一種濕法提取純化微藻藻油的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種濕法來提取純化微藻藻油的方法，包括如下步驟：1)向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，快速攪拌均勻，離心，收集沉淀，獲得脫水處理后的藻泥；2)向步驟1)獲得的脫水處理后的藻泥中加入無毒性或微毒性的有機(jī)溶劑或其水溶液，同時(shí)對(duì)藻泥進(jìn)行細(xì)胞破壁處理，提取微藻中的粗油；3)離心，收集步驟2)提取得到的粗油，向其中加入水和無機(jī)鹽，攪拌均勻，形成粗油水溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均勻后靜置分層或離心分層，共形成三層，分別是上層溶液、中間層固形物和下層溶液，收集上層溶液；4)將上層溶液進(jìn)行脫溶劑處理，獲得微藻藻油。本發(fā)明的方法提取純化微藻藻油，其可酯化油脂得率高，容易操作，能耗低。
【專利說明】一種濕法提取純化微藻藻油的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及能源和微藻生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種通過乙醇脫水-濕法提 油-正己烷萃取來獲得純化微藻藻油的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人口的增長(zhǎng)及生活水平的提高，世界范圍內(nèi)對(duì)能源，尤其是運(yùn)輸能源的需求 量不斷增大；與此同時(shí)，全球氣候變暖及石油儲(chǔ)量減少的問題日益突出。作為一種可本土供 應(yīng)的、容易生物降解的，以及可直接應(yīng)用于現(xiàn)存柴油機(jī)并減少尾氣排放的能源，生物柴油被 廣泛的認(rèn)為是最具潛力的石油替代品。
[0003] 目前，生物柴油開發(fā)面臨的一個(gè)主要障礙是可再生原料的獲得。據(jù)估計(jì)，原料成本 占生物柴油總生產(chǎn)成本的45?58% (Energy Policy, 2006, 34(17) :3268-3283)。因此，廉 價(jià)的、且不影響食品市場(chǎng)的原料是未來可再生生物柴油發(fā)展的關(guān)鍵。而微藻，作為一種水生 非食物作物，被認(rèn)為最理想的生物柴油煉制原料，其產(chǎn)油能力是傳統(tǒng)陸生作物的15?300 倍（Biotechnology Advances, 2007, 25 (3) : 294-306)，在理想條件下，其每畝的產(chǎn)能可達(dá)到 5000?15000加侖每年，且不爭(zhēng)地、爭(zhēng)水、爭(zhēng)糧。
[0004] 如今，微藻中的甘油三酯通過酯交換反應(yīng)制備生物柴油的技術(shù)已取得重大的突 破，而微藻生物質(zhì)的綜合利用以及高成本的油脂提取技術(shù)是微藻生物柴油規(guī)模化開發(fā)的主 要障礙。尤其是油脂提取過程，傳統(tǒng)方法通常需要對(duì)微藻進(jìn)行干燥處理，并涉及有毒溶劑的 使用，導(dǎo)致藻類基質(zhì)的污染問題。
[0005] 普通小球藻（Chlorella vulgaris)用于煉制生物柴油的生命周期評(píng)估 顯示，傳統(tǒng)的以干燥藻粉為原料的有機(jī)溶劑提取法中，小球藻的采收和干燥占整 個(gè)煉制過程能源消耗的 60 % 以上（The International Journal of Life Cycle Assessment, 2010, 15(7) :704-714),使得微藻生物柴油的煉制成本至少是傳統(tǒng)柴油的10 倍以上。
[0006] 近年來，國(guó)內(nèi)外科研工作者對(duì)從微藻培養(yǎng)池或藻泥中濕法提取油脂的技術(shù)進(jìn)行了 廣泛地研究。但由于微藻堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，一些物種甚至還有額外的礦物質(zhì)層，如硅藻，能夠 抵御外界高強(qiáng)度的破壞作用，使得濕法提取過程需要高強(qiáng)度的能源消耗。
[0007] 酸喊水提法（Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2000, 75 (5): 348-352)作為一種無需干燥且避免使用有機(jī)溶劑的提取方法，曾廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)能源的 開發(fā)。但該方法存在以下不足：1、油脂提取過程把蛋白質(zhì)等其它成分也一并提取出來，造成 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)；2、由于油脂在水中的溶解度小，酸堿水提法的油脂提取率往往僅有40? 70% ;3、由此產(chǎn)生的酸堿廢水處理成本較高。
[0008] 超臨界流體萃?。⊿FE)(如超臨界水、乙醇、甲醇等）是一種利用化合物在流體中 的溶解度在高壓和高溫條件下顯著性增加的提取方法[34]。雖然該方法避免了微藻干燥過 程，且提取率高，可綜合利用微藻生物質(zhì)，但保持高壓和高溫所需的設(shè)備及能源投入巨大， 限制了其在生物能源方面規(guī)?；膽?yīng)用。
