在寬溫度范圍內具有活性的蛋白酶變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供特別適用于餐具洗滌應用的蛋白酶組合物。
【專利說明】在寬溫度范圍內具有活性的蛋白酶變體 本申請為2007年7月9日提交的、發(fā)明名稱為"在寬溫度范圍內具有活性的蛋白酶變 體"的PCT申請PCT/US2007/015642的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為 2009 年 1 月 16 日，申請?zhí)枮?200780026962. 2。 本申請要求在審美國臨時專利申請序列號60/831，732的優(yōu)先權。 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明提供特別適用于餐具洗滌應用的蛋白酶組合物。

【背景技術】
[0002] 通常地，傳統(tǒng)家庭和工業(yè)餐具洗滌組合物依賴于高堿度洗滌劑洗滌和氯漂白的結 合用以清潔和消毒餐具。這類系統(tǒng)通常對可漂白污點作用良好。但是，它們在去除含蛋白的 污垢時作用不足，含蛋白的污垢經常出現(xiàn)在家庭、醫(yī)院、自助餐廳、公共飲食業(yè)等的餐具中。 另外，很高堿性并包含氯的組合物被認為對消費者和環(huán)境都不友好。
[0003] 已進行各種嘗試以產生有效去除蛋白質類污垢的餐具洗滌組合物。這些組合物通 常包括在堿性條件下（例如，pH至少9. 5)具有活性的蛋白酶。但是，這樣的組合物具有明 顯的缺點，因為它們很難配制成液體或凝膠形式，這是消費者通常優(yōu)選的餐具洗滌用洗滌 劑形式。另外，堿性餐具洗滌組合物經常被認為是刺激物。
[0004] 已進行一些嘗試以產生低pH值（例如，pH小于9. 5)餐具洗滌組合物。這些組合 物更安全，對環(huán)境更加友好，并且能夠配制成凝膠和液體形式。但是，已經證明：現(xiàn)有的低 pH的餐具洗滌組合物對去除蛋白質類污垢非常低效，即使是在餐具洗滌組合物里配制高濃 度的酶（例如，蛋白酶）時也是如此。
[0005] 因此，在本領域對從餐具上高效去除蛋白質類污垢的餐具洗滌組合物仍存在需 要。另外，對于對環(huán)境和消費者更加友好并且處于易于使用和成本有效的形式的餐具洗滌 組合物仍存在需要。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明提供突變型蛋白酶，其在餐具洗滌劑應用中顯示出改進的性質。在某些優(yōu) 選的實施方式中，所述突變型蛋白酶具有與PB92絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列至少70 %的 同源性，PB92絲氨酸蛋白酶具有如下氨基酸序列：H2N-AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVL DTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQG LEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQ YGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLV NAEAATR-C00H(SEQ ID N0:2)。在另外進一步實施方式中，所述突變型蛋白酶具有與SEQ ID NO:2至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的同源性。在此處 每個優(yōu)選的實施方式中，與野生型PB92蛋白酶相比，所述突變型蛋白酶提供了改進的洗滌 性能和/或改進的穩(wěn)定性。
[0007] 在某些優(yōu)選的實施方式中，與起始蛋白酶相比，本發(fā)明提供具有改進的餐具洗滌 性能的變體蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，所述酶包括那些稱為〇49、045、046、 047/048、050、051/052、053、054、055/056、057、058、059和060的酶，其具有如在本文表1中 所列舉的取代。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供的這些酶具有另外的突變（例如，取代、 插入和/或缺失）。
[0008] 在某些特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供的酶被稱為049,其具有如下的氨基酸 序列： AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAAL NNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSG SVSSIAQGLE WAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVV AASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAA ALVKQKNPSWSNVQI RNHLKNTATS LGSTNLYGSG LVNAEAATR(SEQ ID NO ：3)
[0009] 本發(fā)明還提供新型的酶餐具洗滌用洗滌劑，包括蛋白水解酶產物，其包含至少一 種于此提供的突變型蛋白酶。
[0010] 在另外的實施方式中，本發(fā)明提供的餐具洗滌組合物包括修飾的枯草桿菌蛋白 酶，其中所述枯草桿菌蛋白酶包括至少一種在以SEQ ID N0:2表達的序列中的取代，其中每 個位置與枯草桿菌蛋白酶BPN'的氨基酸序列的氨基酸序列位置相對應，并且其中所述取 代選自下述位置：G118、S128、P129、S130 和 S166。
[0011] 在某些實施方式中，所述修飾的枯草桿菌蛋白酶包括在下述位置進行的取代： G118、S128、P129和S130。在某些優(yōu)選的實施方式中，所述修飾的枯草桿菌蛋白酶包括突 變G118V和至少一個另外的突變。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，所述另外的突變選自 S128F、S128L、S128N、S128R、S128V、P129E、P129L、P129M、P129N、P129L、P129Q、P129S、 S130A、S130K、S130P、S130T、S130V和S166D。在仍進一步優(yōu)選的實施方式中，所述修飾的 枯草桿菌蛋白酶包括在下述位置進行的取代：S128、P129和S130。還在另外的優(yōu)選實施方 式中，所述取代選自3128(：、51281?、？1290、？1291?、5130〇和51306。在某些特別優(yōu)選的實施 方式中，所述修飾的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列以SEQ ID N0:3表達。
[0012] 本發(fā)明還提供包括餐具洗滌組合物的實施方式，所述餐具洗滌組合物包括修飾的 枯草桿菌蛋白酶，其中所述枯草桿菌蛋白酶包括在以SEQ ID N0:2表達的序列中的取代，其 中每個位置與枯草桿菌蛋白酶BPN'的氨基酸序列的氨基酸序列位置相對應，并且其中所 述取代是S130T。
[0013] 本發(fā)明還提供編碼修飾的枯草桿菌蛋白酶的分離核酸，其中所述枯草桿菌蛋白 酶包括至少兩個在以SEQ ID N0:2表達的序列中的取代，其中每個位置與枯草桿菌蛋白 酶BPN'的氨基酸序列的氨基酸序列位置相對應，并且其中所述取代選自下述位置：G118、 S128、P129、S130和S166。在某些實施方式中，所述核酸編碼修飾的枯草桿菌蛋白酶，該修 飾的枯草桿菌蛋白酶包括在下述位置進行的取代：G118、S128、P129和S130。在某些優(yōu)選 的實施方式中，所述核酸編碼包含突變G118V和至少一個另外的突變的修飾的枯草桿菌蛋 白酶。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，所述核酸進一步包括選自下述的另外的突變：S128F、 S128L、S128N、S128R、S128V、P129E、P129L、P129M、P129N、P129L、P129Q、P129S、S130A、 S130K、S130P、S130T、S130V和S166D。在仍進一步優(yōu)選的實施方式中，所述核酸編碼包括 在下述位置進行取代的修飾的枯草桿菌蛋白酶：S128、P129和S130。還在附加的優(yōu)選實施 方式中，所述核酸包括選自下述的取代：3128(：、51281?、？1290、？1291?、5130〇和51306。
