纖維二糖水解酶變體和編碼它們的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及纖維二糖水解酶變體。本發(fā)明還涉及編碼這些變體的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、以及宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生并使用這些變體的方法。
【專利說明】纖維二糖水解酶變體和編碼它們的多核苷酸
[0001 ] 關(guān)于在聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)下完成的發(fā)明的權(quán)利的聲明
[0002]本發(fā)明是根據(jù)能源部授予的合作協(xié)議DE-FC36-08G018080在政府支持下完成的。政府在本發(fā)明中擁有一定權(quán)利。
[0003]序列表的引用
[0004]本申請(qǐng)包含一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，該序列表通過引用結(jié)合在此。
[0005]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0006]本發(fā)明涉及纖維二糖水解酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、以及產(chǎn)生和使用這些變體的方法。
[0007]相關(guān)技術(shù)說明
[0008]纖維素是單糖葡萄糖通過β -1, 4-鍵共價(jià)連接的一種聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解連接葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在任意位置消化纖維素聚合物，使其打開而被纖維二糖水解酶攻擊。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的一種水溶性β -1, 4-連接的二聚體。β -葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。
[0009]將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化成乙醇具有如下優(yōu)點(diǎn)，即易于獲得大量原料、避免燃燒或填埋材料的合意性、以及乙醇燃料的清潔性?，F(xiàn)在認(rèn)為木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物、和城市固體廢物是生產(chǎn)乙醇的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素、以及木質(zhì)素組成。一旦將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的糖，例如葡萄糖，那么這些可發(fā)酵的糖就可以容易地被酵母發(fā)酵成乙醇。
[0010]W02011/050037披露了具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的土生梭孢殼霉(Thielaviaterrestris)纖維二糖水解酶變體。W02011/050037披露了具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的煙曲霉(Aspergillus fumigatus)纖維二糖水解酶變體。
[0011]本發(fā)明提供具有增加的熱穩(wěn)定性的纖維二糖水解酶變體。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明涉及分離的纖維二糖水解酶變體，這些變體包含在與SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))位置處的取代，其中這些變體具有纖維二糖水解酶活性。
[0014]本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、以及宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些變體的方法。
[0015]本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，該方法包括:在本發(fā)明的纖維二糖水解酶變體的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。在一方面，這些方法進(jìn)一步包括回收所降解的或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。 [0016]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生一種發(fā)酵產(chǎn)物的方法，這些方法包括:(a)在本發(fā)明的纖維二糖水解酶變體的存在下，用一種酶組合物使纖維素材料糖化；(b)用一種或多種(例如，數(shù)種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且(C)從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0017]本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，這些方法包括:用一種或多種(例如，數(shù)種)發(fā)酵微生物發(fā)酵該纖維素材料，其中在本發(fā)明的纖維二糖水解酶變體的存在下用一種酶組合物使該纖維素材料糖化。在一方面，發(fā)酵該纖維素材料產(chǎn)生一種發(fā)酵產(chǎn)物。在另一方面，這些方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0018]附圖簡要說明
[0019]圖1示出編碼具有纖維二糖水解酶活性的GH6多肽的嗜熱真菌絲衣霉?fàn)罨@狀菌(Talaromycesbyssochlamydoides)基因的基因組DNA序列(SEQ ID NO:1)和推導(dǎo)的氛基酸序列(SEQ ID NO:2) ο
[0020]圖2示出嗜熱真菌絲衣霉?fàn)罨@狀菌家族GH6A纖維二糖水解酶變體的熱穩(wěn)定性。
[0021]定義
[0022]乙酰木聚糖酯酶:術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶”意指一種羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶恰⒁阴；咎恰⒁阴；咸烟?、乙酸α -萘酯、以及乙酸對(duì)硝基苯酯的水解。出于本發(fā)明的目的，在含有0.01% TWEEN?20(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯)的50mM乙酸鈉(pH5.0)中使用0.5mM乙酸對(duì)硝基苯酯作為底物來測定乙酰木聚糖酯酶活性。一個(gè)單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5、25°C下每分鐘釋放I微摩爾的對(duì)硝基苯酚陰離子的酶的量。
[0023]等位基因變體:術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多種替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，且可導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(所編碼的多肽沒有變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0024]a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶:術(shù)語“ a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一種a -L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對(duì)a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶還被稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本發(fā)明的目的，使用每ml的IOOmM乙酸鈉(pH5)中5mg的中等粘度小麥阿拉伯糖基木聚糖(麥格酶國際愛爾蘭股份有限公司(MegazymeInternational Ireland, Ltd.),愛爾蘭威克洛郡布瑞公司(Bray, C0.Wicklow, Ireland)以
