專利名稱：：通過靶向腫瘤壞死因子受體的前配體裝配域(plad)來緩解炎性關節(jié)炎的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了TNF受體(TNFR)超家族成員的胞夕卜區(qū)保守結構J^介導受體寡聚物的特異性非配體依賴性裝配方面的新功能。
背景技術：
：TNFR超家族成員通常含有胞外區(qū)的1至6個富含半胱氨酸的結構域(CRD)、單個的跨膜結構域和大小可變的胞質(zhì)內(nèi)結構域。該受體家族的成員通常可結合到由結構、功能和序列相似性所定義的TNF細胞因子家族的配體上。這些受體以其活性配體結合態(tài)(ligandedstate)形成三聚體，且一些成員含有被稱為死亡結構域的胞質(zhì)結構域。根據(jù)本發(fā)明，這些受體的胞外區(qū)可通過新的自締合或同型締合功能來進一步表征，所述功能由含有至少1個富含半胱氨酸的結構域的前配體受體裝配域(PLAD)所介導。更糾地說，TNFR超家絲員，包括TRAIL受體1、CD40、60kDa的TNFR和80kDa的TNFR,表現(xiàn)出了這種同型締合功能。包括Fas、LTPR、C謂、CD30、CD27、HVEM、RANK、0X40和DR4在內(nèi)的其它的TNFR超家族成員含有該PLAD。所述PLAD是配體結合和受體功能所必需的。因此，TNFR超家族成員似乎是通過不同的預形成的復M而不是通過配體誘導的單個受體亞基的交:^傳遞信號的。因此，PLAD可被藥物制劑把向以阻斷這些預形成的復合體的形成并因此阻斷受體功能。已經(jīng)確定許多^L生物都進化出了對抗針對它們的免疫應答的有效策略(79)。更具體地說，一些病毒和細菌會表達用于調(diào)節(jié)或直接阻斷免疫效應分子作用的細胞蛋白同源物，包括細胞因子和趨化因子(80)。已經(jīng)鑒定了一些較大DM病毒的TNF受體樣受體(vTNFR)的病毒同源物，所述較大DM病毒包括一些痘病毒和人巨細胞病毒。PLAD介導的vTNFR自締合或與TNF家族受體的異源締合是否存在或其^f可作用尚未得到闡明。兩種主要的關節(jié)炎為類風濕性關節(jié)炎(RA)和I^l毒性關節(jié)炎(SA)。RA是一種伴隨有慢性關節(jié)炎癥和進行性骨破壞的常見的人自身免疫性疾病(禍。盡管尚未完全了解M的病因和發(fā)病機制，但是疾病逸艮中涉及細胞因子例如TNF-a、IL-1、IL-6和NF-kB配體的受體激活物(RANKL)(M-<W。核因子-kB(NF-kB)是這些細胞因子的關鍵性調(diào)節(jié)物(。TNF-a在RA的發(fā)病機制中起重M用，M抗劑例如,西普(也稱為Enbrel)、TNFRII免疫球蛋白Fc融合蛋白和英夫利昔單抗(也稱為Remicade)、抗TNF-ct單克隆抗體可以改善RA的臨床過程(鋪。SA是一種由細菌感染誘發(fā)的快速進行性和高度破壞性的關節(jié)疾病，其中TNF-oc也起到了重要作用(^)。由TNF-a(59)、脂多糖(LPS)、CpG-DM(J。、"和M^、(幼誘發(fā)的實驗性關節(jié)炎小鼠模型已被用來測試新的治療方法。這些試劑能誘發(fā)滑膜炎、血管翳形成、骨和軟骨磁:壞以4人RA和SA中觀察到的其它特征。根據(jù)本發(fā)明，體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)表明TNFRPLAD蛋白能夠有效地抑制TNF-a以及它在實驗性炎性關節(jié)炎中的作用后果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種包括TNF受體樣受體的前S己體裝配域(PLAD)的分離的^J^^列的多狀。本發(fā)明還提供了一種包括前配體裝配域(PLAD)的分離的M,列的多肽，其中所述PLAD選自TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL受體的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、H麗的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD、NGFR的PLAD、Troy的PLAD、EDAR的PLAD、XEDAR的PLAD、DcR3的PLAD、AITR的PLAD、4-1BB的PLAD、DR3的PLAD、RANK的PLAD、TACI的PLAD、BCMA的PLAD、DR6的PLAD、OPG的PLAD、DRS的PLAD、DcRl的PLAD和DcR2的PLAD。