專利名稱：：Dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及修飾的植物。更具體地說，本發(fā)明涉及以使得植物至少一部分(例如該植物的種子)能夠產(chǎn)生商業(yè)上有用的油脂(oil)的方式修飾的植物。長期以來，植物一直是商業(yè)上有價值的油脂源。植物來源的油脂之營養(yǎng)用途迄今為止一直占統(tǒng)治地位，但是目前注意力又轉(zhuǎn)移到工業(yè)用油脂源的植物上，如代替或改進礦物油脂。油料種子(如蕓苔)中含有各種脂類(Hildish和Williams，“天然脂類的化學組成”，ChapmanHall，倫敦，1964)。對通過利用重組DNA技術(shù)改變脂類組分存在大量興趣(如Knauf，TIBtech，1987年2月，40-47)，但到目前為止，盡管這種技術(shù)的復雜性一直在增加，但由于各種原因，這種技術(shù)絕不可能實現(xiàn)所有的目標。制作植物來源之油脂的脂類成分的成功要求扎實地理解相關(guān)的生物化學和基因的知識。廣義來講，這兩個方面是可以達到的。首先，可以修飾植物以便使對這種植物來說是新的的脂肪酸合成，這樣，例如，可以在蕓苔中合成月桂酸和/或硬脂酸。此外，可以改變脂肪酸在脂類的甘油骨架上的摻入模式和/或者程度。本發(fā)明涉及的是后一方面。通過一序列酰基轉(zhuǎn)移酶將脂肪酸部分加入到甘油骨架上而在植物中形成脂類。在甘油分子上存在可以取代脂肪酸(酰基)部分的三個位置，每個位置的取代通過位置特異性酶催化完成。這些酶是甘油-sn-3-磷酸鹽?；D(zhuǎn)移酶(1-?；D(zhuǎn)移酶)、1-?；?sn-甘油-3-磷酸鹽酰基轉(zhuǎn)移酶(2-?；D(zhuǎn)移酶)和sn-1，2-二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(3-?；D(zhuǎn)移酶)。當前，植物中“脂類工程”的一個(但不是唯一的)目標是提供包括具有高含量順芥子酸脂類的油和/或包含三芥酸精(trierucin)油脂。包含順芥子酸脂類由于各種目的商業(yè)上希望得到，特別是在一定的情況下作為礦物油的代替品或補充，這一點上文已提及。就油料種子蕓苔(Brassicanapus)來說(當今栽培中產(chǎn)生油脂最重要的作物之一)，2-?；D(zhuǎn)移酶的特異性能絕對區(qū)分2位上摻入的順芥子酸。這樣，既使是這些蕓苔的栽培品種能夠在1位和3位上摻入順芥子酸，對順芥子酸也沒區(qū)別(至少是減少)，只有最多66％摻入到三酰基甘油中的脂肪酸可以是順芥子酸。已知這種品種是HEAR(高順芥子酸蕓苔)變種。因此希望產(chǎn)生這樣的植物，即常規(guī)的油料種子蕓苔以及HEAR品種，這種植物含有有用水平的三芥酸精和/或含有高水平的順芥子酸和/或含有在2位摻入的順芥子酸的油脂；同樣的油脂是其它植物油料(oil)作物的油脂，如玉米、向日葵和大豆等等，僅列出幾例。而原則上認為將編碼不同脂肪酸特異性的2-?；D(zhuǎn)移酶的DNA引入(例如，從一種不同的植物中)到需要的植物中是可能的，但在實施上存在很多問題。形成三酰甘油的?；饔猛緩剿邢嚓P(guān)的酶都是膜結(jié)合的。有1-?；D(zhuǎn)移酶、2-酰基轉(zhuǎn)移酶、3-?；D(zhuǎn)移酶，它們存在于細胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。還沒有純化它們。這使得對它們的操作很困難，并不能使用很多常規(guī)的DNA克隆方法。奇怪的是，在克隆編碼可溶性的Choroplasticl-酰基轉(zhuǎn)移酶的基因(或至少是cDNA)時不存在這種困難。事實上，為一個完全不同的目的，一直在進行有關(guān)這個酶的重組DNA工作，即Murata等(自然356710-713(1992))進行的提高煙草植物葉片抗寒性的工作。Welter等在脂肪科學技術(shù)，93，No8288-89(1991)中提出克隆膜結(jié)合酶(如2-?；D(zhuǎn)移酶)的策略，盡管沒有給出范例。WO-9413814公開了一種2-?；D(zhuǎn)移酶的DNA序列(和相應的蛋白質(zhì)序列)。這種來自玉米的序列用于轉(zhuǎn)化植物，改變了該植物2-?；D(zhuǎn)移酶正常的底物特異性。該公開內(nèi)容也包括來源于玉米2-AT的cDNA序列用于定位來源于蕓苔屬和菜屬(Limnanthes)物種的高度同源性的2-ATs。目前已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，事實上在菜屬中存在另一種在蕓苔中沒有同系物且是種子特異性的2-AT。這種2-AT能夠在2-位上摻入順芥子酸，這種情況，例如在蕓苔天然的2-AT中是不存在的。因此，本發(fā)明的第一個方面提供了重組的或分離的DNA序列，這種序列編碼一種具有膜結(jié)合的(membrane-bound)2-?