專利名稱：：含有酸性蛋白酶的酸性清洗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有酸性的基本對(duì)抑胃酶肽不敏感的蛋白酶和非離子表面活性劑的清洗組合物。組合物適于在酸性pH值下清洗堅(jiān)硬表面或纖維素和/或羊毛織物。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)今在家用和工業(yè)中使用的清洗組合物大部分為堿性。象CIP清洗的工業(yè)清洗，例如乳牛場(chǎng)或其他食品加工工業(yè)中的薄膜的清洗，通常包括去除礦物沉淀(例如像奶石的粗鹽(水垢))的酸處理，以及去除例如脂肪、蛋白質(zhì)和/或糖類的有機(jī)物質(zhì)的堿性洗滌劑處理。方法通常包含下列步驟漂洗→堿→漂洗→酸→漂洗由于缺乏可工業(yè)生產(chǎn)的酸性pH下有效的酸性蛋白酶，而阻礙了酸性條件下酶法清洗餐具、衣物和工業(yè)和家用堅(jiān)硬表面方法的發(fā)展，雖然需求這樣有益的酸性清洗組合物，開發(fā)完全酸性洗滌方法卻只有很少的嘗試。DE3833047A1公開了含有水解酶的酸性ADW(自動(dòng)餐具洗滌)洗滌劑組合物，此處水解酶可為淀粉酶、水解酶或脂肪酶。US5，698，507公開了pH3-5的膠凝餐具洗滌組合物，其基本上由特定量的非離子表面活性劑、檸檬酸、H2O2、至少一種抗酸性蛋白酶、至少一種淀粉酶、水溶助長(zhǎng)劑、CaCl2、甲酸鈉、膠凝系統(tǒng)和水組成。特定命名的酶為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶(例如Tenase1200、TenaseL-1200和TenaseL-340)和黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶。WO95/02044公開了用于食物、動(dòng)物飼料、飲料、皮革生產(chǎn)以及用于接觸鏡清潔的得自棘孢曲霉(A.aculeatus)的酸性天門氨酸蛋白酶(表示為蛋白酶Ⅰ和蛋白酶Ⅱ)。WO96/29978公開了含有酸性蛋白酶的酸性口腔護(hù)理組合物，其在正常、微堿性口腔環(huán)境下基本上沒有活性。WO96/23579公開了啤酒過濾工藝中膜的洗滌，至少包括a)用含有β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶的含酶水溶液處理膜；b)用酸性清洗劑清洗；以及c)用含堿性溶液的過氧化物清洗。發(fā)明概述我們發(fā)現(xiàn)在有選自抑胃酶肽、Pefabloc、PMSF或EDTA的抑制劑存在下可保持蛋白水解活性的蛋白酶，與其他在相似pH活性范圍的酸性蛋白酶相比，顯示了出人意外的好的清洗和/或活性性能。因此，本發(fā)明提供了優(yōu)于本領(lǐng)域現(xiàn)有堿性洗滌劑組合物的優(yōu)點(diǎn)，如a)過氧(peroxygen)/激活劑漂白系統(tǒng)，例如能氧化或漂白存在于污物或污漬中的多聚芳香化合物的過硼酸鈉或過碳酸鹽和TAED激活物，該系統(tǒng)甚至在低溫下變得更有效，b)酶增強(qiáng)劑漂白系統(tǒng)，例如甚至在低溫下可以使用的過氧化物酶-PPT或漆酶-PPT。酸性條件本身對(duì)一些類型的污漬(例如咖啡和茶)有漂白效果，c)工業(yè)堅(jiān)硬表面清洗中的堿性清洗步驟和漂洗步驟，例如CIP(原位清洗)可以省略，因?yàn)樗嵝韵礈靹┙M合物可以去除有機(jī)污物以及無機(jī)污物或污漬，d)省略堿性清洗步驟將減少堅(jiān)硬表面的損傷。e)通常存在于堿性洗衣洗滌劑中的助洗劑系統(tǒng)在酸性洗衣洗滌劑中可以減少用量或者甚至于省略，因?yàn)樵谒嵝詐H時(shí)水硬性離子通常不會(huì)使表面活性劑沉淀。這意味著在洗滌設(shè)備中例如，自動(dòng)洗衣機(jī)中的結(jié)垢可以避免。這樣，本發(fā)明第一方面提供了用于堅(jiān)硬表面和衣物清洗的酸性洗滌劑組合物，其中含有酸性蛋白酶和至少一種非離子表面活性劑，該蛋白酶在有選自抑胃酶肽、Pefabloc、PMSF或EDTA的抑制劑存在下仍可保持蛋白水解活性。發(fā)明詳述定義此處使用的術(shù)語“堅(jiān)硬表面”涉及水基本上不能滲透的任何表面。堅(jiān)硬表面的實(shí)例有由例如不銹鋼或其他合金、塑料/合成多聚物、橡膠、玻璃、木頭、混凝土、巖石、大理石、石膏以及陶瓷材料制得的表面，上述所有的表面任選地被例如油漆、釉質(zhì)、多聚物等等包被。此處使用的術(shù)語“抑制劑”涉及競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性與蛋白酶相互作用的化合物，因此減少和/或破壞酶對(duì)酶底物的活性。