[0009] Teixeira等人提出了通過離子液體高效破壞細(xì)胞壁提取油脂的方法（Green Chemistry, 2012, 14 (2) : 419-427)，常壓 10CTC下，蛋白核小球藻（Chlore 11a pyrenoidosa) 在[BMM]C1中處理15min后，95%以上的細(xì)胞消失，該方法可直接應(yīng)用于含水量90%以上 的藻泥。但離子液體價(jià)格高昂，且回收難度大。
[0010] 膜分離原位萃取法利用具有生物相容性溶劑（如十二烷、右旋檸檬烯和對(duì)傘花烴 等），微藻培養(yǎng)的同時(shí)進(jìn)行油脂的提取，無需破壞細(xì)胞壁即可萃取培養(yǎng)池中微藻細(xì)胞中的油 月旨（Bioresource Technology, 2013, 134 (2013) : 271-275)，但該方法提取效率低，且需要進(jìn) 一步的研究以確定其對(duì)微藻細(xì)胞活力及油脂合成是否具有長(zhǎng)期的影響。
[0011] 在目前的大多數(shù)濕法提取微藻油脂的方法中，或需要高能耗的微藻干燥過程，或 需要高昂的設(shè)備及能源投入，或無法利用微藻中除油脂外的其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，或油脂提取率 低等。對(duì)于微藻生物柴油的開發(fā)，高成本的生物質(zhì)干燥和油脂提取過程，以及微藻生物質(zhì)的 綜合利用是其規(guī)模化開發(fā)的主要障礙。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提出一種乙醇脫水-濕法提 油-正己烷萃取純化以獲得較純凈的微藻藻油的方法，該方法提取純化微藻藻油，其可酯 化油脂得率高，容易操作，能耗低。
[0013] 本發(fā)明為達(dá)到其目的，采用的技術(shù)方案如下：
[0014] 一種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來獲得純化微藻藻油的方法，包括如下 步驟：
[0015] 1)脫水處理：向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，快速攪拌均勻，離心，收集沉 淀，獲得脫水處理后的藻泥；
[0016] 2)濕法提油：向步驟1)獲得的脫水處理后的藻泥中加入無毒性或微毒性的有機(jī) 溶劑或其水溶液，同時(shí)對(duì)藻泥進(jìn)行細(xì)胞破壁處理，提取微藻中的粗油；
[0017] 3)離心，收集步驟2)提取得到的粗油，向其中加入水和無機(jī)鹽，攪拌均勻，形成粗 油水溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均勻后靜置分層或離心分層，共形成三層， 分別是上層溶液、中間層固形物和下層溶液，收集上層溶液；
[0018] 4)將上層溶液進(jìn)行脫溶劑處理，獲得微藻藻油。
[0019] 進(jìn)一步的，步驟1)中，乙醇溶液的加入量為所述采收的微藻藻泥中所含水量的 0. 1?5倍體積的量，所述的乙醇溶液為濃度在30% (v/v)以上的乙醇水溶液。
[0020] 優(yōu)選的，乙醇溶液的加入量為所述采收的微藻藻泥中所含水量的0. 5?2倍體積 的量，所述乙醇溶液為濃度在70?90% (v/v)的乙醇水溶液。采用該優(yōu)選條件，脫水效果 最佳，而且微藻中脂肪酸甲酯（FAME)的損失率較小。而乙醇溶液添加量的繼續(xù)增加，脫水 后藻泥含水量不會(huì)明顯的減少更多，但是，微藻中FAME的損失率會(huì)大大增加。
[0021] 進(jìn)一步的，步驟2)中，所述的無毒性或微毒性的有機(jī)溶劑或其水溶液的加入量 為，相對(duì)每毫克脫水處理后藻泥干重，向其中加入5?50mL所述的無毒性或微毒性的有 機(jī)溶劑或其水溶液（例如體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇水溶液），步驟2)中進(jìn)行提取的溫度為 90°C，提取的時(shí)間為80min。
[0022] 優(yōu)選的，相對(duì)每毫克脫水處理后藻泥干重，加入10?20mL所述的無毒性或微毒性 的有機(jī)溶劑或其水溶液。
[0023] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述無毒性或微毒性的有機(jī)溶劑選自乙醇、丙醇、異丙醇中 的一種或多種組合。
[0024] 步驟2)中，對(duì)藻泥進(jìn)行細(xì)胞破壁處理采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常用的細(xì)胞破壁處理方法 即可，并無特別限制，例如可以高壓均質(zhì)、微波、超聲波、脈沖電場(chǎng)、凍融、研磨、酸處理、堿處 理中的一種或多種組合的方式，這些均是本【技術(shù)領(lǐng)域】常用的細(xì)胞破壁方式。在一種具體實(shí) 施方式中，步驟2)具體可按如下方法操作：將步驟1)脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐中，相 對(duì)每毫克脫水處理后藻泥干重，向其中加入5?50mL所述的無毒性或微毒性的有機(jī)溶劑或 其水溶液，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時(shí)間為80min。
