一種來源于圓弧青霉的堿性脂肪酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體提供了一種來源于圓弧青霉的堿性脂肪酶。本發(fā)明通過構(gòu)建畢赤酵母工程菌能高效表達(dá)該堿性脂肪酶基因，搖瓶發(fā)酵酶活可達(dá)1630U/mL；本發(fā)明的重組堿性脂肪酶的最適作用pH為8.5，最適溫度為35℃。本發(fā)明所述的含有堿性脂肪酶的洗滌劑組合物去污力強(qiáng)，對(duì)環(huán)境的污染小，具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種來源于圓弧青霉的堿性脂肪酶
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來源于圓弧青霉的堿性脂肪酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(Lipase)，即三?；视王；饷?，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶的基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈，其催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0003]脂肪酶的性質(zhì)研究主要包括最適溫度與pH、溫度與pH穩(wěn)定性、底物特異性等幾個(gè)方面。迄今，已分離、純化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性質(zhì)，它們?cè)诜肿恿俊⒆钸mpH、最適溫度、PH和熱穩(wěn)定性等方面存在不同?？傮w而言，微生物脂肪酶具有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度范圍、高穩(wěn)定性和活性，對(duì)底物的特異性，因此對(duì)微生物脂肪酶的開發(fā)具有重要的意義。
[0004]堿性脂肪酶是指在堿性條件下水解的脂肪酶，它能水解天然油脂，產(chǎn)生脂肪酸和甘油，是一種專門在異相系統(tǒng)油水接口上水解特殊酯類的酶。堿性脂肪酶是一種新型洗滌劑用酶，主要用途是作為洗滌劑的新酶種。它的特性是能分解衣物油污成甘油二酯、甘油單酯及脂肪酸等較易溶于水的物質(zhì)，從而顯著提高洗滌劑的效果，尤其是去除黃斑的效果。此外，堿性脂肪酶還可應(yīng)用于紡織、食品、纖維及造紙工業(yè)領(lǐng)域。因此，堿性脂肪酶具有更廣的應(yīng)用價(jià)值，成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種新型堿性脂肪酶，并通過構(gòu)建含有圓弧青霉{Penicillium eye I opium')的脂肪酶基因的表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，從而獲得高效重組表達(dá)該堿性脂肪酶的畢赤酵母工程菌株，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明所述堿性脂肪酶，其特征在于:
Ca)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的脂肪酶；
(b)在(a)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
[0007]編碼上述堿性脂肪酶的基因，其一種編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0008]上述的堿性脂肪酶在洗滌劑中的應(yīng)用。
[0009]一種洗滌組合物，含有上述堿性脂肪酶。
[0010]本發(fā)明提供的新型脂肪酶來源于圓弧青霉，本發(fā)明通過構(gòu)建畢赤酵母工程菌高效表達(dá)該脂肪酶基因，搖瓶發(fā)酵酶活可達(dá)1630U/mL ;本發(fā)明的重組堿性脂肪酶的最適作用pH為8.5，最適溫度為35°C。本發(fā)明所述的含有堿性脂肪酶的洗滌劑組合物去污力強(qiáng)，對(duì)國際污布EMPA116及EMPA117上的去污效果要好于競爭產(chǎn)品，且對(duì)環(huán)境的污染小，具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為畢赤酵母工程菌ALip發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測分析圖，其中泳道I為畢赤酵母工程菌ALip發(fā)酵上清液，泳道2為對(duì)照組，箭頭所指處的條帶即為本發(fā)明的重組脂肪酶。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖儭?br> [0013]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計(jì)數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋。
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0015]實(shí)施例1堿性脂肪酶基因的克隆
將圓弧青霉eye I opium)過夜培養(yǎng)，取適量菌體置于離心管中，13000rpm 離心 5 min，棄上清；加入 400 ii I 抽提緩沖液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min 后，加入 200 u I 10M NH4AC,冰浴 IOmin ;13000rpm 離心 lOmin，取上清；加入 2 倍體積的無水乙醇，_20°C放置30min ； 13000 rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A.Fungal RNA Kit制備草酸青霉的mRNA，其制備過程參照試劑盒的操作手冊(cè)。
[0016]以提取的圓弧青霉基因組總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為950C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 個(gè)循環(huán)；72°C，7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017]將回收的擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到pMD18-T載體，獲得克隆載體命名pT-ALip，送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測序分析，獲得的核苷酸序列為SEQ ID N0:2，其編碼氨基酸序列為為SEQ ID NO:1。通過NCBI Blast比對(duì)分析，該序列與圓弧青霉的堿性脂肪酶基因的序列相似性為90%，為一新的等位基因。
[0018]實(shí)施例2表達(dá)載體的構(gòu)建
以質(zhì)粒pT- ALip為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件是94°C 5min ；94°C30S ；55°C 30S， 72°C 2min 30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。凝膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行XbaI和Kpn I雙酶切；對(duì)表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K也進(jìn)行XbaI和Kpn I雙酶切；用T4連接酶把雙酶切產(chǎn)物和表達(dá)載體4°C連接過夜；把連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a。獲得相應(yīng)的陽性克隆表達(dá)質(zhì)粒命名為 pPIC-ALip。