；D(zhuǎn)移酶活性的酶，這些序列選自(i)DNA序列，這種序列包含圖3的DNA序列或其互補鏈；(ii)核酸序列，這種核酸序列在嚴格條件下能和圖3的DNA序列或其互補鏈雜交；(iii)核酸序列，這種核酸序列在沒有遺傳密碼的簡并性時能和圖3的DNA序列或其互補鏈雜交。合適地，本發(fā)明的DNA序列包含如上文(i)，(ii)或者(iii)所描述的DNA序列，這種DNA序列是圖3的序列或其互補鏈，或具有(ii)或(iii)特征的一種序列(這里所述的序列是圖3的序列)。上文所述的DNA序列的片段(例如長度至少是15，20，30，40或60個核苷酸)也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。合適的嚴格條件包括在35℃至65℃下的大約0.9摩爾濃度的鹽溶液。更具體地說，嚴格的雜交條件包括6×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、0.5％焦磷酸四鈉和50μg/ml變性的青魚精子DNA；可以在65℃下1×SSC、0.1％SDS中洗滌兩個30分鐘并在65℃下0.2×SSC、0.1％SDS中洗滌1個30分鐘。依照本發(fā)明的重組DNA可以是載體形式，這種載體上有足夠的調(diào)節(jié)序列(如啟動子)指導基因表達。不是表達載體的載體對克隆目的是有用的(表達載體本身也可以用于此目的)。依照本發(fā)明的包含載體的宿主細胞(如細菌和植物細胞)本身也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的2-酰基轉(zhuǎn)移酶可以直接克隆，例如由菜屬DNA文庫利用互補研究。例如，如果利用大腸桿菌作為互補宿主，選擇2-酰基轉(zhuǎn)移酶缺陷型的突變體；用菜屬(如L.douglasii)的DNA文庫轉(zhuǎn)化突變的互補宿主；利用合適的選擇培養(yǎng)基和生長條件，可以很容易地選擇含有靶?；D(zhuǎn)移酶基因的宿主細胞。大腸桿菌突變體JC201是用于有關(guān)2-?；D(zhuǎn)移酶互補研究的合適宿主。在微生物宿主(如類大腸桿菌的細菌)中克隆?；D(zhuǎn)移酶基因，以這種方式表達基因，對在制備轉(zhuǎn)化植物前用宿主分離的膜評價該酰基轉(zhuǎn)移酶基因底物特異性有特別的好處，這樣，大量節(jié)約了研究時間?？梢酝ㄟ^競爭底物分析進行這種評價，在這種方法中，該酶不同的可識別的標記候選底物彼此競爭在甘油酯上的摻入。例如，可以利用14C-瓢兒菜基(erucyl)輔酶A和1H-油酰輔酶A作為-?；D(zhuǎn)移酶的競爭性底物，并且可以測量相應的甘油酯對14C或氚的攝取。(由于2-?；D(zhuǎn)移酶具有以甘油為基礎(chǔ)的受體、以脂肪酸為基礎(chǔ)的底物及供體、底物，可以用不同的受體進行本實驗，如1-瓢兒菜基-甘油-3-磷酸酯和1-油酰-甘油-3-磷酸酯)?？梢酝ㄟ^這種方法將編碼酶(這種酶向受體(特別是1-瓢兒菜基-甘油-3-磷酸酯)提供順芥子酸)的基因鑒定為選擇的DNA序列，以進一步用于如下文所述的本發(fā)明。相應地，本發(fā)明的DNA序列編碼具有膜結(jié)合的2-酰基轉(zhuǎn)移酶活性的酶。如果需要，可以利用本發(fā)明的DNA序列產(chǎn)生其編碼的蛋白質(zhì)。這樣，在第二方面本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)是本發(fā)明DNA序列的表達產(chǎn)物。這種蛋白質(zhì)可以由以表達載體形式存在于宿主細胞中的DNA表達。這種具有2-?；D(zhuǎn)移酶活性的酶蛋白可以具有和圖3所示的序列相同或同源的氨基酸序列。同源的程度一般比已知蛋白質(zhì)的高，至少可以是40、50、60、70、80、90、95或者99％。合適的同源程度是60％或者更大，優(yōu)選的是80％或者更大，最優(yōu)選的是90％或者更大。第三方面，本發(fā)明供了有能力特異性地和本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。本發(fā)明的第四個方面提供一種具有如本文所限定的DNA序列編碼的2-?；D(zhuǎn)移酶的植物，其中所說的酶不是該植物的天然酶。當定向誘變和/或者其它蛋白質(zhì)工程技術(shù)可以用于改變該植物的天然酶時，優(yōu)選的是所述的植物是轉(zhuǎn)基因的，并摻入一種編碼本發(fā)明酶的可表達的2-?；D(zhuǎn)移酶基因。例如，如上文所述，可以通過這種方法制備不區(qū)別順芥子酸的2-?；D(zhuǎn)移酶以在正常情況下在三酰甘油酯的2位上不摻入順芥子酸的植物中表達。本發(fā)明的一個重要實施方案涉及包含三芥酸精的遺傳工程植物。這樣，這種植物比相應非工程植物(如蕓苔)具有更高水平的摻入到三酰甘油中的順芥子酸。