[0025] 優(yōu)選的，步驟3)中，向粗油中加入水的量為使粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 10 %?90%，向粗油中加入無機(jī)鹽的量為使其在粗油水溶液中的濃度達(dá)到0. 01?5mol/L ; 向所述粗油水溶液中加入正己烷的量為所述粗油水溶液的〇. 01?4倍體積的量。加入一 定濃度的無機(jī)鹽，對(duì)油/水乳狀液具有反乳化作用，促進(jìn)油水分離，有助于提高油脂在正己 烷層的溶解效率。
[0026] 更為優(yōu)選的，步驟3)中，向粗油中加入水的量為使粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)達(dá) 到40 %?60%，向粗油中加入無機(jī)鹽的量為使其在粗油水溶液中的濃度達(dá)到0. 05?2mol/ L ;向所述粗油水溶液中加入正己烷的量為所述粗油水溶液的0. 2?0. 8倍體積的量。采用 該更為優(yōu)選的條件，正己烷萃取油脂的效果更好，可更好的提高FAME回收率。所述無機(jī)鹽 選自氯化鈣、氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨中的一種或多種的組合。其中，以氯化鈣最佳。
[0027] 可選的，步驟1)和步驟3)分別重復(fù)操作兩次或多次。
[0028] 本發(fā)明的方法中，所述微藻沒有特別的限制，譬如為微綠球藻等。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 1、濕法提油前對(duì)采收的微藻藻泥進(jìn)行乙醇脫水處理，不僅有效降低了微藻干燥所 需的能耗，并大幅減少了濕法提油過程中藻泥含水量對(duì)可酯化油脂提取率的影響，同時(shí)，脫 水處理后獲得的色素等物質(zhì)可用于進(jìn)行綜合利用。
[0031] 2、以無毒性或微毒性的有機(jī)試劑為提取溶劑，使得提取后的藻渣可作為其它營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)提取的原料，或用于動(dòng)物飼料的開發(fā)。
[0032] 3、正己烷萃取過程中，粗油中的蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)的去除率高，可酯化油脂的損 失小，且該過程不改變油脂中脂肪酸的組成。
[0033] 4、本發(fā)明的方法可酯化油脂的得率高，設(shè)備及能源成本低，容易操作，便于工業(yè)化 應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1是本發(fā)明的乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取純化獲得較純凈的微藻藻油的 基本流程不意圖；
[0035] 圖2是實(shí)施例4?8中藻泥經(jīng)不同濃度乙醇溶液脫水后，藻泥中含液率和含水量 的變化，及脫水前后微藻中FAME損失率的情況；
[0036] 圖3是實(shí)施例6和9?11中藻泥經(jīng)添加不同量乙醇溶液脫水后，藻泥中含液率和 含水量的變化，及脫水前后微藻中FAME損失率的情況；
[0037] 圖4是實(shí)施例6和12?13中藻泥經(jīng)乙醇溶液脫水不同次數(shù)后，藻泥中含液率和 含水量的變化，及脫水前后微藻中FAME損失率的情況；
[0038] 圖5是實(shí)施例14?19中藻泥的含水量對(duì)微波輔助濕法提油過程可酯化油脂得率 的影響；
[0039] 圖6是實(shí)施例20?25中添加的無機(jī)鹽種類對(duì)FAME回收率的影響；
[0040] 圖7是實(shí)施例20和26?30中粗油水溶液中氯化鈣的濃度對(duì)FAME回收率的影 響；
[0041] 圖8是實(shí)施例27和31?36中粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)對(duì)FAME回收率的影 響；
[0042] 圖9是實(shí)施例27和37?43中添加的正己烷與粗油水溶液的體積比對(duì)FAME回收 率的影響；

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明：
[0044] 以下實(shí)施例選用的原料均為海洋微綠球藻（Nannochloris sp.)藻泥，由中國(guó)科學(xué) 院南海海洋研究所戶外跑道池培養(yǎng)獲得。離心獲得的藻泥用去離子水洗滌震蕩后，l〇〇〇〇r/ min離心8min，去掉上清，重復(fù)2次后，收集藻泥作為采收的微藻藻泥，備用。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 一種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來提取純化微藻藻油的方法，按照如下 步驟進(jìn)行：
[0047] 1)脫水處理：稱取5g采收的微藻藻泥于50mL無菌離心管，向微藻藻泥中加入 乙醇溶液，該乙醇溶液的加入量為微藻藻泥中所含有的水的1倍體積的量，該乙醇溶液為 83% (V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后進(jìn)行渦旋0. 5min，10000r/min離心5min，收集沉 淀，獲得脫水后的藻泥；