[0014] 在某些特別優(yōu)選的實施方式中，所述修飾的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列以SEQ ID N0:3表達。在某些附加的實施方式中，本發(fā)明提供編碼以SEQ ID N0:3表達的氨基酸序 列的分離核酸。
[0015] 還在另外的實施方式中，本發(fā)明提供包括至少一種如上所述的分離核酸的載體。 在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供包括如上所述分離核酸中至少一種的載體。在仍進一 步的實施方式中，本發(fā)明提供包括如上所述載體中至少一種的宿主細胞。
[0016] 本發(fā)明還提供餐具洗滌方法，其包括下述步驟：提供至少一種如上所述的修飾的 枯草桿菌蛋白酶和需要清潔的餐具；并且在對所述餐具提供有效清潔的條件下，使所述餐 具接觸所述至少一種修飾的枯草桿菌蛋白酶。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1A顯示含有PB92蛋白酶基因的突變載體的構建。
[0018] 圖1B提供顯示在本發(fā)明某些實施方式中使用的突變步驟的示意圖。
[0019] 圖1C顯示含有突變型PB92蛋白酶基因的表達載體的構建。
[0020] 圖2提供PB92蛋白酶基因的核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)和編碼的前蛋白、原蛋白 和成熟蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)。 發(fā)明詳述
[0021] 本發(fā)明提供用于餐具洗滌應用的方法和組合物，所述組合物包括至少一種突變型 蛋白酶。
[0022] 除非另有說明，本發(fā)明的實踐涉及分子生物學、微生物學、蛋白質純化、蛋白質工 程、蛋白質和DNA測序、重組DNA領域和工業(yè)酶應用和開發(fā)中常用的傳統(tǒng)技術，所有這些都 在本領域的技術范圍內。于此提到的所有專利、專利申請、文章和出版物，無論上述和下述， 因此都通過參考明確引入本文。
[0023] 此外，此處提供的標題沒有對本發(fā)明各個方面或實施方式進行限制，其可以通過 參考作為整體的說明書而被擁有。因此，緊隨下面所定義的術語通過參考作為整體的說明 書而被更加充分地定義。盡管如此，為了便于理解本發(fā)明，大量術語的定義被提供如下。
[0024] 除非此處另有定義，于此使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的 普通技術人員通常理解的相同的含義。例如，Singleton和Sainsbury，Dictonary of Microbiology and Molecular Biology(微生物學與分子生物學字典），第二版，John Wiley and Sons, NY(1994);以及 Hale 和 Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)提供給本領域普通技術人員有關本發(fā)明中所用的很 多術語的普通字典。雖然類似或等同于本文所述那些的任何方法和材料在本發(fā)明實踐中均 可發(fā)現(xiàn)用途，但是優(yōu)選的方法和材料描述于此。因此，下文緊接著定義的術語通過參考作為 整體的說明書而被更充分地描述。并且，如本文所用，單數(shù)術語"一"、"一個"或"其"（"a"， "an"和"the"）包括復數(shù)引用，除非上下文另有明確說明。除非另有說明，分別地，核酸的 書寫是按5'到3'的方向從左向右；氨基酸序列的書寫是按氨基到羧基方向從左向右。應 當理解，本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案和試劑，因為這些可以變化，這取決于它們 被本領域普通技術人員使用時的環(huán)境。
[0025] 期望的是，貫穿本說明書所給出的每個最大數(shù)值限定包括每個較低的數(shù)值限定， 就如同此類較低數(shù)值限定被明確寫入本文一樣。貫穿本說明書所給出的每個最小數(shù)值限定 將包括每個較高的數(shù)值限定，就如同此類較高數(shù)值限定被明確寫入本文一樣。貫穿本說明 書所給出的每個數(shù)值范圍將包括落入此類較寬數(shù)值范圍的每個較窄數(shù)值范圍，就如同此類 較窄數(shù)值范圍全部被明確寫入本文一樣。
[0026] 如本文所使用，術語"相容的"是指清潔組合物材料不會降低此處提供的蛋白酶 (多種蛋白酶）的酶活性，降低的程度使得蛋白酶（多種蛋白酶）在正常使用情況下不像所 期望的一樣有效。具體清潔組合物材料可在下文中詳細示例。
[0027] 如本文所使用，"酶的有效量"是指達到具體應用中達到所需酶活性必需的酶數(shù) 量。這類有效量是本領域普通技術人員容易確定的，并且其基于許多因素，如使用的具體酶 變體、清潔應用、清潔組合物的具體組成和是否需要液體或干燥（例如顆粒）組合物等。
[0028] 如本文所使用，與"突變型蛋白水解酶"結合使用的"具有改進的性質"是指相對 于相應的野生型蛋白酶，具有改進的性能和/或伴隨保持的性能具有改進的穩(wěn)定性的蛋白 水解酶。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，所述改進的性質選自改進的餐具洗滌性能和改進 的穩(wěn)定性，以及改進的餐具洗滌性能和改進的穩(wěn)定性的結合。
[0029] 如本文所使用，短語"洗滌劑穩(wěn)定性"是指洗滌劑組合物的穩(wěn)定性。在某些實施方 式中，穩(wěn)定性在洗滌劑使用過程中評估；而在其他實施方式中，該術語是指在儲存過程中洗 滌劑組合物的穩(wěn)定性。
[0030] 術語"改進的穩(wěn)定性"是用來表示在儲存過程中組合物中的突變型蛋白酶（多種 蛋白酶）具有更好的穩(wěn)定性和/或在泡沫（sud)中更好的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實施方式中，所 述突變型蛋白酶（多種蛋白酶）顯示出在儲存過程中在餐具護理洗滌劑中改進的穩(wěn)定性和 /或在泡沫中改進的穩(wěn)定性，相對于相應的野生型酶，所述穩(wěn)定性包括對氧化劑、螯合劑、自 我分解、表面活性劑和高堿度的穩(wěn)定性。
[0031] 如本文所使用，短語"對蛋白水解的穩(wěn)定性"是指蛋白質（例如，酶）耐受蛋白水 解的能力。不意圖將術語限制于使用任何特定的蛋白酶來評估蛋白質的穩(wěn)定性。
[0032] 如本文所使用，"氧化穩(wěn)定性"是指蛋白質在氧化條件下發(fā)揮功能的能力。具體而 言，所述術語是指在不同濃度的H 202、過酸和其他氧化劑存在下蛋白質發(fā)揮功能的能力。不 同氧化條件下的穩(wěn)定性可以用本領域技術人員已知的標準方法和/或通過本文描述的方 法來測量。氧化穩(wěn)定性的實質變化通過與沒有氧化化合物存在時的酶活性相比較，酶活性 半衰期增加或減少至少約5%或更大（在大多數(shù)實施方式中，優(yōu)選地是增加）得以證明。
[0033] 如本文所使用，"pH穩(wěn)定性"是指蛋白質在特定pH值發(fā)揮功能的能力。一般來說， 大多數(shù)酶具有它們將發(fā)揮功能的有限pH范圍。除了在中間范圍pH發(fā)揮功能的酶（即約 PH7)，還有在很高或很低pH條件下能夠發(fā)揮作用的酶。在各種pH的穩(wěn)定性可用本領域技 術人員已知的標準方法和/或通過本文描述的方法來測量。pH穩(wěn)定性的實質變化通過與酶 最適pH下的酶活性相比，酶活性半衰期增加或減少至少約5%或更大（在大多數(shù)實施方式 中，優(yōu)選地是增加）得以證明。但是，不意圖將本發(fā)明限制于任何pH穩(wěn)定性水平，也不限制 于pH范圍。
[0034] 如本文所使用，"熱穩(wěn)定性"是指蛋白質在特定溫度發(fā)揮功能的能力。一般來說， 大多數(shù)酶都具有它們將發(fā)揮功能的有限溫度范圍。除了在中間范圍溫度（例如室溫）發(fā)揮 作用的酶，還有能夠在很高或很低的溫度下作用的酶。熱穩(wěn)定性可通過已知方法和/或通 過本文描述的方法測量。溫度穩(wěn)定性的實質變化通過當暴露于給定溫度時，突變體催化活 性半衰期增加或減少至少約5%或更大（在大多數(shù)實施方式中，優(yōu)選地是增加）得以證明。 但是，不意圖將本發(fā)明限制于任何溫度穩(wěn)定性水平，也不限制于溫度范圍。
