)品。
[0081 ] 73.在另一方面，提供使紡織物退漿的方法，包括使退漿組合物與上漿紡織物接觸足以使所述紡織物退漿的時間，其中所述退漿組合物包含段落1-15中任一者的變體α -淀粉酶。
[0082]74.在另一方面，提供分離的編碼段落1-15任一者的多肽的多核苷酸。
[0083]75.在另一方面，提供包含段落74的多核苷酸的表達載體。
[0084]76.在另一方面，提供包含段落75的表達載體的宿主細胞。
[0085]通過本發(fā)明的描述和附圖，所述組合物和方法的這些方面和其他方面以及實施例將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0086]圖1是使用默認參數(shù)進行的Amy707淀粉酶和AA560淀粉酶的Clustal比對。
[0087]圖2是包含Amy707基因的pHPLT載體(pHPLT_Amy707)的圖譜。
[0088]序列的簡要i兌明
[0089]SEQ ID NO:1列出了質(zhì)粒pHPLT_Amy707中編碼芽孢桿菌707 a -淀粉酶的成熟形式的經(jīng)密碼子修飾的核苷酸序列。編碼LAT信號肽的序列標有下劃線。
[0090]SEQ ID NO: 2列出了從質(zhì)粒pHPLT_Amy707產(chǎn)生的芽孢桿菌707 a -淀粉酶的前體形式的氨基酸序列。LAT信號肽標有下劃線。
[0091]SEQ ID NO: 3列出了從質(zhì)粒pHPLT-Amy707產(chǎn)生的芽孢桿菌707 α -淀粉酶的成熟
形式的氨基酸序列。
[0092]SEQ ID NO:4 列出了源自芽孢桿菌 DSMl2649 的 ΑΑ560 α -淀粉酶(即 STAINZYME?的親本)的成熟形式的氨基酸序列。
[0093]SEQ ID NO:5列出了 Genebank登錄號Μ18862,其編碼芽孢桿菌707 α -淀粉酶。【具體實施方式】
[0094]所描述的是涉及成麥芽六糖變體淀粉酶的組合物和方法。所述變體是綜合各種實驗方法發(fā)現(xiàn)的，如所附的“實例”中詳細描述的。方法包括利用位點評價文庫(SEL)和基于結(jié)構(gòu)的分析。變體淀粉酶的示例性應用是用于淀粉液化和糖化、用于清潔衣物、餐具和其他應用中的含淀粉污潰、用于紡織物處理(例如退漿)、在動物飼料中用于改善消化率以及用于烘培和釀造。所述組合物和方法的這些及其他方面在下文詳細描述。
[0095]在描述本發(fā)明組合物和方法的各個方面和實施例之前，描述了如下定義和縮寫。
[0096]1.定義和縮寫
[0097]根據(jù)此詳細描述，應用下面的縮寫和定義。注意，除非上下文另有明確指明，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括多個指代物。因此，例如，提及“酶”包括多個此種酶，而提及“劑量”，包括提及一個或多個劑量以及本領域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。
[0098]本文檔被組織成多個章節(jié)，以便于閱讀；然而，讀者將會知道，在一個章節(jié)中進行的陳述可以應用到其他章節(jié)。因此，本公開不同章節(jié)使用的標題不應理解為限制性的。
[0099]除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本領域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。下面提供如下的術(shù)語。
[0100]1.1.縮寫首字母縮略詞
[0101]如下縮寫/首字母縮寫具有如下含義，除非另外規(guī)定:
[0102]
【權(quán)利要求】
1.一種衍生自親本α -淀粉酶多肽的變體α -淀粉酶多肽，所述變體α _淀粉酶多肽在有效氨基酸位置處包含至少一個可組合突變；其中: (i)所述可組合突變是用一不同的氨基酸殘基置換所述親本淀粉酶中存在的氨基酸殘基，與所述親本α-淀粉酶相比，所述置換可改善所述變體α-淀粉酶的至少一種期望的特性，而與所述親本α-淀粉酶相比，未顯著降低所述變體α-淀粉酶的表達、活性或穩(wěn)定性， (ii)所述有效位置是可用多個不同的氨基酸殘基置換的氨基酸位置，所述置換的每一者可導致符合(i)的要求的變體α-淀粉酶，并且 (iii)所述可組合突變對應于列表A、B、C或D中或表C或D中列出的突變，所述列表和表使用SEQ ID N0:3進行編號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體淀粉酶，其中所述可組合突變產(chǎn)生變體淀粉酶，其中關(guān)于(i)蛋白質(zhì)表達、(ii)活性和(iii)洗滌劑穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性，相對于所述親本淀粉酶的最低性能指數(shù)(PI)大于或等于0.9，并且關(guān)于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的所述PI大于或等于1.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體淀粉酶，其中所述可組合突變產(chǎn)生變體淀粉酶，其中關(guān)于(i)蛋白質(zhì)表達、(ii)活性和(iii)洗滌劑穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性，相對于所述親本淀粉酶的最低性能指數(shù)(PI)大于或等于0.8，并且關(guān)于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的所述PI大于或等于1.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體淀粉酶，其中所述可組合突變產(chǎn)生變體淀粉酶，其中關(guān)于(i)蛋白質(zhì)表達、(ii)活性和(iii)洗滌劑穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性，相對于所述親本淀粉酶的最低性能指數(shù)(PI)大于或等于0.5，并且關(guān)于(i)、(ii)或(iii)中的任一者的所述PI大于或等于1.5。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述可組合突變具有適宜性得分+++、++++ 或 +++++,參見表 B ο
