專利名稱：在活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)具有額外氨基酸殘基的i－s1和i－s2亞族枯草桿菌酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在第95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)的98位具有至少一個(gè)額外氨基酸殘基的新的I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酶(subtilase)。當(dāng)用于洗滌劑、清潔和洗滌劑組合物中時(shí)，這些蛋白酶是有用的，表現(xiàn)出優(yōu)異的或改進(jìn)的洗滌性能。本發(fā)明還涉及編碼用于所述酶表達(dá)的基因，當(dāng)被插入到合適的宿主細(xì)胞或微生物中時(shí)表達(dá)所述酶。本發(fā)明還涉及用此基因轉(zhuǎn)化的能夠表達(dá)所述酶變體的宿主細(xì)胞，以及制備這些新酶的方法。
背景技術(shù)：
在洗滌劑工業(yè)中，酶被用于洗滌制劑已有30多年的歷史。在這些制劑中使用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、以及其它的酶，或它們的混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。
大量增加的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程變體，例如，DURAZYM_(Novo Nordisk A/S)，RELASE_(Novo Nordisk A/s)，MAXAPEM_(Gist-Brocades N.V.)，PURAFECT_(Genencor International，Inc.)。
而且，許多蛋白酶變體在本領(lǐng)域中已有描述，例如EP130756(GENENTECH)(相應(yīng)于美國(guó)再頒專利34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985)自然318 375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)193803-813；Russel和Fersht自然328 496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO95/30011(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAYS.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(NOVO NORDISK A/S)；WO91/00345(NOVO NORDISK A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)；以及WO94/02618(GIST-BROCADES N.V.)。
然而，盡管已有大量有用蛋白酶變體的描述，但對(duì)于許多工業(yè)應(yīng)用，仍需求新的改進(jìn)蛋白酶或蛋白酶變體。
因此，本發(fā)明的目的是提供特別是用于洗滌劑工業(yè)的改進(jìn)蛋白酶或蛋白質(zhì)工程化蛋白酶變體。
發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其至少一個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)長(zhǎng)于目前已知的活性位點(diǎn)環(huán)的枯草桿菌蛋白酶在洗滌劑組合物中表現(xiàn)出改進(jìn)的洗滌性能。我們?cè)跇?gòu)建與其親本野生型酶相比在洗滌劑組合物中表現(xiàn)出改進(jìn)的洗滌性能的枯草桿菌蛋白酶變體，尤其是枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI或Savinase_)的變體的過程中對(duì)此進(jìn)行了鑒定。這已在我們的早期申請(qǐng)DK1332/97中描述過。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，在第95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)的98位(或更確切地在第98-99位之間)具有至少一個(gè)額外氨基酸殘基的I-S1(真正的“枯草桿菌蛋白酶”)和I-S2(高堿性枯草桿菌蛋白酶)亞族某些枯草桿菌酶或其變體，與目前已知的以及在所述申請(qǐng)中描述的那些相比，顯示出令人吃驚的改進(jìn)的洗滌能力。
根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)蛋白酶可以通過從自然資源分離獲得，或通過在野生型枯草桿菌蛋白酶的活性位點(diǎn)環(huán)(b)第98和第99位之間導(dǎo)入至少一個(gè)額外的氨基酸殘基(一個(gè)插入)來獲得(對(duì)活性位點(diǎn)環(huán)的定義和位置的編號(hào)見下)。
盡管此發(fā)現(xiàn)是在枯草桿菌蛋白酶309中獲得的，但我們預(yù)測(cè)產(chǎn)生或分離同樣有利的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體是可能的。
而且可能特異地對(duì)自然分離物進(jìn)行篩選，以鑒定含有比已知野生型枯草桿菌酶例如枯草桿菌蛋白酶309的相應(yīng)活性位點(diǎn)環(huán)長(zhǎng)的活性位點(diǎn)環(huán)(b)的新野生型枯草桿菌酶，這種枯草桿菌酶可被認(rèn)為在第98-99位之間有一個(gè)插入氨基酸殘基，而且與關(guān)系最近的已知枯草桿菌蛋白酶例如枯草桿菌蛋白酶309相比，其在洗滌劑中表現(xiàn)出優(yōu)異的洗滌能力。
關(guān)于比對(duì)和編號(hào)，參考下

圖1，1a，2和2a，這些圖顯示了枯草桿菌蛋白酶BPN’(BASBPN)(a)和枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI)(b)之間的比對(duì)，以及枯草桿菌蛋白酶BPN’(a)(BASBPN)和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(g)之間的比對(duì)。圖1和2中的比對(duì)是通過使用GCG軟件包的GAP程序按下文指示的方法確立的，而圖1a和2a中的比對(duì)與WO91/00345中所顯示的相同。在本專利申請(qǐng)中這些比對(duì)被用作殘基編號(hào)的參考。
7個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)(a)-(g)(包括所指出的兩個(gè)末端氨基酸殘基)在此定義為包括下面所給片段中的氨基酸殘基(a)第33和43位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(b)第95和103位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(c)第125和132氨基酸殘基之間的區(qū)域；(d)第153和173氨基酸殘基之間的區(qū)域；(e)第181和195位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(f)第202和204位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(g)第218和219位氨基酸殘基之間的區(qū)域。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及在第95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)的98位具有至少一個(gè)額外氨基酸殘基的分離的(即，純度大于10％的)I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酶，由此所述額外氨基酸殘基相應(yīng)于在第98和99位之間至少一個(gè)氨基酸殘基的插入。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離的DNA序列。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及含有編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及用第四方面的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個(gè)方面涉及本發(fā)明枯草桿菌蛋白酶的制備。
本發(fā)明的酶通?？梢酝ㄟ^如下方式產(chǎn)生培養(yǎng)微生物菌株，從中分離該酶，并以大體上純的形式回收該酶；或?qū)⒈景l(fā)明第四方面的表達(dá)載體插入合適的微生物宿主中，培養(yǎng)該宿主以表達(dá)目的枯草桿菌酶，并回收該酶產(chǎn)物。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的組合物。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及本發(fā)明的酶在許多工業(yè)相關(guān)用途中，尤其是在清潔劑組合物中的應(yīng)用，以及在含有該突變酶的清潔劑組合物，特別是含有該突變枯草桿菌蛋白酶的洗滌劑組合物中的應(yīng)用。定義在更為詳細(xì)地論述本發(fā)明之前，將首先定義下面的術(shù)語和約定。氨基酸命名A＝Ala＝丙氨酸V＝Val＝纈氨酸L＝Leu＝亮氨酸I＝Ile＝異亮氨酸P＝Pro＝脯氨酸F＝Phe＝苯丙氨酸W＝Trp＝色氨酸M＝Met＝甲硫氨酸G＝Gly＝甘氨酸S＝Ser＝絲氨酸T＝Thr＝蘇氨酸C＝Cys＝半胱氨酸Y＝Tyr＝酪氨酸N＝Asn＝天冬酰胺Q＝Gln＝谷氨酰胺D＝Asp＝天冬氨酸E＝Glu＝谷氨酸K＝Lys＝賴氨酸R＝Arg＝精氨酸H＝His＝組氨酸X＝Xaa＝任意氨基酸核酸命名A＝腺嘌呤G＝鳥嘌呤C＝胞嘧啶T＝胸腺嘧啶(僅在DNA中)U＝尿嘧啶(僅在RNA中)變體名稱的命名原則和約定在描述根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生或設(shè)想的各種酶變體時(shí)，為了便于提及，采用下述命名原則和約定首先通過分離的或親本野生型酶與枯草桿菌蛋白酶BPN’(BASBPN)之間的比對(duì)，定義參照框架。
為了給變體編號(hào)，可以通過9.1版本GCG軟件包的GAP程序利用下述參數(shù)獲得該比對(duì)斷缺區(qū)產(chǎn)生罰分(gap creation penalty)＝8和斷缺區(qū)延伸罰分(gap extension penalty)＝8，而所有其它參數(shù)保留其默認(rèn)值。
另一種方法是利用枯草桿菌酶之間的已知公認(rèn)比對(duì)，例如描述于WO91/00345中的比對(duì)。在大多數(shù)情況下，這些差異并不是重要的。
枯草桿菌蛋白酶BPN’(BASBPN)和枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI)以及和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(BLSCAR)之間的比對(duì)，分別顯示在圖1，1a，2，和2a中。通過此比對(duì)，可以參照BASBPN對(duì)許多缺失和插入進(jìn)行定義。在圖1中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶309在第36、58、158、162、163以及164位具有6個(gè)缺失，而在圖1a中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶309在第36、56、159、164、165以及166位具有同樣的缺失。在圖2中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg在第58位具有一個(gè)缺失，而在圖2a中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg在第56位有一個(gè)缺失。這些缺失在圖1，1a，2，2a中通過星號(hào)(*)標(biāo)明。
