原彈性蛋白用于組織修復(fù)或恢復(fù)的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及原彈性蛋白以及使用彈性材料的組織修復(fù)和恢復(fù)。本文公開了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括加熱具有堿性pH的原彈性蛋白溶液用以在溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。本文還公開了根據(jù)該方法制備的彈性材料及其應(yīng)用。
【專利說明】原彈性蛋白用于組織修復(fù)或恢復(fù)的用途
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00780042237.4的中國專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是國際申請(qǐng)PCT/AU2007/001738的中國國家階段申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及原彈性蛋白以及使用彈性材料的組織修復(fù)和恢復(fù)。
【背景技術(shù)】
[0003]彈性蛋白是主要發(fā)現(xiàn)于皮膚、血管、肺以及需要一定程度的彈性來實(shí)現(xiàn)功能的其它組織和器官中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。當(dāng)原彈性蛋白分子上的賴氨酸殘基通過賴氨酰氧化酶與其它原彈性蛋白上的賴氨酸殘基發(fā)生交聯(lián)時(shí)，形成彈性蛋白。
[0004]預(yù)期彈性蛋白可用于包括組織修復(fù)和恢復(fù)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及為具有預(yù)定彈性的醫(yī)學(xué)裝置提供生物相容性表面。在這些應(yīng)用中，一般通過使用與賴氨酸和其它帶電殘基反應(yīng)的試劑(例如戊二醛)使重組原彈性蛋白分子上賴氨酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生交聯(lián)來產(chǎn)生彈性蛋白。
[0005]從重組原彈性蛋白產(chǎn)生彈性蛋白的一個(gè)問題是交聯(lián)劑(例如戊二醛)可能在一些個(gè)體中具有毒性或者另外導(dǎo)致不希望的組織反應(yīng)或過敏。另外，由于彈性蛋白的彈性性質(zhì)傾向于依賴賴氨酸側(cè)鏈的交聯(lián)，因此彈性蛋白可提供的彈性性質(zhì)的范圍是有限的。同樣地，出于交聯(lián)的需要，排除了通過某些標(biāo)準(zhǔn)施用途徑(例如注射)進(jìn)行有效遞送，這是因?yàn)樵跊]有特殊防范的情況下，交聯(lián)劑可能在遞送至彈性蛋白預(yù)定形成部位之前便導(dǎo)致彈性蛋白的形成。
[0006]需要可在不使用交聯(lián)劑的情況下形成的彈性材料。
[0007]還需要可通過注射施用到組織以在與`注射部位相連的部位形成彈性材料的組合物。
[0008]還需要具有在彈性蛋白或用于組織修復(fù)、填充(bulking)和創(chuàng)傷愈合的其它蛋白質(zhì)和生物材料中未發(fā)現(xiàn)之彈性性質(zhì)的彈性材料。
[0009]還需要用于持續(xù)釋放或受控釋放藥物化合物和組織因子的新型制劑，以及需要新的細(xì)胞和組織基質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明試圖至少使上述局限性或問題之一最小化，在一些實(shí)施方案中，提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括加熱具有堿性PH的原彈性蛋白溶液用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料的步驟。
[0011]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括加熱堿性PH至少約7.5和至少約25mM鹽濃度的原彈性蛋白溶液用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0012]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括向溫度約37°C的原彈性蛋白溶液提供堿性pH用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0013]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括向原彈性蛋白溶液提供堿性PH并使該溶液的溫度升至約37°C，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0014]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括將原彈性蛋白加至具有堿性PH及溫度約為37°C的溶液中，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0015]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括將原彈性蛋白加至具有堿性PH的溶液中并使該溶液的溫度升至約37°C，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0016]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括調(diào)節(jié)具有堿性PH且溫度約為37°C的原彈性蛋白溶液的鹽濃度，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0017]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法。所述方法包括調(diào)節(jié)具有堿性PH的原彈性蛋白溶液的鹽濃度并使該溶液的溫度升至約37°C，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0018]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于填充組織或矯正組織缺損的填充劑，所述填充劑由上文所述方法產(chǎn)生的彈性材料形成。 [0019]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了創(chuàng)傷密封劑(sealant)，所述密封劑由上文所述方法產(chǎn)生的彈性材料形成。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有由上文所述方法產(chǎn)生之彈性材料的假體或醫(yī)學(xué)裝置。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于形成彈性材料的包含第一容器、第二容器和書面說明的試劑盒，所述第一容器包含原彈性蛋白，所述第二容器包含待加入到原彈性蛋白以形成包含原彈性蛋白之堿性溶液的試劑，所述書面說明是關(guān)于從所述原彈性蛋白和所述試劑形成彈性材料的指導(dǎo)。