然而，當討論上文優(yōu)選的方法時，本發(fā)明包括由本領(lǐng)域公知的方法得到的修飾過的2-酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白。當然，這種蛋白應該具有的必要的性質(zhì)是在TAGs的2位上有摻入順芥子酸的特異性。然而，利用各種技術(shù)，可以得到修飾的酶，這種酶具有，例如，更大的耐熱性、改進的動力學特征或者甚至是順芥子酸特異性。合適的工程植物的實例包括蕓苔屬如蕓苔、油菜、芥菜或者蕪菁、玉米、向日葵或者大豆。對于可表達的2-酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)基因，應該將一種啟動子和其有效地偶聯(lián)。就本領(lǐng)域目前的情況，由于精確地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的摻入位點是困難的，優(yōu)選的是在轉(zhuǎn)化植物前，將轉(zhuǎn)基因和其啟動子偶聯(lián)。本發(fā)明中有用的啟動子可以是暫時和/或者種子特異性的，但沒有必要對其進行這樣的處理；可以利用組成型啟動子，如果這些啟動子能在該種子中有力的表達并易于分離。如果編碼?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因在其它組織中表達，不可能可逆的影響這些組織，由于這種脂肪酸的實用性，將輔酶A底物有效地限制在種子中。一旦制備完啟動子-轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建體，將其通過任何適當?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)入植物細胞。本發(fā)明擴展到這種植物細胞。優(yōu)選的是利用緩和的(disarmed)Ti質(zhì)粒載體由DNA轉(zhuǎn)化植物細胞并通過本領(lǐng)域已知的方法由農(nóng)桿菌屬運載DNA，例如EP-A-0116718和EP-A-0270822所描述的。另外，利用放電器可以將外源DNA直接導入植物細胞。當農(nóng)桿菌屬無效時，例如受體植物是單子葉時，這種方法是優(yōu)選的。其它任何能在任何物種的任何植物細胞的核DNA中提供穩(wěn)定摻入的DNA之方法也都是合適的。這包括目前不能轉(zhuǎn)化的植物的物種。因此，本發(fā)明的植物包括在其三酰甘油(TAGs)的2位上有高水平摻入的順芥子酸之植物以及含有三芥酸精的植物。優(yōu)選的是依據(jù)本發(fā)明的DNA也包含第二嵌合基因(“標記”基因)，這種基因能使含有外源DNA的轉(zhuǎn)化植物或者組織培養(yǎng)物很容易地和其它不含有外源DNA的轉(zhuǎn)化植物或者組織培養(yǎng)物區(qū)別開。這種標記基因的例子包括抗生素抗性(Herrera-Estrella等，EMBO.J.2(6)987-95(1983)和Herrera-Estrella等，自然303209-13(1983)、除草劑抗性(EP-A-0242246)和葡糖苷酸酶(GUS)表達(EP-A-0344029)。由第二啟動子優(yōu)選控制標記基因的表達，這種啟動子使基因在培養(yǎng)的細胞中表達，這樣可以在植物再生的任何階段選擇含有標記的細胞或組織。這種優(yōu)選的基因來源于編碼花椰菜花葉病毒(CaMV)外殼蛋白的35S亞單位的基因。然而，任何其它合適的第二啟動子都可以利用。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過例如本領(lǐng)域已知的反義或核酶技術(shù)，使相應于轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物的天然2-?；D(zhuǎn)移酶基因至少部分滅活或有效性減少?？梢杂蓡我坏霓D(zhuǎn)化植物細胞再生整株植物，因此本發(fā)明提供了包含如上文所述的本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)基因植物(或其部分，如繁殖材料)。通過已知的方法進行這種再生。因此，在第五個方面，本發(fā)明提供了摻入本發(fā)明DNA序列的植物細胞。在第六方面，本發(fā)明提供了從本發(fā)明的植物獲得的種子。通過本發(fā)明的手段，可以產(chǎn)生植物，這種植物能產(chǎn)生具有規(guī)定的脂類成分的油脂。例如，可以將產(chǎn)生三芥酸精和/或在三酰甘油(TAGs)的2位摻入順芥子酸的植物工程化。此外，可以實質(zhì)性地改變植物中三酰甘油酯的脂類組成，以產(chǎn)生含有所需要的迄今為止順芥子酸含量最高的三酰甘油酯。例如，可以轉(zhuǎn)化油料種子蕓苔(蕓苔)以產(chǎn)生油，這種油的三酰甘油酯具有較未轉(zhuǎn)化的植物中得到的三酰甘油酯具有更高的順芥子酸含量。對于其它產(chǎn)生油的植物也同樣。