在野生型酶中進(jìn)行的各種修飾通常使用下面三個(gè)要素來表示原始氨基酸位置替代氨基酸因此符號(hào)G195E是指第195位的甘氨酸被谷氨酸所替代。
在原始氨基酸殘基可以是任意氨基酸殘基的情況下，有時(shí)可以使用僅指示位置和替代氨基酸的簡(jiǎn)寫符號(hào)，位置替代氨基酸關(guān)于同源枯草桿菌酶中的修飾，此種符號(hào)尤其恰當(dāng)(見下文)。
同樣，當(dāng)替代氨基酸殘基的身份不重要時(shí)，可以使用原始氨基酸位置當(dāng)原始氨基酸和替代氨基酸均可以包含任意氨基酸時(shí)，則僅指明位置，例如170。
當(dāng)原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一種以上但又并非所有氨基酸時(shí)，則在括號(hào){ }中指出選擇的氨基酸，原始氨基酸位置{替代氨基酸1，....，替代的氨基酸n}對(duì)于具體變體，使用具體的三字母或一字母代碼，包括指示任意氨基酸殘基的代碼Xaa和X。替代谷氨酸在第195位替代甘氨酸命名為Gly195Glu或G195E或任意氨基酸在第195位替代甘氨酸命名為Gly195Xaa或G195X或Gly195或G195因此，絲氨酸在第170位替代任意氨基酸殘基將命名為Xaa170Ser或X170S或170Ser或170S關(guān)于同源枯草桿菌酶中的改變，該符號(hào)尤其適合(見下文)。因此170Ser意味著包含例如BASBPN中的Lys170Ser改變和BLSAVI中的Arg170Ser改變(參見圖1)。
對(duì)于原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一種以上但又并非所有氨基酸的改變，甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸在第170位替代精氨酸可以通過Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}來表示，以指示變體R170G、R170A、R170S和R170T。缺失第195位甘氨酸的缺失將表示為Gly195*或G195*相應(yīng)地，一個(gè)以上氨基酸殘基的缺失，例如第195位甘氨酸和196位亮氨酸缺失將表示為Gly195*+Leu196*或G195*+L196*插入額外氨基酸殘基的插入，例如賴氨酸在G195位之后的插入表示為Gly195GlyLys或G195GK；或當(dāng)插入不止一個(gè)氨基酸殘基時(shí)，例如在G195之后插入一個(gè)賴氨酸，丙氨酸和絲氨酸時(shí)，這表示為Gly195GlyLysAlaSer或G195GKAS在這種情況下，通過在插入氨基酸殘基之前的氨基酸殘基位置數(shù)后加上小寫字母來編號(hào)該插入的氨基酸殘基。上述例子中的第194-196位序列將因此被表示為
194 195 196BLSAVI A - G - L194 195 195a 195b 195c 196變體A- G- K-A-S-L在插入與已有氨基酸殘基相同的氨基酸殘基時(shí)，很顯然在命名中產(chǎn)生了簡(jiǎn)并性。例如在上述例子的甘氨酸之后插入一個(gè)甘氨酸，則表示為G195GG。而對(duì)于從194 195 196BLSAVIA-G- L到194 195 195a 196變體 A-G- G- L194 194a 195196的改變，實(shí)際上相同的變化同樣可以表示為A194AG。
這些情況對(duì)于技術(shù)人員來說是顯而易見的，因此表示式G195GG和針對(duì)該類型插入的相應(yīng)表示式旨在包括這種等同簡(jiǎn)并表示式。缺口填充當(dāng)與用于編號(hào)的枯草桿菌蛋白酶BPN’序列進(jìn)行的參照比較中，一個(gè)酶中存在缺失時(shí)，在該位置的插入例如第36位的天冬氨酸插入表示為*36Asp或*36D多重修飾含有多重修飾的變體通過加號(hào)分開，例如Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E表示在第170位和195位用酪氨酸和谷氨酸分別替代精氨酸和甘氨酸的修飾?；蚶鏣yr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示變體Tyr167Gly+Arg170Gly，Tyr167Gly+Arg170Ala，Tyr167Gly+Arg170Ser，Tyr167Gly+Arg170Thr，Tyr167Ala+Arg170Gly，Tyr167Ala+Arg170Ala，Tyr167Ala+Arg170ser，Tyr167Ala+Arg170Thr，Tyr167Ser+Arg170Gly，Tyr167Ser+Arg170Ala，Tyr167Ser+Arg170Ser，Tyr167Ser+Arg170Thr，Tyr167Thr+Arg170Gly，Tyr167Thr+Arg170Ala，Tyr167Thr+Arg170Ser，和Tyr167Thr+Arg170Thr。
當(dāng)涉及到對(duì)具有特定共性的氨基酸殘基例如帶正電荷的殘基(K，R，H)，帶負(fù)電荷的殘基(D，E)進(jìn)行替代、置換、插入或缺失修飾時(shí)，或涉及到保守氨基酸修飾例如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}時(shí)，這種命名原則尤其恰當(dāng)。具體參見“發(fā)明詳述”部分。蛋白酶裂解蛋白質(zhì)底物中酰胺鍵的酶被歸為蛋白酶，或(可互換使用的)肽酶(參見Walsh，1979，酶反應(yīng)原理(Enzymatic Reaction Mechanisms)，W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。氨基酸位置/殘基的編號(hào)如沒有另外提及，本文所用的氨基酸編號(hào)對(duì)應(yīng)于枯草桿菌酶BPN’(BASBPN)序列的編號(hào)。BPN’序列的進(jìn)一步描述參見圖1和2，或Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點(diǎn)含有一個(gè)必需絲氨酸殘基(White，Handler和Smith，1973“生物化學(xué)原理(Principles of Biochemistry)”，第五版，McGraw-Hill Book Company，NY，第271-272頁)。
細(xì)菌絲氨酸蛋白酶具有20,000到45,000道爾頓的分子量。其被二異丙基氟磷酸抑制。它們水解簡(jiǎn)單末端酯并且在活性上相似于同樣是絲氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。更為狹窄的術(shù)語，堿性蛋白酶，其包括一個(gè)亞族，反映了一些絲氨酸蛋白酶的高最適pH值，從pH9.0到11.0(綜述參見Priest(1977)Bacteriological Rev.41 711-753)?？莶輻U菌酶Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523提議將絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞族暫稱為枯草桿菌酶(subtilase)。通過對(duì)170多個(gè)先前被稱作枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列同源分析，定義了這些酶?？莶輻U菌蛋白酶以前常常被解釋為由革蘭氏陽性菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人的提議其是枯草桿菌酶的一個(gè)亞族。各種各樣的枯草桿菌酶已獲得鑒定，而且許多枯草桿菌酶的氨基酸序列已被測(cè)定。對(duì)于這些枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更具體描述，參考Siezen等(1997)。
枯草桿菌酶的一個(gè)亞族，I-S1或“真枯草桿菌蛋白酶”，包含“經(jīng)典的”枯草桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168)，枯草桿菌蛋白酶BPN’，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE_，NOVO NORDISK A/S)，以及枯草桿菌蛋白酶DY(BSSDY)。
Siezen等(上文)識(shí)別了枯草桿菌酶的另一個(gè)亞族，I-S2或高堿性枯草桿菌蛋白酶。I-S2蛋白酶亞族被描述為高堿性枯草桿菌蛋白酶，其包括酶例如枯草桿菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL_Gist-BrocadesNV)，枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE_，NOVO NORDISK A/S)，枯草桿菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE_，NOVO NORDISK A/S)，以及堿性彈性蛋白酶YaB(BSEYAB)?？莶輻U菌酶的首字母縮寫列表I-S1枯草桿菌蛋白酶168，BSS168(BSSAS(枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus)，BSAPRJ(枯草桿菌蛋白酶J)，BSAPRN(枯草桿菌蛋白酶NAT)，BMSAMP(腸系膜肽酶(Mesentericopeptidase))，枯草桿菌蛋白酶BPN’，BASBPN，枯草桿菌蛋白酶DY，BSSDY，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，BLSCAR(BLKERA(角蛋白酶)，BLSCA1，BLSCA2，BLSCA3)，BSSPRC，絲氨酸蛋白酶CBSSPRD，絲氨酸蛋白酶DI-S2枯草桿菌蛋白酶Sendai，BSAPRS枯草桿菌蛋白酶ALP 1，BSAPRQ，枯草桿菌蛋白酶147，Esperase_BLS147(BSAPRM(SubtilisinAprM)，BAH101)，枯草桿菌蛋白酶309，Savinase_，BLS309/BLSAVI(BSKSMK(M-蛋白酶)，BAALKP(枯草桿菌蛋白酶PB92，嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalkalophilic)堿性蛋白酶)，BLSUBL(枯草桿菌蛋白酶BL))，堿性彈性蛋白酶YaB，BYSYAB，“SAVINASE_”SAVINASE_由NOVO NORDISK A/S銷售。其是來自遲緩芽孢桿菌(B.Lentus)的枯草桿菌蛋白酶309，而且其僅在一個(gè)位置上不同于BAALKP(N87S，參見本文圖1)。SAVINASE_具有在圖1中稱為b)的氨基酸序列。親本枯草桿菌酶術(shù)語“親本枯草桿菌酶”描述了一種根據(jù)Siezen等人(1991和1997)定義的枯草桿菌酶。更詳細(xì)的參見剛才上面的“枯草桿菌酶”描述。親本枯草桿菌酶也可以是從自然來源分離的枯草桿菌酶，其中在保留枯草桿菌酶特性的同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行隨后的修飾?；蛘?，術(shù)語“親本枯草桿菌酶”可以被稱為“野生型枯草桿菌酶”?？莶輻U菌酶變體的修飾本文所用術(shù)語“修飾”被定義為包括枯草桿菌酶的化學(xué)修飾以及編碼枯草桿菌酶的DNA的遺傳操作。修飾可以是在目的氨基酸中或處的氨基酸側(cè)鏈置換、氨基酸替代、缺失和/或插入?？莶輻U菌酶變體在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語枯草桿菌酶變體和突變的枯草桿菌酶是指由表達(dá)突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該生物體來源于含有原始或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本生物體，為了產(chǎn)生當(dāng)在合適宿主中表達(dá)時(shí)生產(chǎn)所述突變枯草桿菌酶蛋白酶的突變基因，對(duì)該親本基因進(jìn)行了突變。同源枯草桿菌酶序列為了修飾以獲得本發(fā)明枯草桿菌酶變體，對(duì)SAVINASE_枯草桿菌酶的特異活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)和所述環(huán)中的氨基酸插入進(jìn)行了鑒定。