[0048] 經(jīng)檢測(cè)，脫水后藻泥中含水量由剛采收的藻泥的90%降至37. 41%。在該脫水處 理過程中，F(xiàn)AME損失率僅為6. 02%。
[0049] 2)濕法提油：將步驟1脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐（Milestone ETHOS A)中， 相對(duì)每毫克脫水處理后的藻泥干重，向其中加入20mL95% (v/v)的乙醇水溶液作為提取溶 齊[J，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時(shí)間為80min。
[0050] 3)油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水 和氯化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)為 50%為準(zhǔn)，氯化鈣的加入量以使粗油水溶液中氯化鈣的濃度為0. lmol/L為準(zhǔn)。然后向粗油 水溶液中加入正己烷，加入正己烷的量為所述粗油水溶液的〇. 4倍體積的量，混勻后靜置 720min，收集上層溶液。
[0051] 4)將收集的上層溶液進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以脫除溶劑，獲得微藻藻油。
[0052] 經(jīng)實(shí)施例1提取純化后的微藻油脂，經(jīng)檢測(cè)，其中葉綠素 a、葉綠素 b、胡蘿卜素 和蛋白質(zhì)的含量分別減少為原步驟2獲得的粗油中含量的20. 28%、32. 11 %、30. 35%和 1. 21 %，同時(shí)脂肪酸的濃度濃縮為粗油的1. 60倍，脂肪酸組成無顯著性變化（p > 0. 05)，即 沒有改變油脂的組成。FAME的回收率達(dá)到95. 8%。
[0053] 實(shí)施例2
[0054] -種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來提取純化微藻藻油的方法，按照如下 步驟進(jìn)行：
[0055] 1)脫水處理：稱取5g采收的微藻藻泥于50mL無菌離心管，向微藻藻泥中加入乙 醇溶液，該乙醇溶液的加入量為微藻藻泥中所含有的水的〇. 5倍體積的量，該乙醇溶液為 72% (V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后進(jìn)行渦旋0. 5min，10000r/min離心5min，收集沉 淀，獲得脫水后的藻泥；
[0056] 經(jīng)檢測(cè)，脫水后藻泥中含水量由剛采收的藻泥的90%降至54. 47%。在該脫水處 理過程中，F(xiàn)AME損失率為4. 21 %。
[0057] 2)濕法提油：將步驟1脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐（Milestone ETHOS A)中， 相對(duì)每毫克脫水處理后的藻泥干重，向其中加入10mL95% (v/v)的乙醇水溶液作為提取溶 齊[J，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時(shí)間為80min。
[0058] 3)油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水和 氯化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)為40 % 為準(zhǔn)，氯化鈣的加入量以使粗油水溶液中氯化鈣的濃度為0. 05mol/L為準(zhǔn)。然后向粗油 水溶液中加入正己烷，加入正己烷的量為所述粗油水溶液的〇. 2倍體積的量，混勻后靜置 720min，收集上層溶液。
[0059] 4)將收集的上層溶液進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以脫除溶劑，獲得微藻藻油。
[0060] 經(jīng)實(shí)施例1提取純化后的微藻油脂，經(jīng)檢測(cè)，其脂肪酸的濃度濃縮為粗油的1. 3 倍，脂肪酸組成無顯著性變化（P >0.05)，即沒有改變油脂的組成。FAME的回收率達(dá)到 51. 3%。
[0061] 實(shí)施例3
[0062] 一種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來提取純化微藻藻油的方法，按照如下 步驟進(jìn)行：
[0063] 1)脫水處理：稱取5g采收的微藻藻泥于50mL無菌離心管，向微藻藻泥中加入 乙醇溶液，該乙醇溶液的加入量為微藻藻泥中所含有的水的2倍體積的量，該乙醇溶液為 90% (V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后進(jìn)行渦旋0. 5min，10000r/min離心5min，收集沉 淀，獲得脫水后的藻泥；
[0064] 經(jīng)檢測(cè)，脫水后藻泥中含水量由剛采收的藻泥的90%降至48. 34%。在該脫水處 理過程中，F(xiàn)AME損失率僅為16. 12%。