總體積200 μ I在40°C下持續(xù)30分鐘，接著通過AMINEX? HPX-87H柱色譜(伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)，美國加州赫拉克勒斯(Hercules, CA, USA)進(jìn)行阿拉伯糖分析來測定a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0025]α -葡糖醛酸糖苷酶:術(shù)語“ α -葡糖醛酸糖苷酶”意指一種a -D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)，其催化a -D-葡糖醛酸糖苷到D-葡糖醛酸和醇的水解。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)德弗里斯(de Vries)，1998，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.) 180:243-249來測定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一個(gè)單位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能夠在PH5、40°C下每分鐘釋放I微摩爾的葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶的量。[0026]β -葡糖苷酶:術(shù)語“ β -葡糖苷酶”意指一種β -D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，其催化末端非還原性β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β -D-葡萄糖。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)文丘里(Venturi)等人，2002，來自嗜熱毛殼菌嗜糞變種的胞外β-D-葡糖苷酶:產(chǎn)生、純化以及一些生物化學(xué)特性(Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophiIum:production, purification and somebiochemical properties),基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志(J.Basic Microbiol.) 42:55-66 的程序使用對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷作為底物來測定β -葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的β -葡糖苷酶定義為在25V、ρΗ4.8下，在含有0.01%TWEEN? 20的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對(duì)硝基苯酚陰離子。
[0027]β -木糖苷酶:術(shù)語“β -木糖苷酶”意指一種β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β (I —4)_木寡糖的外切水解，以從非還原性末端去除連續(xù)的D-木糖殘基。出于本發(fā)明的目的，一個(gè)單位的木糖苷酶定義為在40°C、pH5下在含有0.01%TWEEN? 20的IOOmM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-β -D-木糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對(duì)硝基苯酚陰離子。
[0028]cDNA:術(shù)語“cDNA”意指可以通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相對(duì)應(yīng)的基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，它通過一系列的步驟(包括剪接)加工，然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。
[0029]纖維二糖水解酶:術(shù)語“纖維二糖水解酶”意指一種1，4- β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和Ε.C.3.2.1.176)，其催化纖維素、纖維寡糖、或任何含有β -1, 4-連接葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從而從鏈的還原性末端(纖維二糖水解酶I)或非還原性末端(纖維二糖水解酶II)釋放纖維二糖(泰里(Teeri)，1997，生物技術(shù)趨勢(Trends in Biotechnology) 15:160-167 ;泰里等人，1998,生物化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊(Biochem.Soc.Trans.) 26:173-178)。根據(jù)里弗(Lever)等人，1972,分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.) 47:273-279 ;范.帝伯赫(van Tilbeurgh)等人，1982,歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Letters), 149:152-156 ;范.帝伯赫和克萊森斯(Claeyssens)，1985，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)，187:283-288 ;以及湯美(Tomme)等人，1988，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.) 170:575-581所描述的程序來測定纖維二糖水解酶活性。
[0030]纖維素分解酶或纖維素酶:術(shù)語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(例如，數(shù)種)水解纖維素材料的酶。這類酶包括一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶、一種或多種纖維二糖水解酶、一種或多種β_葡糖苷酶、或其組合。用于測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括:(I)測量總纖維素分解活性，并且(2)測量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及葡糖苷酶)，如在張(Zhang)等人，纖維素酶改進(jìn)的展望:篩選和選擇策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and selectionstrategies), 2006,生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnology Advances) 24:452-481 中所綜述的?？偫w維素分解活性通常使用不溶性底物來測量，這些底物包括瓦特曼(Whatman)I號(hào)濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素等等。最常見的總纖維素分解活性測定是使用瓦特曼I號(hào)濾紙作為底物的濾紙測定。該測定是由國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC))(高斯(Ghose),1987,纖維素酶活性的測量(Measurement of cellulase activities),純粹與應(yīng)用化學(xué)(Pure Appl.Chem.) 59:257-68)確立的。
[0031]出于本發(fā)明的目的，通過測量在以下條件下與未添加纖維素分解酶蛋白的對(duì)照水解相比，由一種或多種纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來測定纖維素分解酶活性:l-50mg的纖維素分解酶蛋白/g于PCS中的纖維素(或其他預(yù)處理的纖維素材料)，在適合的溫度(如40 V -80 V，例如50°C、55°C、60°C、65°C、或70 V )和適合的pH (如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持續(xù)3_7天。典型條件為:Iml反應(yīng)，洗滌或未洗滌的預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉(pH5)，ImMMnSO4, 50°C、55°C、或60°C，72小時(shí)，通過AMINEX? HPX-87H柱(伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司，美國加州赫拉克勒斯)進(jìn)行的糖分析。
[0032]纖維素材料:術(shù)語“纖維素材料”意指含有纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，而第三豐富的是果膠。細(xì)胞停止生長后產(chǎn)生的次生細(xì)胞壁也包含多糖，并且它通過與半纖維素共價(jià)交聯(lián)的聚合木質(zhì)素得到強(qiáng)化。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此是一種線性β_ (1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如具有一系列取代基以復(fù)雜支鏈結(jié)構(gòu)存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。盡管纖維素一般為多態(tài)的，但發(fā)現(xiàn)其在植物組織中主要以平行葡聚糖鏈的不溶性晶體基質(zhì)存在。半纖維素通常氫鍵合至纖維素以及其他半纖維素，這有助于穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。