[0022]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于形成彈性材料的組合物，其包含具有堿性pH以及阻止溶液中原彈性蛋白形成彈性材料之溫度的原彈性蛋白溶液。
[0023]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于從原彈性蛋白形成彈性材料的裝置，所述裝置包含第一腔室、第二腔室、分配手段，所述第一腔室包含原彈性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于調(diào)節(jié)所述第一腔室中溶液PH的試劑，所述分配手段用于分配所述第一腔室的溶液以及所述試劑以形成所述溶液和試劑的混合物，從而在所述混合物中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0024]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于從原彈性蛋白形成彈性材料的裝置，所述裝置包含第一腔室、第二腔室和分配手段，所述第一腔室包含具有堿性PH的原彈性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于向所述第一腔室的溶液提供約150mM或更低鹽濃度的溶液，所述分配手段用于分配所述第一腔室和第二腔室的溶液以形成溶液混合物，從而在所述混合物中從原彈性蛋白形成彈性材料。[0025]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了持續(xù)或受控釋放的植入物，所述植入物是由上文所述方法產(chǎn)生的彈性材料形成的。
[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了細(xì)胞或組織基質(zhì)，所述細(xì)胞或組織基質(zhì)是由上文所述方法產(chǎn)生的彈性材料形成的。
[0027]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了形成原彈性蛋白之純化溶液的方法，其包括:
[0028]-提供原彈性蛋白溶液；
[0029]-調(diào)節(jié)所述溶液pH以形成具有堿性pH的溶液，使得原彈性蛋白在該溶液中沉淀；
[0030]-取出所述沉淀物；
[0031]-將所取出的沉淀物添加至具有基本上非堿性pH和/或基本上低溫的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中以形成原彈性蛋白的純化溶液。
[0032]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白溶液形成彈性材料的方法，其包括:
[0033]-⑴提供原彈性蛋白溶液；
[0034]-(2)調(diào)節(jié)所述溶液pH以形成具有堿性pH的溶液，使得原彈性蛋白在溶液中沉淀；
[0035]-(3)取出所述沉淀物；
[0036]- (4) 將所取出的沉淀物添加至具有基本上非堿性pH和/或基本上低溫的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中；以及
[0037]-(5)使所述溶液的溫度升至約37°C，以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1:注射后第15天從大鼠注射部位收集的H&E染色切片。
[0039]圖2:包埋有成纖維細(xì)胞的彈性材料之H&E染色切片。細(xì)胞存在于彈性材料內(nèi)的孔中。
[0040]圖3:SEM成像顯示成纖維細(xì)胞片層在彈性材料上生長。
[0041]實(shí)施方案詳述
[0042]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以通過調(diào)節(jié)溶液的堿度、溫度或鹽濃度而由原彈性蛋白溶液制成彈性材料。在一些實(shí)施方案中，僅通過調(diào)節(jié)溫度和/或堿度來形成彈性材料。在另一些實(shí)施方案中，所述彈性材料可具有OmM的鹽濃度。
[0043]本發(fā)明人所開發(fā)的彈性材料不同于彈性蛋白，因?yàn)樗男纬刹恍枰瓘椥缘鞍追肿拥慕宦?lián)。相反，彈性蛋白在用賴氨酰氧化酶或戊二醛等試劑使原彈性蛋白發(fā)生交聯(lián)時(shí)形成。
[0044]—個(gè)優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的彈性材料一般來說更具有生物相容性，這是因?yàn)樗缓谢瘜W(xué)交聯(lián)劑。然而，應(yīng)理解本發(fā)明的彈性材料可通過賴氨酰氧化酶或其它化學(xué)試劑(例如戊二醛)進(jìn)行交聯(lián)。
[0045]另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的彈性材料可提供彈性蛋白中不能發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括拉伸強(qiáng)度、反彈(recoil)、可壓縮性、生物可降解性以及持久性，特別是在組織或體腔中。因此，根據(jù)本發(fā)明，原彈性蛋白可用于提供使用彈性蛋白尚未獲得的裝置、假體和組織修復(fù)試劑。
[0046]還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可簡單地通過調(diào)節(jié)溫度、pH或鹽度來控制彈性材料的形成。如本文所證明地，這使得可以通過施用途徑(例如注射)更有效地在組織中形成彈性材料。
[0047]應(yīng)理解，“彈性材料”是指可不經(jīng)原彈性蛋白氨基酸殘基的交聯(lián)而從原彈性蛋白形成的材料，而在天然形成彈性蛋白時(shí)(例如通過賴氨酰氧化酶)或者在制備彈性蛋白時(shí)(例如通過戊二醛)原彈性蛋白的氨基酸殘基發(fā)生交聯(lián)。一經(jīng)形成，本發(fā)明的彈性材料可以通過賴氨酰氧化酶或其它化學(xué)試劑(例如戊二醛)進(jìn)行交聯(lián)。
[0048]如下文所述的“彈性材料”還可包含其它組分。
[0049]一般地，“彈性材料”不是自由流動(dòng)的液體。它可以是凝膠、膏、固體或明顯缺乏流動(dòng)性的其它狀態(tài)。有利地，根據(jù)本發(fā)明可設(shè)計(jì)或選擇所需的狀態(tài)性質(zhì)，這通過在所述彈性材料形成過程中調(diào)控溫度、PH或鹽度的參數(shù)來實(shí)現(xiàn)，或者通過用能夠交聯(lián)可交聯(lián)氨基酸側(cè)鏈的試劑(這樣的交聯(lián)劑實(shí)例是戊二醛)將所述材料交聯(lián)來實(shí)現(xiàn)。