然而，本發(fā)明并不限于這種特殊枯草桿菌酶的修飾，而是擴(kuò)展到與SAVINASE_具有同源一級(jí)結(jié)構(gòu)的其它親本(野生型)枯草桿菌酶。兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性在本發(fā)明中用“一致性”參數(shù)來描述。
為了確定兩個(gè)枯草桿菌酶的一致性程度，可以應(yīng)用9.1版本GCG軟件包的GAP程序(下文)以及同上的設(shè)置參數(shù)。除了氨基酸比對(duì)外，該程序還輸出兩個(gè)序列之間的“一致性百分?jǐn)?shù)”計(jì)算結(jié)果。
基于此描述，鑒定可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾的合適同源枯草桿菌酶和相應(yīng)的同源活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是常規(guī)的。洗滌性能在例如洗滌或硬表面清洗過程中，酶催化降解存在于待清潔物品上的各種天然存在底物的能力通常被稱為洗滌能力，洗滌力，去垢力或洗滌性能。在本申請(qǐng)中術(shù)語洗滌性能用于包括該性質(zhì)。分離的DNA序列術(shù)語“分離的”，當(dāng)用于DNA序列分子時(shí)，表示該DNA序列已從其天然的遺傳環(huán)境中分離出來，因此不含有其它無關(guān)或不需要的編碼序列，而且其形式適用于遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。該分離的分子是指那些從其自然環(huán)境中分離的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含有通常與之相關(guān)的其它基因，但可以包括自然存在的5’和3’非翻譯區(qū)例如啟動(dòng)子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是容易的(參見例如，Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。術(shù)語“分離的DNA序列”也可以被稱作“克隆的DNA序列”。分離的蛋白質(zhì)當(dāng)應(yīng)用于蛋白時(shí)，術(shù)語“分離的”是指該蛋白已從其天然環(huán)境中分離出來。
在一種優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質(zhì)相當(dāng)大程度上不含有其它蛋白，特別是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(參見下述))。
通過SDS-PAGE檢測(cè)，分離的蛋白質(zhì)具有大于10％的純度，優(yōu)選大于20％的純度，更優(yōu)選大于30％的純度。進(jìn)一步優(yōu)選提供高純度形式的蛋白質(zhì)，即通過SDS-PAGE檢測(cè)，其純度大于40％，大于60％，大于80％，更優(yōu)選大于95％，甚至更優(yōu)選大于99％的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”也可以被稱為“純化的蛋白質(zhì)”。同源雜質(zhì)術(shù)語“同源雜質(zhì)”是指來源于最初從其中獲得本發(fā)明多肽的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如非本發(fā)明多肽的另一種多肽)。獲自與特定微生物來源相連的術(shù)語“獲自”，在本文中是指由該特定來源產(chǎn)生的，或由其中插入了該來源基因的細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽。底物與蛋白酶底物相關(guān)的術(shù)語“底物”，應(yīng)以其最廣泛形式解釋為包含含有至少一個(gè)易受枯草桿菌酶水解的肽鍵的化合物。產(chǎn)物與蛋白酶酶解反應(yīng)得到的產(chǎn)物相關(guān)的術(shù)語“產(chǎn)物”，在本發(fā)明的上下文中應(yīng)解釋為包括涉及枯草桿菌酶蛋白酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可以是隨后水解反應(yīng)中的底物。
附圖簡(jiǎn)要說明圖1顯示了使用上述GAP程序在枯草桿菌蛋白酶BPN’(a)和Savinase_(b)之間進(jìn)行的比對(duì)。
圖1a顯示了從WO 91/00345獲得的枯草桿菌蛋白酶BPN’和Savinase_之間的比對(duì)。
圖2顯示了使用上述GAP程序在枯草桿菌蛋白酶BPN’和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg之間進(jìn)行的比對(duì)。
圖2a顯示了從WO 91/00345獲得的枯草桿菌蛋白酶BPN’和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg之間的比對(duì)。
圖3顯示了Savinase的三維結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)錄入號(hào)1SVN)。圖中標(biāo)明了活性位點(diǎn)環(huán)(b)。
發(fā)明詳述在第一個(gè)方面，本發(fā)明的枯草桿菌酶涉及在第95到103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中98位具有至少一個(gè)額外氨基酸殘基的分離(即純度大于10％的)I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酶，由此所述額外氨基酸殘基相應(yīng)于在第98-99位之間至少一個(gè)氨基酸殘基的插入。
換句話說，本發(fā)明枯草桿菌酶的特征在于含有一個(gè)多于9個(gè)氨基酸殘基的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)，而且其中與親本或已知野生型枯草桿菌酶比較，該額外氨基酸被認(rèn)為是，或可以被認(rèn)為是在第98位和99位之間插入的。
本發(fā)明第一個(gè)方面的枯草桿菌酶可以是從自然環(huán)境鑒定和分離的親本或野生型枯草桿菌酶。
這種親本野生型枯草桿菌酶可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行特異篩選。
進(jìn)行此篩選的一個(gè)優(yōu)選方法是從多種不同微生物，優(yōu)選不同的芽胞桿菌菌株，特異PCR擴(kuò)增已知編碼枯草桿菌酶活性位點(diǎn)環(huán)的DNA區(qū)。
從其DNA和氨基酸序列同源的意義上而言，枯草桿菌酶是一族保守酶。因此，在活性位點(diǎn)環(huán)兩側(cè)構(gòu)建相對(duì)特異的引物是可能的。
進(jìn)行此操作的一個(gè)方法是研究不同枯草桿菌酶之間的比對(duì)(參見，例如Siezen等.蛋白質(zhì)科學(xué)6(1997)501-523)。從此常規(guī)工作，本領(lǐng)域技術(shù)人員即可構(gòu)建位于活性位點(diǎn)環(huán)兩側(cè)的PCR引物，其中所述活性位點(diǎn)環(huán)相應(yīng)于I-S1和I-S2族的任意一個(gè)成員例如BLSAVI的第95到103位氨基酸殘基之間的活性位點(diǎn)環(huán)(b)。使用此引物從大量不同微生物優(yōu)選不同芽胞桿菌菌株擴(kuò)增DNA，之后對(duì)所述擴(kuò)增PCR片段進(jìn)行DNA測(cè)序，這樣就可能鑒定出產(chǎn)生與例如BLSAVI相比含有更長(zhǎng)活性位點(diǎn)區(qū)的這些族枯草桿菌酶的菌株，其中所述活性位點(diǎn)區(qū)對(duì)應(yīng)于從第95位至103位的活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)，而且可以認(rèn)為在第98-99位之間存在插入。在鑒定了目的枯草桿菌酶的菌株和部分DNA序列之后，完成本發(fā)明枯草桿菌酶的克隆、表達(dá)和純化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)工作。
然而，可以認(rèn)為本發(fā)明的枯草桿菌酶主要是親本枯草桿菌酶的變體。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的分離枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是一個(gè)與親本酶相比具有更長(zhǎng)活性位點(diǎn)環(huán)(b)的構(gòu)建的變體，其構(gòu)建方式是在第98和99位氨基酸殘基之間插入至少一個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的枯草桿菌酶在洗滌劑中顯示出優(yōu)異的洗滌性能，而且如果該酶是構(gòu)建的變體，則與其關(guān)系最近的枯草桿菌酶例如枯草桿菌蛋白酶309相比，該酶在洗滌劑中具有改進(jìn)的洗滌性能。
不同的枯草桿菌酶在不同類型的洗滌劑組合物中將顯示出不同的洗滌能力。在大多數(shù)不同類型的洗滌劑組合物中，本發(fā)明的枯草桿菌酶與其最近的相關(guān)物相比具有改進(jìn)的洗滌性能。
優(yōu)選地，本發(fā)明的枯草桿菌酶與本文實(shí)施例3的洗滌劑組合物(見下文)中的最近相關(guān)物相比具有改進(jìn)的洗滌能力。
為了確定所給枯草桿菌酶氨基酸序列(無論所述枯草桿菌酶序列是親本野生型枯草桿菌酶序列還是通過定點(diǎn)誘變之外的任何其它方法產(chǎn)生的枯草桿菌酶變體序列)是否屬于本發(fā)明的范圍，可以使用以下程序i) 將所述枯草桿菌酶序列與枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(參見本文的“定義”部分(見上))；ii) 基于步驟i)進(jìn)行的比對(duì)，在所述枯草桿菌酶序列中鑒定對(duì)應(yīng)于枯草桿菌酶BPN’活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)的活性位點(diǎn)環(huán)(b)，其中枯草桿菌酶BPN’的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)包含第95至103位氨基酸殘基(包括兩個(gè)末端氨基酸殘基)之間區(qū)域；iii)確定步驟ii)中鑒定的所述枯草桿菌酶序列中的活性位點(diǎn)環(huán)(b)是否長(zhǎng)于BLSAVI中的相應(yīng)活性位點(diǎn)環(huán)，以及所述延長(zhǎng)部分是否相應(yīng)于在第98和99位之間插入了至少一個(gè)氨基酸殘基。
如果是，則所研究的枯草桿菌酶是本發(fā)明范圍中的枯草桿菌酶。
以上步驟i)中進(jìn)行的比對(duì)是按上述方法通過使用GAP程序完成的。
基于此描述，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，鑒定枯草桿菌酶中的活性位點(diǎn)環(huán)(b)和確定所討論的枯草桿菌酶是否屬于本發(fā)明范圍均是常規(guī)的。如果變體是通過定點(diǎn)誘變構(gòu)建的，則當(dāng)然預(yù)先知道該枯草桿菌酶變體是否屬于本發(fā)明范圍。