[0033]纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮、以及穗軸，或樹的葉、枝、以及木材中。纖維素材料可以是，但不限于:農(nóng)業(yè)殘余物、草本材料(包括能源作物)、城市固體廢物、紙漿和造紙 廠殘余物、廢紙、以及木材(包括林業(yè)殘余物)(參見，例如，維色洛戈?duì)?Wiselogel)等人，1995,于生物乙醇手冊(cè)(Handbook on Bioethanol)(查爾斯.E.懷曼(Charles E.Wyman)編輯)，第105-118頁，泰勒弗朗西斯出版集團(tuán)(Taylor&Francis)，華盛頓特區(qū)(Washington D.C.);懷曼(Wyman)，1994,生物資源技術(shù)(Bioresource Technology) 50:3-16 ；林德(Lynd)，1990,應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(Applied Biochemistry and Biotechnology) 24/25:695-719 ；莫思爾(Mosier)等人，1999,木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化的最近進(jìn)展(Recent Progress in Bioconversionof Lignocellulosics),生物化學(xué)工程 / 生物技術(shù)的進(jìn)展(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology), T ?謝伯(T.Scheper)主編,第 65 卷，第 23-40 頁，紐約斯普林格出版社(Springer-Verlag, New York)。在此應(yīng)理解的是,纖維素可以是呈以下形式:木質(zhì)纖維素、包含木質(zhì)素的植物細(xì)胞壁材料、纖維素、以及混合基質(zhì)中的半纖維素。在一個(gè)優(yōu)選方面，纖維素材料是任何生物質(zhì)材料。在另一個(gè)優(yōu)選方面，纖維素材料是木質(zhì)纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。
[0034]在一方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一方面，纖維素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一方面，纖維素材料是廢紙。在另一方面，纖維素材料是木材(包括林業(yè)殘余物)。
[0035]在另一方面，纖維素材料是蘆竹。在另一方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一方面，纖維素材料是竹材。在另一方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一方面，纖維素材料是芒草。在另一方面，纖維素材料是橙皮。在另一方面，纖維素材料是稻草。在另一方面，纖維素材料是柳枝稷。在另一方面，纖維素材料是小麥桿。
[0036]在另一方面，纖維素材料是山楊。在另一方面，纖維素材料是桉樹。在另一方面，纖維素材料是冷杉。在另一方面，纖維素材料是松樹。在另一方面，纖維素材料是白楊。在另一方面，纖維素材料是云杉。在另一方面，纖維素材料是柳樹。
[0037]在另一方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一方面，纖維素材料是棉絨。在另一方面，纖維素材料是濾紙。在另一方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一方面，纖維素材料是磷酸處理的纖維素。
[0038]在另一方面，纖維素材料是一種水生生物質(zhì)。如在此所使用，術(shù)語“水生生物質(zhì)”意指在水生環(huán)境中通過光合作用過程產(chǎn)生的生物質(zhì)。水生生物質(zhì)可以是藻類、挺水植物、浮葉植物、或沉水植物。 [0039]纖維素材料可以按原樣使用或可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理，如在此所描述。在一個(gè)優(yōu)選方面，纖維素材料進(jìn)行了預(yù)處理。
[0040]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”意指直接指定一個(gè)變體的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框決定，該開放閱讀框以起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始，并且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA、或其組合。
[0041]控制序列:術(shù)語“控制序列”意指對(duì)于表達(dá)編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸來說必需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對(duì)于彼此是原生的或外源的。這類控制序列包括但不限于:前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼一種變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè)接頭。
[0042]內(nèi)切葡聚糖酶:術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指一種內(nèi)切-1，4-(1, 3 ;1，4)-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中的1，4-β -D-糖苷鍵和混合β -1, 3葡聚糖如谷類β -D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纖維素組分的其他植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)切水解。可以通過測量底物粘度的降低或通過還原糖測定所確定的還原性末端的增加來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性(張等人，2006，生物技術(shù)進(jìn)展24:452-481)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)高斯，1987，純粹與應(yīng)用化學(xué)59:257-268的程序，在pH5、40°C下使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0043]表達(dá):術(shù)語“表達(dá)”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于:轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0044]表達(dá)載體:術(shù)語“表達(dá)載體”意指包含編碼一種變體的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供其表達(dá)的控制序列的線性或環(huán)形DNA分子。
[0045]家族61糖苷水解酶:術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根據(jù)亨利薩特B.(Henrissat B.)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分類(Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities),生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)280:309-316 ;和亨利薩特B.和貝洛赫A.(Bairoch A.)，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分類(Updating the sequence-based classification ofglycosyl hydrolases),生物化學(xué)雜志316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。這個(gè)家族中的酶最初基于在一個(gè)家族成員中測量到的非常弱的內(nèi)切-1，4- β -D葡聚糖酶活性而被分類為糖苷水解酶家族。這些酶的結(jié)構(gòu)和作用模式是不規(guī)范的，并且它們不能被視為真正的糖苷酶。然而，基于它們?cè)谂c纖維素酶或纖維素酶的混合物結(jié)合使用時(shí)增強(qiáng)木質(zhì)纖維素分解的能力，它們被保留在CAZy分類中。