[0050]在向其施加的力(例如壓縮或拉伸)撤去后，“彈性材料” 一般恢復(fù)到特定形狀或形態(tài)。
[0051 ] “彈性材料”還指壓縮和拉伸后可復(fù)原的、力學(xué)性能持久的(mechanicalIydurable)或者相對(duì)低滯后(relatively low hysteresis)的易彎材料。這種材料可以是可拉伸的、抗張的、可復(fù)原或者能夠反彈的。
[0052]有可能肉眼觀察從原彈 性蛋白溶液形成彈性材料。原彈性蛋白溶液基本上是透明的。隨著彈性材料的形成，由于過渡的沉淀樣狀態(tài)使該溶液的透明度降低而變得不透明。如上所述，彈性材料基本上呈固體形式，并且根據(jù)其組成可具有多種外觀。也可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的分析技術(shù)(例如監(jiān)測溫度或透光率(transmission)的改變)來觀察彈性材料的形成。
[0053]應(yīng)理解，“原彈性蛋白” 一般指包含與原彈性蛋白親水結(jié)構(gòu)域相同或相似之序列或由其組成的肽。親水結(jié)構(gòu)域具有通常富含賴氨酸和丙氨酸殘基的序列。這些結(jié)構(gòu)域常由被2或3個(gè)丙氨酸殘基隔開的一段賴氨酸所組成，例如AAAKAAKAA(SEQ ID NO:1)。其它親水結(jié)構(gòu)域不合有這種多丙氨酸串，但作為替代地在脯氨酸附近具有賴氨酸。相反，原彈性蛋白疏水結(jié)構(gòu)域富含非極性氨基酸，尤其是甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸和丙氨酸，并且常出現(xiàn)3肽至6肽的重復(fù)，例如 GVGVP (SEQ ID NO:2)、GGVP (SEQ ID NO:3)和 GVGVAP (SEQ ID NO:4)。
[0054]重要的是，用于形成所述彈性材料的肽包含至少一部分所述親水結(jié)構(gòu)域，因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)域被認(rèn)為對(duì)于在調(diào)節(jié)原彈性蛋白溶液的堿度、溫度或鹽濃度時(shí)形成彈性材料來說是重要的。
[0055]可用于形成本發(fā)明彈性材料的原彈性蛋白的實(shí)例包括由親水結(jié)構(gòu)域或其同源物組成的那些，以及包含親水結(jié)構(gòu)域或其同源物和部分或全部疏水結(jié)構(gòu)域的那些。一些實(shí)例在下面給出:
[0056].GGVPGAIPGGVPGGVFYP(SEQ ID NO:5), GVGLPGVYP(SEQ ID NO:6), GVPLGYP(SEQID NO:7)，PYTTGKLPYGYGP(SEQ ID NO:8),GGVAGAAGKAGYP(SEQ ID NO:9),TYGVGAGGFP(SEQID NO:10)；
[0057].KPLKP(SEQ ID NO: 11)，ADAAAAYKAAKA(SEQ ID NO:12), GAGVKPGKV(SEQID NO:13), GAGVKPGKV(SEQ ID NO:14), TGAGVKPKA(SEQ ID NO: 15)，QIKAPKL (SEQID NO:16)AAAAAAAKAAAK (SEQ ID NO: 17), AAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLV (SEQ ID NO:18), EAAAKAAAKAAKYGAR(SEQ ID NO: ' 19)EAQAAAAAKAAKYGVGT(SEQ ID NO:20)，AAAAAKAAAKAAQFGLV (SEQ ID NO:21),GGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGI(SEQ ID NO:22)，GALMAKAAKYGMV (SEQ ID NO:23), MAMAAKAMKM (SEQ ID NO:24) ,AMAKAAKYGM(SEQ IDNO:25)，CLGKACGRKRK(SEQ IDNO:26)。
[0058]“原彈性蛋白”可具有與GenBank登錄號(hào)AAC98394所示相同的序列。包含親水結(jié)構(gòu)域的其它原彈性蛋白序列是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于CAA33627 (人(Homo sapiens))、P15502 (人)、AAA42271 (褐家鼠(Rattus norvegicus))、AAA42272 (褐家鼠)、AAA42268 (褐家鼠)、AAA42269(褐家鼠)、AAA80155(小家鼠(Mus musculus)、AAA49082 (紅原雞(Gallusgallus))、P04985(黃牛(BosTaurus) )、ABF82224 (斑馬魚(Danio rerio))、ABF82222 (熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis))、P11547 (綿羊(Ovisaries))。
[0059]“原彈性蛋白”也可以是這些序列的片段，只要該片段包含如上所述親水結(jié)構(gòu)域的至少一部分。一個(gè)實(shí)例是AAC98394的27至724位氨基酸。
[0060]“原彈性蛋白”還可包含具有例如上文所述序列(特別是AAC98394)的肽的同源物，或者是具有例如上文所述序列的肽的同源物，或者是具有例如上文所述序列的肽的同源物之片段。本文中“同源物”是指具有與參考序列不同但相似之序列的蛋白質(zhì)。它還具有與所述參考序列相同的功能，例如當(dāng)如上所述調(diào)整所述同源物的溶液以調(diào)節(jié)堿度、溫度或鹽濃度時(shí)形成彈性材料的能力。
[0061]在一些實(shí)施方案中，所述同源物與肽(例如上文所述，特別是AAC98394)或者包含至少一部分親水結(jié)構(gòu)域的肽片段(例如上文所述)具有至少60%的同源性。
[0062]應(yīng)理解“原彈性蛋白”可以是天然的或重組的。
[0063]本文中“彈性蛋白樣肽”(elastin-like peptide, ELP)是指由分離自分子凝聚所必需之原彈性蛋白或彈性蛋白疏水區(qū)域`的小氨基酸序列(通常小于5個(gè)氨基酸長度)聚合而形成的化合物。一些常用的序列包括GVGVP (SEQ ID NO:2)、GGVP (SEQ ID NO:3)和GVGVAP(SEQ ID NO:4)。