術(shù)語“保留蛋白水解活性”解釋為在用抑制劑處理蛋白酶后，pH5.5時(shí)HPU單位測(cè)定蛋白酶仍保留至少75％自身活性(殘留活性)的性質(zhì)，抑制劑可以為1mM抑胃酶肽、0.1％Pefabloc、0.1％PMSF或100mMEDTA。蛋白酶本發(fā)明上下文中的蛋白酶為酸性蛋白酶，在有選自抑胃酶肽、Pefabloc、PMSF或EDTA的抑制劑存在下可保持蛋白水解活性。MuroaS.和OdaK.(1985)描述了抑胃酶肽的抑制劑有下面的結(jié)構(gòu)式在WO95/02044中顯示了關(guān)于本發(fā)明上下文中抑制的蛋白酶的特性。抑制實(shí)驗(yàn)顯示蛋白酶Ⅰ不被抑胃酶肽所抑制。蛋白酶Ⅱ被抑胃酶肽抑制。根據(jù)OdaK.和MuraoS.(1991)，酸性蛋白酶被描述為兩類，對(duì)抑胃酶肽敏感的羧基或天門冬氨酸蛋白酶，以及對(duì)抑胃酶肽不敏感的羧基蛋白酶。MuroaS.和OdaK.(1995)還提供了參考文獻(xiàn)，對(duì)于酸性蛋白酶此處引入了這一新的亞類。PMSF是有下面結(jié)構(gòu)式的抑制劑而PEFABLOC是有下面結(jié)構(gòu)式的蛋白酶抑制劑優(yōu)選的蛋白酶得自微生物，例如細(xì)菌菌株，如芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)或黃單胞菌(Xanthomonas)，或者真菌菌株(包括酵母)，例如曲霉屬(例如棘孢曲霉或黑曲霉)或Scytalidium(例如S.lignicolum)。在另一個(gè)實(shí)施方案中蛋白酶可從細(xì)菌或真菌得到，通過用含有編碼該蛋白酶的DNA質(zhì)粒/構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌或真菌，對(duì)其進(jìn)行遺傳修飾。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中本發(fā)明的蛋白酶含有一或多個(gè)作為活性中心功能性基團(tuán)的天門冬氨酸和/或羧基殘基。此外，蛋白酶在肉類、卵清、全血、血漿、奶、啤酒、馬鈴薯或豆類中的抑制劑存在的條件下仍保留蛋白水解活性。這樣的抑制劑可以是卵巨球蛋白(ovomacroglobulin)、卵類粘蛋白(ovomucoid)或卵糖蛋白(ovoglycoprotein)。目前受注視的是，需洗滌的污物中存在的抑制劑(例如競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑-本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的術(shù)語)在洗滌方法中扮演重要的角色，因?yàn)樗鼈兛墒顾馕畚锏拿甘Щ罨蚴蛊浠钚越档?。這可能是之所以很難找到適合用于酸性洗滌組合物中的蛋白酶的原因。而且蛋白酶可具有優(yōu)選的最佳pH為2-7，更優(yōu)選為3-6或者最優(yōu)選4.5-5.5。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶還可有20-70℃之間的最佳溫度，例如20-60℃之間，例如30-50℃之間。在另一個(gè)特別實(shí)施方案中，蛋白酶為如WO95/02044中所述的得自棘孢曲霉的蛋白酶Ⅰ或蛋白酶Ⅱ，此處引入作為參考。最優(yōu)選的蛋白酶為蛋白酶Ⅰ。非離子表面活性劑非離子表面活性劑特別適合酸性洗滌劑，因?yàn)樗鼈冊(cè)谥卸人嵝原h(huán)境中功能不受影響。優(yōu)選的非離子表面活性劑為糖脂、脂肪醇乙基氧化物、烷基苯酚乙氧基化物、葡萄糖胺、烷基多葡糖苷(Stache&Kosswig，1990年)。其他合適的組合物組分當(dāng)用于制備洗滌液的水硬度相當(dāng)大，即鈣離子可能影響蛋白酶性能時(shí)，組合物可任選地包含螯合劑。合適的螯合劑應(yīng)當(dāng)能在酸性pH時(shí)螯合鈣離子。優(yōu)選的螯合劑為甲基甘氨酸二乙酸、硝基乙酸、檸檬酸、源自多聚糖的寡聚和多聚(多)羧酸(Kock等，1993年)、糊精或蛋白質(zhì)水解物(DE19547730Al)。組合物還可包含其他增強(qiáng)組合物去污力的成分，例如軟化劑、淀粉酶(如源自NovoNordiskA/S的Fungamyl_，丹麥)、脂肪酶(如源自NovoNordiskA/S的Novocor_AD，丹麥)、纖維素酶(例如Celluzyme_、Carezyme_、和/或Celluclast_，均源自NovoNordiskA/S，丹麥)、木聚糖酶(例如源自NovoNordiskA/S的Biofeed_PLUS或ShearzymeTM，丹麥)、β-葡聚糖酶(例如源自NovoNordiskA/S的Viscozyme_或UltrafloTM，丹麥)、果膠酶(例如源自NovoNordiskA/S的PectinexTMUltra，丹麥)、過氧化物酶(例如源自NovoNordiskA/S的GuardzymeTM，丹麥)、漆酶(例如得自毀絲霉屬(Myceliophthora)或多孔菌屬(Polyporus))、過氧化物酶/漆酶的增強(qiáng)劑(例如PPT或甲基丁香酸甲基丁香酯或其衍生物)和/或緩沖劑(例如檸檬酸)。