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述可組合突變具有適宜性得分++++或+++++,參見表B 0
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述可組合突變具有適宜性得分+++++，參見表B。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述可組合突變具有有效性得分I或2。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，所述變體淀粉酶具有多個可組合突變。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，所述變體淀粉酶還包含對應于選自Arg-181、Gly-182、His-183和Gly-184的殘基的缺失，所述殘基使用SEQ ID NO:3進行編號。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，所述變體淀粉酶還包含對應于殘基Arg-181和Gly-182的缺失，所述殘基使用SEQ ID NO:3進行編號。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述親本α-淀粉酶或所述變體α-淀粉酶與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述親本α -淀粉酶或所述變體α -淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述親本α-淀粉酶或所述變體α-淀粉酶與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述親本α -淀粉酶或所述變體α -淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述親本α-淀粉酶或所述變體α-淀粉酶與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述親本α -淀粉酶或所述變體α -淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的變體淀粉酶，其中所述親本α-淀粉酶或所述變體α-淀粉酶與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一'丨生，或者其中所述親本α -淀粉酶或所述變體α -淀粉酶由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核酸雜交的核酸編碼。
16.一種組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的變體淀粉酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述組合物對于從衣物、餐具或紡織物除去含淀粉污潰是有效的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的組合物，所述組合物還包含表面活性劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項所述的組合物，其中所述組合物為洗滌劑組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項所述的組合物，其中所述組合物為衣物洗滌劑或衣物洗滌劑添加劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-20中任一項所述的組合物，其中所述組合物是人工或自動餐具洗滌劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求16-21中任一項所述的組合物，所述組合物還包含一種或多種另外的選自如下的酶:蛋白酶、半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、脂解酶、金屬脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和除了權(quán)利要求1_15中任一項所述的淀粉酶之外的淀粉酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述組合物是用于液化淀粉。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述組合物是用于糖化包含淀粉的組合物、用于液化后的SSF或用于無預先液化的直接SSF。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述組合物是用于制備發(fā)酵飲料。
26.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述組合物是用于制備烘培食品。
27.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述組合物是用于紡織物退漿。