[0035] 如本文所使用，"化學穩(wěn)定性"是指蛋白質（例如酶）對可不利影響其活性的化學 物質的穩(wěn)定性。在某些實施方式中，此類化學物質包括但不限于過氧化氫、過酸、陰離子洗 滌劑、陽離子洗滌劑、非離子型洗滌劑、螯合劑等。但是，不意圖將本發(fā)明限制于任何特定的 化學穩(wěn)定性水平，也不限制于化學穩(wěn)定性的范圍。
[0036] 如本文所使用，術語"純化的"和"分離的"是指從樣本中去除污染物。例如，感興 趣的酶通過去除溶液或制備物中不是感興趣酶的污染蛋白質和其他化合物來純化。在某些 實施方式中，感興趣的重組酶在細菌或真菌宿主細胞中表達，并且這些感興趣的重組酶通 過去除其他宿主細胞成分來純化；從而增加樣本中感興趣多肽重組酶的百分比。
[0037] 如本文所使用，"感興趣蛋白"是指正在分析、鑒定和/或修飾的蛋白質（如酶或 "感興趣的酶"）。自然發(fā)生的以及重組（例如突變體）的蛋白質可在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)用途。
[0038] 如本文所使用，"蛋白質"是指任何由氨基酸組成并被本領域普通技術人員公認為 蛋白質的組分。術語"蛋白質"、"肽"和多肽于此互換地使用。其中肽是蛋白質的一部分， 本領域普通技術人員可理解術語在上下文中的使用。
[0039] 如本文所使用，功能上和/或結構上相似的蛋白質被認為是"相關蛋白質"。在某 些實施方式中，這些蛋白質來源自不同屬和/或種，包括各綱生物之間的區(qū)別（例如，細菌 蛋白和真菌蛋白）。在某些實施方式中，這些蛋白質來源自不同屬和/或種，包括各綱生物 之間的區(qū)別（例如，細菌酶和真菌酶）。在另外的實施方式中，相關蛋白質由相同種提供。 實際上，不意圖將本發(fā)明限制于任何具體來源（多種來源）的相關蛋白質。另外，術語"相 關蛋白質"包括三級結構的同系物和一級序列同系物（例如，本發(fā)明的酶）。在進一步的實 施方式中，所述術語包括是免疫交叉反應的蛋白質。
[0040] 如本文所使用，術語"衍生物"是指蛋白質，其通過加成（即插入）一個或多個氨 基酸至c-末端和N-末端的一端或兩端，在氨基酸序列的一個或多個不同位點處取代一個 或多個氨基酸，和/或在蛋白質的一個或兩個末端或在氨基酸序列的一個或多個位點處缺 失一個或多個氨基酸，和/或在氨基酸序列的一個或多個位點處插入一個或多個氨基酸， 衍生自蛋白質。優(yōu)選地，蛋白質衍生物的制備是通過修飾編碼天然蛋白的DNA序列，轉化此 DNA序列至適合的宿主中并表達所修飾的DNA序列以形成衍生蛋白質而完成的。
[0041] 相關的（和衍生的）蛋白質包括"變體蛋白質"。在某些優(yōu)選的實施方式中，變體蛋 白質與母體蛋白質以及相互間有小量的氨基酸殘基不同。不同氨基酸殘基的數(shù)量可以是一 個或多個，優(yōu)選地是1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多氨基酸殘基。在某些優(yōu)選的實 施方式中，變體之間不同氨基酸的數(shù)量在1到10之間。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，相關 蛋白質以及特別是變體蛋白質包括至少約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的氨基酸序列同源性。另外，如本文所使用 的相關蛋白質或變體蛋白質是指在顯著區(qū)域數(shù)量上不同于另一相關蛋白質或母體蛋白質 的蛋白質。例如，在某些實施方式中，變體蛋白質具有1、2、3、4、5或10個不同于母體蛋白 質的相應的顯著區(qū)域。
[0042] 適合于產生本發(fā)明蛋白酶的變體的幾種方法是本領域已知的，其包括但不限于位 點飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、隨機誘變、位點定向誘變和定向進化，以及各種其他重組 的方法。
[0043] 如本文所使用，"表達載體"是指包含DNA序列的DNA構建物，該DNA序列與能夠 實現(xiàn)該DNA在合適宿主中表達的適當控制序列可操作地連接。這類控制序列包括實施轉錄 的啟動子、控制此類轉錄的任選的操縱子序列、編碼適合的mRNA核糖體結合位點的序列和 控制轉錄和翻譯終止的序列。載體可以是質粒、噬菌體粒子或簡單地潛在基因組插入片段。 一旦轉化至適合的宿主中，載體可獨立于宿主基因組復制和行使功能，或者在某些情況下， 可以自己整合至基因組中。在本說明書中，"質粒"、"表達質粒"和"載體"經常被互換地使 用，原因在于質粒是目前最常用的載體形式。但是，本發(fā)明意圖包括表達載體的此類其他形 式，其發(fā)揮等同的功能并且是本領域已知的或開始被本領域知曉。
[0044] 在某些優(yōu)選的實施方式中，所述蛋白酶基因被連接至適當?shù)谋磉_質粒。克隆的蛋 白酶基因隨后用于轉化或轉染宿主細胞以表達蛋白酶基因。這種質?？稍谒拗髦幸哉x復 制，即它包含眾所周知的對質粒復制必要的元件或所述質?？杀辉O計成整合至宿主染色體 中。必要元件被提供用于高效基因表達（例如，啟動子可操作地被連接至感興趣的基因）。 在某些實施方式中，這些必要元件被提供作為基因自身的同源啟動子--如果它被識別的 話，（即被宿主轉錄），和轉錄終止子，其是外源的或通過蛋白酶基因的內源終止子區(qū)域供 應的。在某些實施方式中，還包括選擇基因，例如抗抗生素基因，其通過在包含抗微生物的 培養(yǎng)基中生長，能夠實現(xiàn)質粒-被感染宿主細胞的持續(xù)培養(yǎng)保持。
[0045] 雖然可以使用其他方法，但下述盒式誘變方法可用于促進本發(fā)明蛋白酶變體的構 建。
[0046] 首先，如本文所述，獲得編碼蛋白酶的自然發(fā)生的基因并進行整體或部分測序。然 后，在所編碼的蛋白酶中，對期望進行一個或多個氨基酸的突變（缺失、插入或取代）的點 進行序列掃描。評價該點側翼的序列中的限制位點的存在，其用于用寡核苷酸文庫置換基 因的短片段--當該寡核苷酸文庫表達時將編碼各種突變體。此類限制位點優(yōu)選地是在所 述蛋白質基因內的單一位點，以便促進所述基因片段的置換。但是，可以使用任何在蛋白酶 基因內不過度豐富的方便的限制位點，條件是通過限制酶切消化產生的基因片段可在適當 的序列中重組裝。如果限制位點不存在于所選點的方便距離內（從10至15個核苷酸）的 位置處，此類位點可通過在基因中取代核苷酸來產生--以閱讀框和所編碼的氨基酸在最 終構建中都沒有改變的方式進行。為了符合期望的序列而改變其序列的基因突變通過M13 引物延伸來完成，與通常已知的方法一致。定位于適合的側翼區(qū)并評估所需要變化以到達 兩個方便的限制位點序列的任務通過遺傳密碼的冗余、基因限制酶圖譜和不同限制酶的較 大數(shù)量常規(guī)進行。注意如果方便的側翼限制位點是可利用的，上述方法需要僅與不包含位 點的側翼區(qū)結合使用。
[0047] -旦克隆自然發(fā)生的DNA和/或合成DNA，在被突變位置側翼的限制位點使用關聯(lián) 限制酶消化，并且多數(shù)末端-互補的寡核苷酸盒被連接至基因中。誘變通過這種方法而被 簡化，因為所有寡核苷酸均可合成以便具有相同的限制位點，并且不含產生限制位點所必 需的合成接頭。
[0048] 如本文所使用，"相應"是指在蛋白質或肽的列舉位置處的殘基，或指相似的、同源 的或等同于蛋白質或肽中的列舉殘基的殘基。
[0049] 如本文所使用，"相應區(qū)"通常是指沿相關蛋白質或母體蛋白質的相似的位置。
[0050] 術語"核酸分子編碼"、"核酸序列編碼"、"DNA序列編碼"和"DNA編碼"是指沿脫 氧核酸鏈的脫氧核苷酸的順序或序列。這些脫氧核苷酸的順序決定了沿多肽（蛋白質）鏈 的氨基酸的順序。因此，DNA序列編碼氨基酸序列。
[0051] 如本文所使用，術語"相似序列"是指蛋白質中的序列，其提供與感興趣蛋白質 (即通常是感興趣的原始蛋白質）相似的功能、三級結構和/或保守殘基。例如，在含有α 螺旋或β折疊結構的表位區(qū)，在相似序列中的置換氨基酸優(yōu)選地保持同樣的特定結構。該 術語也指核苷酸序列以及氨基酸序列。在某些實施方式中，相似序列被開發(fā)，使得置換氨基 酸產生顯示類似或改進功能的變體酶。在某些優(yōu)選的實施方式中，所述感興趣蛋白質中的 三級結構和/或保守氨基酸殘基位于或接近感興趣的節(jié)段或片段。因此，在感興趣的節(jié)段 或片段含有例如α-螺旋或β -折疊結構之處，置換氨基酸優(yōu)選地保持這一特定的結構。