最后，組合物可以是液體或粉末。在后一情況下，蛋白酶可適當(dāng)?shù)刂瞥煞€(wěn)定化顆粒。使用常規(guī)方法可以得到該制劑。組合物的用途根據(jù)本發(fā)明的組合物可適用于清洗或洗滌堅(jiān)硬表面或衣物的方法中。方法可優(yōu)選地包括將溶于水性溶液的其量足以達(dá)到洗滌效果的組合物與上述堅(jiān)硬表面或衣物接觸。蛋白酶和其他組合物成分可以選擇性地分別加入溶液中。溶解的組合物的量?jī)?yōu)選地以足以提供500-3000HUT/L清洗液的酶劑量，優(yōu)選地500-1500HUT/L清洗液，更優(yōu)選地750-1250HUT/L清洗液，例如1000HUT/L清洗液。待用該方法清洗或洗滌堅(jiān)硬表面在一個(gè)實(shí)施方案中優(yōu)選地為工業(yè)加工設(shè)備或家用設(shè)備。特別優(yōu)選的工業(yè)加工設(shè)備可以為熱交換器、罐(tank)、管道、離心機(jī)、蒸發(fā)機(jī)、過濾器、擠壓機(jī)、絞肉機(jī)、蒸煮罐(cookingjar)、啤酒和葡萄酒發(fā)酵罐、啤酒和葡萄酒過濾器、廢過濾器輔助器(spentfilteraids)、冷卻器、儲(chǔ)存罐、篩網(wǎng)、水力旋流器、超濾裝置、納米過濾裝置、超過濾裝置(hyperfiltrationunit)、微孔過濾裝置以及擠奶器。特別合適的實(shí)施方案是保健或動(dòng)物照料設(shè)備或產(chǎn)品的洗滌。保健設(shè)備包含診斷/分析性(例如內(nèi)窺鏡、血液分析儀)、處理的(例如透析或血液處理設(shè)備)或手術(shù)設(shè)備(例如醫(yī)生、獸醫(yī)或牙醫(yī)為治療患者使用的解剖刀、錘子、夾子或鑷子、鉗子等)，它們會(huì)與源自人或動(dòng)物的血液、其他體液或組織接觸。關(guān)于工藝加工設(shè)備清洗，在特殊實(shí)施方案中方法可以為“原位清洗”(CIP)方法。特別優(yōu)選的家用設(shè)備可以為食具、盤子、杯子、燒杯、玻璃、罐(pots)、盆、電器、抽水馬桶、盥洗間(lavatories)或瓷磚。本發(fā)明的另一合適的實(shí)施方案為用于大規(guī)模糖生產(chǎn)的工業(yè)離子交換柱的清洗，以去除鹽、帶電糖類殘?jiān)⒌鞍踪|(zhì)和氨基酸，以及結(jié)晶前的著色材料。還可以使用本發(fā)明的組合物清洗在異構(gòu)化工藝之前和之后用于淀粉基糖漿生產(chǎn)中的離子交換柱。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案為，用于制造工藝的離子交換器的清洗，在交換器中蛋白質(zhì)或多肽可能通過蛋白質(zhì)材料包被和/或堵塞樹脂材料。通常如此堵塞離子交換器需要基于過量堿和熱條件的清洗過程，這會(huì)降低樹脂的壽命，并且降低再生過程的效率(例如通過使用85℃熱堿，在pH=13-14再循環(huán)大約1小時(shí))。然而，本發(fā)明組合物的使用提供了溫和的清洗過程，這可以保證有效去除會(huì)阻礙這類離子交換器有效再生過程的污物。本發(fā)明的另一特別適合的實(shí)施方案是，清洗用于蛋白質(zhì)分離中進(jìn)行凝膠過濾或親和層析時(shí)使用的柱子。這樣的柱子常含有相當(dāng)昂貴的分離和/或?qū)游霾牧?樹脂，如果用于規(guī)模按比例增加的過程就需要有效的清洗。通常使用苛刻的條件以去除沉積在該材料中的粘稠的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)和糖類的聯(lián)合產(chǎn)物，而且這些苛刻的條件常常降低材料的使用壽命。本發(fā)明組合物的使用還提供了溫和的清洗過程，這保證了柱材料的有效清洗和壽命的延長(zhǎng)。用于清洗含凝膠過濾和親和層析材料的柱的優(yōu)選清洗過程可包括包含有500-3000HUT/L清洗液的酶劑量的清洗液再循環(huán)，優(yōu)選的500-1500HUT/L清洗液，更優(yōu)選地750-1250HUT/L清洗液，例如1000HUT/L清洗液，pH值2-7之間，優(yōu)選3-6，例如4-5，而且溫度應(yīng)當(dāng)保持在10-65℃，優(yōu)選地30-50℃，例如40℃。清洗或洗滌時(shí)間在優(yōu)選實(shí)施方案中根據(jù)方法的類型保持在2分鐘至20小時(shí)之間。關(guān)于家用設(shè)備的清洗，在特殊實(shí)施方案中可在自動(dòng)洗碗機(jī)中實(shí)施該方法。當(dāng)使用用于清洗或洗滌衣物的組合物時(shí)，可以優(yōu)選在工業(yè)規(guī)?