TNF-R、p60TNFR、p80TNFR、Fas、TRAIL受體、LTPR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4、NGFR、Troy、EDAR、XEDAR、DcR3、AITR、4一1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、0PG、DRS、DcRl和DcR2全是TNF受體超家族(在本文中也稱為TNF受體樣受體家刻的成員。本發(fā)明還提供了TNF受體超家族其它成員的PLAD以^U頁域技術人員能夠如何對它進行鑒定的方法。本發(fā)明的多肽可^J1來抑制PLAD的自締合以及TNF受體超家族成員的寡聚化。這些多肽也可^UI來抑制配體與TNF受體超家;^員的結合。本發(fā)明還提供了一種包括TNF受體寡l^應抑制劑的組合物。本發(fā)明進一步提供了缺少PLAD的TNF受體超家;^A員。圖1A示出了缺少配體時的TNFR寡聚物。用DTSSP(7)交聯(lián)經(jīng)TNFa處理過或未經(jīng)TNFa處理過的H9T細胞淋巴瘤。如圖所示，在非還原(泳道1-4、9-12)性或還原(泳道5-8、13-16)性條件下，對全細胞溶胞產(chǎn)物進行電泳，并針對p60或p80TNFR進行印跡。括號標明了三聚體(T)和單體(M)的位置。圓圏標明了與抗-p80抗體交XSJI的非特異性蛋白。所述結果^4了三次獨立的實驗。圖1B說明了特異性的p60TNFR自締合。用p60ACD-GFP-HA(泳道l-3)或pEGFP-Nl(泳道4-6)，并且用pcDM3(泳道1、4)或p60ACD-HA(泳道2、5)或HVEMACD-HA(泳道3、6)轉(zhuǎn)染293T細胞。如圖所示，用抗-GFP抗體進行免疫沉淀(GFPIP在上面的2個圖中)并用抗-HA抗體(HAWB)或抗-GFP抗體(GFPWB)進行印跡。上圖和中圖分別示出了沉淀的p60ACD-GFP-HA(或GFP)和p60ACD-HA。下圖示出了細胞溶胞產(chǎn)物中的p60ACD-HA和HVEMACD-HA蛋白。結果^RA了五次實驗。圖1C說明了特異性的p80自締^^和前配體裝配域(PLAD)的定義。用圖上方所示的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞。用僅識別全長p80的C末端特異性抗-p80抗體(p80IP)進行免疫沉淀(上圖和中圖)。溶胞產(chǎn)物中截短的p80或p60蛋白的表錄下圖中示出。用抗-HA抗體(上圖和下圖)和C末端特異性抗-p80抗體(中即進行蛋白質(zhì)印跡?？招膱A圈^4糖基化和非糖基化形式的P80。實心圓圏表示Ig重鏈。圖1D說明了PLAD足以滿足受體自締合。用p80ACD-GFP-HA(泳道l-5)和每條泳道上方所示的質(zhì)粒一^^轉(zhuǎn)染293T細胞。用抗-GFP抗體進行免疫沉淀并且用抗-HA抗體進行蛋白質(zhì)印跡。共沉淀的DCD蛋白以及它們在總細lfc^胞產(chǎn)物中的表達分別在中圖和下圖中示出。上圖示出了沉淀的p60ACD-GFP-HA蛋白。圖1E說明了PLAD是TNFoc結合所必需的。直方圖示出了在用所示構建體轉(zhuǎn)染過的293T細胞中轉(zhuǎn)染后受體的表達(通過抗-HA染色)以及它們與TNFa的結合(25)。x-軸表示熒光強度，y-軸表示細胞數(shù)量。所示數(shù)量為與用載體轉(zhuǎn)染的對照相比的陽'^^的百分數(shù)。圖2A說明了置換PLAD中的殘基可防止自締合。用所示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞。用抗"GFP抗,照圖1中的方法進行免疫沉淀。用抗-HA抗體進行蛋白質(zhì)印跡。上圖和中圖分別出示了沉淀的p60ACD-GFP-HA(空心圓圏)和p60ACD-HA突變蛋白(括號)。下圖示出了細胞溶胞產(chǎn)物中p60△CD-HA突變體(括號)和HVEMACD-HA(實心圓圏)的表達。圖2B說明了通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)所證明的p60和p80TNFR的同型自締合。用所示的CFP(上圖)和YFP(下圖)質(zhì)豐iJit轉(zhuǎn)染的293T細胞的流式細胞分析的直方圖。虛線表示單獨用CFP轉(zhuǎn)染的對照，實線表示不使用TNFa的FRET而粗線表示使用TNFa的FRET。x-軸和y-軸分別表示FRET熒光強度和細胞數(shù)量。在CFP陽性群中分析FRET,在所述CFPP曰性群中所有細胞也都是YFP陽性的。FRET被定義為由CFP所激發(fā)的YFP的熒it^射。該結果代表了四次獨立的實驗。