[0065] 2)濕法提油：將步驟1脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐（Milestone ETHOS A)中， 相對(duì)每毫克脫水處理后的藻泥干重，向其中加入50mL95% (v/v)的乙醇水溶液作為提取溶 齊[J，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時(shí)間為80min。
[0066] 3)油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水和 氯化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)為60 % 為準(zhǔn)，氯化鈣的加入量以使粗油水溶液中氯化鈣的濃度為2mol/L為準(zhǔn)。然后向粗油水溶液 中加入正己燒，加入正己燒的量為所述粗油水溶液的〇. 8倍體積的量，混勻后靜置720min, 收集上層溶液。
[0067] 4)將收集的上層溶液進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以脫除溶劑，獲得微藻藻油。
[0068] 經(jīng)實(shí)施例1提取純化后的微藻油脂，經(jīng)檢測(cè)，其脂肪酸的濃度濃縮為粗油的1. 2 倍，脂肪酸組成無顯著性變化（P >0.05)，即沒有改變油脂的組成。FAME的回收率達(dá)到 47. 1%。
[0069] 本申請(qǐng)發(fā)明人還通過多個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明所提供的方法中的多個(gè)影響因素進(jìn)行了 研究，詳細(xì)內(nèi)容如下：
[0070] 實(shí)施例4?8為研究在脫水處理步驟中乙醇溶液的濃度對(duì)脫水效果的影響的實(shí)施 例。
[0071] 實(shí)施例4
[0072] 海洋微綠球藻藻泥用去離子水洗滌震蕩后，10000r/min離心8min，去掉上清，重 復(fù)2次后，收集藻泥備用。
[0073] 乙醇脫水處理：稱取5g藻泥于50mL無菌離心管，按乙醇溶液與原藻泥中的水的體 積比1:1添加60% (V/V)的乙醇水溶液，潤(rùn)旋0. 5min，10000r/min離心5min，脫水后的藻 泥轉(zhuǎn)入15mL無菌離心管待測(cè)。
[0074] 實(shí)施例5?8
[0075] 實(shí)施例5?8與實(shí)施例4均基本相同，其不同點(diǎn)在于添加的乙醇溶液的濃度不同， 實(shí)施例5?8的乙醇溶液的濃度依次分別為72% (V/V)、83% (V/V)、90% (V/V)和100%。
[0076] 實(shí)施例4?8脫水效果分析
[0077] 未經(jīng)乙醇脫水處理的藻泥含水量為89%，不同濃度的乙醇溶液，在相同的添加量 下，對(duì)藻泥脫水效果表現(xiàn)出顯著性（P > 0.05)差異，參見圖2。當(dāng)添加的乙醇濃度小于等 于83% (V/V)時(shí)，隨著添加的乙醇濃度增加，脫水后藻泥中含液率及含水量下降，這是因 為隨著添加的乙醇濃度增加，脫水過程中乙醇的含量增加，藻泥中的水被乙醇取代的量增 力口。添加60% (V/V)、72% (V/V)、83% (V/V)的乙醇溶液時(shí)，藻泥中的含水量分別下降至 55. 63%、50· 98%和37. 41%。而當(dāng)添加的乙醇濃度為90. 00% (V/V)和100. 00%時(shí)，由于疏 水性過大，脫水時(shí)濕藻泥結(jié)團(tuán)，導(dǎo)致添加的乙醇溶液無法與藻泥內(nèi)部的水進(jìn)行順利的交換， 乙醇脫水的效果有所下降。此外，隨著添加的乙醇濃度增加，微藻中FAME損失率增加，這是 由于脫水過程中，乙醇濃度的增加導(dǎo)致油脂在溶液中的溶解度增加，當(dāng)乙醇濃度為90. 00% (V/V)和100. 00%時(shí)，F(xiàn)AME的損失率分別達(dá)到14. 49%和18. 31%。綜合比較下，實(shí)施例3 的脫水效果較好，脫水后藻泥中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37. 41%，F(xiàn)AME的損失率為6. 02%。
[0078] 實(shí)施例9?11為研究在脫水處理步驟中乙醇溶液的加入量對(duì)脫水效果的影響的 實(shí)施例。
[0079] 實(shí)施例9?11與實(shí)施例6均基本相同，其不同點(diǎn)在于添加的乙醇溶液與原藻泥中 水的體積比不同，實(shí)施例9?11添加的乙醇溶液與原藻泥中水的體積比依次分別為1:2、 2:1 和 5:1。
[0080] 實(shí)施例6和9?11脫水效果分析
[0081] 如圖3所示，隨著乙醇溶液的添加量增加，脫水后藻泥的含液率減少，這是因?yàn)椋?濾餅或以其它方式脫水后物質(zhì)中液體的含量與液體的表面張力成正比，而隨著乙醇溶液添 加量的增加，脫水過程中乙醇濃度增加，引起液體整體的表面張力減小，從而導(dǎo)致藻泥中保 留的液體含量減少。當(dāng)添加的乙醇溶液與原藻泥中的水的體積比為1:1時(shí)，脫水后，藻泥含 水量下降至37. 41%，微藻中FAME的損失率為6. 02%。隨著乙醇溶液添加量的繼續(xù)增加， 脫水后藻泥含水量減少則趨于緩慢，與此同時(shí)，微藻中FAME的損失率呈直線升高趨勢(shì)。綜 合考慮后，實(shí)施例6的脫水效果最好。