[0052] 如本文所使用，"同源蛋白質"是指具有與感興趣蛋白質（例如，另一來源的蛋白 酶）類似的作用和/或結構的蛋白質（例如，蛋白酶）。不意圖同系物一定在進化上相關。 因此，意圖該術語包括從不同種得到的相同或相似酶（多種酶）（即在結構和功能方面）。 在某些優(yōu)選的實施方式中，期望的是識別同源物，其具有類似于感興趣蛋白質的四級、三級 和/或一級結構，因為使用來自同源物的相似片段置換感興趣蛋白質中的節(jié)段或片段將會 減少變化的破壞性。在某些實施方式中，同源蛋白質已經誘導與感興趣蛋白類似的免疫反 應（多種免疫反應）。
[0053] 如本文所使用，"同源基因"是指來自不同種的至少一對基因，所述基因互相對應 并且是彼此相同或十分相似。該術語包括通過物種形成（即新物種的開發(fā)）而分離的基因 (例如，直向同源基因），以及通過遺傳復制而被分離的基因（例如，平行進化同源基因）。 這些基因編碼"同源蛋白質"。
[0054] 如本文所使用，"直向同源物"和"直向同源基因"是指通過物種形成從共同祖先基 因（即同源基因）進化的不同種的基因。通常地，直向同源物在進化過程中保留相同功能。 直向同源物的識別在可靠預測新測序基因組中的基因功能方面發(fā)現(xiàn)用途。
[0055] 如本文所使用，"種內同源基因"和"平行進化同源基因"是指在基因組中通過復制 而相關的基因。雖然直向同源物在進化過程中保留相同的功能，但是種內同源基因進化出 新的功能，盡管有些功能經常與原始功能相關。平行進化同源基因的實例包括但不限于編 碼胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，這些都是絲氨酸蛋白酶并且在同一種 內一起出現(xiàn)。
[0056] 如本文所使用，"野生型"和"天然的"蛋白質是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的那些。術語 "野生型序列"和"野生型基因"于此被互換使用，是指在宿主細胞中天然的或自然發(fā)生的 序列。在某些實施方式中，野生型序列是指感興趣序列，其是蛋白質工程項目的出發(fā)點。編 碼自然發(fā)生蛋白質的基因可以按照本領域普通技術人員已知的一般方法得到。所述方法通 常包括合成具有編碼感興趣蛋白質區(qū)域的推定序列的標記探針，從表達蛋白質的生物體制 備基因組文庫并通過與探針雜交篩選文庫中感興趣的基因。然后陽性雜交克隆被作圖和測 序。
[0057] 術語"重組DNA分子"于此使用是指DNA分子，其由通過分子生物技術連接在一起 的DNA節(jié)段構成。
[0058] 術語"重組寡核苷酸"是指使用分子生物操作產生的寡核苷酸，包括但不限于通過 多核苷酸序列的限制酶消化產生的兩個或多個寡核苷酸序列的連接，寡核苷酸的合成（例 如，引物或寡核苷酸的合成）等等。
[0059] 序列之間的同源性程度可用本領域已知的任何適合方法測定（見例如，Smith 和 Waterman，Adv.A卯l.Math.，2:482[1981] ;Needleman 和 Wunsch，J.Mol.Biol.， 48:443[1970] ;Pearson 和 Lipman，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:2444[1988];在 Wisconsin 遺傳學軟件包（Genetics Computer Group，Madison，WI)中的程序，例如 GAP、 BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;和 Devereux 等，Nucl. Acid. Res.，12:387-395 [1984])。
[0060] 例如，PILEUP是測定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用進行性的配對比 對從一組相關序列中產生多重序列排比。它也可繪制樹以顯示用于產生比對的成簇關系。 PILEUP 使用 Feng 和 Doolittle (Feng 和 Doolittle，J. Mol. Evol. ,35:351-360 [1987]) 所述的進行性比對方法的簡化。所述方法類似于Higgins和Sharp (Higgins和Sharp, CABI0S5:151-153[1989])所述的方法。有用的PILEUP參數(shù)包括3. 00的默認間距加權， 0. 10的默認間距長度加權和加權末端間距。有用算法的另一個實施例是BLAST算法，由 Altschul 等（Altschul 等，J. Mol. Biol.，215:403-410，[1990];和 Karlin 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993])描述。一個特別有用的 BLAST 程序是 WU-BLAST-2 程 序（見Altschul 等，Meth.Enzymol.，266:460-480[1996])。參數(shù)"W"、"T"和"X"決定比對 的靈敏度和速度。BLAST程序使用下述作為默認值：字長（wordlength，W)為11，BL0SUM62 得分矩陣（見拖1111?)打和他1111?)打，？1'〇(3.恥七1.六。&(1.5(^.舊六89:10915[1989])比對 (alignments，B)為 50,期望值（expectation，E)為 10, M' 5, Ν' -4 和雙鏈比較。
[0061] 如本文所使用，"核酸序列同源性百分比"被定義為在候選序列中與序列核 苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分數(shù)。
[0062] 如本文所使用，術語"雜交"是指核酸鏈與互補鏈通過堿基配對結合的方法，如本 領域已知。
[0063] 如本文所使用，短語"雜交條件"是指進行雜交反應的條件。這些條件通常通過測 量雜交的條件的"嚴格"程度來分類。例如，嚴格程度可基于核酸結合復合物或探針的解鏈 溫度（Tm)。例如，"最大嚴格性"通常發(fā)生在約Tm-5°C (在探針的Tm以下5°C)高嚴格 性"在Tm以下約5-10°C ;"中度嚴格性"在探針的Tm以下約10-20°C ;和"低嚴格性"在Tm 以下約20-25°C?？蛇x地或另外，雜交條件可基于雜交和/或一個或多個嚴格洗滌的鹽或離 子強度條件。例如，6XSSC =極低嚴格性；3XSSC =低至中度嚴格性；1XSSC =中度嚴格 性；和0. 5XSSC =高嚴格性。功能上，最大嚴格條件可被用于鑒定與所述雜交探針具有嚴 格同源性或近嚴格同源性的核酸序列；而高嚴格條件用于鑒定與所述探針具有約80%或 更高序列同源性的核酸序列。
[0064] 對于需要高度選擇性的應用，通常期望使用相對嚴格的條件以形成雜種（例如， 使用相對低的鹽和/或高溫條件）。
[0065] 短語"基本相似"和"基本相同"在至少兩種核酸或多肽的上下文中，通常地是指 多核苷酸或多肽包括如此序列，該序列與參考（即野生型）序列比較，具有至少約50 %的同 源性，更優(yōu)選地至少約60 %的同源性，仍更優(yōu)選地至少約75 %的同源性，更優(yōu)選地至少約 80 %的同源性，還更優(yōu)選地至少約90 %，仍更優(yōu)選地約95 %，最優(yōu)選地約97 %的同源性，有 時多達約98%和約99%的序列同源性。序列同源性可以使用已知程序例如BLAST、ALIGN和 CLUSTAL 使用標準參數(shù)來測定。（見例如，Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; Henikoff 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989] ;Karin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 [1993];和 Higgins 等，Gene 73:237-244[1988])。用于進行 BLAST 分析的軟件通過國家生物技術信息中心（the National Center for Biotechnology Information)是公眾可利用的。此外，可使用 FASTA (Pearson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448[1988])搜索數(shù)據(jù)庫。兩種多肽基本相同的一種指標是第一種多肽與第二種 多肽免疫交叉反應。通常地，通過保守氨基酸取代而不同的多肽是免疫交叉反應的。因此， 例如，一種多肽與第二種多肽基本相同，其中兩種肽的區(qū)別僅在于保守取代。兩種核酸序列 基本相同的另一指標在于兩個分子在嚴格條件下（例如，在中至高嚴格范圍內）互相雜交。
