專利名稱：鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定化變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑(SSI)的變體以及與SSI具同源性的抑制劑(類SSI抑制劑)。這些變體在同酶尤其是同蛋白酶組合后，對于清潔組合物和個人衛(wèi)生組合物是有用的。本發(fā)明還涉及到包括本變體的清潔組合物和個人衛(wèi)生組合物以及編碼這些變體的基因。
背景技術(shù)：
酶組成了最大的一類天然存在的蛋白。酶中的一類包括催化其它蛋白水解的蛋白酶。這一水解蛋白的能力用于將天然存在的和工程產(chǎn)生的蛋白引入清潔組合物，尤其是相關(guān)于衣物洗滌應(yīng)用的清潔組合物。此外，盡管嘗試的不多，其他人還將這些蛋白酶引入個人衛(wèi)生組合物。然而，在這些組合物的貯藏甚至蛋白酶的表達期間，這些蛋白酶經(jīng)常被自身降解或可能降解組合物中存在的其它酶。作為降解的后果，這些清潔和個人衛(wèi)生組合物在達到預(yù)期的增強效果上能力有限。
因此，向該組合物加入蛋白酶活性的抑制劑以限制蛋白酶的自身水解和對其它酶的降解將是有益的。提供可逆的蛋白酶抑制劑，以便于在組合物用于清潔或在清潔環(huán)境中而被稀釋時，蛋白酶不再被抑制而可以水解蛋白污漬，這是十分有價值的。此外，這些抑制劑必須足夠穩(wěn)定以充分發(fā)揮其抑制功能。
用于該用途尤其是洗衣環(huán)境的合成蛋白酶抑制劑或穩(wěn)定劑已經(jīng)被公布。例如，Panandiker等人在轉(zhuǎn)讓給The Procter & Gamble Co.的1995年6月6日授權(quán)的美國專利No.5,422,030中公布了用于穩(wěn)定衣物清潔組合物的芳香族硼酸酯。此外，Bruno等人在轉(zhuǎn)讓給AppliedBiochemists,Inc.的1986年1月28日授權(quán)的美國專利No.4,566,985中提出了鹽酸苯甲脒作為酶抑制劑的使用。這些合成的抑制途徑可能延長貯藏時間，但可能會較昂貴，并且由于發(fā)酵罐中的蛋白水解，它可能不會提高分離產(chǎn)量。
認識到這些缺陷，本領(lǐng)域中的人們已經(jīng)對使清潔組合物中的酶穩(wěn)定的蛋白質(zhì)性(proteinaceous)蛋白酶抑制劑進行實驗。自然界提供了蛋白質(zhì)性蛋白酶抑制劑以在體內(nèi)調(diào)控蛋白酶。但是，由于這些天然存在的蛋白質(zhì)性蛋白酶抑制劑傾向于不穩(wěn)定，它們在含蛋白酶的清潔和個人衛(wèi)生載體中的商業(yè)用途可能有一定的限制。
蛋白質(zhì)性蛋白酶抑制劑典型地為長肽鏈，它可以同蛋白酶的活性位點結(jié)合并抑制其活性。根據(jù)一級氨基酸序列的同源性，這些抑制劑通常歸類于幾個家族(家族Ⅰ到家族Ⅸ)(見Laskowski等.，"ProteinInhibitors of Proteinases",Annual Review of Biochemistry,Vol.49,pp.593-626(1980))。這些抑制劑包括通常稱為家族Ⅵ的抑制劑和家族Ⅲ的抑制劑，家族Ⅵ抑制劑包括eglin和大麥糜蛋白酶抑制劑，家族Ⅲ抑制劑包括鏈霉菌枯草桿菌抑制劑(SSI)和plasminostretin。
這些抑制劑傾向于結(jié)合特定的蛋白酶，而對其它蛋白酶結(jié)合較弱。這樣就很方便針對一特定蛋白酶考慮抑制劑。出于此原因，本領(lǐng)通常討論“蛋白酶/多肽抑制劑對”。一個已知的蛋白酶/多肽抑制劑對的例子是枯草桿菌蛋白酶BPN’/SSI。例見Mitsui等.,"CrystalStructure of a Bacterial Protein Proteinase Inhibitor(Streptomyces Subtilisin Inhibitor)at 2.6_ Resolution",Journal of Molecular Biology,Vol.131,pp.697-724(1979)和Hirono等.,"Crystal Structure at 1.6_ Resolution of theComplex of Subtilisin BPN’with Streptomyces SubtilisinInhibitor",Journal of Molecular Biology,Vol.178,pp.389-413(1984)。
SSI在Subtilisin BPN’存在的情況下是穩(wěn)定的，只要該抑制劑的量足以抑制所有的蛋白酶活性。但是，據(jù)認為具高蛋白酶親和性的抑制劑在洗滌環(huán)境中被稀釋時不會同其解離。見WO 92/03529,Mikkelson等.，指定為Novo Nordisk A/S,1992年3月5日出版。
但是，如果一抑制劑的結(jié)合常數(shù)(Ki)允許在含酶/抑制劑對的清潔組合物中的某些酶具活性，抑制劑同組合物中的酶可能會被水解。因此，找到在蛋白酶以及清潔和個人衛(wèi)生組合物存在的情況下可保持適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定的SSI變體或其他抑制劑是十分有價值的。此外，這些抑制劑優(yōu)選地對于需抑制的特定蛋白酶具有優(yōu)選的Ki。這一Ki必須允許在最后組合物貯存期間對其中的蛋白酶產(chǎn)生抑制。但是，這些清潔和個人衛(wèi)生組合物在洗滌環(huán)境中被稀釋時，該蛋白酶和抑制劑必須解離以產(chǎn)生未受抑制蛋白酶的活性。
Kojima等.,"Inhibition of Subtilisin BPN’by ReactionSite P1 Mutants of Streptomyces Subtilisin Inhibitor",Journal of Molecular Biology,Vol.109,pp.377-382(1991)利用Subtilisin BPN’制造了幾個SSI的P1位(73位)變體并測量了它們的Ki。作為另一個例子，Mikklsen等人披露了Ⅵ家族抑制劑的突變，這些突變據(jù)說具較低的結(jié)合活性。WO 93/17086,Nielsen等.，指定為Novo Nordisk A/S,1993年9月2日出版，披露了plasminostreptin的突變，這些突變據(jù)說具較低的結(jié)合活性。
但是，這些蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性存在問題。WO 98/13387,Correa等．，指定為The Procter & Gamble Co.,1992年4月2日出版(對應(yīng)于美國專利申請序列號No.60/026,944)，披露了可提供增強的穩(wěn)定性的變體。
盡管本領(lǐng)域中所描述的方法多種多樣，對于用于清潔和個人衛(wèi)生組合物中的更穩(wěn)定和更有效蛋白酶抑制劑的需求依然不斷。本發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)在表達和/或在清潔和個人衛(wèi)生組合物中，SSI抑制劑、SSI樣抑制劑及它們的變體很容易在對應(yīng)于SSI的63位和64位之間被水解。因此，本發(fā)明這在此提供了修飾過的SSI抑制劑變體和SSI樣抑制劑變體，它們尤其在63位通過一替代氨基酸殘基進行修飾。這些替代使蛋白酶抑制劑具更高的穩(wěn)定性。這些抑制劑的好處還在于它們在如本文所定義的優(yōu)選的水平上與蛋白酶結(jié)合。因此，本發(fā)明提供了蛋白成分的蛋白酶抑制劑變體，它們具較高的蛋白水解穩(wěn)定性，特別是在清潔和個人衛(wèi)生組合物中，它們與相關(guān)的親本抑制劑相比還對蛋白酶具較低的親和性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有經(jīng)修飾過的氨基酸序列的親本氨基酸序列變體，其經(jīng)修飾過的氨基酸序列包括在對應(yīng)于SSI的63位上的一個氨基酸替換，其親本氨基酸序列選自由SSI、SSI樣抑制劑、SSI變體和SSI樣抑制劑變體組成的群體。這些變體可用于諸如抑制蛋白酶這樣的用途，尤其是在其貯藏和表達期間。本發(fā)明還涉及到編碼這些變體的基因和含這些變體的清潔和個人衛(wèi)生組合物。
發(fā)明詳述在此對本發(fā)明的基本組分進行描述。這里還包括對多種可選擇的和優(yōu)選的組分的非限制性描述，它們有用于本發(fā)明的實施方案。
本發(fā)明可以包括任何如本文所描述的必需的或可選擇的組分、配料和/或限制，或由它們組成或基本由它們組成。
除非特別標(biāo)明，所有的百分比和比率均以重量計算。除非特別標(biāo)明，所有的百分比均在全體組合物的基礎(chǔ)上計算。
在此提到的為材料的商品名，材料包括蛋白酶和可選擇的組分，但不限于此。在此本發(fā)明者不希望將材料限制于冠以特定的商品的材料。與所引用商品名的材料相當(dāng)?shù)牟牧?例如，)可以替代利用于本文的組合物。
所有的組分、配料或組合物的水平均指這些組分、配料或組合物的活性水平，不包括雜質(zhì)，如殘余溶劑或副產(chǎn)品，它們均可能在商品來源存在。
在此引用的所有文獻，包括全部專利、專利申請和印刷出版物，均全文引入作為參考。
本文使用的縮寫將被用作描述氨基酸。表1提供了本文使用的縮寫的列表。
表1
定義本文使用的術(shù)語“突變”指的是基因序列和這些基因序列所產(chǎn)生的氨基酸序列上的變化。突變可以是野生型或親本序列上氨基酸殘基的刪除、替換或添加。
本文使用的術(shù)語“親本”指的是在對應(yīng)于SSI的63位上無氨基酸替換的野生型或變體蛋白酶、蛋白酶抑制劑、蛋白或多肽(即，63位上的氨基酸替換是自然發(fā)生的)。這些親本之一的例子是已知的鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑(SSI)(SEQ ID NO:1)。SSI在Ikenaka等.,"Amino Acid Sequence of an alkaline ProteinaseInhibitor(Streptomyces Subtilisin Inhibitor) fromStreptomyces albogriseoulus S-3253",Journal of Biochemistry,Vol.76,pp.1191-1209(1974)中有進一步的描述。本文使用的氨基酸編號來自Ikenaka等.。本發(fā)明者還使用了一被設(shè)計富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的合成SSI基因，正如B.subtilis的DNA。通過表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，這一合成基因在多肽的氨基末端額外編碼四個氨基酸殘基。包括這四個額外的氨基酸在內(nèi)的這一經(jīng)修飾的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。
本文使用的術(shù)語“野生型”指的是由未突變的有機體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽，在此特指蛋白酶或蛋白酶抑制劑。
本文使用的術(shù)語“變體”指的是蛋白或多肽，在此特指蛋白酶抑制劑或蛋白酶，它們具有分別不同于親本蛋白酶抑制劑或親本蛋白酶的氨基酸序列。