[0046]阿魏酸酯酶:術(shù)語“阿魏酸酯酶“意指4-羥基-3-甲氧基肉桂?；?糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂?；?阿魏?；?基團(tuán)從酯化的糖(其在天然生物質(zhì)底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸酯(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)也被稱為阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羥基肉桂?；ッ浮AE-1I1、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-1、或FAE-1I。出于本發(fā)明的目的，在50mM乙酸鈉(pH5.0)中使用0.5mM阿魏酸對(duì)硝基苯酯作為底物來測定阿魏酸酯酶活性。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶等于能夠在pH5、25°C下每分鐘釋放I微摩爾的對(duì)硝基苯酚陰離子的酶的量。
[0047]片段:術(shù)語“片段”意指缺失其成熟多肽的氨基和/或羧基末端的一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))氨基酸的多肽，其中該片段具有纖維二糖水解酶活性。在一方面，片段包含纖維二糖水解酶的成熟多肽的至少85%的氨基酸殘基，例如至少90%的氨基酸殘基、或至少95%的氨基酸殘基。
[0048]半纖維素分解酶或半纖維素酶:術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(例如，數(shù)種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如，沙洛姆*D.(Shallom, D.)和肖漢姆.Υ.(Shoham, Y.),微生物半纖維素酶(Microbial hemicellulases),微生物學(xué)新見(Current Opinion In Microbiology) ,2003,6(3): 219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關(guān)鍵組分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。這些酶的底物即半纖維素是支鏈和線性多糖的異質(zhì)群體，這些多糖經(jīng)由氫與植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維鍵合，從而將它們交聯(lián)成一個(gè)穩(wěn)固網(wǎng)絡(luò)。半纖維素還共價(jià)附接至木質(zhì)素，從而與纖維素一起形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變結(jié)構(gòu)和組織要求許多酶的協(xié)同作用以使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊是水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸側(cè)基的酯鍵的碳水化合物酯酶(CE)。這些催化模炔基于它們一級(jí)序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有總體相似的折疊的一些家族可以進(jìn)一步被分組為以字母標(biāo)記的氏族(例如，GH-A)。這些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分類可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-ActiveEnzymes) (CAZy)數(shù)據(jù)庫中獲得。可以根據(jù)高斯和比薩拉(Bisaria)，1 987，純粹與應(yīng)用化學(xué)59:1739-1752，在適合的溫度(例如50°C、55°C、或60 0C )和pH(例如5.0或5.5)下測量半纖維素分解酶活性。
[0049]高嚴(yán)格度條件:術(shù)語“高嚴(yán)格度條件”意指對(duì)于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且變性的鮭魚精子DNA、以及50%的甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。將載體材料最終使用2X SSC,0.2% SDS在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0050]宿主細(xì)胞:術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的該親本細(xì)胞的任何子代。
[0051]改進(jìn)的特性:術(shù)語“改進(jìn)的特性”意指與一種變體相關(guān)的相對(duì)于親本有所改進(jìn)的特征。這種改進(jìn)的特性包括但不限于增加的熱穩(wěn)定性。
[0052]增加的熱穩(wěn)定性:術(shù)語“增加的熱穩(wěn)定性”意指相對(duì)于親本，在某一溫度下孵育一段時(shí)期之后變體的纖維二糖水解酶活性的更高程度的保留。變體相對(duì)于親本的增加的熱穩(wěn)定性可以例如在一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))溫度的條件下進(jìn)行評(píng)估。例如，該一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))溫度可以是45°C至95°C范圍中的任何一個(gè)或多個(gè)溫度，例如，45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、*95°C (或在此之間，例如 62°C、67°C、68°C、72°C等)，一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))pH在3至9的范圍內(nèi)，例如3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0 (或在此之間)，持續(xù)適合時(shí)期(時(shí)間)的孵育，例如I分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、45分鐘、或60分鐘(或在此之間，例如23分鐘、37分鐘等)，這樣使得該變體保留殘余活性。然而，還可以使用更長時(shí)期的孵育。術(shù)語“增加的熱穩(wěn)定性”在此可以與“改進(jìn)的熱穩(wěn)定性”互換使用。
[0053]變體相對(duì)于親本的增加的熱穩(wěn)定性可以通過差示掃描量熱法(DSC)使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定(參見，例如，斯特蒂文特(Sturtevant), 1987,物理化學(xué)年評(píng)(AnnualReview of Physical Chemistry) 38:463-488)。變體相對(duì)于親本的增加的熱穩(wěn)定性還可以使用蛋白質(zhì)熱解折疊分析來確定。變體相對(duì)于親本的增加的熱穩(wěn)定性還可以使用用于該變體的其中將變體的性能與親本相比較的任何應(yīng)用測定來確定。例如，可以使用實(shí)例8中所描述的應(yīng)用測定。
[0054]分離的:術(shù)語“分離的”意指處于非天然存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括:(I)任何非天然存在的物質(zhì)；(2)至少部分地從與其天然相關(guān)聯(lián)的一種或多種或所有天然存在的成分中去除的任何物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；⑶相對(duì)于在自然界中發(fā)現(xiàn)的那種物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對(duì)于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分增加該物質(zhì)的量(例如，宿主細(xì)胞中的重組體產(chǎn)量；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；以及比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用)而修飾的任何物質(zhì)。
[0055]低嚴(yán)格度條件:術(shù)語“低嚴(yán)格度條件”意指對(duì)于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且變性的鮭魚精子DNA、以及25%的甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。將載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0056] 成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后處于其最終形式的多肽。在一方面，基于預(yù)測SEQ ID NO:2的氨基酸I至19是信號(hào)肽的SignaIP程序(尼爾森(Nielsen)等人，1997，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering) 10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至456。在本領(lǐng)域中已知的是，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同的成熟多肽(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。