28.一種從表面除去含淀粉污潰或污垢的方法，所述方法包括: 在包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項所述的變體淀粉酶的含水組合物的存在下接觸所述表面， 讓所述多肽水解所述含淀粉污潰中存在的淀粉組分以產(chǎn)生溶解于所述含水組合物中的較小淀粉衍生分子，以及清洗所述表面， 從而從所述表面上移除所述含淀粉污潰。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述水性組合物還包含表面活性劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求28-29中任一項所述的方法，其中所述表面為紡織物表面。
31.根據(jù)權(quán)利要求28-29中任一項所述的方法，其中所述表面是在餐具上。
32.根據(jù)權(quán)利要求28-29中任一項所述的方法，其中所述表面為有污垢的硬質(zhì)表面。
33.根據(jù)權(quán)利要求28-32中任一項所述的方法，其中所述組合物還包含至少一種另外的選自如下的酶:蛋白酶、半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、脂解酶、金屬脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和除了根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉酶之外的淀粉酶。
34.一種糖化包含淀粉的組合物以制備包含葡萄糖的組合物的方法，其中所述方法包括: (i)使所述包含淀 粉的溶液與有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項所述的變體淀粉酶接觸；以及 (ii)糖化所述包含淀粉的溶液以制備所述包含葡萄糖的組合物；其中所述變體淀粉酶催化所述淀粉溶液到葡萄糖的糖化。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述包含淀粉的組合物包含液化淀粉、糊化淀粉或顆粒淀粉。
36.根據(jù)權(quán)利要求34-35中任一項所述的方法，其中所述糖化在約30°C至約75°C的溫度范圍內(nèi)進行。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述溫度范圍為47°C_74°C。
38.根據(jù)權(quán)利要求34- 37中任一項所述的方法，其中所述糖化在pH2.0-7.5的pH范圍內(nèi)進行。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述pH范圍為pH3.5 - 5.5。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述pH范圍為pH3.5 - 4.5。
41.根據(jù)權(quán)利要求34-40中任一項所述的方法，所述方法還包括使所述葡萄糖組合物發(fā)酵以制備發(fā)酵最終(EOF)產(chǎn)物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述發(fā)酵是同時糖化和發(fā)酵(SSF)反應。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的方法，其中所述發(fā)酵在pH2-8下并且在25°C- 70°C的溫度范圍內(nèi)進行48-70小時。
44.根據(jù)權(quán)利要求41-43中任一項所述的方法，其中所述EOF產(chǎn)物包含乙醇。
45.根據(jù)權(quán)利要求41- 44中任一項所述的方法，其中所述EOF產(chǎn)物包含8-18% (v/v)乙醇。
46.根據(jù)權(quán)利要求41- 45中任一項所述的方法，其中所述方法還包括使麥芽漿和/或麥芽汁與淀粉酶接觸。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述方法還包括: (a)制備麥芽衆(zhòng)；(b)過濾所述麥芽漿以得到麥芽汁；以及 (c)使所述麥芽汁發(fā)酵以獲得發(fā)酵飲料， 其中將根據(jù)權(quán)利要求1-16和74-80中任一項所述的變體淀粉酶添加至: (i)步驟(a)的麥芽漿和/或 (ii)步驟(b)的麥芽汁和/或 (iii)步驟(c)的麥芽汁。
48.根據(jù)權(quán)利要求41-47中任一項所述的方法，其中所述EOF產(chǎn)物包含代謝物。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述代謝物是檸檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸S-內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉、Ω-3脂肪酸、丁醇、氨基酸、賴氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或異戊二烯。
50.根據(jù)權(quán)利要求34- 49中任一項所述的方法，所述方法還包括將葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、磷酸酶、植酸酶、支鏈淀粉酶、β -淀粉酶、不是所述變體α-淀粉酶的α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、異淀粉酶、氧化還原酶、酯酶、轉(zhuǎn)移酶、果膠酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶或它們的組合添加至所述淀粉溶液。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中添加所述葡糖淀粉酶達到0.1 -2個葡糖淀粉酶單位(GAU)/g dso
52.根據(jù)權(quán)利要求34-51中任一項所述的方法，其中所述淀粉酶由宿主細胞表達和分泌。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中使所述包含淀粉的組合物與所述宿主細胞接觸。