本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來構(gòu)建，例如通過定點(diǎn)誘變/隨機(jī)誘變或通過不同枯草桿菌酶序列的DNA改組來構(gòu)建。具體參見本文的″制備枯草桿菌酶變體″部分以及材料和方法(參見下文)。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及1.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)插入氨基酸殘基選自T、G、A和S；2.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)插入氨基酸殘基選自下列帶電荷氨基酸殘基D、E、H、K和R，更優(yōu)選D、E、K和R；3.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)插入氨基酸殘基選自下列親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選N、Q、S和T；4.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)插入氨基酸殘基選自下列小的疏水性氨基酸殘基A、G和V；或5.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)插入氨基酸殘基選自下列大的親水性氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y，更優(yōu)選F、I、L、M和Y；在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中與BLSAVI中的相應(yīng)活性位點(diǎn)環(huán)相比，第98和99位之間的所述插入包含至少兩個(gè)氨基酸。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有至少一個(gè)選自下組的插入的分離枯草桿菌酶(使用BASBPN的編號(hào)方式)X98X{T，G，A，S}X98X{D，E，K，R}X98X{H，V，C，N，Q}X98X{F，I，L，M，P，W，Y}或更為具體地對(duì)于枯草桿菌蛋白酶309和緊密相關(guān)的枯草桿菌酶例如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK而言該插入是A98AAA98ATA98AGA98AS
A98ADA98AEA98AKA98ARA98AHA98AVA98ACA98ANA98AQA98AFA98AIA98ALA98AMA98APA98AWA98AY此外，本發(fā)明還涉及在第98位含有如下多個(gè)插入A98AGSGGA98ATGSGA98AGGGSA98ASGSGA98ATGTGA98ASGTGA98AGGGGA98AGSGG或含有任意如下組合的枯草桿菌酶
A98ATDA98ADTG97D+A98ATG97E+A98ATG97K+A98ATG97N+A98ATG97Q+A98ATG97R+A98ATG97GD+A98ATS87G+A98AGGGSA98AT+S99SDL96LD+A98ATA98AT+Y167AA98AT+R247KA98GP+S99AA98AS+A133E+T143KA98AT+A108C+A138CA98AT+Y167A+R170S+A194PA98GI+S99H+G100S+S101A正如本領(lǐng)域所熟知的，所謂一個(gè)氨基酸殘基對(duì)一個(gè)相似氨基酸殘基的保守替代應(yīng)該對(duì)酶的特性僅產(chǎn)生微小的改變。
下面表III列出了多組保守氨基酸替代表III保守氨基酸替代共有性質(zhì)氨基酸堿性(帶正電荷) K＝賴氨酸H＝組氨酸酸性(帶負(fù)電荷) E＝谷氨酸D＝天冬氨酸極性 Q＝谷氨酰胺N＝天冬酰胺疏水性 L＝亮氨酸I＝異亮氨酸V＝纈氨酸M＝甲硫氨酸芳香族 F＝苯丙氨酸W＝色氨酸Y＝酪氨酸小分子 G＝甘氨酸A＝丙氨酸S＝絲氨酸T＝蘇氨酸基于此原則，含有保守替代例如G97A+A98AS+S99G，G97S+A98AT+S99A的枯草桿菌酶變體應(yīng)該表現(xiàn)出彼此不會(huì)明顯不同的特性。
基于此處公開的和/或示例的枯草桿菌酶變體，為了獲得顯示出相似改進(jìn)洗滌能力的其它枯草桿菌酶變體，鑒定這些變體的合適保守修飾對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是常規(guī)的工作。
根據(jù)本發(fā)明，不論為了從自然或人工產(chǎn)生的多樣性中分離本發(fā)明新酶，還是為了從親本枯草桿菌酶設(shè)計(jì)和產(chǎn)生變體，本發(fā)明的枯草桿菌酶均屬于I-S1和I-S2族，尤其是I-S2亞族。
關(guān)于來自I-S1亞族的變體，優(yōu)選從下組選擇親本枯草桿菌酶BSS168(BSSAS，BSAPRJ，BSAPRN，BMSAMP)，BASBPN，BSSDY，BLSCAR(BLKERA，BLSCA1，BLSCA2，BLSCA3)，BSSPRC和BSSPRD，或者它們的保留了I-S1亞族特性的功能性變體。
關(guān)于來自I-S2亞族的變體，優(yōu)選從下組選擇親本枯草桿菌酶BSAPRQ，BLS147(BSAPRM，BAH101)，BLSAVI(BSKSMK，BAALKP，BLSUBL)，BYSYAB和BSAPRS，或它們的保留了I-S2亞族特性的功能性變體。
所述親本枯草桿菌酶尤其是指BLSAVI(SAVINASE_NOVO NORDISKA/S)，因此本發(fā)明的優(yōu)選枯草桿菌酶變體是SAVINASE_的變體。
本發(fā)明還包括所有組合了任意其它氨基酸序列修飾的上述本發(fā)明枯草桿菌酶。特別是包括與本領(lǐng)域已知其它修飾的組合以提供改進(jìn)的酶性質(zhì)。本領(lǐng)域描述了許多具有不同改良特性的變體，而且在本文的“發(fā)明背景”部分(參見上文)也提及了許多這樣的枯草桿菌酶。在此公開這些參考文獻(xiàn)作為鑒定可以有利地與本發(fā)明枯草桿菌酶變體組合的枯草桿菌酶變體的參考。
這些組合包括第222位(提高氧化穩(wěn)定性)，第218位(提高熱穩(wěn)定性)，在穩(wěn)定該酶的Ca-結(jié)合位點(diǎn)中例如第76位的替代，以及許多現(xiàn)有技術(shù)已知的其它位置。
在其它實(shí)施方案中，可以有利地將本發(fā)明枯草桿菌酶變體與任意下述位置的一個(gè)或更多修飾組合起來27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。
特別是下列BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK和BAALKP的變體被認(rèn)為適用于進(jìn)行組合K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。
而且，包含與上述任意一個(gè)或多個(gè)修飾組合的如下任意變異S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A，或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合的變體表現(xiàn)出改進(jìn)的特性。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與一個(gè)或多個(gè)在任何第129、131、133和194位的修飾組合，這些修飾優(yōu)選129K、131H、133P、133D和194P修飾，且最優(yōu)選P129K、P131H、A133P、A133D和A194P修飾。任何這樣的修飾預(yù)期可以在本發(fā)明枯草桿菌酶變體的生產(chǎn)中提供更高的該變體表達(dá)水平。
因此，本發(fā)明的一個(gè)更進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的變體，其中所述修飾選自下組制備枯草桿菌酶變體用以克隆本發(fā)明枯草桿菌酶以及將插入導(dǎo)入基因(例如枯草桿菌酶基因)的方法是本領(lǐng)域所熟知的，參考在“發(fā)明背景”部分引用的文獻(xiàn)。
通常，為了獲得本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，可以使用用以克隆基因和將(隨機(jī)和/或定點(diǎn))插入導(dǎo)入所述基因的標(biāo)準(zhǔn)程序。對(duì)于適合技術(shù)的進(jìn)一步描述，參見本文實(shí)施例(見下文)和(Sambrook等人。(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA laboratory manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室。冷泉港，NY；Ausubel，F(xiàn).M.等(編)″現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current protocols in Molecular Biology)″.John Wiley andSons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編)″芽胞桿菌的分子生物學(xué)方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)″.JohnWiley and Sons，1990)；以及WO 96/34946。
此外，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以通過人工產(chǎn)生多樣性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來構(gòu)建，例如不同枯草桿菌酶基因的DNA改組(WO 95/22625；Stemmer WPC，自然(Nature)370389-91(1994))。例如將實(shí)際上已被鑒定與Savinase_相比含有更長(zhǎng)活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)的一個(gè)或多個(gè)枯草桿菌酶部分序列和編碼Savinase_的基因進(jìn)行DNA改組，在隨后對(duì)具有改進(jìn)洗滌性能的變體進(jìn)行篩選之后，即可提供根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明酶的DNA結(jié)構(gòu)的重組表達(dá)載體可以是任意可方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體。
載體的選擇通常取決于其將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外實(shí)體形式存在并且其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒?；蛘撸撦d體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞后部分或全部整合到宿主細(xì)胞基因組中并且隨其整合的染色體一起復(fù)制的載體。
該載體優(yōu)選是表達(dá)載體，而且在該表達(dá)載體中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操作地與DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它片段連接。通常，表達(dá)載體來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有二者的元件。術(shù)語“可操作地連接”是指對(duì)片段進(jìn)行排列以使其按預(yù)期目的發(fā)揮功能，例如，轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子中起始并沿著編碼酶的DNA序列前進(jìn)。
啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任意DNA序列，可以來自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的適合啟動(dòng)子的例子包括嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)基因，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因，解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)堿性蛋白酶基因，或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因的啟動(dòng)子，或λ噬菌體PR或PL啟動(dòng)子，或大腸桿菌(E.coli)lac，trp或tac啟動(dòng)子。