[0066] 如本文所使用，"等同殘基"是指共有特定氨基酸殘基的蛋白質。例如，對于已用 X-射線晶體學測定三級結構蛋白質（例如，蛋白酶），等同殘基可通過測定三級結構水平下 的同源性來鑒定。等同殘基被定義為這樣的殘基：具有推定等同殘基的蛋白質和感興趣的 蛋白質在比對后，它們的特定氨基酸殘基的兩個或多個主鏈原子的原子坐標在0. 13nm內 并且優(yōu)選在0. lnm內。最佳模型已被定向和定位以給出所分析蛋白質的非氫蛋白質原子的 原子坐標的最大重疊后，可得到比對。優(yōu)選的模型是晶體學模型，其在可用的最高分辨率下 給出實驗衍射數(shù)據(jù)的最低R因子，這是使用晶體學和蛋白質表征/分析領域普通技術人員 已知的方法測定的。
[0067] 術語"調控元件"于此使用是指控制核酸序列表達某些方面的遺傳元件。例如，啟 動子是促進可操作連接的編碼區(qū)轉錄起始的調控元件。另外的調控元件包括剪接信號、多 腺苷酸化信號和終止信號。
[0068] 如本文所使用，"宿主細胞"通常是原核或真核宿主，其用使用本領域已知的重組 DNA技術構建的載體轉化或轉染。轉化的宿主細胞能夠復制編碼蛋白質變體的載體或表達 期望的蛋白質變體。在編碼前或前原形式的蛋白質變體的載體的情況下，此類變體當被表 達時，通常從宿主細胞分泌至宿主細胞培養(yǎng)基中。
[0069] 術語"引入"在將核酸序列插入細胞中的上下文中，是指轉化、轉導或轉染。轉化方 法包括但不限于本領域已知的任何適合方法，例如原生質體轉化、氯化鈣沉淀、電轉化、裸 DNA等等，如本領域已知。（見，Chang和Cohen，Mol. Gen. Genet. ,168:111_115[1979] ;Smith 等，Appl. Env. Microbiol. ,51:634[1986];和 Ferrari 等的 Harwood, Bacillus, Plenum Publishing Corporation, pp.57_72[1989]中的綜述文章）。
[0070] 術語"啟動子/增強子"表示包含能夠提供啟動子和增強子功能的序列的DNA片 段。所述增強子/啟動子可以是"內源"或"外源"或"異種"的。內源增強子/啟動子是在 基因組中與特定基因自然連接的增強子/啟動子。外源（異種）增強子/啟動子是通過遺 傳操作（即分子生物技術）并列于基因放置的增強子/啟動子。
[0071] 在表達載體上"剪接信號"的存在通常引起重組轉錄體的較高水平表達。剪接 信號調節(jié)內含子從一級RNA轉錄體的去除并由剪接供體和受體位點組成（Sambrook等， Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York[1989]，pp. 16. 7-16. 8)。
[0072] 術語"穩(wěn)定轉染"或"穩(wěn)定地被轉染"是指外源DNA引入和整合至被轉染細胞的基 因組中。術語"穩(wěn)定轉染體"是指已經將外來或外源DNA穩(wěn)定地整合進轉染細胞基因組DNA 中的細胞。
[0073] 術語"可選擇標記"或"可選擇基因產物"于此使用是指編碼酶活性的基因的用途， 所述酶活性賦予可選擇標記在其中表達的細胞抗抗生素或抗藥物性。
[0074] 如本文所使用，術語"擴增"和"基因擴增"是指特定DNA序列被不成比例地復制 以致于所擴增的基因變成以比最初存在于在基因組中更高的拷貝數(shù)存在。在某些實施方式 中，存在藥物時通過生長進行的細胞選擇（例如，可抑制酶的抑制劑）導致編碼在藥物存在 情況下生長所需的基因產物的內源基因的擴增，或編碼這種基因產物的外源（即輸入）序 列的擴增，或兩者均有。存在藥物時通過生長進行的細胞選擇（例如，可抑制酶的抑制劑） 可導致編碼在藥物存在情況下生長所需的基因產物的內源基因的擴增，或編碼這種基因產 物的外源（即輸入）序列的擴增，或兩者均有。
[0075] "擴增"是涉及模板特異性的核酸復制的特殊情況。其與非特異性模板復制（即，復 制是模板依賴型的，但不依賴于特定模板）相反。模板特異性此處區(qū)別于復制保真度（即， 適當?shù)亩嗪塑账嵝蛄械暮铣桑┖秃塑账幔ê颂?或脫氧核糖_)特異性。模板特異性經常以 "靶"特異性進行描述。在靶序列被尋求從其他核酸中挑選出來的意義上，該靶序列是"靶"。 擴增技術被設計為主要用于這種挑選。
[0076] 如本文所使用，術語"共擴增"是指將可擴增標記與其他基因序列一起導入單個細 胞中（即，包含一個或多個非選擇性基因，例如包含在表達載體內的那些）并施加適當?shù)倪x 擇壓力以使細胞擴增可擴增標記和其他非選擇性基因序列。所述可擴增標記可以被物理連 接至其他基因序列，或可選地，兩個分離的DNA片段--其中一個含有可擴增標記，另一個 含有非選擇性標記--可被引入同一細胞。
[0077] 如本文所使用，術語"可擴增標記"、"可擴增基因"和"擴增載體"是指標記、基因 或載體，其編碼的基因在適當?shù)纳L條件下允許擴增該基因。
[0078] 如本文所使用，術語"可擴增核酸"是指可以用任何擴增方法擴增的核酸。"可擴 增核酸"通常將包括"樣本模板"被考慮在內。
[0079] 如本文所使用，術語"樣本模板"是指源于樣本的核酸，其用于分析"靶"的存在 (下面定義）。相反，"背景模板"用于指不是樣本模板的核酸，其可以存在或可以不存在于 樣本中。背景模板通常不被注意。它可以是樣本遺留的結果，或者可能是由于試圖從樣本 中純化去除的核酸污染物的存在而引起。例如，來自生物體而不是被檢測的那些的核酸可 在測試樣本中作為背景存在。
[0080] "模板特異性"在大多數(shù)擴增技術中通過酶的選擇來獲得。擴增酶是指在使 用它們的條件下僅處理核酸異源混合物中特定核酸序列的酶。例如，在Q3復制酶 的情況下，MDV-1RNA是復制酶的特異性模板（見例如，Kacian等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 69:3038[1972])。其他核酸不能被這種擴增酶復制。相似地，在T7RNA聚合 酶的情況下，這種擴增酶對其自身的啟動子具有嚴格的特異性（見Chamberlin等， Nature228:227[1970])。在T4DNA連接酶的情況下，所述酶不會連接兩個寡核苷酸或多 核苷酸，其中在連接的接頭處寡核苷酸或多核苷酸底物和模板之間存在錯配（見，mi和 Wallace，Genomics 4:560[1989])。最終，Tag和Pfu聚合酶，由于它們在高溫發(fā)揮功能的 能力，被發(fā)現(xiàn)對所結合的序列顯示出高特異性，并因此被引物限定；高溫導致有利于引物與 靶序列雜交而不與非靶序列雜交的熱力學條件。
[0081] 如本文所使用，術語"引物"是指寡核苷酸，不論是作為純化的限制酶切消化天然 發(fā)生或合成產生地，當置于互補于核酸鏈的引物延伸產物的合成被誘導的條件下時（即， 在核苷酸和誘導劑如DNA聚合酶存在下，和在適合的溫度和pH下），其能夠作為合成的起始 點。引物優(yōu)選地是單鏈以實現(xiàn)最大的擴增效率，但是可以可選地是雙鏈。如果是雙鏈，引物 在用于制備延伸產物之前，首先被處理以分離其鏈。優(yōu)選地，所述引物是寡脫氧核苷酸。所 述引物必須足夠長以在誘導劑存在情況下引發(fā)延伸產物的合成。引物的準確長度依賴于多 種因素，包括溫度、引物來源和使用方法。
[0082] 如本文所使用，術語"探針"是指寡核苷酸（即，核苷酸序列），不論作為純化的限 制酶切消化天然的發(fā)生或者是合成地、重組地或通過PCR擴增產生的，其能夠與另一個感 興趣的寡核苷酸雜交。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針用于檢測、鑒定和分離特定基因序 列。預期的是本發(fā)明使用的任何探針都將用任何"報告分子"標記以便在任何檢測系統(tǒng)中 是可檢測的，所述檢測系統(tǒng)包括但不限于酶（例如，ELISA以及基于酶的組織化學分析）、熒 光、放射性和發(fā)光系統(tǒng)。不意圖將本發(fā)明限制于任何特定的檢測系統(tǒng)或標記。
[0083] 如本文所使用，術語"靶"在關于擴增方法使用時（例如，聚合酶鏈反應），是指與 引物結合用于聚合酶鏈反應的核酸區(qū)域。因此，"靶"試圖從其他核酸序列中挑選出來。"片 段"被定義為在靶序列內的核酸區(qū)域。