；蚣矣靡?guī)模洗滌機(jī)中實(shí)施該方法。優(yōu)選的衣物為纖維素織物和/或非結(jié)構(gòu)化(non-structured)服裝，例如絲綢、乙酸酯、羊毛、苧麻或人造絲服裝。特別是羊毛和絲綢的清洗根據(jù)本發(fā)明很有用，因?yàn)樗嵝缘那逑礂l件不僅軟化衣物，還有抗微生物的作用(即殺死或抑制微生物細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在pH2-7之間，優(yōu)選3-6，例如4-5，實(shí)施用于清洗或洗滌堅(jiān)硬表面或衣物的方法，而且溫度應(yīng)當(dāng)保持在10-65℃之間，優(yōu)選地30-50℃，例如40℃。清洗或洗滌時(shí)間在優(yōu)選實(shí)施方案中根據(jù)方法的類型保持在2分鐘至20小時(shí)之間。例如，工業(yè)膜的清洗可規(guī)定浸在組合物的(循環(huán))溶液中過夜(長(zhǎng)達(dá)20小時(shí))，然而工業(yè)化洗碟應(yīng)當(dāng)在2-10分鐘之內(nèi)完成。材料和方法蛋白酶HUT活性的測(cè)定根據(jù)NovoNordiskA/S，丹麥發(fā)表的AF92/2方法測(cè)定HUT活性。1HUT為在40℃和pH4.7下30分鐘時(shí)間從消化的變性血紅蛋白形成一定量水解物的酶量，所述水解物的量相當(dāng)于275納米處溶于0.006N鹽酸中1.10微克/ml酪氨酸溶液的吸光度為0.0084。在給定條件下用0.5M乙酸鹽緩沖液中的酶消化變性的血紅蛋白底物。用三氯乙酸沉淀未消化的血紅蛋白，在275nm測(cè)定上清液中水解物的吸光度。蛋白酶蛋白水解的HUP活性1血紅蛋白蛋白酶單位(hpu)定義為如下所述在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘釋放1毫摩爾伯氨基(通過與絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)比較來測(cè)定)所需的酶量如Britton和Robison，化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Chem.Soc.)，1931年，1451頁所述，用廣域緩沖液制備2％(w/v)血紅蛋白溶液(牛，Sigma提供)，pH調(diào)為5.5。2ml底物溶液在25℃水浴中預(yù)孵育10分鐘。加入相當(dāng)于約0.2-0.3hpu/ml廣域緩沖液(pH5.5)的含bg/ml酶制品的1ml酶液。25℃孵育30分鐘后，加入淬滅劑(5ml溶液，含17.9g三氯乙酸、29.9g乙酸鈉和19.8g乙酸，去離子水加到500ml)終止反應(yīng)。除了在酶溶液之前加入淬滅劑以外，用與受試溶液相同的方式制備空白對(duì)照。反應(yīng)混合物在水浴中保持20分鐘，之后用Whatman42濾紙的濾器將其過濾。通過伯氨基與鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化來測(cè)定伯氨基含量，方法如下7.62克四硼酸二鈉十水合物和2.0克十二烷基硫酸鈉溶解到150ml水中。然后將溶于4ml甲醇中的160毫克OPA與400mlβ-巰基乙醇一起加入，之后用水將溶液加到200ml。將3mlOPA試劑加到400ml如上得到的過濾物中，混合。大約5分鐘后測(cè)定340nm處的光密度(OD)。用100ml廣域緩沖液(pH5.5)中含10毫克絲氨酸的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行OPA實(shí)驗(yàn)。緩沖液?jiǎn)为?dú)用作空白。通過下列公式從OD測(cè)定值計(jì)算蛋白酶活性hpu/ml酶溶液(ODt-ODb)×CSER×Q(ODSER-ODB)×MWSER×ti]]>hpu/克酶制=hpu/mlb其中ODt、ODb、ODSER和ODB分別是受試溶液、空白、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)和緩沖液的光密度，CSER是標(biāo)準(zhǔn)液中絲氨酸的濃度(毫克/ml)(在該情況下0.1毫克/ml)，MWSER是絲氨酸的分子量(105.09)。Q是酶溶液的稀釋因子(在該情況下是8)，ti是以分鐘為單位的孵育時(shí)間(在該情況下是30分鐘)。評(píng)估自動(dòng)洗碗機(jī)(ADW)中組合物的方法不銹鋼盤子和瓷碟在污染之前預(yù)先在75℃高堿性pH進(jìn)行洗滌。用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序測(cè)試蛋白酶的效率，其中按如下方法將不銹鋼盤子弄臟在BraunUK20廚房混合器中將15只雞蛋(卵清+卵黃)和255ml全奶在最低速混合2分鐘。之后混合液通過0.5mm孔徑的篩網(wǎng)。