[0057]成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有纖維二糖水解酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，基于預(yù)測SEQ ID NO:1的核苷酸I至57編碼信號(hào)肽的SignalP程序(尼爾森等人，1997，同上)，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸58至1786或其cDNA序列。
[0058]術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在此應(yīng)理解為包括基因組DNA序列的cDNA序列或cDNA序列的基因組DNA序列。
[0059]中等嚴(yán)格度條件:術(shù)語“中等嚴(yán)格度條件”意指對(duì)于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且變性的鮭魚精子DNA、以及35%的甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。將載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS在55°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0060]中-高等嚴(yán)格度條件:術(shù)語“中-高等嚴(yán)格度條件”意指對(duì)于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且變性的鮭魚精子DNA、以及35%甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。將載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0061]突變體:術(shù)語“突變體”意指編碼一種變體的一種多核苷酸。
[0062]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指從天然存在的基因中分離的、或以自然中不會(huì)另外出現(xiàn)的方式被修飾成包含核酸區(qū)段的、或是合成的單鏈抑或雙鏈的核酸分子，它包含一個(gè)或多個(gè)控制序列。 [0063]可操作地連接:術(shù)語“可操作地連接”意指這樣一種構(gòu)型，其中控制序列相對(duì)于多核苷酸的編碼序列置于適當(dāng)位置處，這樣使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。
[0064]親本或親本纖維二糖水解酶:術(shù)語“親本”或“親本纖維二糖水解酶”意指對(duì)其做出改變以產(chǎn)生本發(fā)明的纖維二糖水解酶變體的一種纖維二糖水解酶。親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體或片段。
[0065]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽:術(shù)語“具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽”意指催化具有纖維素分解活性的酶對(duì)纖維素材料的水解的增強(qiáng)的GH61多肽。出于本發(fā)明的目的，通過測量在以下條件下與用相等的總蛋白質(zhì)負(fù)載量而無纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/g于PCS中的纖維素)的對(duì)照水解相比，來自由纖維素分解酶水解纖維素材料的還原糖的增加或纖維二糖與葡萄糖總量的增加來測定纖維素分解增強(qiáng)活性:l-50mg總蛋白質(zhì)/g于預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)中的纖維素，其中總蛋白質(zhì)由50% -99.5% w/w纖維素分解酶蛋白和0.5%-50% w/w具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的蛋白質(zhì)組成，在適合的溫度(如40V -80°C，例如，50°C、55°C、60°C、65°C、或70V )和適合的pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持續(xù)1_7天。在一個(gè)優(yōu)選方面，使用在總蛋白質(zhì)重量的2% -3%的米曲霉(Aspergillus oryzae) β -葡糖苷酶(根據(jù)W002/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或總蛋白質(zhì)重量的2%-3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如W02002/095014中所描述
在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白負(fù)載量的存在下CELLUCLAST? 1.5L(諾維信公司(Novozymes A/S),丹麥巴格斯瓦爾德(Bagsvaerd，Denmark))的混合物作為纖維素分解活性的來源。[0066]用于確定GH61多肽的纖維素分解增強(qiáng)活性的另一種測定是在40°C下將GH61多肽與0.5%磷酸溶脹纖維素(PASC) UOOmM乙酸鈉(pH5)、ImM MnS04、0.1 %沒食子酸、0.025mg/
ml的煙曲霉β -葡糖苷酶、以及0.01 % TRITON? XlOO —起孵育24-96小時(shí)，接著測定從
PASC釋放的葡萄糖。
[0067]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過將達(dá)到相同的水解程度所需要的纖維素分解酶的量降低優(yōu)選至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，來增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解。
[0068]預(yù)處理的玉米秸桿:術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸桿”意指通過熱和稀硫酸處理、堿預(yù)處理、中性預(yù)處理、或本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理從玉米秸桿得到的纖維素材料。
[0069]序列一致性:兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性通過參數(shù)“序列一致性”來描述。
[0070]出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),賴斯(Rice)等人，2000,遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德爾曼和翁施，1970,分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來測定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位擴(kuò)展罰分0.5以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用尼德爾標(biāo)記為“最長一致性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比一致性并且計(jì)算如下:
[0071](一致的殘基X100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中的空位總數(shù))
[0072]出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯等人，2000,同上)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，同上)來測定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位擴(kuò)展罰分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用尼德爾標(biāo)記為“最長一致性”的輸出(使用-nobrief?選項(xiàng)獲得)作為百分比一致性并且計(jì)算如下:
[0073](一致的脫氧核糖核酸X100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中的空位總數(shù))
[0074]子序列:術(shù)語“子序列”意指缺失成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端的一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))核苷酸的多核苷酸，其中該子序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的片段。在一方面，一個(gè)子序列包含纖維二糖水解酶的成熟多肽編碼序列的至少85%的核苷酸，例如至少90%的核苷酸或至少95%的核苷酸。