本發(fā)明的變體本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了在諸如體外和在清潔和個人衛(wèi)生組合物材料存在的情況下更加穩(wěn)定的蛋白酶抑制劑變體。此外，這些變體同樣在體內(nèi)也更穩(wěn)定，這便提高了來自有機體的蛋白酶的產(chǎn)量。
本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)出優(yōu)選的結(jié)合常數(shù)(Ki)的變體，這可在生長、收集、純化、貯藏和洗滌期間對蛋白酶進行適當(dāng)?shù)囊种啤＿@一優(yōu)選的結(jié)合提供了更好的穩(wěn)定性和更長的貯藏時間。
本發(fā)明的變體對蛋白酶具有提高的穩(wěn)定性，它在清潔和個人衛(wèi)生組合物中抑制蛋白酶，但在洗滌環(huán)境中被稀釋后與之解離。
本發(fā)明的變體具有親本氨基酸序列的修飾氨基酸序列，此處的修飾氨基酸序列包括對應(yīng)于鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶(即本文SSI所指)的63位上的一個氨基酸替換，此處的親本氨基酸序列選自SSI、SSI樣抑制劑、SSI變體和SSI樣抑制劑變體。對應(yīng)于SSI的63位上的氨基酸替換可以是任何相比于親本氨基酸序列可產(chǎn)生更高穩(wěn)定性的氨基酸殘基。對應(yīng)于SSI的63位上的氨基酸替換在最優(yōu)選的情況下是被異亮氨酸替換。這樣的一個變體被表示為“L63I”。在表示這一變體時先給出了出現(xiàn)在親本氨基酸序列中的原始氨基酸，其后是位置號碼，第三個給出的是替換后的氨基酸。這樣，L63I指的是出現(xiàn)在天然抑制劑SSI第63氨基酸位置(63位)的亮氨酸(L)被異亮氨酸(I)替代。位置編號與上文的Ikenaka等．(SEQ ID NO:1)相對應(yīng)，并且忽略了存在于合成的SSI(SEQ ID NO:1)氨基末端的4個額外的氨基酸殘基。本文所列的其他替換均以此種方式表示。
本文的變體不限于63位被替換的SSI。63位的替換也可以在親本氨基酸序列(當(dāng)然包括編碼該氨基酸序列的核苷序列)上進行，而該親本本身為SSI變體、SSI樣抑制劑或SSI樣抑制劑的變體。更優(yōu)選的親本氨基酸序列包括SSI和SSI變體。最優(yōu)選的親本氨基酸序列為SSI變體。SSI變體的披露的例子有Kojima等.，"Inhibition ofSubtilisin BPN’by Reaction Site P1 Mutants of StreptomycesSubtilisin Inhibitor",Journal of Molecular Biology,Vol.109,pp.377-382(1991)；Tamura等.，"Mechanisms of TemporaryInhibition in Streptomyces Subtilisin Inhibitor Induced by anAmino Acid Substitution,Typtophan 86 Replaced by Histidine",Biochemistry,Vol.30,pp.5275-5286(1991)；JO 3099-099-A，轉(zhuǎn)讓給Tsumura & Co.，授權(quán)于1989年9月12日；Mikkelson等.，美國專利號5,674,833，轉(zhuǎn)讓給Novo Nordisk A/S,1997年10月7日授權(quán)；WO 93/17086,Nielsen等.，轉(zhuǎn)讓給Novo Nordisk A/S,1993年9月2日出版。其它SSI的變體披露于美國專利申請序列號No.60/026,944的WO 98/13387,Correa等.，轉(zhuǎn)讓給The Procter& Gamble Co.,1992年4月2日出版，這些變體本文統(tǒng)稱為“抑制劑類群A”。優(yōu)選的變體SSI(在此用作親本氨基酸序列)為抑制劑類群A中的變體。用作親本氨基酸序列的更優(yōu)選的SSI變體在此列為以下表格2-6。同樣，所有的位置編號對應(yīng)于如Ikenaka等．所描述的SSI。
表2具單位點替換的親本氨基酸序列的非限制性示例
表3具雙位點替換的親本氨基酸序列的非限制性示例
表4具三位點替換的親本氨基酸序列的非限制性示例
表5具四位點替換的親本氨基酸序列的非限制性示例
表6具五位點替換的親本氨基酸序列的非限制性示例
這樣，本發(fā)明變體的非限制性示例可以被描述為變體1、變體2等等，例如，其中變體1可表示為L63*+D83C，其“*”代表任何非SSI的63位的原始氨基酸的氨基酸，變體1-I可表示為L63I+D83C。它們之中的更加優(yōu)選的變體列于表7，這些變體的63位均被異亮氨酸替換。
表7本發(fā)明的優(yōu)選變體的非限制性示例
(表續(xù))
本文的其它優(yōu)選親本氨基酸序列包括在相對應(yīng)于SSI的62位上有替換的變體。62位上的替換可以是除親本中天然出現(xiàn)的氨基酸(對于SSI，天然出現(xiàn)的氨基酸為丙氨酸)外的任何氨基酸。62位上的優(yōu)選的替換選自Lys,Arg,Glu,Asp,Thr,Ser,Gln,Asn和Trp，較優(yōu)選的替換選自Lys,Arg,Glu,Asp,Thr,Ser,Gln和Asn,更優(yōu)選的替換選自Lys,Arg,Glu和Asp，更加優(yōu)選的替換選自Lys和Arg，最優(yōu)選的為Lys。優(yōu)選的氨基酸序列除列于表2-6中的替換之外還在62位上有一個替換。這樣的親本的例子被命名為親本X-A62*，其中X對應(yīng)于例舉于表2-6中的親本。這樣，親本6-A62*就對應(yīng)于A62*+M73P+D83C+S98A。與此類似，親本6-A62K對應(yīng)于A62K+M73P+D83C+S98A。與此類似，本文例舉的一個變體為變體6-I-A62*，它對應(yīng)于A62*+L63I+M73P+D83C+S98A。這樣，變體6-I-A62K對應(yīng)于A62K+L63I+M73P+D83C+S98A。表8以該方式列出了本發(fā)明的其他優(yōu)選變體。
表8本發(fā)明的其他優(yōu)選變體的非限制性示例
其它有用于本發(fā)明的親本氨基酸序列(其為SSI變體)包括在對應(yīng)于SSI的98位上有單替換的變體和在98位和62位上有雙替換的變體。表9列出了該類別中的優(yōu)選親本氨基酸序列。
表9親本氨基酸序列的非限制性示例
本發(fā)明的變體的相關(guān)例子列于下表10。
表10本發(fā)明的變體的非限制性示例
SSI可以雙體形式存在。這樣，不受理論的束縛，提供對過量的蛋白酶具增強的抗性的穩(wěn)定化的雙體SSI也是可能的。優(yōu)選的這一穩(wěn)定化雙體SSI包括兩個共價結(jié)合在一起的單體。這一結(jié)合可以是酯、酰胺、二硫或其他通常出現(xiàn)在氨基酸或它們的側(cè)鏈中的鍵。這里的“共價二聚化”和“共價穩(wěn)定化”指的是如此共價結(jié)合成雙體的單體。較優(yōu)選的二聚化通過二硫鍵進行。本發(fā)明的變體有意包括以雙體形式存在的變體，無論它們以分子內(nèi)或分子間力結(jié)合。
本文中其它有用的親本氨基酸序列包括SSI樣抑制劑(通常稱為SSI樣(SIL)蛋白)和SSI樣抑制劑變體。SSI樣抑制劑的相關(guān)背景信息可見Laskowski等.，"Protein Inhibition of Proteases",Annual Review of Biochemistry,Vol.49,pp.593-626(1980)。優(yōu)選的SSI樣抑制劑和SSI具約50％以上的同一氨基酸序列，較優(yōu)選的具65％以上的同一序列，更優(yōu)選的具70％以上的同一序列，其中較優(yōu)選的抑制劑可歸類為家族Ⅲ抑制劑。見上文中Laskowski等．的文獻。這樣的SSI樣抑制劑的例子包括SIL10(序列提供于SEQ IDNO:4),SIL13(SEQ ID NO:5)和SIL14(SEQ ID NO:6)，它們的進一步描述見Terabe等.，"Three Novel Subtilisin-TrypsinInhibitors from Streptomyces:Primary Structures andInhibitor Properties",Journal of Biochemistry,Vol.116 pp.1156-1163(1994)，這樣的例子還有SIL2(序列提供于SEQ ID NO:9)、SIL3(SEQ ID NO:10)和SIL4(SEQ ID NO:11)，它們的進一步描述見Taguchi等.，"Comparative Studies on the PrimaryStructure and Inhibitory Properties of Subtilisin-trypsinInhibitors from Streptomyces",European Journal ofBiochemistry,Vol.220,pp.911-918(1994)。這樣的SI樣抑制劑的另兩個例子包括STI1(序列提供于SEQ ID NO:7)和STI2(SEQ IDNO:8)，其進一步描述可見Strickler等.，"Two Novel StreptomycesProtein Protease Inhibitors",The Journal of BiologicalChemistry,Vol.267,No.5,pp.3236-3241(1992)。另一SSI樣抑制劑已知為plasminostreptin(序列提供于SEQ ID NO:12)，其進一步描述可見Sugino等.，"plasminostreptin,a ProteinProtease Inhibitors Produced by Streptomycesantifibrinostreptin",The Journal of Biological Chemistry,Vol.253,No.5,pp.1546-1555(1978)。另一SSI樣抑制劑為SLPI(序列提供于SEQ ID NO:13)，其進一步描述可見Ueda等.，"aProtein Protease Inhibitors Produced by Streptomyces lividans66 Exhibits Inhibitory Activities Towards Both SubtilisinBPN’and Trypsin",Journal of Biochemistry,Vol.112,pp.204-211(1993)。另一SSI樣抑制劑為SACI(序列提供于SEQ ID NO:14)，其進一步描述可見Tanabe等.，"Primary Structure andReactive Site of Streptoverticillium Anticoagulant(SAC),aNovel Protein Protease Inhibitors Produced byStreptoverticillium cinnamoneum Subsp.cinnamoneum",Journal of Biochemistry,Vol.115,pp.752-761(1994)。另一SSI樣抑制劑為SILI(序列提供于SEQ ID NO:15)，其進一步描述可見Kojima等.，"Primary Structure and InhibitoryProperties of a Protease Inhibitor Produced by Streptomycescacaoi",Biochemica et Biophysica Acta,Vol.1207,pp.120-125(1994)。其它的SSI樣抑制劑的討論可見Taguchi等.，"HighFrequency of SSI-like Protease Inhibitors Among Streptomyces",Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,Vol.57,pp.522-524(1993),Taguchi等.，"Streptomyces SubtilisinInhibitors-Like Proteins Are Distributed Widely inStreptomycetes",Applied and Environmental Microbiology,pp.4338-4341(Dec.1993)，以及Suzuki等.，"Partial Amino AcidSequence of an alkaline Protease Inhibitor",AgriculturalBiological Chemistry,Vol.45,pp.629-634(1981)。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，還有其他的SSI樣抑制劑在本領(lǐng)域中有所描述。