也可以利用圖3序列通過雜交和/或限制性內(nèi)切酶分析和/或測序研究獲得啟動子。在另一方面，本發(fā)明提供了(a)一種產(chǎn)生油脂的方法，這種方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的植物和收獲從這種植物或它的一部分(特別是種子)產(chǎn)生的油脂；(b)從本發(fā)明的植物或其一部分，或本發(fā)明的種子獲得的油脂，在這種油脂的TAGs2位上具有摻入的順芥子酸；(c)從本發(fā)明的植物或其一部分，或本發(fā)明的種子獲得的油脂，這種油脂含有三芥酸精；(d)一種由本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)化的微生物宿主；(e)一種油料種子蕓苔植物或其它產(chǎn)生油脂的大田作物，其含有三芥酸精；(f)一種油料種子蕓苔植物或其它產(chǎn)生油脂的大田作物，其在TAGs2位上具有摻入的順芥子酸；(g)一種轉(zhuǎn)基因植物，其至少在部分細胞中表達本發(fā)明的DNA序列。具體的說，這種DNA序列在該植物的種子中表達。本發(fā)明每一方面的優(yōu)選特性是就在細節(jié)上已作修正的每一個其它方面而言。由下列實施例說明本發(fā)明。這些實施例參照附圖，其中圖1顯示實施例2得到的cDNA序列和其衍生的蛋白質(zhì)序列；圖2顯示蕓苔、玉米和菜屬之克隆的比較；圖3顯示實施例3所描述的pCB129的cDNA序列。圖4顯示利用圖3的序列對OWL數(shù)據(jù)庫同源檢索的結(jié)果；圖5和6顯示與大腸桿菌2-AT比較，圖3序列的BESTFIT序列對比(圖5)；以及和大腸桿菌2-AT比較，圖3菜屬部分序列的bestfit序列對比(圖6)。線表明兩個對比序列之間確切的匹配。雙點表明保守氨基酸取代，單點表明較低程度保守的氨基酸對；圖7顯示圖3序列和大腸桿菌2-AT頂端匹配序列的序列對比；圖8顯示以一種菜屬2片斷(CB129)為探針探查的胚、葉片和莖RNA的Northern印跡分析的結(jié)果；圖9a-c顯示實施例6所描述的Southern印跡的結(jié)果；圖10顯示利用JC201(包含pCB129)和JC200膜進行底物特異性分析的結(jié)果；圖11顯示利用JC201(包含pCB129)和JC200膜進行進一步底物特異性分析的結(jié)果；圖12是有關(guān)實施例8的質(zhì)粒pSCV1.2的限制性圖譜；圖13顯示實施例9進行的PCR方法的結(jié)果；圖14顯示種子三酰甘油的反相HPLC分析；和圖15顯示三芥酸精質(zhì)譜對比。實施例1文庫的構(gòu)建Limnanthesdouglasii植株是在溫室生長的，種子在第III期和第IV期收集，如Laurent和Huang所限定的Limnanthesalba(大多數(shù)在第IV期)，(植物生理，991711-1715(1992))?？俁NA的分離是通過標準的熱SDS方法，利用寡dt-纖維素色譜純化mRNA(利用PharmaciamRNA純化試劑盒的所附手冊中詳細描述的方法)。通過PharmaciacDNA合成試劑盒用5μgPolyA+RNA構(gòu)建cDNA文庫。用-dt填裝cDNA并且象EcoRI片段一樣克隆到噬菌體載體lamdaZAPIl中。一個質(zhì)粒為基礎(chǔ)的cDNA文庫是由一個未擴增的lamda文庫等分試樣獲得的，此文庫是利用Delauney和Verma中所描述的方案(植物分子生物學，手冊A141-23(1990))通過輔助噬菌體R408質(zhì)粒救援(rescue)完成的，在構(gòu)建的過程中，把1×106菌落(＝cDNA克隆)平板接種并且刮劃到LB培養(yǎng)基上。生長3小時后進行質(zhì)粒的制備，從而得到的菜屬中后期胚產(chǎn)生的1×106cDNA克隆的cDNA文庫樣品。實施例2與玉米克隆同源的菜屬′1′克隆的分離利用WO-9413814描述的蕓苔2AT克隆600bpNcoI/PstI片段，通過種子cDNA文庫的異源篩選獲得菜屬cDNA′1′克隆。此片段和蕓苔蛋白質(zhì)的N-末端相對應。噬斑在6×SSC、I×Denhardts、0.5％焦磷酸鈉和1mMEDTA的條件下雜交(在減量EDTA的相同溶液同時加入50μg/毫升變性的鯡精子DNA進行預雜交)，同時在60℃在I×SSC下洗滌濾器。雜交克隆(＝pCB121)的cDNA序列如圖1所示。蕓苔、玉米和菜屬′1′克隆之間的關(guān)系如圖2所示。實施例3互補cDNA克隆-菜屬′2′的獲得利用Brown等描述(植物分子生物學，26211-223(1994))的質(zhì)粒文庫進行了2-AT突變體JC201的互補作用。在電穿孔感受態(tài)的JC201的第一個轉(zhuǎn)化過程中使用500ng的DNA，在使用50ng質(zhì)粒的第二個轉(zhuǎn)化之后，實質(zhì)上更多的菌落在42℃、存在cDNA質(zhì)粒而不是只有質(zhì)粒載體(pBSSK+)的條件下生長。