[0082] 實(shí)施例12?13為研究在脫水處理步驟的重復(fù)次數(shù)對(duì)脫水效果的影響。
[0083] 實(shí)施例12?13與實(shí)施例6均基本相同，其不同點(diǎn)在于脫水步驟的重復(fù)次數(shù)不同， 實(shí)施例6為脫水1次，而實(shí)施例12?13的脫水的次數(shù)依次分別為2和3。
[0084] 實(shí)施例6和12?13脫水效果分析
[0085] 由于采收后的藻泥含水量較高（82. 17%?95.88% )，需要進(jìn)行乙醇的多級(jí)脫 水才能達(dá)到理想含水量的藻泥，如圖4所示，濕藻泥經(jīng)過一次、二次和三次乙醇脫水后，藻 泥中含水量分別降至37. 42%、25. 32 %和19. 61%，同時(shí)，微藻中FAME的損失率分別達(dá)到 6. 02%、18. 31 %和25. 28%。為減少FAME的損失，實(shí)施例6的脫水方案為最佳。
[0086] 實(shí)施例14?19為研究濕法提油步驟中，藻泥脫水程度（或含水量）對(duì)提取效果 的影響。
[0087] 實(shí)施例14
[0088] 微藻粗油提?。悍Q取生物質(zhì)干重為lg含水量為95 %的藻泥于50mL微波反應(yīng)罐， 按料液比1:20添加95% (V/V)的乙醇溶液作為提取溶劑，提取條件：Milestone ETHOS A采 用溫度控制模式，微波頻率范圍800MHZ?1000MHZ自動(dòng)調(diào)節(jié)，提取溫度為90°C，提取時(shí)間為 80min。油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用氯仿 定容至10mL，取2mL的定容液，測(cè)定可酯化油脂的含量。
[0089] 可酯化油脂得率=提取的可酯化油脂含量/微藻生物質(zhì)干重X 100%
[0090] 實(shí)施例15?19
[0091] 實(shí)施例15?19與實(shí)施例14均基本相同，其不同點(diǎn)在于所用藻泥的含水量不同， 實(shí)施例15?19的所用藻泥的含水量依次分別為10%、20%、40%、60%和80%。
[0092] 實(shí)施例14?19可酯化油脂提取效果分析
[0093] 如圖5所示，藻泥含水量對(duì)微波輔助濕法提取微藻中的可酯化油脂具有較大的影 響，當(dāng)含水量從10%上升至95%時(shí)，F(xiàn)AME的得率下降了 75. 19%。因此，需要對(duì)新鮮采收的 藻泥（含水量約80?95%)進(jìn)行一定程度的脫水，當(dāng)藻泥中的含水量降到20%?40%時(shí)， 藻泥中的含水量對(duì)可酯化油脂的提取率無顯著性影響（P > 〇. 05)，該含水量可作為藻泥提 取前脫水的目標(biāo)值。由實(shí)施例6可知，新鮮采收的含水率為89%的藻泥，經(jīng)83%的乙醇溶 液一次脫水后，藻泥中的水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)即可下降至37. 42%，能夠滿足微波輔助濕法提油過 程對(duì)藻泥含水率的需要。
[0094] 實(shí)施例20?25為研究在萃取步驟中無機(jī)鹽對(duì)油脂純化效果。
[0095] 實(shí)施例20
[0096] 微藻油脂的萃取純化：準(zhǔn)確量取5mL實(shí)施例17提取的微藻粗油，加入水和氯 化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，使粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)為〇. 5,氯化鈣的濃 度為0.5mol/L，再按正己烷與粗油水溶液的體積比為1的量添加正己烷溶液，混勻后靜 置1440min，收集上層溶液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用氯仿定容至10mL，準(zhǔn)確量取2mL定容液， 測(cè)定可酯化油脂的含量。再準(zhǔn)確量取2mL定容液，分別按Lowry (Journal of Biological Chemistry, 1951，193(1) :265-275)和 Stein (CUP Archive, 1979)的方法測(cè)定蛋白質(zhì)和色素 含量。
[0097] 可酯化油脂回收率=萃取獲得的可酯化油脂含量/粗油中的可酯化油脂含 量 X100%
[0098] 實(shí)施例21?25
[0099] 實(shí)施例21?25與實(shí)施例20均基本相同，其不同點(diǎn)在于無機(jī)鹽的種類不同，實(shí)施 例21?24的所用無機(jī)鹽依次分別為氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀和硫酸銨。實(shí)施例25則不加 任何無機(jī)鹽。
[0100] 實(shí)施例20?25可酯化油脂純化效果分析
[0101] 由圖6可知，以不加任何無機(jī)鹽的純化過程為對(duì)照，添加一定量無機(jī)鹽后，F(xiàn)AME的 回收率提高了 12. 31?45. 88%，這是因?yàn)榧尤胍欢舛鹊臒o機(jī)鹽對(duì)油/水乳狀液具有反乳 化作用，促進(jìn)油水分離，提高油脂在正己烷層的溶解效率。其中，實(shí)施例20獲得的FAME回 收率最高，達(dá)84. 99%。