SSI樣抑制劑的變體也可在此用作親本氨基酸序列。這些變體包括那些選自上文所述的SSI樣抑制劑，其氨基酸序列含一個或多個突變。所有在本文提及的變體中例示過的替換均可在SSI樣抑制劑的相對應(yīng)位置制造以提供一親本氨基酸序列。其它的可用作親本氨基酸序列的SSI樣抑制劑變體的非限制性例子披露于Nielson等.，WO93/17086，轉(zhuǎn)讓給Novo Nrdisk A/S，授權(quán)于1993年9月2日。
如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，SSI樣抑制劑、其變體或SSI的變體的天然編碼的63位(示例)可能并不對應(yīng)于SSI的63位。因此，正如本領(lǐng)域所熟知，可能需要對序列編號進行調(diào)整以定位對應(yīng)于SSI的63位(示例)。序列的排列可見于本文引用的參考以及本領(lǐng)域的其它參考。
本發(fā)明優(yōu)選的變體所表現(xiàn)的Ki可使該變體在清潔和個人衛(wèi)生組合物中抑制幾乎所有的蛋白酶(優(yōu)選的可抑制約60％的蛋白酶，更優(yōu)選的可抑制約99％)，而在稀釋后和/或在洗滌期間可同抑制劑解離。
例如，當(dāng)使用的變體同蛋白酶的化學(xué)計量比為2∶1時，優(yōu)選的抑制劑對蛋白酶的Ki為約10-12M到10-4M，更優(yōu)選的為10-10M到10-6M，最優(yōu)選的10-8M到10-7M。當(dāng)然，如果洗滌設(shè)備的大小或產(chǎn)品的濃度有變化，須據(jù)此調(diào)整Ki。對一個有用Ki的預(yù)測可由熟練的技術(shù)人員進行，而無需進行考慮到諸如組合物在使用時的稀釋、結(jié)合常數(shù)對所使用的相關(guān)清洗方法的溫度的依賴、變體同蛋白酶的化學(xué)計量比等類似的參數(shù)的過度的試驗。
由于變體在體內(nèi)最終由DNA所編碼，因此該DNA可用于定義變體序列。編碼變體的DNA可用于任何數(shù)量的質(zhì)粒和/或表達系統(tǒng)，包括體內(nèi)表達系統(tǒng)和體外表達系統(tǒng)，例如植物(用于生物技術(shù)的較為優(yōu)選，包括煙草，含油種子作物，例如油菜籽、大豆及其他類似之物，谷物，例如玉米、大麥、燕麥，其它蔬菜，例如番茄、馬鈴薯及類似植物)和微生物表達系統(tǒng)，后者包括真菌，例如酵母，以及細菌，例如枯草桿菌、大腸桿菌及其他類似菌。優(yōu)選的表達系統(tǒng)為微生物，更優(yōu)選的為天然細菌，最優(yōu)選的為枯草桿菌或大腸桿菌，而枯草桿菌更好一些。
編碼變體的DNA可參入在細胞中有活性的質(zhì)?；蚴删w，還可以直接參入用于克隆或表達本發(fā)明的變體的有機體的基因組。
應(yīng)當(dāng)了解，在本發(fā)明的指導(dǎo)下熟練的技術(shù)人員將會認為用于編碼一個本發(fā)明變體的DNA可引入同本發(fā)明的其它變體一樣的質(zhì)粒、噬菌體或染色體。另外，該質(zhì)粒、噬菌體或染色體還可以編碼蛋白酶，它包括含抑制劑和/或蛋白酶作為其一部分的融合蛋白，無論它是否被本發(fā)明的變體所抑制均可。
熟練的技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)了解上述的DNA亦可考慮，并披露DNA的RNA轉(zhuǎn)錄本。熟練的技術(shù)人員無需實驗便可通過檢測DNA序列來獲知RNA序列。
本發(fā)明還涉及到編碼這些變體的基因。
可以預(yù)期，熟練的技術(shù)人員可制備本發(fā)明的變體的抗體。這些抗體可以已知的方法來制備。
例如，可將本發(fā)明的變體注射入適合的哺乳動物，如鼠、兔和其它類似動物。適當(dāng)?shù)姆桨干婕暗矫庖咴谧魟┐嬖谙碌闹貜?fù)注射，注射依照可提高血清中的抗體產(chǎn)量的時間表來進行。免疫血清的滴度的測量可以本發(fā)明的變體作為抗原通過本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析步驟來進行。
抗血清可直接使用，還可以通過收集外周血淋巴細胞或免疫動物的脾臟并使產(chǎn)抗體細胞永生化，隨之使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析方法確認合適的抗體產(chǎn)生細胞，而獲得單克隆抗體。
多克隆或單克隆抗體可通過標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法用于檢測本發(fā)明的表達。這樣，預(yù)計可以利用這些抗體制備試劑盒以用于測量表達水平及其它。
這些抗體還可利用標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)方法偶聯(lián)于閃爍照像標(biāo)記，例如锝99或I-131，或偶聯(lián)于熒光標(biāo)記。標(biāo)記的抗體還可用于競爭性分析，例如動力學(xué)分析，以此測出Ki。
如本領(lǐng)域所知，DNA和氨基酸序列中會有偶然的錯誤。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在由本文所公布內(nèi)容重復(fù)本發(fā)明者的工作時可通過常規(guī)技術(shù)發(fā)現(xiàn)任何錯誤并加以適當(dāng)改動。
制造和使用方法以下的例子并不是要對所申請的發(fā)明進行限制，而是向熟練的技術(shù)人員提供關(guān)于如何制造和使用本發(fā)明的指導(dǎo)。有了這些例子的指導(dǎo)、本文的其它披露內(nèi)容以及本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的其它信息，熟練的技術(shù)人員可以制造和使用本發(fā)明。為行文簡潔，本領(lǐng)域和已知領(lǐng)域方法的重復(fù)引用均已被省去，因為它們?yōu)槭炀毜募夹g(shù)人員所預(yù)知。
變體可通過對編碼親本氨基酸序列的核苷序列進行突變而制備，這樣便產(chǎn)生了具修飾過的氨基酸序列的變體。這些方法為本領(lǐng)域所已知，其中一種如下所示。
用一個含有與親本氨基酸序列相對應(yīng)的基因的噬菌粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌dut-ung-菌株CJ236并且利用VCSM13輔助噬菌體產(chǎn)生單鏈含尿嘧啶的DNA模板(Kunkel等.，"Rapid and Efficient Site-SpecificMutagenesis Without Phenotypic Selection",Methods inEnzymology,Vol.154,pp.367-382(1987)，改動見Yuckenberg等.，"Site Directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors",Mutagenesis-APractical Approach,McPherson,M.J.ed.,pp.27-48(1991))。引物位點特異性突變可通過經(jīng)改動的Zoller和Smith的方法(Zoller,M.J.,and M.Smith,"Oligonucleotid-Directed MutagenesisUsing M13-Derived Vectors:An Efficient and GeneralProcedure for the Production of Point Mutations in anyFragment of DNA",Nucleic Acids Research,Vol.10,pp.6487-6500(1982))被用于產(chǎn)生所有的變體(基本上如上文的Yuckenberg等.的文獻所述)。
使用380B DNA合成儀來制造寡聚核苷酸。將突變反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株MM294(American Type Culture Collection E.coli33625)。通過DNA測序確認出所有的突變并將分離得的DNA轉(zhuǎn)化入枯草桿菌表達菌株P(guān)G632(Sauders等.，"Optimization of theSiganal-Sequence Cleavage Site for secretion from Bacillussubtilis of a 34-amino acid Fragment of Human ParathyroidHormone",Gene,Vol.102,pp.277-282(1991)and Yang等.，"Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis andthe Use of the Cloned Gene to Create an in vitro-DerivedDeletion Mutation",Journal of Bacteriology,Vol.160,pp.15-21(1984))。
變體以如下方法制備。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含目的質(zhì)粒的枯草桿菌細胞，培養(yǎng)基含29g/l的胰蛋白胨、29g/l的酵母抽提物和5g/l的氯化鈉，并補充以1.25％maltrin M100(Grain Processing Corporation,Muscatine,IA)、100mM pH7.5的HEPES、80μM MnCl2、50μM的卡那霉素。培養(yǎng)物在37℃下溫育24小時。