[0084] 如本文所使用，術語"聚合酶鏈反應"（polymerase chain reaction, PCR)是指美 國專利號4, 683, 195、4, 683, 202和4, 965, 188--此處通過引用引入--的方法，其包括 用于增加基因組DNA混合物中靶序列的片段濃度而無需克隆或純化的方法。這種用于擴增 靶序列的方法包括引入過量很多的兩種寡核苷酸引物至包含期望靶序列的DNA混合物，隨 后在DNA聚合酶存在下進行準確順序的熱循環(huán)。所述兩種引物與它們雙鏈靶序列的各自鏈 互補。為實現(xiàn)擴增，混合物被變性，并且引物隨后被退火至其靶分子內的互補序列。在退火 后，所述引物用聚合酶延伸，以形成一對新的互補鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟 可被重復多次（即，變性、退火和延伸組成一個"循環(huán)"；可以有許多"循環(huán)"），以得到期望 靶序列的高濃度擴增片段。期望的靶序列擴增片段的長度由引物相對于彼此的相對位置決 定，因此，該長度是可控參數(shù)?；谒龇椒ǖ闹貜头矫妫摲椒ū环Q為"聚合酶鏈反應"（下 文中"PCR"）。因為靶序列的期望擴增片段在混合物中成為主要的序列（根據(jù)濃度），因此 它們被稱為是"PCR擴增的"。
[0085] 如本文所使用，術語"擴增試劑"是指除引物、核酸模板和擴增酶外擴增所需的那 些試劑（脫氧核苷酸三磷酸、緩沖液等）。通常地，擴增試劑與其他反應成分一起被放置并 包含在反應容器中（測試管、微孔等）。
[0086] 利用PCR，通過幾種不同方法可能將基因組DNA特定靶序列的單拷貝擴增至可檢 測水平（例如，與標記探針雜交；引入生物素化引物，隨后是抗生物素蛋白-酶偶聯(lián)檢測； 引入 32p-標記的脫氧核苷酸三磷酸例如dCTP或dATP至所擴增的片段中）。除了基因組 DNA，任何寡核苷酸或多核苷酸序列也可用適當?shù)囊锓肿咏M擴增。特別地，通過PCR方法 本身產生的擴增片段自身就是隨后PCR擴增的有效模板。
[0087] 如本文所使用，術語"PCR產物"、"PCR片段"和"擴增產物"是指包括變性、退火和 延伸的PCR步驟的兩個或更多循環(huán)完成后所得到的化合物的混合物。這些術語包括一個或 多個靶序列的一個或多個片段已被擴增的情況。
[0088] 如本文所使用，術語"限制內切酶"和"限制酶"是指細菌酶，其中每種在特定核苷 酸序列處或其附近切割雙鏈DNA。
[0089] 如本文所使用，"表面性質"被用于指靜電荷以及諸如由蛋白質表面顯示的疏水性 和/或親水性等性質。
[0090] 如本文所使用，"洗滌劑組合物"和"洗滌劑配方"用于指意圖用在清潔污染物體 的洗滌介質中的混合物。在優(yōu)選的實施方式中，該術語用于指用于清潔盤碟、刀具等的洗 滌劑（例如"餐具洗滌用洗滌劑"）。不意圖將本發(fā)明限制于任何特定的洗滌劑配方或組合 物。事實上，意圖除了含有至少一種本發(fā)明蛋白酶的洗滌劑之外，該術語還包括含下述物質 的洗滌劑：表面活性劑、轉移酶（多種轉移酶）、水解酶、氧化還原酶、增效助劑、漂白劑、漂 白活化劑、上藍劑和熒光染料、結塊抑制劑、掩蔽劑、酶活化劑、抗氧化劑和增溶劑。
[0091] 如本文所使用，"餐具洗滌組合物"是指用于清潔包括刀具在內的餐具的所有形式 的組合物，包括但不限于顆粒和液體形式。不意圖將本發(fā)明限制于任何特定類型或餐具組 合物。事實上，本發(fā)明在清潔任何材料的餐具（例如盤碟，包括但不限于碟子、酒杯、玻璃 杯、碗等）和刀具（例如廚房用具，包括但不限于湯匙、刀、叉、服務用具等）中發(fā)現(xiàn)用途，所 述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金屬、瓷器、玻璃、丙烯酸樹脂等。術語"餐具"于此被用于 指盤碟和刀具。
[0092] 如本文所使用，突變型蛋白酶的"洗滌性能"是指突變型蛋白酶對餐具洗滌的作 用，其對沒有將突變型蛋白酶添加至組合物中的洗滌劑提供額外清潔性能。洗滌性能在相 關洗滌條件下進行比較。
[0093] 術語"相關洗滌條件"此處用于表示在洗滌劑市場部分在家庭中實際應用的條件， 特別是洗漆溫度、時間、洗漆機械、泡沫濃度（sud concentration)、洗漆劑類型和水的硬 度。
[0094] 術語"改進的洗滌性能"用于表示在相關洗滌條件下在去除餐具和/或刀具污跡 方面獲得更好的最終效果，或者相對于相應的野生型酶獲得同樣的最終結果，需要基于重 量基礎較少的突變型蛋白酶。
[0095] 術語"保持的洗滌性能"用于表示突變型蛋白酶的洗滌性能，在相關洗滌條件下基 于重量基礎至少為相對于相應的野生型酶的80%。
[0096] 蛋白酶的洗滌性能是通過它們在適當測試條件下去除某些代表性污跡的能力來 方便地測量。在這些測試系統(tǒng)中，其它相關因素，如洗滌劑組合物、泡沫濃度、水的硬度、洗 滌機械、時間、pH和/或溫度，可以以模仿某一市場部分典型家庭應用條件的方式來控制。 當用于通過DNA誘變修飾的蛋白水解酶上時，描述于此的實驗室應用測試系統(tǒng)是代表性的 家庭應用。因此，于此提供的方法促進對大量不同酶的測試和對特別地適合于特定類型的 洗滌劑應用的那些酶的選擇。以這種方式，用于特定應用條件的"定制的"（tailor made) 酶是容易選擇的。
[0097] 如本文所使用，術語"消毒"是指從表面去除污染物，以及抑制或殺死物品表面上 的微生物。不意圖將本發(fā)明限制于任何特定的表面、物品或被去除的污染物（多種污染物） 或微生物。
[0098] 某些細菌絲氨酸蛋白酶被稱為"枯草桿菌蛋白酶"?？莶輻U菌蛋白酶包括枯草 芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、淀粉液化芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) ("枯草桿菌蛋白酶BPN"）和地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)( "枯 草桿菌蛋白酶Carlsberg")的絲氨酸蛋白酶（見例如，Markland和Smith,在 Boyer(ed. ), Enzymes, The (Boyer, ed. )vol. 3, pp. 561-608, Academic Press, New York, [1971])。桿菌菌株例如嗜堿桿菌菌株產生其他蛋白酶。近來種類的實例包括諸如 MAXACAL?蛋白酶（于此也被稱為"PB92蛋白酶"，分離自桿菌nov. spec.PB92)和 SAVINASE?蛋白酶的絲氨酸蛋白酶。另外的蛋白酶包括但不限于PROPERASE?蛋 白酶。
[0099] PB92蛋白酶的氨基酸（SEQ ID N0:2)和DNA序列（SEQ ID N0:1)顯示于圖2中。 成熟蛋白酶由269個氨基酸組成，分子量為約27, 000道爾頓，等電點在高堿范圍內。PB92 蛋白酶對蛋白質底物的活性用堿性德爾夫特單位表達（Alkaline Delft Units，ADU)。ADU 活性根據(jù)英國專利說明書號1，353, 317中描述方法測定，除pH從8. 5改變至10. 0之外。純 化PB92蛋白酶具有的活性為21，000ADU/mg。在酪蛋白上測量的轉換數(shù)（kcat (催化常數(shù)）） 為 90sec kol 、
[0100] 枯草桿菌蛋白酶Carlsberg的純化制備物的比活性（見，Delange和51]1；[1:11，工 Biol. Chem.，243:2184 [1968])等于 10, 000ADU/mg ;枯草桿菌蛋白酶 BPN ' (Matsubara 等，J.Biol.Chem.，240:1125[1965])的為7,000ADU/mg。除了上述參數(shù)如比活性和轉換數(shù) ( kcat)，PB92蛋白酶本身區(qū)別于像Carlsberg枯草桿菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶BPN'和在 洗滌劑中配制的其他蛋白酶（例如MAXATASE?.和ALCALASE? )之類的蛋白酶， PB92蛋白酶帶有高正電荷，其可通過天然蛋白質的凝膠電泳顯現(xiàn)。