隨機地揀出這些菌落中的18個菌落，從每一個菌落中分離出cDNA克隆。所有的18個克隆都具有相同大小的、1.1kb的EcoRI插入片斷，并且其中一個(命名為pCB129)用于進一步的研究。pCB129的測序繪出了在pCB129中的1.1kb插入片斷的限制性位點圖譜。把切開和再連接的質(zhì)粒和更小的亞克隆到pBSSK+的插入片段作為測序模板以獲得圖3所示的序列。實施例4其他的酰基轉(zhuǎn)移酶的同源體起始于第一甲硫氨酸的281個氨基酸開放讀框用作探針序列針對OWL數(shù)據(jù)庫來檢索同源蛋白質(zhì)。頂端的配對序列如圖4所示。和WO-A-9413814的公開的pMAT1玉米序列相比，ORF和大腸桿菌的2-AtPLSC更同源一些。菜屬蛋白質(zhì)有27％與大腸桿菌蛋白質(zhì)PlsC相同，如果比較蛋白質(zhì)的一個更小的片段，相同的區(qū)域為38％(在141個氨基酸的片斷中)(見圖6)。頂端配對蛋白質(zhì)的序列對比如圖7所示。實施例5Northern印跡分析用32P標記pCB129的開放讀框，與具有來源于菜屬的胚、葉和莖上1μg的polyA+RNA的Northern印跡(在印跡42℃用0.1×SSC0.1％SDS洗滌)在42℃雜交?；蛟谂咧斜磉_較好，而在葉和莖干中的表達的水平較低(參見圖5)。實施例6Southern印跡分析為了使用植物DNA進行Southern印跡分析，用BamHI、EcoRI和HindIII切割擬南芥、Limnanthesdouglasii和蕓苔DNA的2，5和10μg的樣品以用于分離和轉(zhuǎn)移。在同一個雜交溶液(如以上實施例2中所描述的噬斑雜交)中和所有印跡雜交。菜屬′1′探針是一個1.3kb的EcoRI/HindIII片段，在60℃2×SSC中洗滌印跡，并給出如圖9a中所示的結(jié)果(更嚴格是在60℃0.2×SSC洗滌另一個印跡，在每個蕓苔道仍然有5-6帶)。同時也進行兩個具有菜屬′2′探針的印跡。首先利用pCB129的EcoRI插入片斷作為探針，并且在60℃2×SSC中洗滌，給出的結(jié)果如圖9b中所示。用pC8129的ORF相應的探針重復實驗，結(jié)果如圖9c中所示。很明顯，在高度嚴格的條件下在蕓苔中存在菜屬1的同系物，而不是菜屬2的同系物。實施例7底物特異性測定將含有pCB129的JC201在200ml的培養(yǎng)物中生長，在細菌超聲處理引起裂解之后收集膜碎片。在16000g兩次清除離心(clearingspin)之后，在200000g收集膜沉淀。懸浮的膜和來源于JC200細菌的膜(這種細菌是2-AT野生型的)一起用于單一底物的測定。在這些測定中的LPA受體是32P瓢兒菜基LPA。它是由甘油、[r32P]-ATP和瓢兒菜基輔酶A用甘油激酶和擬南芥過量產(chǎn)生的1-AT(在實驗室中能夠得到)生成的。從輔酶A中通過二氧化硅薄層色譜純化LPA，然后在甲醇中提取，干燥后在0.2％的辛基吡喃葡萄糖(octylglucopyranoside)中懸浮。將100μMLPA和100μM18∶1CoA或者100μM22∶1CoA一起用于測定。JC200和JC201(pCB129)的膜單獨用于此測定中。實驗重復兩次，第一次采取兩份樣品，第二次采取多點次單一樣品。結(jié)果如圖10和11所示。在第二次實驗中采用了更短的培養(yǎng)時間以盡量在至少兩個樣品點上得到時間的線性組合以得到起始速度的精確值。把pCB129加入到JC201，使得膜比JC200的野生大腸桿菌膜能夠更有效地利用輔酶A。在第二個實驗中，5分鐘后18∶1-22∶1的輔酶A摻入速率，對于菜屬補充膜是1.45∶1，而對于JC200膜是3.38∶1(參見圖10和圖11)。實施例8pCB129植物表達載體的構(gòu)建把圖3中所描述的cDNA序列的推定的ORF克隆到植物表達載體PAR4(napin)啟動子和Bluescript的苯基苯乙烯酮合酶(CHS)終止子盒上。利用PCR在ORF推定的起始密碼子改造一個NcoI位點是必要的，為避免PCR整個ORF和減少誤差引入該序列的可能性，通過PCR合成了一個280bp片段并且將其作為XbaI/BamHI片段克隆到pCB130。pCB130是帶有5′BamHI的缺失片段的pCB129充分測序的亞克隆。形成的克隆命名為pCB141。編碼推定的ORF的pCB143中的約880btNCOI/SmaI片斷被切除并且克隆到在pCB141形成的pAR4的NcoISmaI位點。包含napin啟動子-2-ATORFCHS終止子的pCB143的XbaI/HindIII片段和BSLII接頭連接并且克隆到質(zhì)粒SCV1.2(圖12)上，形成SCV144。第二個構(gòu)建體是通過改造一個大約100個堿基下游的NcoI位點以便在菜屬2克隆的第二甲硫氨酸開始翻譯。用和SCV144相同的方式構(gòu)建該載體。