[0064]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了存在一組溫度、堿度和鹽濃度條件，在所述條件下原彈性蛋白溶液可形成彈性材料。不希望受假設(shè)的限制，認(rèn)為這些條件影響導(dǎo)致形成所述彈性材料的原彈性蛋白分子親水結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。因此，所述彈性材料不同于由帶電氨基酸側(cè)鏈交聯(lián)形成的天然或人工彈性蛋白。也不同于ELP凝聚形成的材料。
[0065]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括加熱具有堿性PH的原彈性蛋白溶液，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0066]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括向溫度約為37°C的原彈性蛋白溶液提供堿性pH，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0067]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括向原彈性蛋白溶液提供堿性PH并使該溶液的溫度升至約37°C，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0068]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括將原彈性蛋白加至具有堿性pH且溫度約為37°C的溶液中，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0069]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括將原彈性蛋白加至具有堿性pH的溶液中并使該溶液的溫度升至約37°C，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0070]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括調(diào)節(jié)具有堿性PH且溫度約為37°C的原彈性蛋白溶液的鹽濃度，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0071]一般地，濃度大于約1.5mg/mL的原彈性蛋白溶液能夠形成期望完整性的彈性材料，盡管也可使用更低的濃度。在大多數(shù)應(yīng)用中，所述溶液濃度小于約300mg/mL。因此，濃度為約1.5mg/mL~約300mg/mL的原彈性蛋白溶液是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，使用濃度為約IOmg/mL~約300mg/mL的原彈性蛋白溶液。最優(yōu)選地，使用濃度為約10mg/ml~約200mg/mL的原彈性蛋白溶液。
[0072]已確定約pH7.5或更高的pH足以導(dǎo)致在溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。pH一般不超過約PH13，因?yàn)樵谠損H之上彈性材料的形成不太好。更優(yōu)選地，約pH9~pH13是理想的。然而，最優(yōu)選使用約PHlO~pHll的pH。其它可使用的pH值包括8.0、8.5、9.5、10,10.5 和 11.5。
[0073]可通過多種方式來調(diào)節(jié)堿度，所述方式包括(I)向原彈性蛋白溶液中直接添加pH增高物質(zhì)，(2)通過將含有足夠量pH增高物質(zhì)的溶液與原彈性蛋白溶液混合使之成為堿性的。PH增高物質(zhì)可以是堿、緩沖液、質(zhì)子吸收物質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)包括Tris堿、NH4OH和NaOH的實(shí)例可用作PH增高或控制物質(zhì)。
[0074]當(dāng)pH為堿性并且低于約9.5時(shí)，形成本發(fā)明的彈性材料可能需要鹽。當(dāng)使用鹽時(shí)，濃度一般大于25m M，可能高達(dá)200mM。優(yōu)選地，所述鹽濃度為約IOOmM~150mM。更優(yōu)選地，所述鹽濃度為約150mM。特別地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)隨著pH降至pHIO以下(但仍保持堿性)，形成所述彈性材料需要鹽，并且所需鹽的量隨著PH降低而升高。所以，例如，在約pH9~10時(shí)需要鹽，例如應(yīng)向該溶液提供等同于約60mM的鹽濃度。在一些實(shí)施方案中，所述溶液具有等同于哺乳動(dòng)物等滲鹽水(150mM)或更低的摩爾滲透壓濃度。在另一些實(shí)施方案中，所述溶液具有大于150mM的滲透壓。所述鹽濃度還可以是OmM。
[0075]所述溶液的鹽濃度可以通過加入鹽來控制，包括任何離子化合物、單價(jià)或二價(jià)離子或者能夠影響溶液滲透壓的低分子量物質(zhì)。例如，可使用NaC1、KC1、MgS04、Na2C03或葡萄糖。優(yōu)選的鹽是NaCI。
[0076]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白溶液形成彈性材料的方法，其包括:
[0077]-(I)提供原彈性蛋白溶液；
[0078]-(2)調(diào)節(jié)所述溶液pH以形成具有堿性pH的溶液，使得原彈性蛋白在該溶液中沉淀；
[0079]-(3)取出所述沉淀物；
[0080]- (4)將所取出的沉淀物添加至具有基本上非堿性pH和/或基本上低溫的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中；以及[0081]-(5)使所述溶液的溫度升至約37°C，以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0082]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中所述溶液的溫度優(yōu)選為約4°C~約37°C，步驟(4)中低于約4°C。另外，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中所述溶液的pH優(yōu)選至少約pH9，步驟
(4)中低于約pH9。步驟⑷中pH可以低至約pH7.5。另外，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液的鹽濃度優(yōu)選為約OmM~200mM。
[0083]因此，在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括加熱具有低于10的堿性pH以及150mM或更低鹽濃度的原彈性蛋白溶液，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。因?yàn)樵瓘椥缘鞍兹芤汉退鰪椥圆牧系腜H較接近于哺乳動(dòng)物PH，所以這些實(shí)施方案對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用是特別優(yōu)選的。