54.根據(jù)權(quán)利要求52或53所述的方法，其中所述宿主細胞還表達和分泌葡糖淀粉酶或其他酶。
55.根據(jù)權(quán)利要求52-54中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞能使所述組合物發(fā)酵。
56.一種組合物，所述組合物包含通過根據(jù)權(quán)利要求34-55中任一項所述的方法制備的葡萄糖。
57.一種液化淀粉，所述液化淀粉通過根據(jù)權(quán)利要求34-55中任一項所述的方法制備。
58.一種發(fā)酵飲料，所述發(fā)酵飲料通過根據(jù)權(quán)利要求34-55中任一項所述的方法制備。
59.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉酶的用途，其用于制備包含葡萄糖的組合物。
60.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉酶的用途，其用于制備液化淀粉。
61.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉酶的用途，其用于制備發(fā)酵飲料。
62.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉酶的用途，其用于清潔含淀粉污潰。
63.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉酶的用途，其用于紡織物退漿。
64.根據(jù)權(quán)利要求34-55中任一項所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求58所述的發(fā)酵飲料或根據(jù)權(quán)利要求61所述的用途，其中所述發(fā)酵飲料或發(fā)酵最終產(chǎn)物選自 (i)選自如下的啤酒:全麥芽啤酒、根據(jù)“純凈法”釀造的啤酒、愛爾啤酒、IPA、拉格啤酒、苦啤酒、低麥芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麥芽酒、無酒精啤酒和無酒精麥芽酒；和 (ii)選自如下的谷物或麥芽飲料:水果味麥芽飲料、酒味麥芽飲料和咖啡味麥芽飲料。
65.—種制備食品組合物的方法，所述方法包括:將如下物質(zhì)合并: (i)一種或多種食品成分，和 (ii)根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的變體α-淀粉酶， 其中所述變體淀粉酶催化所述食品成分中存在的淀粉組分的水解而產(chǎn)生葡萄糖。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述食品組合物選自食品、烘焙組合物、食品添加劑、動物食品、飼料產(chǎn)品、飼料添加劑、油、肉和豬油。
67.根據(jù)權(quán)利要求65-66中任一項所述的方法,其中所述一種或多種食品成分包含烘培成分或添加劑。
68.根據(jù)權(quán)利要求65-67中任一項所述的方法,其中所述一種或多種食品成分選自:面粉；抗變陳淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麥芽α-淀粉酶或其具有生麥芽α-淀粉酶活性的變體、同源物或突變體；烘培食品用木聚糖酶；和脂肪酶。
69.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述一種或多種食品成分選自: (i)來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的生麥芽糖α-淀粉酶， (ii)來自芽孢桿菌屬(Bacillus)、曲霉屬(Aspergillus)、嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces)或木霉屬(Trichoderma)的烘焙食品用木聚糖酶， (iii)來自異孢鐮孢菌(Fusariumheterosporum)的糖脂酶。
70.根據(jù)權(quán)利要求65-69中任一項所述的方法，其中所述食品組合物包含生面團或生面團產(chǎn)品，優(yōu)選經(jīng)加工的生面團產(chǎn)品。
71.根據(jù)權(quán)利要求65-70中任一項所述的方法，所述方法還包括烘焙所述食品組合物以制備烘焙物。
72.根據(jù)權(quán)利要求65-70中任一項所述的方法，其中所述方法還包括: (i)提供淀粉介質(zhì)； (ii)向所述淀粉介質(zhì)添加淀粉酶；以及 (iii)在步驟(b)期間或之后給所述淀粉介質(zhì)加熱以制備烘焙產(chǎn)品。
73.一種使紡織物退漿的方法，所述方法包括使退漿組合物與上漿紡織物接觸足以使所述紡織物退漿的時間，其中所述退漿組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的變體α -淀粉酶。
74.—種分離的多核苷酸,所述多核苷酸編碼根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的多肽。
75.—種表達載體,所述表達載體包含根據(jù)權(quán)利要求74所述的多核苷酸。
76.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含根據(jù)權(quán)利要求75所述的表達載體。
【文檔編號】C11D3/386GK103917642SQ201280052976
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】L·G·卡斯康-佩雷拉, D·A·埃斯特爾, M·科爾克曼, H·穆爾德 申請人:丹尼斯科美國公司