實施例9通過土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化油料種子蕓苔把基于SCV的載體SCV144(實施例8提及，其攜帶種子特異性啟動子控制下的推定的ORF)引入到根癌土壤桿菌的菌株，形成的根癌土壤桿菌的菌株用來轉(zhuǎn)化如Moloney等所描述的(植物細胞報告，8238-242(1989))高順芥子酸油料種子蕓苔子葉葉柄。SCV144攜帶了新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因，其在抗生素卡那霉素存在的條件下其允許轉(zhuǎn)化體發(fā)育。進行了兩個轉(zhuǎn)化實驗(1000個子葉)。再生的植物生長到四葉期，然后通過聚合酶鏈反應篩選NPTII基因的存在。使用了下面的引物TN5KAN15′CGCAGGTTCTCCGGCGGCTTCGGTGC3′(26個堿基)TN5KRN25′AGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAG3′(25個堿基)所使用的緩沖液如下10×＝100mMTMSpH8.8500mMKCl15mMMgCl2，1％Triton×100使用了下列方案30個循環(huán)a)在97.5℃20秒。b)在65℃30秒。c)在74℃90秒。還使用了在72℃5分鐘的一個循環(huán)并且溫度緩慢降低到室溫。結(jié)果如圖13所示。50個NPTII+Ve植株生長至成熟，通過Southern印跡分析實施例3中提及的序列的存在。從生長的種子分離出了微粒體片斷。這個組織和polytron是同質(zhì)的，經(jīng)過一個40000g清除離心之后用200000g沉淀收集膜片斷。用0.5M鹽洗滌膜以除去外膜蛋白質(zhì)，然后在-80℃存儲之前再用200000g沉淀。用50μM18∶1LPA、100μM22∶1LPA和100μM18∶1的輔酶A或者22∶1輔酶A作為?；w分別進行分析。微粒體能在2位摻入22∶1的輔酶A1-?；?甘油-3-磷酸鹽。HEAR油料種子蕓苔的對照微粒體不能這種進行反應。分析了攜帶這種基因的10個植株的種子的三芥酸精分子的存在(參見Taylor等，美國油脂化學學會雜志，69355-358(1992)三芥酸精含量的分析、Christie、脂類分析，第二版，Pergamon出版社，Toyonto，加拿大158-161(1982)2-位順芥子酸含量的測定)和種子油脂中順芥子酸的水平。三芥酸精的水平級差是明顯的(結(jié)果列于表1)。而在未轉(zhuǎn)化的品系沒有發(fā)現(xiàn)，并且在再生植株中，發(fā)現(xiàn)一些植株順芥子酸的水平超過正常HEAR未轉(zhuǎn)化品系的水平。表1</tables>實施例10TAG提取從轉(zhuǎn)基因植物中收集了成熟種子。然后種子通過勻漿的方法先用異丙醇(2ml)后用己烷(Sml)提取。過濾提取物，將溶劑在氮氣流下蒸發(fā)，然后在含有BHT(50mg/ml)丙酮-吲哚乙腈中(1∶1，v/v；1ml)吸收TAGs，在分析前貯存在4℃條件下。利用GynkotekModel480泵和VarexModelIII的蒸發(fā)光散射檢測器的高效反相液相色譜分析TAGs。此柱是由兩種具有保護柱配套的ChromSpherC18(100×4.6mm；3微米顆粒)系列柱體組成。流動相是丙酮-吲哚乙腈(1∶1，V/V)，并把10μl注射到柱子中。在這個系統(tǒng)中，大約在17-20分鐘洗脫三芥酸精。氣相色譜用甲醇鈉催化的轉(zhuǎn)酯作用制備脂肪酸的甲基酯(Chrietie，W.W.，氣相色譜和脂類，Dunde；油脂出版社(1989))。在HewlettPackardMode15890系列II氣相色譜儀上分析它們，配以裂痕/無裂痕注射，同時裝備一個熔化的二氧化硅的毛細管柱(膜厚25m×0.25mm×0.2mm)，毛細管柱涂上一層CP-Wax52CB。載氣是流速為1ml/分鐘的氫。毛細管柱的初始溫度是170℃(3分鐘)，然后溫度以4℃/分鐘的速率增加到210℃，保持此溫度25分鐘。通過電子整合定量組分。質(zhì)譜分析在以上所述的必要的條件下從5個微量制備HPLC中收集并合并具有三芥酸精的共色譜組分。除去溶劑之后，將己烷溶液中的脂類由注射器泵直接插入到FinniganSSQ質(zhì)譜測定儀，在一個大氣壓、5.07kV的冠電壓下化學電離(APCI)。胰脂肪酶水解利用Luddy等的方法，TAGs很容易被胰脂肪酶水解(J.Am.油脂化學Soc，41693-696(1964))，1MTris緩沖液(1mlPH8)、氯化鈣溶液(0.1ml；2.2％)和膽汁的鹽溶液(0.25ml；0.05％)加入到TAGs，這些溶液用胰脂肪酶(豬胰酶，Sigma)在40℃水解2分鐘。加入乙醇(1ml)使反應停止，隨后加入6M鹽酸(1mL)，同時溶液用乙醚(每份4ml)提取三次。溶劑層用蒸餾水(3ml)沖洗一次，用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器除去溶劑之前用硫酸鈉干燥。