[0084]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括調(diào)節(jié)具有堿性PH的原彈性蛋白溶液的鹽濃度并使該溶液的溫度升至約37°C，用以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0085]已確定約37°C的溫度對(duì)于在溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料來說是優(yōu)選的。然而，在一些實(shí)施方案中，可使用低于37°C的溫度。一般地，溫度高于4°C。通常低于42°C。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，形成彈性材料所需的溫度與原彈性蛋白溶液中原彈性蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)。也就是說，低濃度原彈性蛋白的溶液需要較高的溫度來形成彈性材料。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，作為原彈性蛋白溶液在特定溫度下所保持時(shí)間的函數(shù)，柔韌性增加，完整性持續(xù)更長。
[0086]可通過將所述溶液提供到哺乳動(dòng)物組織中或其上來加熱所述溶液，使得來自所述組織的熱傳遞提高所述溶液的溫度，或者通過對(duì)所述組織進(jìn)行照射來實(shí)現(xiàn)。
[0087]或者,可通過將所述溶液與非生命表面(inanimate surface)相接觸并加熱所述表面來加熱所述溶液。所述 非生命表面可在模具或鑄件上來提供，用于為所述方法形成的彈性材料提供預(yù)定的形狀或形態(tài)，還可以在假體、支架等裝置上來提供。
[0088]當(dāng)通過加熱溶液來引發(fā)彈性材料形成時(shí)(即當(dāng)合適的pH和/或鹽條件已提供時(shí))，一般將所述溶液保存在低于30°C的溫度下，優(yōu)選約4°C，直到需要形成彈性材料時(shí)。
[0089]優(yōu)選地，初始溶液中的大部分原彈性蛋白用于形成所述彈性材料。
[0090]在一些實(shí)施方案中，可以將能夠交聯(lián)原彈性蛋白殘基(例如賴氨酸)側(cè)鏈的試劑與通過上述方法從原彈性蛋白溶液形成的彈性材料進(jìn)行交聯(lián)。如本文所述，交聯(lián)不是形成所述彈性材料所必需的，事實(shí)上這是本發(fā)明彈性材料與彈性蛋白之間的區(qū)別點(diǎn)。不希望受理論的限制，本發(fā)明人認(rèn)為所述彈性材料的形成至少部分是由于包括帶電酪氨酸、賴氨酸和精氨酸殘基的電荷相互作用以及穩(wěn)定性氫鍵的組合所致。本發(fā)明人認(rèn)為可能形成了二酪氨酸。重要的是，這些相互作用是在沒有交聯(lián)劑的情況下發(fā)生的。
[0091 ] 然而，在下述一些應(yīng)用中，當(dāng)所述彈性材料已形成時(shí)，將這些側(cè)鏈進(jìn)行交聯(lián)是有用的，因?yàn)檫@為所述彈性材料提供了另外的性質(zhì)。具體地，與交聯(lián)劑不存在時(shí)形成的彈性材料相比，使用交聯(lián)劑(例如戊二醛)使得彈性材料更硬、更致密、更堅(jiān)韌，因此可能在體內(nèi)更具有生物穩(wěn)定性。對(duì)于要求更高的組織復(fù)原應(yīng)用來說或者當(dāng)不需要與周圍天然組織相容時(shí)，本發(fā)明人建議該材料可能比非交聯(lián)彈性材料更加優(yōu)選。值得注意的是，當(dāng)將戊二醛加到堿性PH的原彈性蛋白溶液中時(shí)，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，隨著所述彈性材料的形成呈現(xiàn)出特別的顏色，這在臨床上可用作固體形 成的判定因素。[0092]預(yù)期可以使用可用于(天然或人工)形成彈性蛋白的任何交聯(lián)劑。實(shí)例包括賴氨酰氧化酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、戊二醛、京尼平(genipin)和胺反應(yīng)交聯(lián)劑(例如BS3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑是戊二醛，并且以約0.001?/ν%溶液至約0.5?/ν%溶液的濃度使用。
[0093]本發(fā)明的方法和由此形成的彈性材料在組織填充應(yīng)用中是特別有用的，例如，當(dāng)需要利用美容來修繕或改善外觀時(shí)的應(yīng)用(例如使唇豐滿、填充鼻唇溝、減少皺紋或者其它組織改善)，或者當(dāng)需要支持先天性缺損或由疾病或手術(shù)切除造成之缺損時(shí)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
[0094]更詳細(xì)地，由于所述彈性材料的形成可通過調(diào)節(jié)溫度、pH或鹽度來簡單地控制，因此這允許通過將具有或已具有堿性PH的原彈性蛋白溶液注射到所需部位并使熱從組織傳遞以導(dǎo)致所述彈性材料形成，從而原位形成填充劑。另外，可通過調(diào)整鹽度或PH或者通過在所述彈性材料已形成之后加入交聯(lián)劑來調(diào)節(jié)所述彈性材料形成的時(shí)間以及所形成材料的彈性特征和持久性。
[0095]主要的益處是可通過使用細(xì)號(hào)針來有效地提供所述填充劑。在該施用模式中，可通過調(diào)整溫度、pH或鹽濃度、或者降低注射用制備物中pH之前在高pH下的孵育時(shí)間中的一種或多種來控制用于形成填充劑的原彈性蛋白溶液的粘度。
[0096]所述原彈性蛋白溶液可皮內(nèi)或皮下注射，或者在真皮中或真皮下更深處注射，或者注射進(jìn)其它組織，以提供彈性材料的儲(chǔ)庫(depot)。
[0097]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用美容來改善組織的方法，其包括將含有原彈性蛋白的溶液注射進(jìn)需要美容改善的組織，以根據(jù)上述方法在所述組織中形成彈性材料。所述美容改善可以是去除或減少皮膚皺紋，使嘴唇豐滿或者還原或重塑組織的外觀、組織特征或面部特征。在注射前所述原彈性蛋白溶液可保持冷卻，例如在約4°C下，然后通過來自組織的熱傳遞加溫至體溫。或者，可使用外部能量源照射所述組織以提高原彈性蛋白溶液的溫度，從而在該組織中形成彈性材料。
[0098]還可將原彈性蛋白溶液應(yīng)用至組織表`面，以由彈性材料提供覆蓋或支持。