變體的純化首先進行離心以除去細胞。隨即加入1N的鹽酸以將pH降至4左右。離心沉淀不溶物。通常變體可在上清找到。以20mM,pH4乙酸鈉對上清進行透析。變體典型地在這一步沉淀出來。在Tris堿中重新懸浮沉淀并分析其對枯草桿菌蛋白酶BPN’的Y217L衍生物的抑制。某些情況下，變體經(jīng)過這些沉淀步驟后保持可溶。在這一情況下，可通過S Sepharose柱以20mM,pH4的乙酸鈉分離可溶部分。以濃度遞增的氯化鈉洗脫樣品并進行蛋白酶抑制分析。在所有的情況下，含變體的部分在使用前以1mM,pH8.0的Tris進行透析。
本發(fā)明變體的特征SSI抑制蛋白酶，尤其是枯草桿菌蛋白酶BPN’和枯草桿菌蛋白酶BPN’的Y217L變體。以SSI為例，本發(fā)明的變體的抑制活性以如下方法測量。將SSI同蛋白酶混合，在0.1M pH8.6的Tris,10mM CaCl2存在的情況下室溫溫育15分鐘。隨即按DelMar等.，AnalyticalBiochemistry,Vol.99,pp.316-320(1979)中的方法測量蛋白酶活性。加入10ul的N-琥珀酰-ala-ala-Pro-Phe-對-氮苯胺(20mg/ml)以起始反應(yīng)。根據(jù)410nm下吸收的增強測量反應(yīng)速率，該增強反映了對蛋白酶的抑制。
出于需要將本發(fā)明的一個變體同清潔或個人衛(wèi)生組合物中的蛋白酶(合適的蛋白酶在下文描述)合并，其在產(chǎn)品環(huán)境中的穩(wěn)定性也被測試。變體的穩(wěn)定性可通過對蛋白酶活性進行長時間測量來檢測。如果變體是穩(wěn)定的，蛋白酶活性水平將是較恒定的。但是如果變體被破壞，蛋白酶活性將升高。在本例中，變體同1.1nmol的具Y217L替換的一個枯草桿菌蛋白酶BPN’變體相混合。加入了水以使各樣品的體積一致。在按如下表配置的液體洗滌劑復(fù)合物中經(jīng)10分鐘以形成復(fù)合體
這一組合物占樣品總體積的三分之一。以15μl的樣品同975μl的0.1M,pH8.6的Tris HCl和0.01MCaCl2相混合。在室溫下溫育該稀釋物30分鐘。溫育后加入底物并測算出蛋白酶的量。通過幾周后蛋白酶活性的增加檢測變體的降解。該降解可直接同SSI的相對應(yīng)數(shù)據(jù)進行比較。
變體的Ki以如下方式計算。將變體同600μg/ml N-琥珀酰-ala-ala-Pro-Phe-對-氮苯胺在990μl 50mM pH8的Tris溶液中混合。加入選定的蛋白酶以起始反應(yīng)(適當(dāng)?shù)牡鞍酌笇⒃诤笪拿枋?。追蹤20分鐘的水解速率。經(jīng)過最后的10至15分鐘可觀測到穩(wěn)定的速率。根據(jù)Goldstein,"The Mechanism of Enzyme-Inhibitor-SubstrateReactions", Journal of General Physiology,Vol.27,pp.529-580(1944)中的方程，以該速率同無變體情況下的速率相比較并計算Ki。
本發(fā)明的清潔組合物在本發(fā)明的另一實施方案中，有效重的一種或多種本發(fā)明的變體被包含于清潔組合物中，該組合物可用于清潔須除去肽污染的表面。這些清潔組合物包括織物清潔組合物、硬表面清潔組合物、包括盤碟清潔組合物的輕垢型清潔組合物，以及盤碟自動清洗機的去污劑組合物，但不限于這些。
本文的清潔組合物包括有效量的一種或多種本發(fā)明的變體以及一清潔組合物載體，該載體含蛋白酶。本文所使用的“有效量的變體”或其它類似術(shù)語意指為在具體的清潔組合物獲得必需的蛋白水解活性所必需的變體的量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在許多因素的基礎(chǔ)上可較容易地確定該有效量，這些因素的例子如，所用的特定變體、清潔應(yīng)用、清潔組合物的具體組合、需要液態(tài)還是干性(如顆粒、柱狀)組合物及其他類似因素。優(yōu)選的清潔組合物含0.0001％至10％的一種或多種本發(fā)明變體，更優(yōu)選的清潔組合物含0.001％至1％，最優(yōu)選的清潔組合物含0.01％至0.1％?？赡軕?yīng)用到本變體的多種清潔組合物的幾個實施例將在下文詳細討論。
本發(fā)明的變體可用于清潔組合物中以在貯存期間抑制蛋白酶，這樣便可保護蛋白酶防止其自降解或其它來源的降解，如組合物中存在的其它酶。因此，本發(fā)明的組合物的一個基本組分是本發(fā)明變體所抑制的一種蛋白酶。該蛋白酶可以來自動物、植物，較優(yōu)選的來自微生物。優(yōu)選的蛋白酶包括抑制劑為SSI的蛋白酶。這樣的蛋白酶包括產(chǎn)自Bacillus alcalophilus,Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus amylosaccharius,Bacillus licheniformis,Bacilluslentus和Bacillus subtilis的蛋白酶。這些蛋白酶中優(yōu)選的包括sublisin BPN、sublisin BPN’、sublisin Carlsberg、sublisin DY、sublisin 309、蛋白酶K以及thermitase，它包括A/Salcalase_(Novo Industries,Copenhagen,Denmark)、Esperase_(Novo Industries)、Sayinase_(Novo Industries)、Maxatase_(Gist-Brocades,Delft,Netherlands)、Maxacal_(Gist-Brocades)、Maxapem15_(Gist-Brocades)以及上文的變體。此處所用的更優(yōu)選的蛋白酶包括得自Bacillusamyloliquefaciens的蛋白酶及其變體。最優(yōu)選的野生型蛋白酶為sublisin BPN’。
本文以后統(tǒng)稱為“蛋白酶類群A”的sublisin BPN’的變體可用作蛋白酶，它們披露于美國專利號No.5,030,378,Venegas,1991年7月9日，其特征為具以下突變的sublisin BPN’氨基酸序列(序列由SEQ ID NO:3所表示)。
(a)166位的Gly為Asn,Ser,Lys,Arg,His,Gln,ala或Glu所替代；169位的Gly為Ser，所替代；222位的Met為Gln,Phe,His,Asn,Glu,ala或Thr；或者(b)160位的Gly為ala所替代，222位的Met為ala所替代。
本文以后統(tǒng)稱為“蛋白酶類群B”的sublisin BPN’的其他變體在本文中可用作蛋白酶，它們披露于歐洲專利號EP-B-251,446，轉(zhuǎn)讓給Genencor International,Inc.，于1988年1月7日發(fā)表，1994年12月28日授權(quán)，其特征為在一個或多個以下位點具突變的野生sublisin BPN’氨基酸序列Tyr21,Thr22,Ser24,Asp36,ala45,ala48,Ser49,Met50,His67,Ser87,Lys94,Val95,Gly97,Ser101,Gly102,Gly103,Ile107,Gly110,Met124,Gly127,Gly128,Pro129,Leu135,Lys170,Tyr171,Pro172,Asp197,Met199,Ser204,Lys213,Tyr214,Gly215,Ser221；或以上列出的位點與下列突變有單重或多重組合，Asp32,Ser33,Tyr104,ala152,Asn155,Glu156,Gly166,Gly169,Phe189,Tyr217和Met222。
其他在本文中可用作蛋白酶的sublisin BPN’變體在下文統(tǒng)稱為“蛋白酶類群C”，其描述見WO 95/10615，轉(zhuǎn)讓給GenencorInternational Inc.，發(fā)表于1995年4月20日，其特征為具突變的野生sublisin BPN’氨基酸序列，該突變?yōu)锳sn76位同以下一個或多個突變的組合Asp99,Ser101,Gln103,Tyr104,Ser105,Ile107,Asn109,Asn123,Leu126,Gly127,Gly128,Leu135,Glu156,Gly166,Glu195,Asp197,Ser204,Gln206,Pro210,ala216,Tyr217,Asn218,Met222,Ser260,Lys265和ala274。
其他在本文中可用作蛋白酶的優(yōu)選sublisin BPN’變體在下文統(tǒng)稱為“蛋白酶類群D”，其描述見美國專利號4,760,025,Estell，等.，1988年7月26日，特征為具一個或多個突變的野生sublisin BPN’氨基酸序列，其突變位點選自由以下位點組成的群體Asp32,Ser33,His64,Tyr104,Asn155 Glu156,Gly166,Gly169,Phe189,Tyr217和Met222。
本文所用的更優(yōu)選的蛋白酶選自由alcalase_、sublisin BPN’、蛋白酶類群A、蛋白酶類群B、蛋白酶類群C、蛋白酶類群D組成的群體。最優(yōu)選的蛋白酶選自蛋白酶類群D。
本發(fā)明的組合物包括重量百分比為0.0001％至1％的活性蛋白酶，優(yōu)選的組合物包括0.0005％至0.2％，最優(yōu)選的組合物包括0.002％至0.1％。蛋白酶的混合物也可包括在內(nèi)。當(dāng)然，清潔組合中蛋白酶的重量百分比隨最終組合物中的水的含量、助洗劑的含量及其他類似條件而變化。例如，在優(yōu)選的顆粒狀去污劑中，組合物中含0.064mg/g至0.64mg/g的蛋白酶為宜。
在一個優(yōu)選的實施方案中，清潔組合物中變體同蛋白酶的優(yōu)選摩爾比(變體比蛋白酶)為3∶1至1∶1，更優(yōu)選的比值為3∶1至1.5∶1，最優(yōu)選的比值為2∶1。
除本發(fā)明的變體外，本發(fā)明的清潔組合物還包括一清潔組合物載體，它包括一種或多種與變體和/或蛋白酶相容的清潔組合物材料。本文所用的術(shù)語“清潔組合物材料”指的是任何被選用于特定類型的所需清潔組合物和產(chǎn)品形式(如液態(tài)、顆粒、柱狀、噴霧、棒狀、糊狀、凝膠狀)的材料，該材料應(yīng)與組合物中所用的變體相容。根據(jù)待清洗材料和使用時用于清潔環(huán)境的組合物的所需形式可較容易地對清潔組合物材料作出具體選擇。本文所用的術(shù)語“相容”意指清潔組合物材料對變體的抑制活性和/或蛋白酶的蛋白水解活性的降低不會達到使蛋白酶不具通常使用所需求的效力的程度。下文將詳細例示具體的清潔組合物材料。
本發(fā)明的變體可被用于多種需要豐富泡沫和良好的清潔活性的去污劑組合物。這樣，本變體可同多種傳統(tǒng)成分一起被用于充分配制的硬表面清潔劑、盤碟清潔組合物、織物洗衣組合物及其它。這些組合物可以是液態(tài)、顆粒、柱狀及其它形式。這些組合物可以“濃縮”去污劑的形式配制，它們含重量百分比30％至60％的表面活性劑。
本文的清潔組合物可依情況優(yōu)選地含多種表面活性劑(例如陰離子、非離子或兩性離子表面活性劑)。這些表面活性劑典型地存在含量為組合物的5％至35％。