如有必要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列也可以可操作地連接一個(gè)合適的終止子。
本發(fā)明的重組載體可以進(jìn)一步含有使得載體能夠在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
該載體還可以含有一個(gè)選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物彌補(bǔ)了宿主細(xì)胞缺陷的基因，或編碼例如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等抗生素抗性，或重金屬或除草劑抗性的基因。
為了引導(dǎo)本發(fā)明酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號(hào)序列(也稱為前導(dǎo)序列，前原序列(prepro sequence)或前序列(pre sequence))。分泌信號(hào)序列在正確閱讀框中與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號(hào)序列通常位于編碼酶的DNA序列的5’端。分泌信號(hào)序列可以是正常與酶聯(lián)系的分泌信號(hào)序列，也可以來自編碼另一種分泌蛋白的基因。
用于分別地將編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動(dòng)子和任選的終止子和/或分泌信號(hào)序列連接起來，或通過合適的PCR擴(kuò)增方案裝配這些序列，然后將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的適合載體中的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見，例如Sambrook等，同上)。宿主細(xì)胞被導(dǎo)入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明酶的DNA序列可以與所述宿主同源或異源。如果該DNA序列與宿主細(xì)胞同源，即由宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生，則其典型地是與另一個(gè)啟動(dòng)子序列或，如果適用，與另一個(gè)分泌信號(hào)序列和/或終止子序列可操作地連接，而不是存在于其天然環(huán)境中。術(shù)語“同源的”旨在包括編碼所述宿主生物天然產(chǎn)生的酶的DNA序列。術(shù)語“異源的”旨在包括宿主細(xì)胞天然并不表達(dá)的DNA序列。因此，該DNA序列可以來自另一種生物，或其可以是合成序列。
本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)或重組載體所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的任意細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核生物包括植物的細(xì)胞。
在培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子包括革蘭氏陽性細(xì)菌例如芽胞桿菌屬(Bacillus)菌株如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)、巨大芽孢桿菌(B.megatherium)或蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，或鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株，如淺青紫鏈霉菌(S.lividans)或鼠灰鏈霉菌(S.murinus)，或革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌(Echerichia coli)。
細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合、或通過使用感受態(tài)細(xì)胞，按本來已知的方式進(jìn)行(參見Sambrook等，見上文)。
當(dāng)在細(xì)菌例如大腸桿菌中表達(dá)該酶時(shí)，該酶可以典型地以不可溶顆粒(稱作包涵體)形式留在細(xì)胞質(zhì)中，或可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)至周質(zhì)間隙。在前一種情況中，裂解細(xì)胞并回收顆粒，變性，之后通過稀釋變性劑使該酶重新折疊。在后一種情況中，可以通過破碎細(xì)胞從周質(zhì)間隙回收該酶。例如，通過超聲處理或滲壓震擾來釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)容物并回收該酶。
當(dāng)在革蘭氏陽性細(xì)菌例如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌株中表達(dá)該酶時(shí)，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，或可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)至細(xì)胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況中，可以按下文所述方法從培養(yǎng)基中回收該酶。生產(chǎn)枯草桿菌酶的方法本發(fā)明提供生產(chǎn)本發(fā)明的分離酶的方法，其中在允許該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)用編碼此酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的合適宿主細(xì)胞，并且從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的酶。
當(dāng)含有編碼此酶的DNA序列的表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化到異源宿主細(xì)胞中時(shí)，即可以進(jìn)行本發(fā)明酶的重組異源產(chǎn)生。
因此生產(chǎn)高純度的其特征在于不含有同源雜質(zhì)的枯草桿菌酶組合物是可能的。
在本文中，同源雜質(zhì)是指來源于最初獲得本發(fā)明酶的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如，除本發(fā)明酶之外的其它多肽)。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適用于所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的任何常規(guī)培養(yǎng)基?？梢詫⒈磉_(dá)的枯草桿菌酶方便地分泌至培養(yǎng)基中，并由此通過熟知程序進(jìn)行回收，這些程序包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，采用鹽例如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)成分，然后進(jìn)行層析如離子交換層析、親和層析等等。本發(fā)明枯草桿菌酶變體的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶蛋白酶變體可以有許多工業(yè)用途，尤其是在洗滌劑工業(yè)中。
此外，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶變體的酶組合物。
對(duì)優(yōu)選的工業(yè)應(yīng)用以及相應(yīng)的優(yōu)選酶組合物的總結(jié)描述如下。
該總結(jié)不旨在以任何方式完全列出本發(fā)明枯草桿菌酶變體適合應(yīng)用。本發(fā)明枯草桿菌酶變體還可以在包括使用蛋白酶，特別是枯草桿菌酶的本領(lǐng)域已知其它工業(yè)應(yīng)用中使用。含有突變酶的洗滌劑組合物本發(fā)明包括本發(fā)明突變酶在清潔和洗滌劑組合物中的應(yīng)用以及這些含有該突變枯草桿菌蛋白酶的組合物。這些清潔和洗滌劑組合物在本領(lǐng)域中已有很好的描述，對(duì)于適合的清潔和去污組合物的進(jìn)一步描述，參見WO96/34946，WO 97/07202，WO 95/30011。
此外，下面的實(shí)施例闡明了許多本發(fā)明枯草桿菌酶變體在洗滌性能上的改進(jìn)。洗滌劑組合物本發(fā)明酶可以被加入洗滌劑組合物中并因此成為洗滌劑組合物的一個(gè)成分。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以例如配制成手洗或機(jī)洗洗衣洗滌劑組合物，其中包括適用于污染的紡織物預(yù)處理的洗衣添加組合物以及加入了織物軟化劑的漂洗組合物，或配制成用于一般家用硬物體表面清潔操作的洗滌劑組合物，或配制成用于手工或機(jī)械洗碟操作的洗滌劑組合物。
在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明酶的洗滌添加劑。該洗滌添加劑與所述洗滌劑組合物均可以含有一或多種其它酶例如蛋白酶、脂酶、角質(zhì)酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabanase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或過氧化物酶。
通常，所選酶的性質(zhì)應(yīng)與所選洗滌劑相適應(yīng)(即最適pH、與其它的酶和非酶成分的兼容性，等等)，并且該酶應(yīng)當(dāng)以有效的量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括動(dòng)物，植物或微生物來源的蛋白酶。優(yōu)選微生物來源的蛋白酶?；瘜W(xué)修飾突變體或蛋白質(zhì)工程突變體也包括在內(nèi)。該蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選微生物的堿性蛋白酶，或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是來自芽胞桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147以及枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的胰蛋白酶)和描述于WO 89/06270和WO94/25583中的鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。
有用蛋白酶的例子是描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)下列位置發(fā)生了替換的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
優(yōu)選的商業(yè)上可獲得蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM以及KannaseTM(Novo Nordisk A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的脂肪酶?；瘜W(xué)修飾突變體或蛋白質(zhì)工程突變體也包括在內(nèi)。有用的脂肪酶的例子包括來自腐殖霉屬(Humicola)(同義詞Thermomyces)的脂肪酶例如EP 258 068和EP 305 216中描述的來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶、或WO 96/13580中描述的來自H.insolens的脂肪酶，假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、司徒茨氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽胞桿菌屬脂肪酶例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