利用硅膠(即HypersilH3(250×4.6mm)柱)通過微量制備HPLC分離所需的2-單酰甘油產(chǎn)物。同時利用了一個光譜物理Model8700溶劑轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和CunowModelDDL21光散射檢測器(SevernAnalytical)。將層流分離器(stream-splitter)(大約10∶1)插入到柱和檢測器之間以收集組分。流動相是流速為1ml/分鐘的異己烷-甲基terbutyl醚-醋酸(體積比100∶100∶0.02)。在大約14分鐘后，單?；视拖疵摮鰜?，并且通過流層分離器手工收集。如以前的方法將其進行甲基化，用于氣相色譜分析。結(jié)果TAG的HPLC分析為了初步鑒定表達菜屬LPA-At蛋白的植株，分析轉(zhuǎn)基因植株的成熟種子的三芥酸精的存在情況。利用反相HPLC提取和檢驗TAGs組分(圖14)。利用此系統(tǒng)在大約17-20分鐘洗脫出三芥酸精，圖14顯示了非轉(zhuǎn)化的未檢測出三芥酸精的蕓苔的分析結(jié)果。然而，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株SCV144-2和SCV144-9分別有2.8％和0.4％一種脂類(這種脂類洗脫時和三芥酸精有相同的保留時間)(圖14B和C)。在圖14所示的色譜圖中三芥酸精的保留時間的輕微差異是明顯的，因為這些分析是在輕微不同的條件和不通場合下進行的，但是每一次分析都通過可靠的三芥酸精的分配來確定三芥酸精峰的位置。這種脂類分離是通過反相HPLC部分根據(jù)鏈長度和分子不飽和程度來進行的。洗脫時間隨著脂肪酸鏈中碳原子的總數(shù)的增加而增加，但是粗略地隨著每個雙鍵的2C當量而降低。因此一個C201-C221-C221的TAG能在一個類似但是不同于三芥酸精(C221-C221-C221)的位置洗脫出來；如果這個TAG也存在時，三芥酸精不能區(qū)別于C201-C221-C241。得到的結(jié)果明顯地表明順芥子酸摻入到sn-2，但是為了絕對的確定三芥酸精峰的等同性，進行了質(zhì)譜分析。三芥酸精的質(zhì)譜對比SCV144-2和SCV144-9種子中收集三芥酸精的共色譜成分，將5個微制備HPLC的這些成分合并，進行質(zhì)譜分析。圖15A顯示可靠的三芥酸精的光譜。圖15B顯示SCV144-9的轉(zhuǎn)基因的種子的光譜。M/Z1053.5最豐富的離子(在(A)和(B)分別標記為1054和1053)是三瓢兒菜基甘油分子態(tài)的離子[M+]。在715/716的離子代表erucate失去的部分。結(jié)果確認了三芥酸精的存在，因而表明在轉(zhuǎn)基因的蕓苔植物中順芥子酸加入到TAG的sn-2位。TAG的脂肪酸分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物SCV144-2和SCV144-9三芥酸精的水平很低(分別為2.8％和0.4％)。因此，為了確定是否順芥子酸在sn-2位的摻入限制了三芥酸精的產(chǎn)生，在TAG中進行了脂肪酸詳細的定位分析。通過甲酯的氣相色譜(GC)，測定了全部脂肪酸組合物。通過用胰脂肪酶(此酶能從sn-1和sn-3除去?；鶊F)初步處理TAG確定2位的脂肪酸的存在。通過微型制備HPLC分離出需要的2-單?；视彤a(chǎn)物，然后將其甲基化，再利用氣相色譜檢驗。在油料種子中，在所用的生長條件下，開始的種群有一個最大的順芥子酸值，為31.7mol％。選擇的非轉(zhuǎn)化蕓苔植株分析表明在2位沒有順芥子酸的摻入。然而，在具有0.4％的三芥酸精和32.2mol％的順芥子酸水平的SCV144-9中，順芥子酸由9mol％的在sn-2酯化的脂肪酸組成。同樣地，在具有2.8％三芥酸精的SCV144-2中，順芥子酸由32.1mol％的整個TAG脂肪酸和28.3mol％的在sn-2酯化的脂肪酸組成。在這些轉(zhuǎn)基因植物中，在sn-2的順芥子酸的含量表現(xiàn)為和三芥酸精含量相關(guān)。權(quán)利要求1.一種重組的或者分離的DNA序列，該序列選自(i)DNA序列，這種序列包含圖3的DNA序列或其互補鏈；(ii)核酸序列，這種核酸序列在嚴格條件下能和圖3的DNA序列或其互補鏈雜交；(iii)核酸序列，在沒有遺傳密碼的簡并性時這種核酸序列能和圖3的DNA序列或其互補鏈雜交。2.一種如權(quán)利要求1所要求的DNA序列，其是具有特征(i)的序列。3.一種如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所要求的DNA序列，其編碼具有膜結(jié)合的2-酰基轉(zhuǎn)移酶活性的酶。4.一種分離的蛋白質(zhì)，其是權(quán)利要求1-3之任一所限定的DNA序列的表達產(chǎn)物。5.一種蛋白質(zhì)，其實質(zhì)上與權(quán)利要求4所要求的蛋白質(zhì)同源。