此處所用的表面活性劑的非限制性例子包括傳統(tǒng)的C11-C18烷基苯磺酸和伯和隨機的烷基硫酸、C10-C18仲(2,3)烷基硫酸，其分子式為CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3M+)CH2CH3，其中x和(y+1)為至少為7的整數(shù)，較優(yōu)選的則為至少為9的整數(shù)，M為水溶性的陽離子，尤其是鈉離子，非限制性例子還包括C10-C18烷基烷氧基硫酸(尤其是E0 1-5乙氧基硫酸)、C10-C18烷基烷氧基羧酸(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸)、C10-C18烷基多聚糖苷和它們相對應(yīng)的硫酸多聚糖苷、C12-C18α-磺化脂肪酸酯、C12-C18烷基和烷基苯酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物或乙氧/丙氧混合物)、C12-C18甜菜堿和硫代甜菜堿(“sultaines”),C10-C18胺氧化物及其它類似物。烷基烷氧基硫酸(AES)和烷基烷氧基羧酸(AEC)在此處較為優(yōu)選。這些表面活性劑同胺氧化物和/或甜菜堿或Saltaine的組合使用也是較優(yōu)選的，這取決于配方設(shè)計師的要求。其它有用的傳統(tǒng)表面活性劑以標(biāo)準(zhǔn)文本列出。特別有用的表面活性劑包括C10-C18N-甲基葡萄糖酰胺，它披露于美國專利號5,194,639,Connor等.，1993年3月16日注冊。
本發(fā)明的清潔組合物中的其它十分廣泛的組分包括其它活性組分、載體、助水溶物、加工輔助物、染料或色素、以及用于液體制劑的溶劑。如果需要泡沫的額外增加，可將諸如C10-C16烷醇酰胺(alkolamide)這樣的泡沫產(chǎn)生劑加入組合物，典型的含量為約1％到約10％。C10-C14單乙醇或二乙醇酰胺為典型的一類這樣的泡沫產(chǎn)生劑。將這樣的泡沫產(chǎn)生劑同高泡沫輔助表面活性劑，例如上述的胺氧化物、甜菜堿和硫代甜菜堿一起使用也是有益的。如果需要，可加入可溶性的鎂鹽以產(chǎn)生更多的泡沫，如MgCl2、MgSO4等等，其濃度一般為約0.1％至約2％。
本文的液體去污劑組合物可以含水或其它溶劑作為載體。低分子量的伯或仲醇適于使用，例如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。對于可溶表面活性劑，單羥基醇較為優(yōu)選，但也可使用含約2至6個碳原子和約2至6個羥基基團的多醇(例如1,3-丙二醇、1,2亞乙基二醇、甘油和1,2-丙二醇)。組合物可以含約5％到約90％的這些載體，典型地含約10％到約50％。
本文的去污劑組合物于在水中清洗操作時優(yōu)選地配制，清洗用水的pH在6.8至11間。最終產(chǎn)品典型地在該范圍內(nèi)配制成。用于將pH控制在建議使用水平的工藝包括諸如緩沖液、堿和酸的使用。這些工藝為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
在配制本發(fā)明的硬表面清潔組合物和織物清潔組合物的過程中，配方設(shè)計師可能愿意使用多種助洗劑，其重量百分比為約5％到約50％。典型的助洗劑包括1-10微米的沸石、多羧基酸如檸檬酸和氧代的琥珀酸、層化硅酸鹽、磷酸鹽及其它。其它傳統(tǒng)的助洗劑列于標(biāo)準(zhǔn)的配方一覽表中。
同樣地，配方設(shè)計師可能愿意在這些組合物中使用多種附加的酶，例如纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，它們含量典型地為重量百分比約0.001％到約1％。洗衣去污劑領(lǐng)域中已知多種清潔和織物用酶。
多種漂白化合物，例如過碳酸鹽、過硼酸鹽等類似化合物，可被用于這些組合物，它們含量典型地為重量百分比約1％到約15％。如果需要，這些組合物還可含漂白激活劑，例如四乙酰基亞乙基二胺、壬?；趸交撬峒捌渌愃苹衔?，其在本領(lǐng)域也是已知的。其使用含量典型地為重量百分比約1％到約10％。
這些組合物還可以使用污漬解離劑(soil release agent)特別是寡聚酯陰離子型，螯合劑，特別是氨基膦酸鹽和亞乙二胺丁二酸酯，粘土去除劑，特別是乙氧化四亞乙基戊胺，分散劑，特別是聚丙烯酸酯和聚天冬酰胺(polyasparatate)，增亮劑，特別是陰離子增亮劑，泡沫抑制劑，特別是硅氧烷和仲醇，織物柔軟劑，特別是綠土粘土，等等類似物質(zhì)，它們的含量為重量百分比約1％到約35％。標(biāo)準(zhǔn)的配方一覽表和已發(fā)表專利有關(guān)于這些傳統(tǒng)材料的眾多詳細描述。
酶穩(wěn)定劑也可用于清潔組合物。這樣的酶穩(wěn)定劑包括丙二醇(優(yōu)選含量為約1％到約10％)、甲酸鈉(優(yōu)選含量為約0.1％到約1％)和甲酸鈣(優(yōu)選含量為約0.1％到約1％)。
其它有用的清潔組合物包括粘土去除劑、分散劑、增亮劑、泡沫抑制劑和織物柔軟劑。
本發(fā)明的變體可用于硬表面清潔組合物。本文所用的“硬表面清潔組合物”用于清潔諸如地板、墻壁、浴室瓷磚等等硬表面的液態(tài)或顆粒狀去污劑組合物。硬表面清潔組合物典型地含有表面活性劑和水溶性多價螯合助洗劑。然而，在某些特殊產(chǎn)品如窗戶噴霧清潔劑中有時并不使用表面活性劑，因為它們可能在玻璃表面殘留薄膜狀和/或斑點狀痕跡。
表面活性劑存在時可能含量低至本文的組合物的0.1％，但該組合物典型地含約0.25％到約10％，含約1％到約5％則更為優(yōu)選。
本組合物典型地含約0.5％到約50％的去污助洗劑，較優(yōu)選的含量為1％到約10％。
較優(yōu)選的pH值為約7到12。如果需要調(diào)節(jié)pH，可使用傳統(tǒng)的pH調(diào)節(jié)試劑，例如氫氧化鈉、碳酸鈉或鹽酸。
溶劑可包含于組合物中。有用的溶劑包括乙二醇醚，例如二亞乙基乙二醇單己醚、二亞乙基乙二醇單丁醚、亞乙基乙二醇單丁醚、亞乙基乙二醇單己醚、亞丙基乙二醇單丁醚、二亞丙基乙二醇單丁醚，有用的溶劑還包括二醇，例如2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇和2-乙基-1,3己二醇，溶劑的例子不限于此。。使用時這些溶劑典型的含量為約0.5％到約15％，更優(yōu)選的含量為約3％到約11％。
另外，當(dāng)組合物對表面進行“全效”施用后不對表面沖洗，本組合物可使用強揮發(fā)性溶劑如異丙醇或乙醇以輔助該組合物從表面較快速的蒸發(fā)。使用時揮發(fā)性溶劑在該組合物中典型的含量為約2％到約12％。
本發(fā)明的變體在以下所述中包含的清潔組合物中也是有用的美國專利臨時申請No.60/079,477,Rubingh等.，申報于1998年3月26日；美國專利臨時申請No.60/079,397,Rubingh等.，申報于1998年3月26日；美國專利申請?zhí)朜o.09/048,174,Weisgerber等.，申報于1998年3月26日；美國專利申請?zhí)朜o.09/088912，要求優(yōu)先于美國專利暫行申請No.60/079,477,Weisgerber等.，申報于1998年6月2日。
硬表面清潔組合物由以下實施例闡明。
實施例1-6液態(tài)硬表面清潔組合物
所有配方均調(diào)至pH7在實施例1-6中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體6-I，其結(jié)果基本相似。
在本發(fā)明的另一實施方案中，盤碟清潔組合物含一種或多種本發(fā)明的變體。本文所使用的“盤碟清潔組合物”指的是用于清洗盤碟的所有形式的組合物，它包括顆粒狀和液態(tài)形式，但不限于此。本發(fā)明的盤碟清潔組合物由以下實施例闡明。
實施例7-10液態(tài)盤碟去污劑
所有配方均調(diào)至pH7。
在實施例7-10中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體7-I-A62K，其結(jié)果基本相似。
本發(fā)明的液態(tài)織物清潔組合物由如下實施例闡明。
實施例11-13液態(tài)織物清潔組合物
在實施例11-13中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體2-I，其結(jié)果基本相似。
個人衛(wèi)生組合物本發(fā)明的變體還適用于個人衛(wèi)生組合物，這些組合物選自leave-on和rinse-off護發(fā)素，香波，leave-on和rinse-off痤瘡組合物，洗面奶和護理劑，沐浴露，香皂，起泡和無泡面部清潔劑、化妝品，手部、面部和軀體洗液和保濕劑，leave-on面部保濕劑、化妝品和清潔擦拭物，口腔衛(wèi)生組合物以及接觸透鏡衛(wèi)生組合物。本發(fā)明的個人衛(wèi)生組合物含有效量的一種或多種本發(fā)明的變體和一種個人衛(wèi)生載體，該個人衛(wèi)生載體含一種蛋白酶。有效量的變體包括其優(yōu)選限制在本文中關(guān)于清潔組合物處有所描述。
為便于說明，與一種蛋白酶共存的本發(fā)明的變體適合于以下參考文獻所描述的組合物美國專利號5,641,479,Linares等.，頒發(fā)于1997年6月24日(皮膚清潔劑)；美國專利號5,599,549,Wivell等.，頒發(fā)于1997年2月4日(皮膚清潔劑)；美國專利號5,585,104,Ha等.，頒發(fā)于1996年12月17日(皮膚清潔劑)；美國專利號5,540,852,Kefauver等.，頒發(fā)于1996年7月30日(皮膚清潔劑)；美國專利號5,510,050,Dunbar等.，頒發(fā)于1996年4月23日(皮膚清潔劑)；美國專利號5,612,324,Guang lin等.，頒發(fā)于1997年3月18日(抗痤瘡制劑)；美國專利號5,587,176,Warren等.，頒發(fā)于1996年12月24日(抗痤瘡制劑)；美國專利號5,549,888,Venkateswaran等.，頒發(fā)于1996年8月27日(抗痤瘡制劑)；美國專利號5,470,884,Corless等.，頒發(fā)于1995年11月28日(抗痤瘡制劑)；美國專利號5,650,384,Gordon等.，頒發(fā)于1997年7月22日(沐浴露)；美國專利號5,607,678,Moore等.，頒發(fā)于1997年3月4日(沐浴露)；美國專利號5,624,666,Coffindaffer等.，頒發(fā)于1997年4月29日(護發(fā)劑和/或香波)；美國專利號5,618,524,Bolich等.，頒發(fā)于1997年4月8日(護發(fā)劑和/或香波)；美國專利號5,624,666,Coffindaffer等.，頒發(fā)于1997年4月29日(護發(fā)劑和/或香波)；美國專利號5,612,301,Inman，頒發(fā)于1997年3月18日(護發(fā)劑和/或香波)；美國專利號5,573,709,Wells，頒發(fā)于1996年11月12日(護發(fā)劑和/或香波)；美國專利號5,482,703,Pings，頒發(fā)于1996年1月9日(護發(fā)劑和/或香波)；美國專利號Re.34,584,Grote等.，重新頒發(fā)于1994年4月12日(護發(fā)劑和/或香波)；美國專利號5,641,493,Date等.，頒發(fā)于1997年6月24日(化妝品)；美國專利號5,605,894,Blank等.，頒發(fā)于1997年2月25日(化妝品)；美國專利號5,585,090,Yoshioka等.，頒發(fā)于1996年12月17日(化妝品)；美國專利號4,939,179,Chenev等.、頒發(fā)于1990年7月3日(手部、面部和軀體洗液)；美國專利號5,607,980,McAtee等.，頒發(fā)于1997年3月4日(手部、面部和軀體洗液)；美國專利號4,045,364,Richet等.，頒發(fā)于1977年8月30日(化妝品和清潔擦拭物)；歐洲專利申請，EP 0619 074,Touchet等.，發(fā)表于1994年10月12日(化妝品和清潔擦拭物)；美國專利號4,975,217,Brown-Skrobot等.，頒發(fā)于1990年12月4日(化妝品和清潔擦拭物)；美國專利號5,096,700,Seibel，頒發(fā)于1992年3月17日(口腔清潔組合物)；美國專利號5,028,414,Sampathkumar，頒發(fā)于1991年7月2日(口腔清潔組合物)；美國專利號5,028,415,Benedict等.，頒發(fā)于1991年7月2日(口腔清潔組合物)；美國專利號5,028,415,Benedict等.，頒發(fā)于1991年7月2日(口腔清潔組合物)；美國專利號4,863,627,Davies等.，頒發(fā)于1989年9月5日(接觸透鏡清潔溶液)；美國專利號Re 32,672,Huth等.，重新頒發(fā)于1988年5月24日(接觸透鏡清潔溶液)；美國專利號4,609,493,Schafer，頒發(fā)于1986年9月2日(接觸透鏡清潔溶液)。