[0099]因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在疾病、外傷、手術(shù)切除或其它創(chuàng)傷部位支持組織或器官的方法，該方法包括將含有原彈性蛋白的溶液注射或以其它方式施加到需要支持的組織或器官中或其周圍，從而根據(jù)上述方法在所述組織或器官中或其周圍形成彈性材料。在一個(gè)實(shí)施例中，注射原彈性蛋白溶液以形成彈性材料，其在括約肌部位周圍提供了增加物(augmentation),例如作為一種尿失禁治療形式用于填充在膀胱括約肌周圍。
[0100]在上述實(shí)施方案中，堿性原彈性蛋白溶液在注射前可以被冷卻，例如至約4°C，然后通過來自組織的熱傳遞被加溫至體溫?；蛘?，可使用外部能量源照射組織以提高原彈性蛋白溶液的溫度從而在組織中形成彈性材料。
[0101]應(yīng)理解，可根據(jù)上述方法在外部制備所述彈性材料，然后將其插入組織或組織腔中。
[0102]例如，可將原彈性蛋白溶液澆鑄到模具中，根據(jù)上述方法形成彈性材料，從而得到隨后植入患者體內(nèi)的合適形狀。一個(gè)實(shí)例是當(dāng)手術(shù)切除患者組織的一部分而留下空腔時(shí)，需要用生物相容的彈性材料進(jìn)行填充。在這些情況下，可使用已知方法評(píng)估需填充位置的形狀，并基于該評(píng)估來制備合適的模具。然后，在模具內(nèi)澆鑄原彈性蛋白溶液，根據(jù)上文所述方法形成彈性材料，以用于植入需要填充的位置內(nèi)。[0103]在另一個(gè)實(shí)施例中，可根據(jù)上文所述方法使原彈性蛋白溶液形成顆粒形式的彈性材料。例如，可使用乳液、微流體(microfluidic)或本領(lǐng)域已知用于制備顆粒的其它體系來形成顆粒。還可以從原彈性蛋白濃度低于約1.5mg/mL的原彈性蛋白溶液形成顆粒。所述顆粒可以基本上為球形，具有0.1微米至10微米的直徑。可使用本領(lǐng)域已知的高速遞送技術(shù)將彈性材料顆粒遞送至需要治療的位置。
[0104]根據(jù)上文所述方法從原彈性蛋白溶液形成彈性材料的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述彈性材料可快速形成，事實(shí)上比形成彈性蛋白可達(dá)到的速度更快。這使得可以在模具中形成彈性蛋白無法形成的多種精巧以及復(fù)雜的形狀。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由于可通過調(diào)整溫度、PH和/或鹽度來控制從原彈性蛋白材料形成彈性材料的速度，因此在受控方法中可以導(dǎo)入氣體以形成氣泡并產(chǎn)生開放的海綿樣基質(zhì)?；蛘?需要時(shí)可避免形成氣泡。
[0105]另一個(gè)在外部形成組織植入物的方法是使用包括基于激光的蝕刻(laser basedlithography)、電噴霧和電紡(electrospinning)的技術(shù)。
[0106]根據(jù)上文所述方法從原彈性蛋白溶液形成的彈性材料特別地可用于密封創(chuàng)傷或者用于為新修復(fù)的創(chuàng)傷增加支持，特別是當(dāng)肉芽組織已經(jīng)取下但實(shí)質(zhì)纖維化(其會(huì)賦予愈合創(chuàng)傷以強(qiáng)度)尚未發(fā)生時(shí)的創(chuàng)傷。這些創(chuàng)傷的實(shí)例包括手術(shù)創(chuàng)傷或者外傷(例如撕裂傷、擦傷、刺傷或燒傷、或者其它缺損)導(dǎo)致的創(chuàng)傷。所述創(chuàng)傷可位于皮膚、皮下、深部組織或者其功能實(shí)現(xiàn)需要至少一些彈性的器官中。
[0107]根據(jù)上文所述方法從原彈性蛋白溶液形成的彈性材料可用于常規(guī)使用纖維蛋白密封劑(fibrin sealant)和手術(shù)粘合膠(surgical glue)的場合。一個(gè)實(shí)例是在吻合術(shù)需要有效密封以減少流體損失時(shí)。另一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要快速阻止血流時(shí)，或者需要預(yù)防微生物侵入時(shí)。 [0108]有多種施用途徑。這些包括將原彈性蛋白溶液噴、刷拭、傾倒、涂(paste)或者接觸到創(chuàng)傷上，以使得根據(jù)上述方法在創(chuàng)傷中或創(chuàng)傷表面上形成彈性材料。
[0109]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了密封組織創(chuàng)傷的方法，其包括將原彈性蛋白溶液噴、涂、傾倒、刷拭或者接觸到組織創(chuàng)傷，以使得根據(jù)上述方法形成彈性材料。
[0110]在這些實(shí)施方案中，原彈性蛋白溶液可添加其它化合物、蛋白質(zhì)和因子以促進(jìn)、調(diào)節(jié)或改善創(chuàng)傷密封。
[0111]如上所述，根據(jù)上文所述方法從原彈性蛋白溶液形成彈性材料的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述彈性材料可快速形成，事實(shí)上比彈性蛋白形成可達(dá)到的速度更快。因此，設(shè)想有可能獲得對(duì)創(chuàng)傷的快速密封。另外，對(duì)溫度、PH和/或鹽度的調(diào)整影響所述彈性材料形成的速度意味著可更有效地控制創(chuàng)傷密封的速度。
[0112]除了上文所述的組織支持和填充劑之外，根據(jù)上文所述方法從原彈性蛋白溶液形成的彈性材料特別地可用于制備假體和醫(yī)學(xué)裝置。實(shí)例包括用于支持開放生物結(jié)構(gòu)(例如導(dǎo)管和腔室)的植入物或支架。其它實(shí)例包括用于輔助生物結(jié)構(gòu)反彈的帶。
[0113]另一應(yīng)用是為生物不相容的醫(yī)學(xué)裝置(例如起搏器或耳蝸植入物)提供生物相容性涂層，其具有彈性、可復(fù)原并且能夠持久位于組織部位。在這些實(shí)施方案中，所述彈性材料對(duì)避免纖維化來說是重要的。
[0114]所述彈性材料可快速形成(事實(shí)上比彈性蛋白形成可達(dá)到的速度更快)意味著可以將薄的均勻表面涂層施加到醫(yī)學(xué)裝置，在不干擾所述裝置性能的情況下提供生物相容性。
[0115]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒和組合物，其用于根據(jù)如上所述的方法使用原彈性蛋白溶液形成彈性材料。在一種形式中，試劑盒包含第一容器、第二容器和書面說明，所述第一容器包含原彈性蛋白，所述第二容器包含提供堿性溶液的試劑，所述書面說明是關(guān)于使用所述原彈性蛋白和試劑形成彈性材料的指導(dǎo)。
[0116]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了形成彈性材料的組合物，其包含具有堿性pH及阻止溶液中原彈性蛋白形成彈性材料之溫度的原彈性蛋白溶液。如上所述，所述組合物可包含鹽，特別是當(dāng)所述溶液的PH低于pHIO時(shí)。在一些形式中，可采用粉末形式提供所述組合物，其在使用時(shí)進(jìn)行水化以提供原彈性蛋白溶液。經(jīng)過加熱，在溶液中從原彈性蛋白形成所述彈性材料。