將5只不銹鋼盤子浸沒在雞蛋/奶混合物中并將其置于干燥架子上。室溫過夜晾干后，盤子在通風(fēng)恒溫烘箱中于120℃烘烤1小時(shí)。為了測(cè)試淀粉酶，用凝膠化淀粉溶液的2％懸浮液將5只瓷盤弄臟，室溫過夜晾干。對(duì)于自動(dòng)洗碗機(jī)程序，使用6人的770型CylindaExcellenceKompakt機(jī)器。該機(jī)器有安裝了結(jié)合來自進(jìn)水口的水中鈣離子的離子交換器。在4號(hào)程序時(shí)溫度設(shè)定在55℃。該程序執(zhí)行如下a)主洗滌以7分鐘將清洗液從25℃加熱到55℃開始，洗滌10分鐘結(jié)束。b)引入冷漂洗水。漂洗需要5分鐘，漂洗過程中的溫度根據(jù)裝載情況從35到45℃變化。c)用引入的冷水進(jìn)行第二次漂洗。在第二次漂洗過程中用8分鐘將水從20℃加熱到55℃，然后泵出。d)在55℃烘干約5分鐘。在洗滌之前和之后，對(duì)于蛋白膜或用碘(KI/I2)染色的淀粉膜直接測(cè)定光反射值。用標(biāo)準(zhǔn)液制備染色液，制備方法如下稱20.0克Merck目錄號(hào)5043的碘化鉀(KI)和1.27克Merck目錄號(hào)4763的碘(I2)于2升的燒杯里，用離子交換水加到1.0升。溶液在室溫?cái)嚢璐蠹s10分鐘。將盤子緩緩地推過碘液，然后置于晾干架上。使用MinoltaChroma計(jì)量?jī)x(CR-300型)進(jìn)行測(cè)定。使用每只盤子的6個(gè)單獨(dú)值計(jì)算平均R值。用公式RPF(％)[或RSF(％)]=[R洗滌后-R洗滌前]/[R清洗盤子-R洗滌前]*100％計(jì)算去除的薄膜百分比的計(jì)算值一蛋白質(zhì)為RPF％，淀粉為RSF％。下述實(shí)施例所屬的每張表中顯示了用于一個(gè)機(jī)器的洗滌劑組合物以及得到的清洗結(jié)果。通過加入2-7ml4NHCl改變pH。評(píng)估洗衣組合物的方法用2.0千克壓艙衣物和人為弄臟的織物在商品化的歐洲洗衣機(jī)(AEG型_KO-LAVAMATJUBILEUM40)進(jìn)行洗滌洗性能測(cè)試。將10片(5×5厘米)被奶、血和炭黑(EMPA116)弄臟的商品化的“標(biāo)準(zhǔn)”樣本(標(biāo)準(zhǔn)棉織物)以及10片用菠菜葉抽提物浸透并且隨后在70℃熱處理30分鐘的樣本，固定在壓艙布料上。根據(jù)賣主的說明，使用所謂的“Klarvask”程序在40℃進(jìn)行無預(yù)洗洗滌過程，最后在1400轉(zhuǎn)/分離心。洗滌過程中，取一份洗滌液的樣品，用Acilit_pH0-6型pH試紙測(cè)定pH值。洗滌過程之后用400轉(zhuǎn)/分的中等離心漂洗2次。整個(gè)過程中共使用50升水。通過使用配備了CLX75W氙氣燈和纖維光學(xué)的J&MTidasMMS/16光度計(jì)在460nm處測(cè)定從樣本釋放的反射光的密度％R(％釋放)，完成已洗滌的受試樣本的評(píng)估。每個(gè)樣本在有3或4個(gè)樣本的架子的頂部進(jìn)行測(cè)定(為了減少可能穿透紡織品結(jié)構(gòu)而不被吸收或反射的光的量)。數(shù)值ΔRENz=R洗滌的-R無酶洗滌的，反映了酶對(duì)每種類型的樣本所做的貢獻(xiàn)。結(jié)果表示為平均值和置信區(qū)間，例如[％R洗滌的-W；％R洗滌的+W]，此處W為95％信度。使用的化學(xué)品/酶a)得自FlukaChemika號(hào)72560的NTA(次氮基三乙酸)。b)得自BASF-德國的TriIon_A(NTA-Na3)-次氮基三乙酸三鈉鹽。c)得自BASF-德國的TriIon_M(MGDA-Na3)-甲基甘氨酸二乙酸三鈉鹽。d)得自HenkelKGaA-德國的Dehyphon_LS54(非離子型脂肪醇乙氧基化物)。e)得自BASF-德國的Lutensol_AO3(非離子型脂肪醇乙氧基化物)。f)得自BASF-德國的Lutensol_AO7(非離子型脂肪醇乙氧基化物)。g)得自BASF-德國的Sokalan_HP25(改性多聚羧酸酯(鹽))；用作抗再沉淀劑。h)如WO95/02044中所述得到的蛋白酶Ⅰ(1.05kHUT/克)。i)如WO95/02044中所述得到的蛋白酶Ⅱ(5.22kHUT/克)。j)得自NovoNordiskA/S，丹麥的Flavourzyme_(65.2kHUT/克)。k)得自NovoNordiskA/S，丹麥的Fungamyl_。實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例中證明了ADW中蛋白酶樣品的作用。數(shù)據(jù)列于表1.表1表1顯示，盡管給予的蛋白酶Ⅰ的劑量HUT-活性顯著低于Flavourzyme和蛋白酶Ⅱ，蛋白酶Ⅰ給出了最高的清洗值(RPF％)。實(shí)施例2本實(shí)施例中證明了不同pH值對(duì)ADW中的蛋白酶Ⅰ的性能的影響。