其它例子包括例如描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中的脂肪酶變體。
優(yōu)選的商業(yè)上可獲得脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)。淀粉酶合適的(α和/或β)淀粉酶包括細(xì)菌或真菌來源的淀粉酶?；瘜W(xué)修飾的突變體或蛋白質(zhì)工程突變體也包括在內(nèi)。淀粉酶包括，例如，從芽胞桿菌屬例如地衣芽孢桿菌的特定菌株中獲得的α-淀粉酶，更詳細(xì)的描述在GB 1,296,839中。
有用淀粉酶的例子是描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)下列位置發(fā)生了替換的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商業(yè)上可獲得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/s)、RapidaseTM和PurastarTM(來自GenencorInternational Inc.)。纖維素酶適合的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的纖維素酶。化學(xué)修飾突變體或蛋白質(zhì)工程突變體也包括在內(nèi)。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐殖霉屬(Humicola)、鐮孢霉屬(Fusarium)，梭孢殼屬(Thielavia)、枝頂孢霉屬(Acremonium)的纖維素酶，例如Humicola insolens，Myceliophthora thermophila和尖鐮孢(Fusariumoxysporum)產(chǎn)生的真菌纖維素酶，這些酶公開于US 4,435,307、US5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259。
特別合適的纖維素酶是具有護(hù)色功能的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是例如描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纖維素酶。其它例子是描述于WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的纖維素酶變體。
商業(yè)上可獲得的纖維素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovoNordisk A/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor InternationalInc.)，以及KAC-500(B)TM(Kao公司)。過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物，細(xì)菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。化學(xué)修飾突變體或蛋白質(zhì)工程突變體也包括在內(nèi)。有用的過氧化物酶的例子包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中所描述的，來自鬼傘菌屬(Coprinus)的過氧化物酶例如來自(C.Cinereus)的過氧化物酶，及其變體。
商業(yè)上可獲得的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
可以通過加入含有一或多種酶的分開的添加劑，或通過加入含有所有這些酶的組合添加劑，將這些洗滌劑酶包含在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑即分開的添加劑或組合添加劑，可以配制成例如顆粒、液體或漿液等等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制品是顆粒，尤其是非起塵(non-dusting)顆粒，液體，尤其是穩(wěn)定的液體，或漿液。
非起塵顆?？梢园蠢鏤S 4,106,991和4,661,452中所公開的方法生產(chǎn)，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行包被。蠟樣包被材料的例子是平均分子量為1000到20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16到50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚(ethoxylatednonylphenol)；其中具有15到80個(gè)環(huán)氧乙烷單位并且醇含有12到20個(gè)碳原子的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單、二和三甘油酯。適于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的薄膜形成包被材料見GB 1483591。液體酶制品可以根據(jù)已有技術(shù)通過例如加入多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定?？梢愿鶕?jù)EP 238,216中公開的方法制備受保護(hù)的酶。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便形式例如條形、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是水性的，典型地含有高達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或是非水性的。
該洗滌劑組合物含有一或多種表面活性劑，該表面活性劑可以是非離子包括半極性，和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子表面活性劑。這些表面活性劑典型地按重量計(jì)以0.1％到60％的水平存在。
當(dāng)包括在內(nèi)時(shí)，洗滌劑通常含有大約1％到大約40％的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽、α-烯基磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。
當(dāng)包括在內(nèi)時(shí)，洗滌劑通常含有大約0.2％到大約40％的非離子表面活性劑例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇胺、聚羥基烷基脂肪酸酰胺或氨基葡糖(“葡糖酰胺”)的N-酰基N-烷基衍生物。
該洗滌劑可以含有0-65％的洗滌助劑或絡(luò)合劑例如沸石，二磷酸鹽，三磷酸鹽，膦酸酯，碳酸鹽，檸檬酸鹽，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基丁二酸、可溶性硅酸鹽或分層的硅酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。
該洗滌劑可以包含一或多種聚合物。例子有羧甲基纖維素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，馬來酸/丙烯酸共聚物和十二烷基異丁烯酸/丙烯酸共聚物。
該洗滌劑可以含有漂白體系，該漂白體系可以包括H2O2來源物質(zhì)例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，這些物質(zhì)又可以與形成過酸的漂白活化劑例如四乙酰乙二胺或壬酰羥苯磺酸鹽結(jié)合?；蛘?，該漂白體系可以含有例如酰胺、酰亞胺或砜類的過氧酸。
本發(fā)明洗滌劑組合物中的酶可以通過使用常規(guī)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定，例如多元醇例如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且該組合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述的方法配制。
該洗滌劑還可以含有其它常規(guī)去污成分，例如織物調(diào)理劑，其包括粘土、發(fā)泡增效劑、泡沫抑制劑、抗腐蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、光漂白劑、增溶劑、晦暗抑制劑或香料。
目前我們正在考慮，在該洗滌劑組合物中加入任何酶，尤其是本發(fā)明的酶，加入量為每升洗滌液中加入相當(dāng)于0.01-100mg的酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液中加入0.05-5mg的酶蛋白，尤其是每升洗滌液中加入0.1-1mg的酶蛋白。
另外可以將本發(fā)明的酶加入WO 97/07202中所公開的洗滌劑制品中，其中WO 97/07202在此以參考文獻(xiàn)方式并入。在皮革工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以被應(yīng)用于皮革工業(yè)，尤其是用于皮革脫毛。
在所述應(yīng)用中，優(yōu)選在另外含有其它蛋白酶的酶組合物中使用本發(fā)明枯草桿菌酶變體。
對(duì)于其它適合的蛋白酶的更具體描述，參見有關(guān)用于洗滌劑組合物的合適酶的部分(見上文)。羊毛工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的酶可以被應(yīng)用于羊毛工業(yè)，尤其是用于含羊毛衣物的清洗中。
在所述應(yīng)用中，優(yōu)選在進(jìn)一步含有其它蛋白酶的酶組合物中使用本發(fā)明枯草桿菌酶變體。
對(duì)于其它適合的蛋白酶的更具體描述，參見有關(guān)用于洗滌劑組合物的合適酶的部分(見上文)。
在下述實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了更為詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例并不旨在以任何方式對(duì)本發(fā)明要求的范圍進(jìn)行限制。材料和方法菌株枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等，1990)。
遲緩芽孢桿菌309和147是保藏在NCIB且編號(hào)為NCIB 10309和10147的遲緩芽胞桿菌的特定菌株，其描述于美國(guó)專利3,723,250，該文獻(xiàn)以參考文獻(xiàn)方式并入本文。
大腸桿菌MC 1000(M.J.Casadaban和SN.Cohen(1980)；分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)138 179-207)通過常規(guī)方法被制備成r-、m+，其也描述于美國(guó)專利申請(qǐng)039,298.中。質(zhì)粒pJS3大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，含有編碼枯草桿菌酶309的合成基因(由Jacob Schiφdt等人描述于“蛋白質(zhì)和肽通訊”(Proteinand peptide letters)339-44(1996)中)。
pSX222枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(描述于WO 96/34946中)。普通分子生物學(xué)方法除非另有說明，DNA操作和轉(zhuǎn)化采用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行(Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等(編)″現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南″.John Wiley andSons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編)″芽胞桿菌的分子生物學(xué)方法″.John Wiley and Sons，1990).