[0117]根據(jù)所述試劑盒和組合物所提供的用途(例如用于組織填充、創(chuàng)傷密封或本文所述的其它應(yīng)用)，還可以向所述試劑盒和組合物提供其它分子。例如，另一些結(jié)締組織分子可與原彈性蛋白制劑在一起提供或用于一起配制。實(shí)例包括膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、纖維蛋白、糖胺聚糖(例如透明質(zhì)酸和硫酸肝素、軟骨素等分子)。也可提供這些分子的人造形式，例如ELP。
[0118]在另一些形式中，可向原彈性蛋白制劑提供藥物化合物或用于一起配制，包括抗生素、生長促進(jìn)劑、抗菌劑、血管發(fā)生化合物、抗癌劑等。
[0119]另一些形式可提供生物因子，例如組織因子、細(xì)胞因子、生長因子等。特別優(yōu)選的是參與創(chuàng)傷愈合、纖維化和肉芽形成的因子。
[0120]另一些形式可提供細(xì)胞，特別是參與創(chuàng)傷愈合的細(xì)胞。實(shí)例包括上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞前體、角質(zhì)形成細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等。
[0121]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于從原彈性蛋白形成彈性材料的設(shè)備或裝置，其包含第一 腔室、第二腔室和分配手段，所述第一腔室包含原彈性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于調(diào)節(jié)所述第一腔室溶液PH的試劑，所述分配手段用于分配所述第一腔室的溶液和所述第二腔室的試劑以形成所述溶液和試劑的混合物，從而在所述混合物中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0122]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從原彈性蛋白形成彈性材料的裝置，所述裝置包含第一腔室、第二腔室和分配手段，所述第一腔室包含具有堿性PH的原彈性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于向所述第一腔室的溶液提供約150mM或更低鹽濃度的溶液，所述分配手段用于分配所述第一腔室和第二腔室的溶液以形成溶液的混合物，從而在所述混合物中從原彈性蛋白形成彈性材料。
[0123]這些裝置可用于根據(jù)上文所述方法通過將所述原彈性蛋白溶液噴、涂、涂抹或注射到預(yù)期組織部位或無生命表面(例如模具)來施加所述原彈性蛋白溶液以形成彈性產(chǎn)物。例如，可改造所述裝置使其可與細(xì)號(hào)針連接。在另一種形式中，可改造所述裝置使其可與噴霧器連接。
[0124]應(yīng)理解，如上所述，所述裝置可在所述第一或第二腔室中或者在該裝置的另一腔室中含有其它分子、化合物、因子和細(xì)胞。
[0125]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可得到本發(fā)明彈性材料的前體或中間形式，當(dāng)適當(dāng)調(diào)整pH、鹽濃度或溫度時(shí)其可回復(fù)到溶液形式。更詳細(xì)地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在高于約4°C (優(yōu)選約37°C)下將含原彈性蛋白的溶液PH調(diào)節(jié)至高于約pH9時(shí)，形成了隨后可從溶液中分離出來的沉淀物。然后當(dāng)PH降低到非堿性條件和/或溫度降低時(shí)，有可能使得所述沉淀解離并分散。所分散的沉淀物含有至少一些游離的原彈性蛋白。
[0126]預(yù)期該發(fā)現(xiàn)特別可用于從重組表達(dá)系統(tǒng)中純化原彈性蛋白。
[0127]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了形成原彈性蛋白純化溶液的方法，其包括:
[0128]-提供原彈性蛋白溶液；
[0129]-調(diào)節(jié)所述溶液pH以形成具有堿性pH的溶液，使得原彈性蛋白在所述溶液中沉淀；
[0130]-取出所述沉淀物；
[0131]-將所取出的沉淀物添加至具有基本上非堿性pH和/或基本上低溫的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中以形成原彈性蛋白的純化溶液。
[0132]根據(jù)上文所述方法從原彈性蛋白溶液形成的彈性材料的一個(gè)特別重要的應(yīng)用是提供持續(xù)或受控釋放化合物的機(jī)制。更具體地，通過在所述材料形成過程中調(diào)整PH或鹽度，或者通過用戊二醛或其它交聯(lián)劑在所述材料形成后交聯(lián)所述材料，有可能設(shè)計(jì)或選擇具有特別持久性質(zhì)的彈性材料。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)交聯(lián)形式的所述彈性材料與非交聯(lián)形式相比傾向于更硬、更致密、更堅(jiān)固。而后者傾向于更類似天然彈性蛋白。一些形式傾向于在組織中更易降解，因此為接種于所述彈性材料中的藥物或類似分子提供了更快速地爆發(fā)式釋放。另一些形式則更持久、較不易降解，因而為藥物或類似分子提供了更長時(shí)間的釋放。
[0133]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了持續(xù)或受控釋放的植入物，所述植入物是根據(jù)上文所述方法從原彈性蛋白溶液形成的彈性材料。所述持續(xù)釋放的植入物可含有如上所述的分子、化合物、因子和細(xì)胞。
[0134]如上所述，由于可通過調(diào)整溫度、pH和/或鹽度來控制從原彈性蛋白溶液形成彈性材料的速率，因此可在受控方法中導(dǎo)入氣體以形成氣泡并得到具有開放海綿樣基質(zhì)的彈性材料。這為接種實(shí)現(xiàn)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的細(xì)胞、組織和因子提供了特別有用的支架或基質(zhì)。合適細(xì)胞和因子的實(shí)例在上文有描述。
[0135]有利地，可控制所述彈性材料的孔隙率，使得再生組織可穿過所形成的結(jié)構(gòu)。或者，可形成具有孔的結(jié)構(gòu)，其足以使得僅僅分子和因子擴(kuò)散進(jìn)出所述彈性材料。
[0136]因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了細(xì)胞或組織基質(zhì)，所述細(xì)胞或組織基質(zhì)是利用上文所述方法從彈性材料形成的。