[0075]變體:術(shù)語“變體”意指具有纖維二糖水解酶活性的、包含一個(gè)改變(即在一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))位置處的一個(gè)取代、插入和/或缺失)的一個(gè)多肽。取代意指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸被一個(gè)不同的氨基酸替代；缺失意指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸的去除；并且插入意指鄰近于并且緊跟著占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸之后添加一個(gè)氨基酸。本發(fā)明的變體具有其親本纖維二糖水解酶的纖維二糖水解酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0076]極高嚴(yán)格度條件:術(shù)語“極高嚴(yán)格度條件”意指對(duì)于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且變性的鮭魚精子DNA、以及50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。將載體材料最終使用2X SSC,0.2% SDS在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0077]極低嚴(yán)格度條件:術(shù)語“極低嚴(yán)格度條件”意指對(duì)于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且變性的鮭魚精子DNA、以及25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。將載體材料最終使用2X SSC,0.2% SDS在45°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0078]野生型纖維二糖水解酶:術(shù)語“野生型”纖維二糖水解酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌)表達(dá)的一種纖維二糖水解酶。 [0079]含有木聚糖的材料:術(shù)語“含有木聚糖的材料”意指包含含有β -(1-4)連接木糖殘基主鏈的植物細(xì)胞壁多糖的任何材料。陸生植物的木聚糖是具有i3-(l_4)-D-吡喃木糖主鏈的雜聚物，其通過短的碳水化合物鏈分支。它們包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚，L-阿拉伯糖、和/或由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖組成的不同寡糖。木聚糖類型的多糖可以分為均木聚糖和雜木聚糖，這些雜木聚糖包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及復(fù)合雜木聚糖。參見，例如，埃伯林格羅瓦(Ebringerova)等人,2005,聚合物科學(xué)進(jìn)展(Adv.Polym.Sc1.) 186:1-67。
[0080]木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于測量木聚糖分解活性的兩種基本方法包括:(1)測量總木聚糖分解活性，并且(2)測量單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如，內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶測定的最近進(jìn)展總結(jié)于若干出版物中，這些出版物包括:別雷(Biely)和普喬爾德(Puchard)，2006，食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志(Journal of theScience of Food and Agriculture) 86 (II): 1636-1647 ;斯帕尼科瓦(Spanikova)和別雷，2006,葡糖醒酸酯酶-由裂裙菌產(chǎn)生的新穎碳水化合物酯酶(Glucuronoyl esterase-Novelcarbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune)，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)580(19):4597-4601 ;赫爾曼(Herrmann)、沃散斯卡(Vrsanska)、尤日奇科娃(Jurickova)、赫西(Hirsch)、別雷、以及庫比切克(Kubicek), 1997,里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一種多功能 β _D_ 木聚糖木糖水解酶(The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is amultifunctional beta-D-xylan xylohydrolase),生物化學(xué)雜志 321:375-381。
[0081]總木聚糖降解活性可以通過測定由不同類型的木聚糖(包括例如燕麥(oatspelt)木聚糖、山毛櫸木木聚糖、以及落葉松木木聚糖)形成的還原糖，或通過光度法測定從不同共價(jià)染色的木聚糖釋放的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定是基于從聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如貝利(Bailey)、別雷、剖坦恩(Poutanen), 1992,用于木聚糖酶活性的測定方法的實(shí)驗(yàn)室間測試(Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity)，生物技術(shù)雜志(Journal ofBiotechnology) 23 (3): 257-270中所述。木聚糖酶活性還可以在37 °C下在0.01 %TRITON? Χ-100 (4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸鈉緩沖液(pH6)中用0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作為底物來測定。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C、pH6下在200mM磷酸鈉(pH6)中從作為底物的0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青蛋白。
[0082]出于本發(fā)明的目的，通過測量在以下典型條件下由一種或多種木聚糖降解酶引起的樺木木聚糖(西格瑪化學(xué)有限公司(SigmaChemical C0.，Inc.),美國密蘇里州圣路易斯(St.Louis，MO，USA))水解的增加來確定木聚糖降解活性:1ml反應(yīng)、5mg/ml底物(總固體)、5mg木聚糖分解蛋白/g底物、50mM乙酸鈉(pH5)、50°C、24小時(shí)，使用如里弗(Lever), 1972,用于碳水化合物的比色測定的新反應(yīng)(A new reaction for colorimetricdetermination of carbohydrates)，分析生物化學(xué)47:273-279所描述的對(duì)羥基苯甲酸酸餅(PHBAH)測定進(jìn)行糖分析。
[0083]木聚糖酶:術(shù)語“木聚糖酶”意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1，4- β -D-木糖苷鍵的內(nèi)切水解。出于本發(fā)明的目的，在37°C下在
0.01%TRITON? X-100和200mM磷酸鈉緩沖液(pH 6)中用0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚
糖作為底物來測定木聚糖酶活性。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C、pH6下在200mM磷酸鈉(PH6)中從作為底物的0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青蛋白。
[0084]用于變體命名的規(guī)則
[0085]出于本發(fā)明的目的，在SEQ ID N0:2中披露的成熟多肽用于確定另一種纖維二糖水解酶中相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。將另一種纖維二糖水解酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽進(jìn)行比對(duì)，并且基于該比對(duì)，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯等人，2000,遺傳學(xué)趨勢16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，分子生物學(xué)雜志48:443-453)來確定與SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸位置編號(hào)。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位擴(kuò)展罰分0.5以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。氨基酸位置的編號(hào)是基于SEQ ID NO: 2的全長多肽(例如，包括信號(hào)肽)，其中位置I是信號(hào)肽的第一個(gè)氨基酸(例如，Met)。