[0102] 實(shí)施例26?30為研究無機(jī)鹽濃度對(duì)油脂純化效果的影響。
[0103] 實(shí)施例26?30與實(shí)施例20均基本相同，其不同點(diǎn)在于氯化鈣的濃度不同，實(shí)施 例26?30的氯化鈣濃度依次分別為(λ 05、0· 1、0· 25、0· 5和2mol/L。
[0104] 實(shí)施例20和26?30可酯化油脂純化效果分析
[0105] 由圖7可知，氯化鈣的濃度為0. 00?0. 10mol/L時(shí)，F(xiàn)AME回收率隨氯化鈣濃度 的增加而增加，當(dāng)氯化鈣濃度為〇. l〇mol/L時(shí)，F(xiàn)AME回收率最高，而繼續(xù)提高氯化鈣濃度， FAME回收率無顯著性增加。綜合考慮生產(chǎn)投入及FAME回收率，實(shí)施例27的效果較好。
[0106] 實(shí)施例31?36為研究萃取步驟中加入水的量對(duì)油脂純化效果的影響。
[0107] 實(shí)施例31?36與實(shí)施例27均基本相同，其不同點(diǎn)在于加入水的量不同，實(shí)施例 31?36的粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)依次分別為0. 2、0. 3、0. 4、0. 6、0. 7和0. 8。
[0108] 實(shí)施例27和31?36可酯化油脂純化效果分析
[0109] 由圖8可知，當(dāng)粗油水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)從0. 2增加到0. 5時(shí)，F(xiàn)AME的回收率 從25. 91%逐漸增加至最大值83. 06%，提高了 2. 21倍。這是由于粗油水溶液的極性隨著 水的體積分?jǐn)?shù)增加而增大，使油脂更傾向溶于正己烷中。當(dāng)水的體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)從50%增加 到80%時(shí)，F(xiàn)AME回收率隨著水的體積分?jǐn)?shù)增加而下降，這是由于當(dāng)粗油水溶液中水的體積 分?jǐn)?shù)超過50%后，乳狀液形成，且其穩(wěn)定性隨著水的體積分?jǐn)?shù)增加而增加，導(dǎo)致正己烷萃取 油脂越來越困難。實(shí)施例27的效果較好。
[0110] 實(shí)施例37?43為研究萃取步驟中正己烷的加入量對(duì)油脂純化效果的影響。
[0111] 實(shí)施例37?43與實(shí)施例27均基本相同，其不同點(diǎn)在于正己烷的添加量不同，實(shí) 施例37?43的正己烷與粗油水溶液的體積比依次分別為0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、2和4。
[0112] 實(shí)施例27和37?43可酯化油脂純化效果分析
[0113] 由圖9可知，隨著正己烷與粗油水溶液的體積比，油脂在兩相中的分布平衡向 正己烷層移動(dòng)，F(xiàn)AME的回收率增加，當(dāng)體積比為0. 4和0. 6時(shí)，F(xiàn)AME的回收率分別達(dá)到 95. 49%和96. 92%，但兩者無顯著性差異（p > 0. 05)。而繼續(xù)增加正己烷的用量，F(xiàn)AME的 回收率不斷降低。綜合考慮正己烷的用量和FMAE的回收率，實(shí)施例39的效果較好。
[0114] 實(shí)施例中涉及的部分測(cè)定方法介紹如下：
[0115] 藻泥中含水量的測(cè)定：即水占藻泥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，稱取5g藻泥于快速水分分析儀的 托盤中，105°C烘干至恒重，計(jì)算差值。
[0116] 微藻中可酯化油脂含量的測(cè)定：微藻中的可酯化油脂，即可轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯 (FAME)的油脂，以樣品經(jīng)甲酯化后，采用氣質(zhì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)得的FAME的含量計(jì)算。 原藻泥及脫水后的藻泥，冷凍干燥后，以BF3為催化劑進(jìn)行甲酯化：準(zhǔn)確稱取0. Olg藻粉 于10mL螺口玻璃管中，加0. lmL濃度為lmg/mL的C19:0二氯甲烷溶液，氮?dú)獯蹈珊螅?2mL 濃度為（λ 5mol/L 的 Na0H-CH30H 溶液，75 °C 水浴 15min，冷卻后，加入 2mL BF3-CH30H 溶液，75°C水浴15min，冷卻后，加入lmL飽和NaCl溶液，2mL正己烷溶液，4000r/min離 心8min，取lmL上層液，經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，放入氣相色譜進(jìn)樣瓶中。分析條 件：Agilent6890N-5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，以高純氦氣作為載氣，恒流流速為lmL/min。 進(jìn)樣量Ιμ?，分流比2:1，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為235°C和240°C。升溫程序：110°C 保持2min，然后以5°C /min升至220°C保持lOmin。質(zhì)譜分析采用掃描方式，掃描范圍 33.00-450.00u。各峰型的鑒定采用NIST05a譜庫自動(dòng)檢索。根據(jù)各脂肪酸相對(duì)于C19:0 內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算各脂肪酸組分的絕對(duì)含量，再換算出在總脂干重中的脂肪酸含量。