6.一種抗體，其能特異性地和權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所限定的蛋白質(zhì)結(jié)合。7.一種植物，其具有由權(quán)利要求1至3之任一所限定的DNA序列編碼的2-?；D(zhuǎn)移酶，其中所說的酶不是該植物的天然酶。8.一種如權(quán)利要求7所要求的植物，其是2-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因植物。9.一種如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所要求的植物，其是蕓苔屬、玉米、向日葵或者大豆。10.一種如權(quán)利要求9所要求的植物，其是蕓苔、油菜、芥菜或蕪菁。11.一種如權(quán)利要求7至10之任一所要求的植物，其具有摻入到三酰甘油的順芥子酸的較高水平。12.一種如權(quán)利要求7至11之任一所要求的植物，在其種子三酰甘油(TAGs)的2-位上具有摻入的順芥子酸。13.一種如權(quán)利要求7至12之任一所要求的植物，其含有三芥酸精。14.一種如權(quán)利要求7至13之任一所要求的植物，其中所說的轉(zhuǎn)基因2-?；D(zhuǎn)移酶比該植物的這種天然酶對順芥子酸具有更高的特異性。15.一種如權(quán)利要求7至14之任一所要求的植物，其中所說的天然2-酰基轉(zhuǎn)移酶被通過例如核酶或者反義核酸至少部分滅活或者除去。16.一種植物細胞，其摻入了權(quán)利要求1至3之任一所限定的DNA。17.一種如權(quán)利要求16所要求的植物細胞，其是蕓苔屬、玉米、向日葵或者大豆的細胞。18.一種如權(quán)利要求16所要求的植物細胞，其是蕓苔、油菜、芥菜或者蕪菁細胞。19.從權(quán)利要求7至15之任一所限定的植物得到的種子。20.一種產(chǎn)生油脂的方法，該方法包括栽培權(quán)利要求7至15之任一所要求的植物和收獲由這種植物或它的一部分(特別是種子)產(chǎn)生的油脂。21.從權(quán)利要求7至15之任一所限定的植物或其一部分，或者從權(quán)利要求19所限定的種子獲得的油脂。22.如權(quán)利要求21所要求的油脂，在其TAGs至少一部分的2位上具有摻入的順芥子酸。23.如權(quán)利要求21所要求的油脂，其含有三芥酸精。24.如權(quán)利要求21至23之任一所要求的油脂，其可通過權(quán)利要求20所限定的方法獲得。25.一種用權(quán)利要求1至3之任一所限定的DNA序列轉(zhuǎn)化的微生物宿主。26.一種權(quán)利要求1至3之任一所要求的DNA序列的片段，其至少包含15個核苷酸。27.編碼的RNA的DNA，所述RNA對權(quán)利要求1至3之任一所要求的DNA編碼的有義RNA是反義的。28.編碼一種核酶的DNA，所述核酶對權(quán)利要求1至3之任一所要求的DNA編碼的RNA具有特異性。29.一種包含啟動子的分離的或者重組的DNA，所述啟動子能天然驅(qū)動基因的表達以產(chǎn)生權(quán)利要求4或5所要求的蛋白質(zhì)。30.一種油料種子蕓苔植物或其它產(chǎn)油脂的大田作物，其含有三芥酸精。31.一種油料種子蕓苔植物或其它產(chǎn)油脂的大田作物，在其TAGs2位上有摻入的順芥子酸。32.一種轉(zhuǎn)基因植物，其至少在部分細胞中表達權(quán)利要求1至3之任一所限定的DNA序列。33.如權(quán)利要求32所要求的轉(zhuǎn)基因植物，其是一種蕓苔屬植物。34.如權(quán)利要求33所要求的轉(zhuǎn)基因植物，其是蕓苔、油菜、芥菜或者蕪菁。35.如權(quán)利要求32至34之任一所要求的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的DNA序列在該植物的種子中表達。36.一種如權(quán)利要求33至35之任一所要求的轉(zhuǎn)基因植物，其是一種HEAR植物。全文摘要可以產(chǎn)生具有來源于菜屬的2－?；D(zhuǎn)移酶的植物,特別是轉(zhuǎn)基因植物,和天然酶相比,所述酶具有改變的底物特異性。例如,為了產(chǎn)生三芥酸精,油料種子蕓苔可以含有來源于Limnanthesdouglasii的2－?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明公開了Limnanthesdouglasii的2－?；D(zhuǎn)移酶的cDNA序列和其相應的蛋白質(zhì)序列。文檔編號C11B1/00GK1177981SQ9619238公開日1998年4月1日申請日期1996年2月9日優(yōu)先權(quán)日1996年2月9日發(fā)明者A·R·斯拉巴斯,A·P·布朗,C·L·布羅夫,J·T·M·克羅恩申請人:吉恩·希爾斯有限公司