[0101] 由于PB92蛋白酶在堿性pH值下在污跡去除方面具有活性，因此其通常用于洗 滌劑添加劑，與洗滌劑成分如表面活性劑、增效助劑和氧化劑一起使用。后面的試劑大 多數(shù)以粉末形式使用。與其他蛋白酶如前述的枯草桿菌蛋白酶相比，PB92蛋白酶具有 高的污跡去除效率。這意味著獲得相同的洗滌性能只需較少的PB92蛋白酶。對氧化 敏感是PB92蛋白酶和所有用于洗滌劑應用的其他已知絲氨酸蛋白酶的重要缺點（見例 如，Stauffer 等，J.Biol.Chem. ,244:5333-5338[1969];和 Estell 等，J.Biol.Chem.， 263:6518-6521 [1985])。由于含有過硼酸鹽-四水合物和TAED的活化劑系統(tǒng)產生的H202 或過酸引起的PB92蛋白酶的氧化，產生相比非氧化PB92蛋白酶，基于ADU/mg比活性分別 為50%和10%的酶。
[0102] 本發(fā)明提供用于生產、篩選和選擇衍生自天然產生的細菌絲氨酸蛋白酶的突變型 蛋白水解酶的方法和組合物。此類突變體例如是通過源自嗜堿桿菌菌株野生型基因的基因 編碼的那些。在大多數(shù)優(yōu)選的實施方式中，所述菌株是PB92。
[0103] 但是，源自嗜堿桿菌絲氨酸蛋白酶SAVINASE?的突變體是適合的。本發(fā)明還在 選擇源自蛋白酶而不是來自嗜堿桿菌菌株PB92的絲氨酸蛋白酶的修飾的蛋白酶方面發(fā)現(xiàn) 用途。例如，編碼枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶的基因 是已知的并且可被用作誘變的靶標。但是，不意圖將本發(fā)明限制于任何特定方法，因為任何 適合的誘變方法在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)用途，其包括但不限于寡核苷酸-輔助的位點定向誘變， 或區(qū)域定向的隨機誘變。
[0104] 在某些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供的用于選擇突變型蛋白水解酶的方法-- 包括生產和篩選，包括如下步驟：誘變編碼感興趣蛋白水解酶或其片段的克隆基因；分離 所得到的突變型蛋白酶基因或多個基因；引入優(yōu)選在適合的載體上的突變型蛋白酶基因或 多個基因至適合的宿主菌株中用于表達和生產；回收所產生的突變型蛋白酶；和鑒定那些 具有改進的性質用于洗滌劑應用的突變型蛋白酶。
[0105] 用于產生突變型蛋白酶的適合宿主菌株包括可轉化的微生物，在該微生物中可實 現(xiàn)蛋白酶的表達。具體而言，衍生蛋白酶的相同種或屬的所有宿主菌株是適合的，例如桿菌 菌株，優(yōu)選嗜堿桿菌菌株和最優(yōu)選桿菌nov. spec. PB92或其突變體，它們具有基本相同的 性質。此外，枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌菌株在優(yōu)選的菌株內。其他 適合的和優(yōu)選的宿主菌株包括那些在用突變體基因轉化之前基本不能夠產生細胞外蛋白 水解酶的菌株。特別感興趣的是蛋白酶缺陷型桿菌宿主菌株，例如桿菌nov. spec. PB92的 蛋白酶缺陷型衍生物。蛋白酶的表達通過使用在被選擇的宿主生物體內起作用的表達信號 來實現(xiàn)。表達信號包括調控蛋白酶基因轉錄和翻譯的DNA序列。在選擇的宿主菌株中適當 的載體能夠以充分高的拷貝數(shù)復制，或通過染色體整合能夠實現(xiàn)蛋白酶基因在宿主菌株中 的穩(wěn)定保持。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的突變型蛋白水解酶通過在適當?shù)陌l(fā)酵條件下培養(yǎng)包含期望突變型 蛋白水解基因或多個基因的轉化宿主菌株，以及回收所生產的酶而制備。
[0107] 優(yōu)選地，被表達的蛋白酶被分泌至培養(yǎng)基中，這促進它們的回收，或在革蘭氏陰性 細菌情況下，宿主菌株進入外周胞質空間。對于分泌，使用適合的氨基末端信號序列，優(yōu)選 地，如果在選擇的宿主菌株中是可操作的（functional)，所述信號序列由原始基因編碼。
[0108] 在某些實施方式中，自然發(fā)生或天然突變的洗滌劑蛋白酶的性質通過在酶中引入 多種突變來增強。很大程度上，所述突變是保守或非保守置換，雖然缺失和插入在某些實施 方式中也得到應用。
[0109] 關于保守置換，如下表得到應用： 脂肪族 中件 非極性（G、A、P、L、I、V) 極性（C、M、S、T、N、Q) 帶電的 帶負電（D、E) 帶正電（K、R) 芳呑族 (F、H、W、Y) 其中任何氨基酸可用同一種類的任何其他氨基酸取代，特別是在同一行上的。另外，極 性氨基酸N、Q可取代或被取代為帶電的氨基酸。用于本發(fā)明的目的，特別是在不直接涉及 活性位點的位點處，導致蛋白酶帶負電特征增加的置換是特別感興趣的。
[0110] 特別感興趣的突變區(qū)域是當Eglin C與活性位點結合時，那些距離抑制劑分子 Eglin C在4A距離內的氨基酸。
[0111] 下列編號基于PB92蛋白酶，但考慮因素與其他具有基本同源結構的絲氨酸蛋白 酶有關，特別是那些具有大于約70%的同源性，更特別地是，具有大于約90%的同源性的 絲氨酸蛋白酶。特定感興趣的位置包括32、33、48-54、58-62、94-107、116、123-133、150、 152-156、158-161、164、169、175-186、197、198、203-216(PB92 編號），因為這些位置的大部 分是可用于與蛋白質類底物直接相互作用。通常地，在位置32、62、153和215的氨基酸不 被取代，因為在這些位點的突變趨向于降低洗滌性能。在某些最特別優(yōu)選的實施方式中，突 變在位置116、126、127和128(PB92編號）上進行。在可選的實施方式中，另外的突變在位 置160上進行。
[0112] 在進一步實施方式中，特別感興趣的置換位置包括60、94、97-102、105、116、 123-128、150、152、160、183、203、211、212、213、214 和 216(PB92 編號）。在某些位置，所述 置換將不穩(wěn)定的氨基酸（例如甲硫氨酸）改變成氧化更穩(wěn)定的氨基酸（例如蘇氨酸），同時 保持在其位點處氨基酸的一般構象和體積。在某些其他實施方式中，用幾乎任何其他氨基 酸置換天然氨基酸，獲得改進的結果，特別是在其中羥基化氨基酸S和/或T被置換成極性 或非極性氨基酸或甚至芳香族氨基酸的取代中。
[0113] 在某些最特別優(yōu)選的實施方式中，取代包括（PB92編號）： G116I、V、L S126任何氨基酸P127任何氨基酸S128任何氨基酸 S160帶負電或中性脂肪族或R A166帶電的，特別是帶負電 M169中性脂肪族，優(yōu)選非極性 N212帶負電 M216脂肪族極性，特別是S、T、N、Q
[0114] 令人驚訝的是，盡管許多突變導致蛋白酶對普通底物的較低比活性，但是相對于 天然酶，洗滌性能是相當?shù)幕蛟鰪姷?，并在許多情況下，儲存穩(wěn)定性得以改進。另外，某些 PB92突變型蛋白酶的洗滌性能，與天然的PB92蛋白酶相比，發(fā)現(xiàn)為約120%至約180%。因 此，本發(fā)明提供與天然的蛋白酶相比，具有許多改進性能的變體蛋白酶。
[0115] 在某些實施方式中，幾種突變組合以增加洗滌劑組合物中蛋白酶的穩(wěn)定性。正面 影響相同蛋白酶洗滌的幾種突變可以被組合成能夠產生可能更進一步改進的蛋白酶的單 一突變型蛋白酶基因（例如，S126M、P127A、S128G、S160D 和 G116V、S126N、P127S、S128A、 S160D ;PB92編號）。通過將例如G116V和S160D的優(yōu)良洗滌性能與其他突變（PB92編號） 的穩(wěn)定性性質結合，提供另外的蛋白酶突變體。
[0116] 可用的突變體還通過組合于此描述的任何突變或突變組來提供。在另外的實施方 式中，于此具體提供的有用的突變與在其他位點的突變組合。在某些實施方式中，這些組合 導致酶性質的基本改變，而在其他實施方式中，改變較不重要。
[0117] 本發(fā)明還包括如本文定義的一種或多種突變型蛋白水解酶在洗滌劑組合物（多 個組合物）和/或洗滌過程（多個洗滌過程）中的用途。最后，應明確，通過氨基酸在蛋白 酶多肽鏈中的缺失或插入--或者通過誘變人工建立或在與PB92蛋白酶同源的蛋白酶中 自然發(fā)生，氨基酸編號可以改變。但是，應當理解，與PB92蛋白酶的氨基酸位置同源的位置 應落入權利要求的范圍內。 實驗
[0118] 提供下述實施例，用以顯示并進一步說明本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方式和方面，并 且其不被解釋為限制其范圍。