[0086]另一種纖維二糖水解酶中相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基的鑒別可以通過使用若干計(jì)算機(jī)程序使用其對(duì)應(yīng)的缺省參數(shù)比對(duì)多個(gè)多肽序列來確定，這些計(jì)算機(jī)程序包括但不限于MUSCLE (通過對(duì)數(shù)期望值的多序列比較；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research) 32:1792-1797) ;MAFFT (6.857 版或更新版本；加藤(Katoh)和庫瑪(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066 ;加藤等人，2005，核酸研究33:511-518 ;加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息學(xué)(Bioinformatics) 23:372-374 ;加藤等人，2009，分子生物學(xué)中的方法(Methods in Molecular Biology) 537: 39-64 ;加藤和朝都，2010，生物信息學(xué)26:1899-1900);以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA (1.83版或更新版本；湯普森等人，1994，核酸研究 22:4673-4680)。
[0087] 當(dāng)另一個(gè)纖維二糖水解酶與SEQ ID NO:2的成熟多肽歧異使得傳統(tǒng)的基于序列的比較無法檢測出它們的關(guān)系時(shí)(林達(dá)爾(Lindahl)和埃洛氟松(Elofsson), 2000,分子生物學(xué)雜志295:613-615)時(shí)，可以使用其他配對(duì)序列比較算法。在基于序列的搜索中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(譜(profile))來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，PS1-BLAST程序通過迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個(gè)譜，并且能夠檢測遠(yuǎn)距離同源物(阿特休爾(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中具有一個(gè)或多個(gè)代表，那么可以實(shí)現(xiàn)甚至更大的靈敏度。程序如GenTHREADER(瓊斯(Jones)，1999，分子生物學(xué)雜志287:797-815 ;麥古芬(McGuffin)和瓊斯，2003，生物信息學(xué)19:874-881)利用來自不同來源(PS1-BLAST、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)比對(duì)譜、以及溶劑化勢)的信息作為預(yù)測查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物學(xué)雜志313:903-919的方法可以用于將未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于SCOP數(shù)據(jù)庫中的超家族模型進(jìn)行比對(duì)。這些比對(duì)進(jìn)而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于該目的而開發(fā)的多種工具可以評(píng)估這類模型的準(zhǔn)確度。
[0088]對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，數(shù)種工具和資源可用于檢索并且產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如，蛋白的SCOP超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了比對(duì)，并且那些比對(duì)是可訪問的并且可下載的。兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以使用多種算法，如距離比對(duì)矩陣(Holm(霍爾姆)和桑德爾(Sander), 1998,蛋白質(zhì)(Proteins) 33:88-96)或組合擴(kuò)展(辛迪亞洛夫(Shindyalov)和博爾內(nèi)(Bourne)，1998，蛋白質(zhì)工程11:739-747)進(jìn)行比對(duì)，并且這些算法的實(shí)施可以另外用于查詢具有相關(guān)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，霍爾姆和帕克(Park)，2000，生物信息學(xué) 16:566-567)。
[0089]在描述本發(fā)明的纖維二糖水解酶變體中，以下所描述的命名法適于方便參考。采用已接受的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。
[0090]取代。對(duì)于氨基酸取代，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代被表示為“Thr226Ala”或“T226A”。多個(gè)突變由加號(hào)(“ + ”)分開，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分別在位置205和位置411處甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且絲氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
[0091]缺失。對(duì)于氨基酸缺失，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195處的甘氨酸缺失被表示為“Glyl95*”或者“G195*”。多個(gè)缺失由加號(hào)(“ + ”)分開，例如，“Glyl95*+Ser411*” 或 “G195*+S411*”。
[0092]插入。對(duì)于氨基酸插入，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸被表示為“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多個(gè)氨基酸的插入被表示為[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸被表示為“Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA”。
[0093]在這類情況下，通過將小寫字母添加至在所插入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置編號(hào)中來對(duì)所插入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。在以上實(shí)例中，該序列因此將是:
[0094]
【權(quán)利要求】
1.一種纖維二糖水解酶變體，包含在與SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，其中該變體具有纖維二糖水解酶活性。
2.如權(quán)利要求1所述的變體，該變體與親本纖維二糖水解酶的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的變體，該變體是選自下組的親本纖維二糖水解酶的一種變體，該組由以下各項(xiàng)組成:(a)與SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6、SEQ IDNO:8、SEQ IDNO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:58,SEQ ID N0:60、SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 110, SEQID NO: 112、SEQ ID NO: 114、或SEQ ID NO: 116的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽；(b)由在至少低嚴(yán)格度條件下與以下各項(xiàng)雜交的多核苷酸編碼的多肽:(i) SEQ ID NO: USEQID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:9、SEQ IDNO:ll、SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ I D NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ IDNO:41,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO: 53,SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO: 109,SEQ ID NO:1lUSEQ ID NO: 113、或 SEQ ID NO: 115 的成熟多肽編碼序列，或(ii) (i)的全長補(bǔ)體；(c)由與以下各項(xiàng)具有至少60%序列一致性的多核苷酸編碼的多肽:SEQ ID NO: K SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ IDNO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID N0:41、SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID N0:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59, SEQIDNO:61、SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 109、SEQ IDNO:1lUSEQ ID NO: 113、或SEQ ID NO: 115 的成熟多肽編碼序列;以及(d) SEQ ID NO: 2,SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO: 50,SEQ ID NO: 52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO: 110,SEQ ID NO: 112,SEQ ID NO: 114、或 SEQ ID NO: 116 的成熟多肽的片段，該變體具有纖維二糖水解酶活性。
4.如權(quán)利要求3所述的變體，其中該親本纖維二糖水解酶包含以下各項(xiàng)，或由其組成:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO: 14,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO: 50、SEQ IDNO: 52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:64,SEQ IDNO:66、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:70, SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 114、或SEQ ID NO: 116的成熟多肽；或其具有纖維二糖水解酶活性的片段。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的變體，該變體與SEQID NO: 2,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO: 52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO: 56,SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQID NO: 70、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 114、或 SEQ ID NO: 116 的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的變體，包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)取代，該組由以下各項(xiàng)組成:Y112H、V154M、S197Y、I228V、I261L、S306A、以及 G375E。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的變體，進(jìn)一步包含在與SEQID NO:2的成熟多肽的位置247、262、300、322、332、338、以及439相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，其中該變體具有纖維二糖水解酶活性。
8.如權(quán)利要求7所述的變體，進(jìn)一步包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)取代，該組由以下各項(xiàng)組成:A247S、T262K、N300D、V3221、D332N、E338K、以及 T439。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的變體，進(jìn)一步包含在與SEQID NO:2的成熟多肽的位置256、287、以及344相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，其中該變體具有纖維二糖水解酶活性。
10.如權(quán)利要求9所述的變體，進(jìn)一步包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)取代，該組由以下各項(xiàng)組成:C256L、L2871、以及 L344F。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的變體，該變體具有與該親本相比增加至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍的熱穩(wěn)定性。
12.—種分離的多核苷酸,該分離的多核苷酸編碼如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的變體。
13.—種產(chǎn)生纖維二糖水解酶變體的方法，該方法包括:(a)在適合于該變體的表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含如權(quán)利要求12所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞；并且任選地(b)回收該變體。
14.一種用如權(quán)利要求12所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。
15.—種產(chǎn)生如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的變體的方法，該方法包括:(a)在有益于該變體的產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含編碼該變體的多核苷酸的一種轉(zhuǎn)基因植物或一種植物細(xì)胞；并且任選地(b)回收該變體。
16.一種用于獲得纖維二糖水解酶變體的方法，該方法包括:在親本纖維二糖水解酶中與SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置112、154、197、228、261、306、以及375相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處引入取代，其中該變體具有纖維二糖水解酶活性；并且回收該變體。
17.一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，該方法包括:在如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的纖維二糖水解酶變體的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。
18.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括:(a)在如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的纖維二糖水解酶變體的存在下，用一種酶組合物使一種纖維素材料糖化；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵該糖化的纖維素材料，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且(c)從該發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
19.一種發(fā)酵纖維素材料的方法,該方法包括:用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵該纖維素材料，其中在如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的纖維二糖水解酶變體的存在下，用一種酶組合物使該纖維素材料糖化。
20.一種全液配 制品或細(xì)胞培養(yǎng)組合物，包含如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的變體。
【文檔編號(hào)】C11D3/386GK103998605SQ201280062735
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月20日
【發(fā)明者】M.沃古利斯 申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司