本發(fā)明的變體在以下所述中包含的個人衛(wèi)生組合物中也是有用的美國專利臨時申請No.60/079,477,Rubingh等.，申報于1998年3月26日；美國專利臨時申請No.60/079,397,Rubingh等.，申報于1998年3月26日；美國專利申請?zhí)朜o.09/048,174,Weisgerber等.，申報于1998年3月26日；美國專利申請?zhí)朜o.09/088912，要求優(yōu)先于美國專利暫行申請No.09/048,174,Weisgerber等.，申報于1998年6月2日。
在一個優(yōu)選的實施方案中，個人衛(wèi)生組合物中變體同蛋白酶的優(yōu)選摩爾比(變體比蛋白酶)為3∶1至1∶1，更優(yōu)選的比值為3∶1至1.5∶1，最優(yōu)選的比值為2∶1。
為進一步說明本發(fā)明的口腔清潔組合物，本發(fā)明的一種或多種變體和一種或多種蛋白酶被包含于用于從牙齒或假牙上除去蛋白污漬的組合物中。本文所用的“口腔清潔組合物”指的是潔齒劑、牙膏、牙膠、牙粉、口腔洗液、口腔噴霧、口腔凝膠、香口膠、錠劑、小囊、藥片、生物膠、預(yù)防膏、牙科治療溶液等類似物。優(yōu)選的口腔清潔組合物含重量百分比約0.0001％到約20％的本發(fā)明的一種或多種變體和一種蛋白酶以及一種個人衛(wèi)生載體，較優(yōu)選的變體含量為約0.001％到約10％，更優(yōu)選的變體含量為約0.01％到約5％。
典型的，口腔清潔組合物的口腔清潔組分中的個人衛(wèi)生載體組分通常含量為重量百分比約50％到約99.99％，優(yōu)選含量為約65％到約99.99％，更優(yōu)選含量為約65％到約99％。
可包含于本發(fā)明的口腔清潔組合物中的個人衛(wèi)生載體組分和任選組分為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。本文上文引用的參考文獻中披露了可用于口腔清潔組合物的種類繁多的組合物類型、載體組分和任選組分。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于在口腔外清洗假牙的的假牙清潔組合物含一種或多種本發(fā)明的變體。這些假牙清潔組合物含重量百分比約0.0001％到約50％的本發(fā)明的一種或多種變體和-和一種蛋白酶以及一種個人衛(wèi)生載體，較優(yōu)選的變體含量為約0.001％到約35％，更優(yōu)選的變體含量為約0.01％到約20％。本領(lǐng)域已知多種假牙清潔組合物的形式，如泡騰片等等(例見美國專利號5,055,305,Young)，它們通常適用于一種或多種用以從假牙上除去蛋白污漬的變體。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，接觸透鏡清潔組合物含一種或多種本發(fā)明的變體。這些接觸透鏡清潔組合物優(yōu)選地含重量百分比約0.01％到約50％的本發(fā)明的一種或多種變體和一種蛋白酶以及一種個人衛(wèi)生載體，較優(yōu)選的變體含量為約0.01％到約20％，更優(yōu)選的變體含量為約1％到約5％。本領(lǐng)域已知多種接觸透鏡清潔組合物的形式，如藥片或液體等等，它們通常適用于一種或多種用以從接觸透鏡上除去蛋白污漬的變體。
本發(fā)明的接觸透鏡清潔組合物實施方案由實施例14-17闡明。
實施例14-17
接觸透鏡清潔組合物
在實施例14-17中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體9-I，其結(jié)果基本相似。
實施例18-21闡明了本發(fā)明變體在軀體清潔產(chǎn)品中的應(yīng)用實施例18-21軀體清潔產(chǎn)品
(表)續(xù)
在實施例18-21中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體14-I，其結(jié)果基本相似。
實施例22-25闡明了本發(fā)明變體在潔面產(chǎn)品中的應(yīng)用實施例22-25潔面產(chǎn)品
(表)續(xù)
在實施例22-25中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體24-I，其結(jié)果基本相似。
實施例26-27闡明了本發(fā)明變體在leave-on皮膚增濕組合物中的應(yīng)用
實施例26-27leave-on皮膚增濕組合物
在實施例26-27中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體13-I，其結(jié)果基本相似。
實施例28闡明了本發(fā)明變體在清潔擦拭組合物中的應(yīng)用
實施例28清潔擦拭組合物
將上述組合物浸透一含纖維素和/或聚酯的機織吸收薄片，組合物含量為該吸收薄片重量的250％。
在實施例28中，在表7,8,10中重新引用的變體以及其他變體中本文所引述的優(yōu)選變體被用來替換變體20-I，其結(jié)果基本相似。
序列表<110>Saunders,Charles W.
Correa,Paul E.
Sun,YipingRubingh,Donn N.<120>鏈霉菌枯草桿菌居白酶抑制劑的穩(wěn)定化變體<130>穩(wěn)定化變體<140><141><150>60/091,911<151>1998-07-07<160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>113<212>PRT<213>白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolue)<400>1Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val1 5 10 15G1y Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu Arg Ala Val Thr20 25 30Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Gly Ser35 40 45Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu Asn Ala Leu Thr50 55 60Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Met Val Tyr Asp Pro Val Leu Leu65 70 75 80Thr Val Asp Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Val85 90 95Phe Ser Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser Ser Val Ala Phe100 105 110Phe<210>2<211>117<212>PRT<213>白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)<400>2Ala Gly Glu Phe Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu1 5 10 15Val Leu Thr Val Gly Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu20 25 30Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro35 40 45Ala Ala Gly Ser Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu50 55 60Asn Ala Leu Thr Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Met Val Tyr Asp65 70 75 80Pro Val Leu Leu Thr Val Asp Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser85 90 95Tyr Glu Arg Val Phe Ser Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser100 105 110Ser Val Phe Ala Phe115<210>3<211>275<212>PRT<213>解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquetaciens)<400>3Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Vel Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr155 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275<210>4<211>107<212>PRT<213>耐熱鏈霉菌(Streptomyces thermotolerans)<400>4Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu Ser Ala1 5 10 15Ile Ala Ala Thr Pro Glu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Lys20 25 30Ala Ala Gly Thr His Pro Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Gly Val Gly Gly Asp Phe Asp Ala Leu Thr