通過給予不同劑量的4NHCl來改變pH值，數(shù)據(jù)列于表2。表2表2顯示，在pH4和pH4.5時(shí)，蛋白酶Ⅰ給出了幾乎相同的清洗值(RPF％)。沒有酶時(shí)，即使更酸的條件(pH3.2)也不能將盤子清洗到任何可見的程度。實(shí)施例3本實(shí)施例中，測(cè)試了在洗滌劑中額外加入Fungamyl的作用并使用涂布了淀粉的瓷盤。數(shù)據(jù)列于表3。表3表3顯示了在有或無淀粉酶存在時(shí)，蛋白酶Ⅰ去除蛋白質(zhì)的清洗作用。當(dāng)不包括蛋白酶Ⅰ時(shí)，淀粉酶顯示了很小的作用。實(shí)施例4本實(shí)施例中，測(cè)試了在有或無蛋白時(shí)，含有酸性對(duì)抑胃酶肽不敏感的蛋白酶之洗滌液的水解作用。還測(cè)試了使用自來水(輕微硬度的)和離子交換水的作用。數(shù)據(jù)列于表4。冷凍干燥的血紅蛋白(NovoNordisk-丹麥)溶于自來水(18°dH(德國等級(jí)水硬度))，或者在軟化水中配成20克/升溶液。將下列成分懸浮/溶解于1000ml軟化水中，配制成1000ml洗滌液a)12克NTAb)20克Lutensol_A07c)62克Na2SO4采用磁力攪拌，將Erlenmeyer燒瓶中的5克洗滌液加到100ml血紅蛋白溶液中。用NaOH將pH調(diào)到4.5。燒瓶置于40℃恒溫水浴。加入1000μl蛋白酶Ⅰ，在t=1分鐘和t=30分鐘時(shí)間點(diǎn)取樣品，用滲透壓力計(jì)上測(cè)定滲透壓(mOSM/kg水)，類型從高級(jí)儀器(AdvancedInstruments)上寬度范圍滲透壓3W2。測(cè)定結(jié)果表示為兩次測(cè)定值之差，以ΔmOSM/kg水表示。為了測(cè)試?yán)缏亚宓囊种谱饔?，在加入酶之前，?ml溫和攪勻的卵清加到反應(yīng)混合物中。表4表4顯示，無論使用自來水還是離子交換水，蛋白酶Ⅰ有效地水解血紅蛋白。還清楚顯示了，卵清不能使蛋白酶Ⅰ有任何程度的失活。實(shí)際上，因?yàn)楫?dāng)有卵清存在時(shí)，有更高的ΔmOSM/kg水值，所以蛋白酶Ⅰ也可以水解這種蛋白質(zhì)。5ml卵清加入后有大約0.6克的蛋白質(zhì)被進(jìn)一步水解。實(shí)施例5本實(shí)施例中，使用自來水(輕微硬度的)和離子交換水，采用實(shí)施例4中的方法測(cè)試含不同的酸性的對(duì)抑胃酶肽不敏感的蛋白酶之洗滌液的水解作用。數(shù)據(jù)列于表5。表5<tablesid="table5"num="005"><table>洗滌劑試驗(yàn)5.1試驗(yàn)5.2試驗(yàn)5.3試驗(yàn)5.4NTA-Na3(Trilon_A)0.04克0.04克0.04克0.04克NTA(Fluka)0.02克0.02克0.02克0.02克Lutensol_AO30.03克0.03克0.03克0.03克Lutensol_AO70.07克0.07克0.07克0.07克Sokalan_HP250.07克0.07克0.07克0.07克水離子交換的4.77克4.77克4.77克4.77克底物1)血紅蛋白2.0克2.0克2.0克2.0克底物-水來自自來水0095.0克95.0克底物-水離子交換的95.0克95.0克00pH4.54.54.54.5蛋白酶活性劑量及酶類型3.0kHUT來自蛋白酶Ⅰ65.2kHUT來自Flavourzyme_3.0kHUT來自蛋白酶Ⅰ65.2kHUT來自Flavoruzyme_mOSM/kg水在t=1分鐘在t=30分鐘5680405658746079ΔmOSM/kg水24161619</table></tables>表5顯示，即使蛋白酶Ⅰ的HUT活性劑量顯著低于采用Flavourzyme時(shí)，蛋白酶Ⅰ在離子交換水中導(dǎo)致水解作用更高。在硬度稍大的自來水中，即使HUT活性劑量顯著低于Flavourzyme，水解作用還是相當(dāng)?shù)摹?shí)施例6本實(shí)施例中，測(cè)試了在合適的微酸性洗衣洗滌劑組合物中蛋白酶Ⅰ的洗衣性能。表6<tablesid="table6"num="006"><table>洗滌劑試驗(yàn)6.1試驗(yàn)6.2MGDA-Na3(Trilon_M)13.8克13.8克Lutensol_AO33.3克3.3克Lutensol_AO76.4克6.4克Sokalan_HP256.3克6.3克檸檬酸11.6克11.6克Na2SO428.6克28.6克具有測(cè)試布片的衣服2kg2kg每次洗滌所用水量15升15升洗滌用水的pH約43.5-4蛋白酶活性劑量及酶類型無300kHUT來自蛋白酶Ⅰ菠菜測(cè)定數(shù)平均值％R(i)W(95％)[％R(i)-W；％R(i)+W]ΔRENZ1218.70.5[18.2；19.2]1820.80.6[20.2；21.4]2.1EMPA116測(cè)定數(shù)平均值％R(i)W(95％)[％R(i)-W；％R(i)+W]ΔRENZ1216.10.9[15.2；17.0]2420.20.7[19.6；20.9]4.1</table></tables>表6顯示，在這些溫和條件下蛋白酶Ⅰ明顯有利于兩種不同樣本的清洗?？