實(shí)施例
[0137]實(shí)施例1在無交聯(lián)劑的情況下形成彈性材料
[0138]原彈性蛋白優(yōu)選在大于1.5mg/mL(通常10~200mg/mL)的濃度下混合于磷酸鹽緩沖液中，使用IM NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至約pH9~約pH13，優(yōu)選pHll。然后，將所述溶液加溫至高于4°C，優(yōu)選至約37°C。形成軟膏樣實(shí)體，然后固化以形成彈性材料。
[0139]實(shí)施例2在較低堿性pH范圍下用鹽形成彈性材料
[0140]將原彈性蛋白以10mg/mL的濃度溶于水溶液中。分別將水溶液的鹽濃度和pH滴定為O~150mM和pH7~12。將原彈性蛋白溶液的溫度提高至37°C，利用肉眼和觸覺來評(píng)估形成彈性材料的能力。在冷卻后測試這樣形成的任何彈性材料的持久性。
[0141]隨著pH降低可看到兩個(gè)過渡點(diǎn)。在pHIO以上，在溶液中從原彈性蛋白形成持久的彈性材料不需要溶液中的鹽。但是，隨著PH降低到10以下，需要約60mM的鹽濃度使得在溶液中從原彈性蛋白形成持久的彈性材料。
[0142]實(shí)施例3在交聯(lián)劑存在時(shí)形成彈性材料
[0143]原彈性蛋白溶液在大于1.5mg/mL(通常10~200mg/mL)的濃度下與戊二醛(0.001~0.5% (重量/體積))混合于堿性pH(約pH8.5)的磷酸鹽緩沖液中，加溫形成彈性材料。所述材料呈粉紅色，并且與根據(jù)實(shí)施例1和2形成的彈性材料相比具有更高的密度和硬度。
[0144]實(shí)施例4原彈性蛋白的純化
[0145]將自細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的含原彈性蛋白的粗制上清調(diào)節(jié)至pH9~13，優(yōu)選11，從而將原彈性蛋白分子從所述溶液中沉淀出來形成沉淀物。從上清中分離所述沉淀物并重懸于具有非堿性PH及較低溫度的緩沖液中，從而使沉淀物在緩沖液中分散形成溶液。然后在冷凍條件下保存所述溶液。
[0146]實(shí)施例5體內(nèi)形成彈性材料
[0147]使用26號(hào)針將經(jīng)pH調(diào)節(jié)的200mg/ml原彈性蛋白溶液的單次劑量(0.1ml)皮內(nèi)注射到健康雌性Sprague Dawley大鼠中。大鼠的體溫導(dǎo)致快速發(fā)生熱誘導(dǎo)彈性材料形成。在15天的時(shí)間內(nèi)觀察所述動(dòng)物，然后進(jìn)行組織學(xué)檢查。無定形的實(shí)體材料存在于皮下(hypodermis)包括皮膚肌 肉下的疏松結(jié)締組織(圖1)中。使用BA-4彈性蛋白特異性抗體的免疫組化染色證實(shí)了在該大儲(chǔ)庫中存在持久性彈性材料。
[0148]實(shí)施例6摻入藥物的彈性材料
[0149]通過將pH調(diào)節(jié)到10.8、在37°C下孵育I小時(shí)、冷卻然后重新調(diào)節(jié)pH至7.4而制得彈性材料。將藥物紫杉醇的顆粒包埋于樣品中。加熱到37°C后，樣品固化，得到包含所分配藥物顆粒的彈性材料。將H1299肺癌細(xì)胞接種于所制備的彈性材料上及其周圍。對(duì)照彈性材料不含紫杉醇。觀察到接種于含紫杉醇之彈性材料上的細(xì)胞發(fā)生凋亡。而細(xì)胞侵入對(duì)照樣品。對(duì)照樣品以及含有紫杉醇但未接觸細(xì)胞的彈性材料未發(fā)生凋亡。
[0150]實(shí)施例7彈性材料和細(xì)胞相互作用
[0151]將成纖維細(xì)胞摻入彈性材料中(圖2)或者接種到彈性材料上(圖3)。
【權(quán)利要求】
1.從原彈性蛋白產(chǎn)生彈性材料的方法，其包括加熱具有堿性PH的原彈性蛋白溶液以在所述溶液中從原彈性蛋白形成彈性材料。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述堿性pH大于約7.5。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述堿性pH大于約9。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溫度大于約4°C。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溫度約為37°C。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述原彈性蛋白溶液具有小于約200mM的鹽濃度。
7.權(quán)利要求1的方法,其中所述鹽濃度大于約60mM，所述pH小于約10。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述原彈性蛋白以大于約1.5mg/mL的濃度存在于所述溶液中。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述原彈性蛋白以約10mg/mL~200mg/mL的濃度存在于所述溶液中。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述原彈性蛋白包含與原彈性蛋白親水結(jié)構(gòu)域相同或相似的序列。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述原彈性蛋白由與原彈性蛋白親水結(jié)構(gòu)域相同或相似的序列組成。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利 要求的方法，其中所述彈性材料還包含選自藥物、生物細(xì)胞、生物因子和生物分子的組分。
13.用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的彈性材料，其中所述彈性材料根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法而形成。
14.權(quán)利要求13的彈性材料，其中所述醫(yī)學(xué)應(yīng)用選自填充組織、矯正組織缺損和密封創(chuàng)傷。
15.權(quán)利要求13或14的彈性材料，其中所述彈性材料是選自以下的產(chǎn)品:假體或醫(yī)學(xué)裝置、持續(xù)釋放或受控釋放的植入物、細(xì)胞或組織基質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61Q90/00GK103861148SQ201410068957
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2007年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2006年11月13日
【發(fā)明者】安托尼·史蒂文·魏斯, 蘇珊娜·瑪麗·米蒂厄 申請(qǐng)人:悉尼大學(xué)