Ala Arg Asp Gly Val Met50 55 60Cys Thr Lys Gln Tyr Asp Pro Val Val Val Thr Val Glu Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ser Asn Asp Cys Met85 90 95Lys Asn Ala Tyr Gly Thr Gly Val Phe Ser Phe100 105<210>5<211>109<212>PRT<213>鮮黃鏈霉菌(Streptomyces galbus)<400>5Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Met Gly His Gly Glu1 5 10 15Ser Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Arg Ala Val Thr Leu Asn Cys Ala20 25 30Pro Ser Ala Ser Gly Thr His pro Ala Pro Ala Leu Ala Cys Ala Glu35 40 45Leu Arg Ala Ala Gly Gly Asp Leu Asp Ala Leu Ala Gly Pro Ala Asp50 55 60Thr Val Cys Thr Lya Gln Tyr Ala Pro Val Val Ils Thr Val Asp Gly55 70 75 80Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Sar Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Asn Gly85 90 95Cys Val Lys Asn Ala Ser Gly Ser Ser Val Phe Ala Phe100 105<210>6<211>107<212>PRT<213>遠青鏈霉菌(streptomyces azureus)<400>6Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala1 5 10 15Ala Ala Ala Thr Pro Glu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Arg20 25 30Pro Ser Gly Thr His Pro Val Ala Gly Ser Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Gly Val Gly Gly Asp Val His Ala Leu Thr Ala Thr Asp Gly Val Met50 55 60Cys Thr Lys Gln Tyr Asp Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Arg Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ser Asn Glu Cys Val85 90 95Lys Asn Ala Tyr Gly Ser Gly Val Phe Ala Phe100 105<210>7<211>110<212>PRT<213>淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)<400>7Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu1 5 10 15Ser Ala Ala Thr Ala Ala Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala20 25 30Pro Thr Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Glu35 40 45Leu Arg Ala Ala His Gly Asp Pro Ser Ala Leu Ala Ala Glu Asp Ser50 55 60Val Met Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly65 70 75 80Val Trp Gln Gly Arg Arg Leu ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Aan Glu85 90 95Cys Val Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Thr Phe Glu100 105 110<210>8<211>110<212>PRT<213>長孢鏈霉菌(streptomyces longisporus)<400>8Ala Ser Leu Tyr Ala Pro SerA la Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly1 5 10 15Thr Ser Ala Ala Ala Ala Thr Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Asn Cys20 25 30Ala Pro Thr Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Pro Ala Leu Ala Cys Ala35 40 45Asp Leu Arg Gly Val Gly Gly Asp Ile Asp Ala Leu Lys Ala Arg Asp50 55 60Gly Val Ile Cys Asn Lys Leu Tyr Asp Pro Val Va1 Val Thr Val Asp65 70 75 80Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Gly Asn85 90 95Glu Cys Val Lys Asn Ser Tyr Gly Thr Ser Leu Phe Ala PRe100 105 110<210>9<211>113<212>PRT<213>微小鏈霉菌(streptomyces parvulus)<400>9Thr Ala Pro Ala Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Ile1 5 10 15Gly Gln Gly Glu Ser Ala Ala Ala Thr Ser Pro Leu Arg Ala Val Thr20 25 30Leu Thr Cys Ala Pro Lys Ala Thr Gly Thr His Pro Ala Ala Asp Ala35 40 45Ala Cys Ala Glu Leu Arg Arg Ala Gly Gly Asp Phe Asp Ala Leu Ser50 55 60Ala Ala Asp Gly Val Met Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val65 70 75 80Thr Val Asp Gly Val Trp Gln Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Glu Arg Thr65 90 95Phe Ala Asn Glu Cys Val Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val phe Thr100 105 110Phe<210>10<211>107<212>PRT<213>天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)<400>10Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu Ser Ala1 5 10 15Ala Thr Ala Ala Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Thr20 25 30Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Asp Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Ala Ala His Gly Asp Pro Ser Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Val Met50 55 60Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Asn Glu Cys Val85 90 95Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Thr Phe100 105<210>11<211>116<212>PRT<213>淺紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)<400>11Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val1 5 10 15Leu Thr Ile Gly His Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Thr Pro Glu Arg20 25 30Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Thr Ser Ser Gly Thr His Pro Ala35 40 45Ala Ser Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg Gly Val Gly Gly Asp Phe Ala50 55 60Ala Leu Lys Ala Arg Asp Asp Val Trp Cys Asn Lys Leu Tyr Asp Pro65 70 75 80Val Val Val Thr Ala Gln Gly Val Trp Gln Gly Gln Arg Val Ser Tyr85 90 95Glu Arg Thr Phe Gly Asn Ser Cys Glu Arg Asp Ala Val Gly Gly Ser100 105 110Leu Phe Ala Phe115<210>12<211>109<212>PRT<213>抗解纖維鏈霉菌(streptomyces antifibrinolyticus)<400>12Gly Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Met Gly His Gly Asn1 5 10 15Ser Ala Ala Thr Val Asn Pro Glu Arg Ala Val Thr Leu Asn Cys Ala20 25 30Pro Thr Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Leu Gln Ala Cys Ala Glu35 40 45Leu Arg Gly Ala Gly Gly Asp Phe Asp Ala Leu Thr Val Arg Gly Asp50 55 60Val Ala Cys