梢姷玫降摩enz值。實(shí)施例7本實(shí)施例中，測(cè)定了蛋白酶Ⅰ和蛋白酶Ⅱ?qū)?種不同的可能抑制劑的敏感性，所有的抑制劑除PEFABLOC得自Pentapharm,Basel，瑞士以外，均得自Sigma。EDTA是金屬酶抑制劑，而PEFABLOC和PMSF是絲氨酸蛋白酶抑制劑。在用抑制劑處理之前和之后，在pH5.5時(shí)以HPU/I測(cè)定蛋白酶溶液的蛋白水解活性。抑制實(shí)驗(yàn)得出下列結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明，蛋白酶Ⅰ在任何一種抑制劑存在下仍保持活性，而蛋白酶Ⅱ在EDTA、PEFABLOC和PMSF存在下可保持活性，但抑胃酶肽可抑制其活性。參考文獻(xiàn)MuroaS.和OdaK.抑胃酶肽不敏感的酸性蛋白酶天冬氨酸蛋白酶及其抑制劑，KostkaV.(編輯)379-399頁，(1985年)WalterdeGruyter，柏林KockH.,BeckR.,R_perH.,用于洗滌劑的淀粉衍生的產(chǎn)物，Starch/St_rke，45卷，2-7頁，1993年。StacheH.,KosswigK.,(編輯)Tensid-Taschenbuch，第3版，CarlHanserVerlag,München，1990年。OdaK.,MuraoS.；抑胃酶肽不敏感的羧基蛋白酶；天冬氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能；DunnB.M.(編輯)，Plenum出版社，紐約，1991年。權(quán)利要求1．一種包含酸性蛋白酶和至少一種非離子表面活性劑的酸性洗滌劑組合物，該蛋白酶在有選自抑胃酶肽、Pefabloc、PMSF或EDTA的抑制劑存在下保持蛋白水解活性。2．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述蛋白酶可從細(xì)菌或包括酵母的真菌中獲得。3．根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述細(xì)菌為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、或黃單胞菌屬。4．根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述的真菌為曲霉屬或Scytalidium。5．根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述真菌為棘孢曲霉。6．根據(jù)權(quán)利要求2-5的組合物，其中所述細(xì)菌或真菌是用包含編碼所述蛋白酶的DNA之DNA載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌或真菌而進(jìn)行遺傳修飾的。7．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中蛋白酶包含作為活性中心中功能性基團(tuán)的天冬氨酸殘基。8．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中蛋白酶包含作為活性中心中功能性基團(tuán)的羧基殘基。9．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中蛋白酶在有卵巨球蛋白抑制劑存在下還保持蛋白水解活性。10．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中蛋白酶在有卵類粘蛋白抑制劑存在下還保持蛋白水解活性。11．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中蛋白酶在有卵糖蛋白抑制劑存在下還保持蛋白水解活性。12．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述蛋白酶在選自肉、卵清、全血、血漿、奶、啤酒、馬鈴薯或豆類的產(chǎn)品之中存在的抑制劑存在時(shí)還保持蛋白水解活性。13．根據(jù)任一前述權(quán)利要求的組合物，其中所述蛋白酶為蛋白酶Ⅰ或蛋白酶Ⅱ。14．根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述蛋白酶為蛋白酶Ⅰ。15．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物還包含螯合劑。16．