DNA操作用的酶依據(jù)供應(yīng)商的說明書進(jìn)行使用。DNA操作用的酶除非另有說明，所有DNA處理用的酶例如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶等均從New England Biolabs公司獲得。蛋白水解活性在本發(fā)明的上下文中，蛋白水解活性以Kilo NOVO蛋白酶單位(KNPU)表示。該活性的測(cè)定是相對(duì)于酶標(biāo)準(zhǔn)(SAVINASE_)進(jìn)行的，并且以標(biāo)準(zhǔn)條件下蛋白水解酶對(duì)二甲基酪蛋白的消化為基礎(chǔ)，所述標(biāo)準(zhǔn)條件是50℃、pH8.3、反應(yīng)時(shí)間9分鐘、測(cè)量時(shí)間3min。文件AF 220/1可從Novo NordiskA/S，丹麥索取獲得，此文件以參考文獻(xiàn)方式并入本文。
GU是甘氨酸單位，定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，40℃孵育15分鐘時(shí)，以N-乙酰酪蛋白作為底物產(chǎn)生相當(dāng)于1mmole甘氨酸的NH2基團(tuán)量的蛋白水解酶活性。
酶活性也可以采用PNA實(shí)驗(yàn)，根據(jù)與可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-對(duì)硝基酚的反應(yīng)來測(cè)定，該方法描述于美國(guó)石油化工產(chǎn)品學(xué)會(huì)雜志(Journal of American Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，LA.，(1988)。發(fā)酵用于生產(chǎn)枯草桿菌酶的發(fā)酵在含有100ml BPX培養(yǎng)基的500ml帶擋板的錐形瓶中于30℃在旋轉(zhuǎn)搖床(300r，p.m)上進(jìn)行5天。
因此為了制備例如2升細(xì)菌培養(yǎng)液，20個(gè)錐形瓶同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)基BPX培養(yǎng)基成分(每升)馬鈴薯淀粉 100g碾碎的大麥 50g大豆粉 20gNa2HPO4x12H2O 9gPluronic0.1g酪蛋白酸鈉 10g該培養(yǎng)基中的淀粉用α-淀粉酶液化，并且該培養(yǎng)基通過120℃加熱45分鐘進(jìn)行滅菌。滅菌后通過加入NaHCO3至0.1M將培養(yǎng)基的pH調(diào)整到9。實(shí)施例1酶變體的構(gòu)建和表達(dá)定點(diǎn)誘變?cè)诨钚晕稽c(diǎn)環(huán)(b)中第98到99位之間含有特定插入的本發(fā)明枯草桿菌酶309定向位點(diǎn)變體可以通過DNA片段的傳統(tǒng)克隆方法制備(Sambrook等.，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版.，冷泉港，1989)，其中所述DNA片段是通過含有目的插入片段之寡核苷酸的PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的(見下文)。
模板質(zhì)粒DNA是pJS3，或其含有枯草桿菌酶309變體的類似物。
通過寡核苷酸指導(dǎo)的誘變導(dǎo)入插入物以構(gòu)建A98AX插入變異(X＝第98和99位之間插入的任意氨基酸殘基)，產(chǎn)生A98AX枯草桿菌酶309變體。
將該枯草桿菌酶309變體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。通過限制性核酸內(nèi)切酶消化、DNA片段的純化、連接以及枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化，將從這些大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過夜培養(yǎng)物中純化的DNA轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中?？莶菅挎邨U菌的轉(zhuǎn)化按Dubnau等，1971，分子生物學(xué)雜志.56，第209-221頁所述的方法進(jìn)行。用于在確定區(qū)域插入隨機(jī)插入物的定域隨機(jī)誘變用于進(jìn)行定域隨機(jī)誘變的整個(gè)策略是合成一個(gè)對(duì)應(yīng)于插入位點(diǎn)兩側(cè)DNA序列的誘變引物(寡核苷酸)，其由定義該插入片段的DNA堿基對(duì)分隔開。
隨后，所獲的誘變引物與合適的反向引物一起用于PCR反應(yīng)。純化產(chǎn)生的PCR片段并在第二次PCR反應(yīng)中延伸該片段，之后用核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化并將所獲片段克隆至大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體中(見下文)。
或者，如有必要，將產(chǎn)生的PCR片段作為引物和第二個(gè)合適的反向引物一起進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，使得該誘變區(qū)可以被消化并克隆至穿梭載體中。PCR反應(yīng)在常規(guī)的條件下進(jìn)行。
通過此策略，在SAVINASE中構(gòu)建了定域隨機(jī)文庫，其中插入片段被導(dǎo)入到活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)的第98和99位之間。
通過誘變引物引入突變(見下文)，以致可以提供所有20種氨基酸(N＝25％的A，T，C，和G；而S＝50％ C和G)。使用如下引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一段PCR片段5’CTA AAT ATT CGT GGTGGC GC 3’(有義)和5’GAC TTTAAC AGC GTA TAG CTC AGC 3’(反義)，然后將一段重疊序列與該P(yáng)CR片段組合并通過另一輪PCR，使上文誘變引物產(chǎn)生的PCR片段向Savinase的N端延伸。將延伸的DNA片段克隆到修飾質(zhì)粒pJS3(見上文)的Hind III和Mlu I位點(diǎn)，并對(duì)十個(gè)隨機(jī)選擇的大腸桿菌菌落測(cè)序以證實(shí)所設(shè)計(jì)的突變。
誘變引物(5’GCT GAG CTA TAC GCT GTT AAA GTC CTA GGG GCG NNSAGC GGT TCA GGT TCG GTC AGC 3’(正義))與位于pJS3的Mlu I位點(diǎn)下游的合適反向反義引物(例如5’-CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT-3’(反義)一起用于PCR反應(yīng)，質(zhì)粒pJS3作為模板。通過使用限制酶Hind III和MluI將該獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pJS3穿梭載體中。
通過熟知技術(shù)將該隨機(jī)文庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。
制備的文庫含有大約100,000個(gè)獨(dú)立克隆/文庫。
對(duì)隨機(jī)選擇的10個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)所設(shè)計(jì)的突變。
為了純化本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，用含有本發(fā)明變體的枯草芽孢桿菌pJS3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌株，并按上述方法在含有10μg/ml氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)施例2酶變體的純化本方法涉及用于在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明枯草桿菌酶的2升級(jí)發(fā)酵的純化。
大約1.6升的發(fā)酵培養(yǎng)液在1升的離心杯中5000rpm離心35分鐘。上清液用10％醋酸調(diào)節(jié)pH至6.5并用Seitz Supra S100過濾板過濾。
濾出液使用配有Amicon SlYlO UF柱體的Amicon CH2A UF裝置濃縮到大約400ml。離心和過濾UF濃縮液，之后室溫下在pH7的桿菌肽(Bacitracin)親和柱上進(jìn)行吸附。使用含有25％ 2-丙醇、1M氯化鈉和0.01二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣(調(diào)節(jié)pH至7)的緩沖液，室溫下從該桿菌肽柱中洗脫該蛋白酶。
將來自桿菌肽純化步驟的具有蛋白酶活性的組分合并，并施加至經(jīng)如下緩沖液平衡的750ml Sephadex G25柱中(5cm直徑)，該緩沖液含有0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣，調(diào)節(jié)pH至6.5。
合并來自Sephadex G25柱的具有蛋白水解活性的組分，并施加至經(jīng)如下緩沖液平衡的150ml CM Sepharose CL 6B陽離子交換柱中(5cm直徑)，該緩沖液含有0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣，調(diào)節(jié)pH至6.5。
使用具有0-0.1M氯化鈉線性梯度的2升相同緩沖液(對(duì)于枯草桿菌蛋白酶147為0-0.2M氯化鈉)洗脫該蛋白酶。
在最后的純化步驟中，合并含有蛋白酶的來自CM Sepharose柱的組分，并在配有GR81PP膜的Amicon超濾小室(來自Danish Sugar Factories公司)中濃縮。
通過使用實(shí)施例1中的構(gòu)建和發(fā)酵技術(shù)，以及上述的分離操作，我們生產(chǎn)和分離了下列枯草桿菌蛋白酶309變體A98ATA98ASA98ADA98AEA98APA98AGA98AHA98AIA98AT+Y167AA98ADA98AGA98AHA98AIA98ANA98APA98ASA98ATA98AVA98AYA98SDA98TPA98TWA98ASGTGA98ATGSGA98ATGTGA98AGGGGA98AGSGGA98AT+Y167AA98AT+R247KA98GP+S99AG97D+A98AT
G97E+A98ATG97K+A98ATG97N+A98ATG97Q+A98ATG97R+A98ATS87G+A98AGGGSA98AS+A133E+T143KA98AT+A108C+A138CA98AT+Y167A+R170S+A194PA98GI+S99H+G100S+S101A這些變體在初步測(cè)試中顯示出比Savinase更好的洗滌性能。實(shí)施例3含有酶變體的洗滌劑組合物的洗滌性能下面的實(shí)施例提供了在所顯示條件下進(jìn)行的許多洗滌測(cè)試的結(jié)果。小型洗滌(MINI WASH)洗滌條件

洗滌劑所用洗滌劑分別從丹麥(OMO，目錄ED-9745105)和美國(guó)(Wisk，目錄ED-9711893)的超市獲得。使用前，通過微波處理使洗滌劑中的所有酶失活。布樣所用布樣是從EMPA Testmaterialen，Movenstrasse 12，CH-9015 St.Gall，瑞士獲得的EMPA116和EMPA117。反射率測(cè)試材料的反射率(R)測(cè)量是使用Macbeth ColorEye 7000光度計(jì)在460nm下進(jìn)行的。該測(cè)量依據(jù)廠商說明書來進(jìn)行。評(píng)價(jià)對(duì)枯草桿菌酶洗滌性能的評(píng)價(jià)由所研究的枯草桿菌酶的改進(jìn)因子或性能因子決定。
改進(jìn)因子，IF劑量/反應(yīng)，定義為當(dāng)枯草桿菌酶濃度趨于零時(shí)，含有所研究枯草桿菌酶的洗滌劑的洗滌性能曲線和含有參照枯草桿菌酶的相同洗滌劑的洗滌性能曲線的斜率的比值。
IF劑量/反應(yīng)＝a/a參照洗滌性能根據(jù)通過式I計(jì)算R=R0+a·ΔRmax·cΔRmax+a·c---(I);]]>其中R是以反射率單位表示的洗滌性能；R0是擬合曲線與y-軸的截距(空白)；a是當(dāng)c→0時(shí)擬合曲線的斜率；c是酶的濃度；ΔRmax是當(dāng)c→∞時(shí)的理論最大洗滌效果。
性能因子P是通過式II計(jì)算的 其中R變體是用10nM變體洗滌的測(cè)試材料的反射率；Rsavinase是用10nM Savinase洗滌的測(cè)試材料的反射率；R空白是未用酶洗滌的測(cè)試材料的反射率。US(洗滌劑US Wisk，布樣EMPA117)


因此，觀察到本發(fā)明的枯草桿菌酶與Savinase_相比顯示出改進(jìn)的洗滌能力。
權(quán)利要求