Thr Lys Gln Phe Asp Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly65 70 75 80Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Pha Ala Asn Glu85 90 95Cys Val Lys Asn Ser Tyr Gly Met Thr Val Phe Thr Phe100 105<210>13<211>107<212>PRT<213>淺青紫鏈霉菌(streptomyces lividans)<400>13Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu Ser Ala1 5 l0 15Ala Thr Ala Ala Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Thr20 25 30Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Ala Ala His Gly Asp Pro Ser Ala Leu Ala Ala Glu Asp Ser Val Met50 55 60Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Asn Glu Cys Val85 90 95Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Thr Phe100 105<210>14<211>110<212>PRT<213>肉桂型肉桂鏈輪絲菌(streptoverticillium cinnamoneum)<400>14Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Ile Gly Gln Gly Asp1 5 10 15Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ile Gln Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Met20 25 30Pro Lys Ala Asp Gly Thr His Pro Asn Thr Arg Gly Ala Cys Ala Gln35 40 45Leu Arg Leu Ala Gly Gly Asp Phe Glu Lys Val Thr Lys Ile Lys Glu50 55 60Gly Thr Ala Cys Thr Arg Glu Trp Asn Pro Ser Val Val Thr Ala Glu65 70 75 80Gly Val Trp Glu Gly Arg Arg Val Ser Phe Glu Arg Thr Phe Ala Asn85 90 95Pro Cya Glu Leu Lys Ala gly Lys Gly Thr Val Phe Glu Phe100 105 110<210>15<211>110<212>PRT<213>可可鏈霉菌(streptomyces cacaoi)<400>15Ser Lsu Tyr Ala Pro Ser Ala Val Val Ile Ser Lys Thr Gln Gly Ala1 5 10 15Ser Ala Asp Ala Pro Ala Gln Arg Ala Val Thr Leu Arg Cys Leu pro20 25 30Val Gly Gly Asp His Pro Ala Pro Glu Lys Ala Cys Ala Ala Leu Arg35 40 45Glu Ala Gly Gly Asp Pro Ala Ala Leu Pro Arg Tyr Val Glu Asp Thr50 55 60Gly Arg Val Cys Thr Arg Glu Tyr Arg Pro Val Thr Val Ser Val Gln65 70 75 80Gly Val Trp Asp Gly Arg Arg Ile Asp His Ala Gln Thr Phe Ser Asn85 90 95Ser Cys Glu Leu Glu Lys Gln Thr Ala Ser Val Tyr Ala Phe100 105 110
權(quán)利要求
1．一種變體，其特征在于一親本氨基酸序列的修飾氨基酸序列，其中修飾氨基酸序列的特征在于在相對應(yīng)于SSI的63位上的一個氨基酸替換，其中親本氨基酸序列選自由SSI、SSI樣抑制劑、SSI變體和SSI樣抑制劑變體組成的群體。
2．權(quán)利要求1的變體，其中在相對應(yīng)于SSI的63位上的氨基酸替換用異亮氨酸進行。
3．上述任一權(quán)利要求的變體，其中親本氨基酸序列選自由SSI和SSI變體組成的群體。
4．上述任一權(quán)利要求的變體，其表現(xiàn)出的Ki可使變體(a)在含變體和蛋白酶的組合物中抑制蛋白酶；并且(b)在稀釋后同蛋白酶解離。
5．上述任一權(quán)利要求的變體，其表現(xiàn)出的KI在約10-12M到約10-4M。
6．上述任一權(quán)利要求的變體，它選自由以下組成的群體(a)L63I+D83C；(b)L63I+M73D；(c)L63I+M73D+D83C；(d)L63I+M73P+D83C；(e)L63I+M70Q+D83C；(f)L63I+M70Q+M73P+V74F+Dg3C；(g)L63I+M70Q+M73P+V74W+D83C；(h)L63I+M70Q+M73P+D83C+S98A；(i)L63I+G47D+M73P+V74F+D83C；(j)L63I+G47D+M73P+V74W+D83C；(k)L63I+G47D+M73P+D83C+S98A；(l)L63I+G47D+M70Q+M73P+V74F+D83C；(m)L63I+G47D+M70Q+M73P+V74W+D83C；(n)L63I+G47D+M73P+V74F+D83C+S98A；(o)L63I+G47D+M73P+V74W+D83C+S98A；(p)A62*+L63I+D83C；(q)A62*+L63I+M73D；(r)A62*+L63I+M73D+D83C；(s)A62*+L63I+M73P+D83C；(t)A62*+L63I+M70Q+D83C；(u)A62*+L63I+M73P+D83C+S98A；(v)A62*+L63I+M73P+Y75A+D83C；(w)A62*+L63I+M73P+D83C+S98V；(x)A62*+L63I+M70Q+M73P+D83C；(y)A62*+L63I+M73P+V74A+D83C；(z)A62*+L63I+M73P+V74F+D83C；(aa)A62*+L63I+M70Q+D83C+S98A；(bb)A62*+L63I+G47D+M70Q+D83C；(cc)A62*+L63I+G47D+D83C+S98A；(dd)A62*+L63I+G47D+M73P+D83C；(ee)A62*+L63I+G47D+M73D+D83C；(ff)A62*+L63I+M70Q+M73P+V74F+D83C；(gg)A62*+L63I+M70Q+M73P+V74W+D83C；(hh)A62*+L63I+M70Q+M73P+D83C+S98A；(ii)A62*+L63I+G47D+M73P+V74F+D83C；(jj)A62*+L63I+G47D+M73P+V74W+D83C；(kk)A62*+L63I+G47D+M73P+D83C+S98A；(ll)A62*+L63I+G47D+M70Q+M73P+V74F+D83C；(mm)A62*+L63I+G47D+M70Q+M73P+V74W+D83C；(nn)A62*+L63I+G47D+M73P+V74F+D83C+S98A；(oo)A62*+L63I+G47D+M73P+V74W+D83C+S98A；(pp)L63I+A62K+S98Q；(qq)L63I+A62K+S98D；(rr)L63I+A62K+S98E；(ss)L63I+A62R+S98Q；(tt)L63I+A62R+S98D；(uu)L63I+A62R+S98E；(vv)L63I+S98A；(ww)L63I+M73P+D83C+S98D；(xx)L63I+M73P+D83C+S98E；(yy)L63I+M73P+S98D；(zz)L63I+M73P+S98E；(aaa)L63I+M73P+S98A；(bbb)A62K+L63I+M73P+D83C+S98D；(ccc)A62R+L63I+M73P+D83C+S98D；(ddd)A62K+L63I+M73P+D83C+S98E；(eee)A62R+L63I+M73P+D83C+S98E；(fff)A62K+L63I+M73P+S98A；(ggg)A62R+L63I+M73P+S98A；(hhh)L63I+G47D+M73P+D83C+S98D；(iii)L63I+G47D+M73P+D83C+S98E；and(jjj)L63I+M73P.
7．上述任一權(quán)利要求的變體，它選自由以下組成的群體(a)A62K+L63I+M73P+D83C+S98Q；(b)A62K+L63I+M73P+D83C+S98D；(c)A62K+L63I+M73P+D83C+S98E；(d)A62K+L63I+S98Q；(e)A62K+L63I+S98D；(f)A62K+L63I+S98E；(g)A62R+L63I+M73P+D83C+S98Q；(h)A62R+L63I+M73P+D83C+S98D；(i)A62R+L63I+M73P+D83C+S98E；(j)L63I+M73P+D83C+S98A.(k)A62R+L63I+S98Q；(l)A62R+L63I+S98D；(m)A62R+L63I+S98E；(n)L63I+S98A；(o)A62K+L63I+M73P+D83C+S98D；(p)A62R+L63I+M73P+D83C+S98D；(q)A62K+L63I+M73P+D83C+S98E；(r)A62R+L63I+M73P+D83C+S98E；(s)A62K+L63I+M73P+S98A；and(t)A62R+L63I+M73P+S98A.
8．編碼上述任一權(quán)利要求的變體的突變基因。
9．一種組合物，它含有上述任一權(quán)利要求的變體以及一種載體，該載體選自由清潔組合物載體和個人衛(wèi)生組合物載體組成的群體。
10．權(quán)利要求9的一種組合物，其中變體同蛋白酶的比例在在約3∶1到約1∶1之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及枯草桿菌蛋白酶抑制劑(SSI)的變體和與SSI有同源性的抑制劑。這些變體可與酶,特別是蛋白酶合用于清潔組合物及個人衛(wèi)生組合物。變體包含對應(yīng)于SSI的63位上的氨基酸替換。這些變體在清潔組合物及個人衛(wèi)生組合物中提供更高的蛋白水解酶穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的變體及編碼這些變體的基因的清潔組合物及個人衛(wèi)生組合物。
文檔編號C11D3/26GK1316000SQ99810458
公開日2001年10月3日 申請日期1999年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月26日
發(fā)明者C·W·桑德斯, P·E·科雷, Y·孫, M·D·保爾, D·N·盧兵 申請人:寶潔公司