[0119] 在下述實驗公開中，應用下述縮寫：°C (攝氏度）^pm(每分鐘轉數(shù)）；H20(水）； HC1 (鹽酸）；aa(氨基酸）；bp(堿基對）；kb(千堿基對）；kD(千道爾頓）；gm(克）； μ g和ug (微克）；mg (毫克）；ng (納克）；μ 1和ul (微升）；ml (毫升）；mm (毫米）； nm(納米）；μπι和um(微米）；M(摩爾）；mM(毫摩爾）；μΜ和uM(微摩爾）；U(單位）； V(伏特）；MW(分子量）；sec(秒）；min(S)(分鐘）；hr(s)(小時）；MgCl2(氯化鎂）； NaCl(氯化鈉）；0D28C)(280mn處的光密度）；0D_(600mn處的光密度）；PAGE(聚丙烯酰胺 凝膠電泳）；EtOH(乙醇）；PBS(磷酸緩沖鹽溶液[150mM NaCl、10mM磷酸鈉緩沖液，pH 值7.2]) ;SDS(十二烷基硫酸鈉）；TriS(三（羥甲基）氨基甲烷）；TAED(N，N，N'N'_四 乙酰乙二胺）；w/v(重量體積比）；v/v(體積體積比）；MS(質譜分析）；TIGR(基因 組研究所，Rockville，MD) ;AATCC(美國紡織和染色化學家協(xié)會）；SR(污垢或污跡 去除）；WFK(wfk Testgewebe GmbH， Bruggen-Bracht，德國）；Amersham(Amersham Life Science,Inc.Arlington Heights, IL) ；ICN(ICN Pharmaceuticals, Inc. , Costa Mesa,CA) ；Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ; Amicon (Ami con Inc.，Beverly，MA) ;ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA) ;Amersham(Amersham Bioscience, Inc. ,Piscataway,NJ) ；Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware,Lincoln Park, NJ) ；BioRad(BioRad, Richmond, CA) ；Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto,CA) ；Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI) ；GIBC0 BRL 或 Gibco BRL (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ；Novagen(Novagen, Inc. , Madison, WI )；Qiagen(Qiagen, Inc. , Valencia,CA) ；Invitrogen(Invitrogen Corp. , Carlsbad,CA)； Finnzymes(Finnzymes 0y,Espoo,芬蘭）；Macherey-Nagel (Macherey-Nagel, East on,PA) ；Merieux (Instirut Merieux,Codex, FR) ；Kelco(CP Kelco,Atlanta, GA)； Genaissance (Genaissance Pharmaceuticals, Inc. , New Haven,CT) ；DNA 2. 0 (DNA 2.0,Menlo Park,CA) ；MIDI (MIDI Labs,Newark,DE) ；InvivoGen(InvivoGen,San Diego, CA)Sigma(Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO) ； Sorval1(Sorval 1 Instruments, DuPont Co., Biotechnology Systems 子公司,Wilmington, DE)； Stratagene(Stratagene Cloning System,La Jolla，CA) ；Roche(Hoffmann La Roche, Inc. , Nutley,NJ) ；Agi1ent (Agi1ent Technologies,Palo Alto, CA)； Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ) ；Zeiss (Carl Zeiss,Inc.,Thornwood, NY)； Henkel(Henkel，GmbH，Dusseldorf，德國）；Cognis (Cognis Corp, USA,Cincinnati, OH)； Finnzymes (Finnzymes 0y,Espoo,芬蘭）；Reckitt Benckiser，Berks，英國）； BASF (BASF Corp. , Florham Park, NJ) ； IKW (Industrieverband Kotperflege und Waschmittel，F(xiàn)rankfurt，德國）；和 WFK(Testgewebe GmbH，Briiggen-Bracht，德國）。
[0120] -些餐具洗滌實驗中所用的含有3. OOmmol Ca+Mg(16. 8° d)的合成水如下制 備。首先，制備三種儲液。溶液1是800mm〇l/l NaHC03(67.2g/l);溶液2是154.2mmol/l MgS04*7H 20(38.0g/l);和溶液 3 是 446. lmmol/1 CaCl2*2H20(65.6g/l)。制備溶液后，將儲 液1、2和3每種50ml置于含有7L脫礦質水的容器中，并隨后用另外的脫礦質水填充容器 至10L。使用前，用HC1或NaOH將合成水的pH值調整至7. 5。
[0121] 下面的表（表1)提供在本發(fā)明開發(fā)過程中產生和測試的突變體。在此表中，為方 便起見，同時提供BPN'和PB92編號。

【權利要求】
1. 餐具洗滌組合物，其包括修飾的枯草桿菌蛋白酶，其中所述枯草桿菌蛋白酶包括至 少一種在以SEQ ID N0:2表達的序列中的取代，其中每個位置與枯草桿菌蛋白酶BPN'的氨 基酸序列的氨基酸序列的位置相對應，并且其中所述取代選自下述位置：G118、S128、P129、 S130 和 S166。
2. 根據(jù)權利要求1所述的餐具洗滌組合物，其中所述修飾的枯草桿菌蛋白酶包括在下 述位置進行的取代：G118、S128、P129和S130。
3. 根據(jù)權利要求1所述的餐具洗滌組合物，其中所述修飾的枯草桿菌蛋白酶包括突變 G118和至少一個另外的突變。
4. 根據(jù)權利要求3所述的餐具洗滌組合物，其中所述另外的突變選自：S128F、S128L、 S128N、S128R、S128V、P129E、P129L、P129M、P129N、P129L、P129Q、P129S、S130A、S130K、 S130P、S130T、S130V 和 S166D。
5. 根據(jù)權利要求1所述的餐具洗滌組合物，其中所述修飾的枯草桿菌蛋白酶包括在下 述位置進行的取代：S128、P129和S130。
6. 根據(jù)權利要求5所述的餐具洗滌組合物，其中所述取代選自：S128C、S128R、P129Q、 P129R、S130D 和 S130G。
7. 根據(jù)權利要求1所述的餐具洗滌組合物，其中所述修飾的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸 序列以SEQ ID NO:3表達。
8. 餐具洗滌組合物，其包括修飾的枯草桿菌蛋白酶，其中所述枯草桿菌蛋白酶包括在 以SEQ ID N0:2表達的序列中的取代，其中每個位置與枯草桿菌蛋白酶BPN'的氨基酸序列 的氨基酸序列的位置相對應，并且其中所述取代為S130T。
9. 分離核酸，其編碼如權利要求1所述的修飾枯草桿菌蛋白酶。
10. 載體，其包括權利要求9所述的分離核酸。
11. 宿主細胞，其包括權利要求10所述的載體。
12. 餐具洗滌方法，其包括下述步驟：提供如權利要求1中所述的至少一種的修飾的枯 草桿菌蛋白酶和需要清潔的餐具；以及在對所述餐具提供有效清潔的條件下，使所述餐具 與所述修飾的枯草桿菌蛋白酶接觸。
【文檔編號】C11D3/386GK104232365SQ201410407979
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2007年7月9日 優(yōu)先權日:2006年7月18日
【發(fā)明者】P·奧古斯丁, F·齊德戈伯, A·J·保羅斯, J·C·范德萊 申請人:丹尼斯科美國公司