1.I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酶，其在第95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中的98位具有至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，由此所述額外氨基酸殘基相應(yīng)于在第98和99位之間至少一個(gè)氨基酸殘基的插入。
2.權(quán)利要求1的分離的枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是在前體枯草桿菌酶的第98和99位之間具有至少一個(gè)插入的氨基酸的構(gòu)建的變體。
3.權(quán)利要求1或2的分離的枯草桿菌酶，其選自X98X{A，T，G，S}，X98X{D，E，K，R}，X98X{H，V，C，N，Q}，和X98X{F，I，L，M，P，W，Y}
4.權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)額外或插入的氨基酸殘基選自T，G，A和S。
5.權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)額外或插入的氨基酸殘基選自帶電荷的氨基酸殘基D、E、H、K和R，更優(yōu)選D、E、K和R。
6.權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)額外或插入的氨基酸殘基選自親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選N、Q、S和T。
7.權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)額外或插入的氨基酸殘基選自小的疏水性分子氨基酸殘基A、G和V。
8.權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)額外或插入的氨基酸殘基選自大的疏水性分子氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y，更優(yōu)選F、I、L、M和Y。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之任意一項(xiàng)的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個(gè)額外或插入的氨基酸殘基包含在活性位點(diǎn)環(huán)(b)中的一個(gè)以上的額外或插入氨基酸殘基。
10.前述權(quán)利要求之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體，其中所述第98和99位之間的插入與在任意其它位置的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步修飾相結(jié)合。
11.權(quán)利要求15的枯草桿菌酶變體，其中所述進(jìn)一步修飾位于以下的一個(gè)或多個(gè)位置27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。
12.前述權(quán)利要求之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體，其中所述修飾與下列一個(gè)或多個(gè)位置的修飾相結(jié)合129、131、133和194。
13.前述權(quán)利要求之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶，其中該枯草桿菌酶，或如果該枯草桿菌酶是變體，則親本枯草桿菌酶，屬于I-S1亞族。
14.權(quán)利要求13的枯草桿菌酶，其中該親本枯草桿菌酶選自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR，或它們的保留了I-S1亞族特性的功能性變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶，其中該枯草桿菌酶，或如果該枯草桿菌酶是變體，則親本枯草桿菌酶，屬于I-S2亞族。
16.權(quán)利要求15的枯草桿菌酶，其中該親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB，或它們的保留了I-S2亞族特性的功能性變體。
17．權(quán)利要求3、15或16的分離的枯草桿菌酶，其選自A98AA，A98AT，A98AG，A98AS，A98AD，A98AE，A98AK，A98AR，A98AH，A98AV，A98AC，A98AN，A98AQ，A98AF，A98AI，A98AL，A98AM，A98AP，A98AW，A98AY，A98SD，A98TP，和A98TW。
18．權(quán)利要求15-17之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體，其中所述進(jìn)一步修飾選自K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167X、R170X、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。
19．權(quán)利要求15-17之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體，其中所述進(jìn)一步修飾選自S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A，或這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合，其與權(quán)利要求1-14之任意一項(xiàng)中提及的任意一個(gè)或多個(gè)替代、缺失和/或插入相組合。
20.權(quán)利要求15-17之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體，其中所述進(jìn)一步修飾還選自P129K、P131H、A133P、A133D和A194P。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求之任意一項(xiàng)的變體，其含有選自以下組的修飾A98AT+Y167A；A98AT+S99SD；A98ATD；A98ADT A98AGSGG；A98ATGSG；A98AGGGS；A98AGGGG；A98ASGTG；A98ATGTG；S87G+A98AGGGS；L96LD+A98AT；G97D+A98AT；G97E+A98AT；G97K+A98AT；G97N+A98AT；G97Q+A98AT；G97R+A98AT；G97GD+A98AT；A98AT+Y167A；A98AT+R247K；A98GP+S99A；A98AS+A133E+T143K；A98AT+A108C+A138C；A98AT+Y167A+R170S+A194P；A98GI+S99H+G100S+S101A.
22.屬于I-S1亞族的具有下列氨基酸序列的枯草桿菌酶1 10 20 30A-Q-T-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V40 50 60L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-T-D70 80 90G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L98a 110 120Y-A-V-K-V-L-N-S-X-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D130 140 150V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V160 170 180A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V190 200 210D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P220 230 240T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N250 260 270L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V275E-A-A-A-Q或具有包含第98a位氨基酸殘基并顯示與上述序列相比有大于70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性的氨基酸序列的同源枯草桿菌酶。
23.屬于I-S2亞族的具有下列氨基酸序列的枯草桿菌酶.1 10 20 30.A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-40 50 60.L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-Q-D-70 80 90.G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-98a 110 120.Y-A-V-K-V-L-G-A-X-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-130 140 150.V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-160 170 180.A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-. 190 200 210.D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-220 230 240.G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-250 260 270.W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-.275.E-A-A-T-R或具有包含第98a位氨基酸殘基并顯示與上述序列相比有大于70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性的氨基酸序列的同源枯草桿菌酶。
24.權(quán)利要求22或23的枯草桿菌酶變體，其中第98a位的X選自T、A、G、S和P。
25.編碼權(quán)利要求1-24之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的分離的DNA序列。
26.含有權(quán)利要求25的分離DNA序列的表達(dá)載體。
27.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求26的表達(dá)載體的微生物宿主細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的微生物宿主，其是細(xì)菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬細(xì)菌，特別是遲緩芽孢桿菌。
29.權(quán)利要求27的微生物宿主，其是真菌或酵母，優(yōu)選絲狀真菌，特別是曲霉屬。
30.制備權(quán)利要求1-24之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的方法，其中在利于所述變體表達(dá)和分泌的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求27-29之任意一項(xiàng)的宿主，并回收該變體。
31.含有權(quán)利要求1-24之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的組合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的組合物，其還含有纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、別的蛋白酶、或淀粉酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的組合物，其中該組合物是洗滌劑組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-24之任意一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體或者根據(jù)權(quán)利要求31或32的酶組合物在洗衣和/或洗碟洗滌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在第95－103位的活性位點(diǎn)(b)環(huán)內(nèi)的98位含有額外氨基酸殘基的I－S1和I－S2亞族枯草桿菌酶。與其親本酶相比,枯草桿菌酶變體在洗滌劑中顯示改良的洗滌性能。
文檔編號(hào)C11D3/386GK1342199SQ99815582
公開日2002年3月27日 申請(qǐng)日期1999年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月18日
發(fā)明者K·安德森維爾博, F·米凱爾森, P·漢森坎普, C·安德森, M·諾里加德-馬德森 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲有限公司