[0019]實(shí)施例3畢赤酵母工程菌的構(gòu)建
表達(dá)質(zhì)粒PPIC- ALip用Sac I酶切電泳鑒定；乙醇沉淀濃縮，測定DNA濃度，以3 y g/UL濃度稀釋質(zhì)粒片段保存?zhèn)溆谩?br> [0020]制備畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，重懸于I mL預(yù)冷的電泳緩沖液中(配方:lmM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM 蔗糖，pH 7.8)。在 80 y L 感受態(tài)細(xì)胞中加入 5 y L 線性化重組質(zhì)粒pPIC- ALip ;電轉(zhuǎn)化(條件為1500V、200Q、25iiF);最后涂布于MM平板(MM培養(yǎng)基組分:1.34%YNB，4X 10_5%生物素，0.5%甲醇)，挑選其中一株重組菌株命名為畢赤酵母 ALip {Pi chi a pas toris ALip
[0021]實(shí)施例4發(fā)酵和酶學(xué)性質(zhì)測定 將上述畢赤酵母工程菌ALip接種于5ml BMGY ( I %酵母提取物，2%蛋白陳，1.34 %YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，把菌體加入50ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(I %酵母提取物，2%蛋白陳，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，0.5%甲醇)，每12小時(shí)補(bǔ)加50 ii L甲醇，誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖1所示，箭頭所指31kDa處有一明顯的蛋白條帶，分子量大小與預(yù)測一致，說明本發(fā)明構(gòu)建的畢赤酵母工程菌株能有效重組表達(dá)堿性脂肪酶。
[0022]脂肪酶活力單位
Ig固體酶粉(或Iml液體酶),在一定溫度和pH條件下，Imin水解底物產(chǎn)生I U mo I的可滴定的脂肪酸，即為一個(gè)酶活力單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。
[0023]酶活測定方法:
取兩個(gè)100ml三角瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中各加入底物溶液4.0Oml和磷酸緩沖液5.00ml，再于A瓶中假如95%乙醇15.00ml，于40°C ±0.2°C水浴中預(yù)熱5min，然后于A、B瓶中各加待測酶液1.0Oml，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B瓶中立即補(bǔ)加95%乙醇15.0Oml終止反應(yīng)，取出；于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液兩滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保存30s，不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。
[0024]脂肪酶的酶活力按下列公式計(jì)算:
(V1 - V2) XCX50Xn
X1 = ------------------------X 1/15

0.05
式中:
Xl-樣品的酶活力，U / ml ；
Vl—滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml ；
V2—滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml ； c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mo I / L ；
50——0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.0Oml相當(dāng)于脂肪酸50 u mo I ；
n——酶液稀釋倍數(shù)；
0.05—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；1/15-反應(yīng)時(shí)間15min,以Imin計(jì)；
所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示至整數(shù)。
[0025]本發(fā)明采用上述測定方法對(duì)畢赤酵母工程菌ALip發(fā)酵上清液進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，發(fā)酵液中脂肪酶的酶活高達(dá)1630U/mL，說明該工程菌能高效重組表達(dá)圓弧青霉的堿性脂肪酶基因。
[0026](I)最適溫度分析
分別測定上述畢赤酵母工程菌ALip發(fā)酵上清液在25 0C >30 0C >35 °C >40 °C >45 V、50°C、55°C、60°C，pH9.0的條件下酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線，結(jié)果顯示，本發(fā)明重組表達(dá)的堿性脂肪酶的最適作用溫度為35°C。
[0027](2)最適pH分析
用PH值分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液稀釋上述上清液，在溫度35°C條件下測定酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做pH-相對(duì)酶活曲線，結(jié)果顯示，本發(fā)明重組表達(dá)的堿性脂肪酶的最適作用PH為9.5。
[0028]實(shí)施例5堿性脂肪酶在洗滌劑中的應(yīng)用
本發(fā)明提供了一種液體堿性脂肪酶組合物，包括:本發(fā)明的重組堿性脂肪酶、碳酸鈣、硼酸鈉、甲酸鈉、多元醇和山梨酸鉀。具體含量見表1。。
[0029]表1液體堿性脂肪酶組分及含量
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪酶，其特征在于: Ca)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的脂肪酶； (b)在(a)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
2.用于編碼權(quán)利要求1所述脂肪酶的基因。
3.權(quán)利要求2所述基因，其一種核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.權(quán)利要求1所述脂肪酶在洗滌劑中的應(yīng)用。
5.一種洗滌組合物，所述的組合物包含有權(quán)利要求1所述的脂肪酶。
【文檔編號(hào)】C11D3/386GK103642769SQ201310651601
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】李佩佩, 齊建, 王華明, 黃亦鈞 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司