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述非離子表面活性劑為糖脂、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚-乙氧基化物、葡糖胺或烷基多聚葡糖苷。17．根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中所述螯合劑在酸性pH時(shí)能結(jié)合鈣離子。18．根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其中所述螯合劑為甲基甘氨酸二乙酸、硝基乙酸、檸檬酸、源自多聚糖的寡聚和多聚(多)羧酸、糊精或蛋白質(zhì)水解物。19．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其還包含軟化劑、淀粉酶、脂酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、過氧化物酶、漆酶、過氧化物酶/漆酶的增強(qiáng)劑和/或緩沖劑。20．一種用于清洗或洗滌堅(jiān)硬表面或衣物的方法，包括將根據(jù)任一前述權(quán)利要求的組合物與所述堅(jiān)硬表面或衣物接觸，該組合物以足以提供清洗作用的量溶于水性溶液。21．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中蛋白酶以選自500-3000HUT/升清洗液、500-1500HUT/升清洗液，優(yōu)選750-1250HUT/升清洗液和1000HUT/升清洗液的范圍存在于水性溶液中。22．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中堅(jiān)硬表面包含在工業(yè)工藝設(shè)備或家用設(shè)備中。23．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述工業(yè)工藝設(shè)備為熱交換器、罐、管道、離心機(jī)、蒸發(fā)機(jī)、過濾器、擠壓機(jī)、絞肉機(jī)、蒸煮罐、啤酒和葡萄酒發(fā)酵罐、啤酒和葡萄酒過濾器、廢過濾器輔助器、冷卻器、儲(chǔ)存罐、篩網(wǎng)、水力旋流器、超濾裝置、納米過濾裝置、超過濾裝置、微孔過濾裝置、離子交換柱、凝膠過濾柱或擠奶器。24．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述家用工藝設(shè)備為食具、盤子、杯子、燒杯、玻璃、罐、盆、電器、抽水馬桶、盥洗間或瓷磚。25．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述方法為原位清洗(CIP)法。26．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在自動(dòng)洗碗機(jī)中清洗所述家用加工設(shè)備。27．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述堅(jiān)硬表面包含在保健或動(dòng)物照料設(shè)備之中。28．根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述保健或動(dòng)物照料設(shè)備選自診斷、分析、處理和手術(shù)設(shè)備。29．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中在工業(yè)規(guī)?；蚣矣靡?guī)模的洗滌機(jī)中清洗所述衣物。30．根據(jù)權(quán)利要求20-29的方法，其中清洗溶液的pH在2-7之間，優(yōu)選3-6，例如4-5。31．根據(jù)權(quán)利要求20-29的方法，其中清洗溶液的溫度在10-65℃之間，優(yōu)選30-50℃，例如40℃。32．根據(jù)權(quán)利要求20-29的方法，其中清洗時(shí)間在2分鐘至20小時(shí)之間。33．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中衣物包含毛或絲綢。全文摘要本發(fā)明涉及含有酸性蛋白酶和至少一種非離子表面活性劑的酸性洗滌劑組合物,該蛋白酶在有選自抑胃酶肽、Pefabloc、PMSF或EDTA的抑制劑存在下仍保持蛋白水解活性。組合物還提供了清洗或洗滌堅(jiān)硬表面或衣物的方法,該方法包含將所述堅(jiān)硬表面或衣物與根據(jù)本發(fā)明的以足以提供清洗作用的量溶于水溶液的組合物接觸。文檔編號(hào)C11D3/34GK1295610SQ9980454公開日2001年5月16日申請(qǐng)日期1999年3月25日優(yōu)先權(quán)日1998年3月27日發(fā)明者H·S·奧爾森申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司