[0117] FAME損失率=(原微藻中FAME含量-脫水后微藻中FAME含量）/原微藻中FAME 含量X 100%
[0118] FAME的回收率=萃取獲得的產(chǎn)物中可酯化油脂含量/粗油中的可酯化油脂含 量 X 100%
[0119] 文中未特別說明之處，均可采用本【技術(shù)領(lǐng)域】現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，在此不再贅述。
[0120] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，故 凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修 改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種濕法提取純化微藻藻油的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 脫水處理：向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，攪拌均勻，離心，收集沉淀，獲得脫 水處理后的藻泥； 2) 濕法提油：向步驟1)獲得的脫水處理后的藻泥中加入無毒性或微毒性的有機(jī)溶劑 或其水溶液，同時(shí)對(duì)藻泥進(jìn)行細(xì)胞破壁處理，提取微藻中的粗油； 3) 離心，收集步驟2)提取得到的粗油，向其中加入水和無機(jī)鹽，攪拌均勻，形成粗油水 溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均勻后靜置分層或離心分層，收集上層溶液； 4) 將上層溶液進(jìn)行脫溶劑處理，獲得純化微藻藻油。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，乙醇溶液的加入量為所述采收 的微藻藻泥中所含水量的〇. 1?5倍體積的量，所述的乙醇溶液為濃度在30% (v/v)以上 的乙醇水溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，乙醇溶液的加入量為所述采收的微藻藻 泥中所含水量的〇. 5?2倍體積的量，所述乙醇溶液為濃度在70?90% (v/v)的乙醇水溶 液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的無毒性或微毒性的有機(jī) 溶劑或其水溶液的加入量為，相對(duì)每毫克脫水處理后藻泥干重，向其中加入5?50mL所述 的無毒性或微毒性的有機(jī)溶劑或其水溶液，步驟2)中進(jìn)行提取的溫度為90°C，提取的時(shí)間 為 80min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，相對(duì)每毫克脫水處理后藻泥干重，加入 10?20mL所述的無毒性或微毒性的有機(jī)溶劑或其水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或4或5所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述無毒性或微毒性 的有機(jī)溶劑選自乙醇、丙醇、異丙醇中的一種或多種組合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或4或5所述的方法，其特征在于，步驟2)中，對(duì)藻泥進(jìn)行細(xì)胞破壁 處理采用高壓均質(zhì)、微波、超聲波、脈沖電場(chǎng)、凍融、研磨、酸處理、堿處理中的一種或多種組 合的方式。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，向粗油中加入水的量為使粗油 水溶液中水的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%?90%，向粗油中加入無機(jī)鹽的量為使其在粗油水溶液 中的濃度達(dá)到〇. 01?5mol/L ;向所述粗油水溶液中加入正己烷的量為所述粗油水溶液的 0. 01?4倍體積的量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽選自氯化鈣、氯化鎂、氯化 鈉、氯化鉀、硫酸銨中的一種或多種的組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)和步驟3)分別重復(fù)操作兩次或 多次。
【文檔編號(hào)】C11B1/00GK104059773SQ201410312879
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】魏東, 袁顯淵 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)