圖3A示出了TNFR超家族典型成員的CRD1(p60的CRD1(SEQIDNO:22)、p80的CRD1(SEQIDNO:23)、LTPR的CRD1(SEQIDNO:24)、CD40的CRD1(SEQIDNO:25)、HVEM的CRD1(SEQIDNO:26)和CD30的CRD1(SEQIDNO:27))的序列比對。該圖示出了高度保守的半^t^酸位置，所述位置用于二^克鍵并且界定了能賦予TNFR超家M員資格的富含半皿酸的結構域。圖3B說明了TNFR超家族其它成員中的受體自締合。用DR4ACD-GFP-HA(泳道1-4)或CD4△CD-GFP-HA(泳道5、6)與p80△CD-HA(泳道1、6)、p60△CD-HA(泳道2)、HVEM△CD-HA(泳道3)、DR4△CD-HA(泳道4)或CD40△CD-HA(泳道5)—^轉(zhuǎn)染293T細胞。分別用抗-GFP和抗-HA抗體進行免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡。上圖示出了免疫復合體中的沉淀蛋白，下圖示出了細胞溶胞產(chǎn)物中的DCD蛋白表達。實心圓圏表示GFP融M白，箭頭表示免疫復合體中的DCD蛋白。圖3C示出了通過FRET證明的DR4和CD40的特異性受體締合的流式細胞分析。按圖2B中的方法使用所示的CFP(上部)和YFP(下部)質(zhì)豐iJft進行轉(zhuǎn)染。虛線表示單獨用CFP時的本底FRET，粗線表示同時存在CFP融合蛋白和YFP融^^蛋白時的FRET。對于每個組來說，x-軸為FRET強度，y-軸為細胞JL量。圖3D示出了兩種基于預締合三聚體復M的TNFR信號傳導模型。對于預裝配鏈重排模型(左)，橢圓形^4CRDC^M遠端向膜近端的方向?qū)RD編號為l-4)，斑點方才錄示月M結構域。該受體是從垂直于質(zhì)膜的角度觀察的。羅馬數(shù)字代表三聚體復合體中的鏈。對于該三聚體簇模型(右)，灰色符號表示細胞表面上預裝配的TNFR三聚體，帶圓團的三角代束三聚的TNFot。數(shù)字1-3代表預裝配三聚體復合體中的受體的三條隨。該受體是按向下俯視質(zhì)膜的角度》見察的。圖4A示出了在沒有配體結合的情況下，病原性Fas突變會導致顯性干涉。野生型(WT)、Pt2(del52-96)和Pt6(A241D)Fas分子的表面表達和結^#征。左側欄示出了通過針對每個受體蛋白N-末端存在的AU-1表位標簽染色時，轉(zhuǎn)染到293T細胞后24小時的表面表達。中間欄示出了用10pg/ml抗-Fas拮抗抗體AP0-1(Kamiya)染色的同樣的細胞。右側欄示出了設計用于通過修飾的亮氨酸拉鏈來三聚化并且用抗-亮氨酸拉鏈mAb(FasL染料)通過染色來顯影的FasL的結合。抗體結合用藻紅蛋白綴合的抗-小鼠抗體來顯影。括號(bracket)表示與未轉(zhuǎn)染的對照相比時，對染色呈強陽性的細胞的百分數(shù)。在每幅圖中，粗線和細線分別代耒轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的細胞制品的信號。所有的直方圖都代表了以4個十進制刻度間隔(4decade)對數(shù)焚光刻度(X軸)相對細胞計數(shù)(Y軸)作圖的10，000次事件。在使用Flowjo軟件(Treestarsoftware)的FACScalibur流式細胞/f義上收集lt據(jù)。圖4B示出了與WTFas共轉(zhuǎn)染的突變體Fas分子導致的顯性抑制。將10|ig所示的表達載體或單獨的PCI載體電穿孔到不^t。先前所述(M的人Fas的BW細胞中，用5pgpEGFP-Nl(Clontech)標記轉(zhuǎn)染了GFP的細胞。24小時后，加入所示量的抗-FasmAbAP0-1和1/20體積的可溶性蛋白A(Sigma)以使凋亡誘導最大化。通過用流式細胞術計算GFP-陽性的活細胞并計算細胞消亡來量化凋亡U力。圖4C說明了Fas分子的自締合。將編碼HA-標記的Fas的表達栽體與野生型(WT)Fas和EC突變體Pt2Fas(del52-96)共轉(zhuǎn)染，所述HA-標記的Fas的C-末端死亡結構域4皮綠色熒光蛋白(HAFas1-210:GFP)所代替。對照細胞用WTFas和TNF受體家族成員皰滲病4^A介質(zhì)(HVEM或HveA)的HA-標記的胞質(zhì)截短型共轉(zhuǎn)染，所g質(zhì)截短型融合了GFP(HAHVEMACD:GFP)。按實施例中所述，裂解細胞溶胞產(chǎn)物，用抗-GFP進行免疫沉淀并且進行電泳。用抗FasC—末端的多克隆^j6l清(C20，SantaCruzbiotechnology)(抗—FasCT)探測沉淀蛋白的印跡以顯示與GFP標記的蛋白共沉淀的全長Fas分子。也可以用抗-HA-HRP(RocheMolecularBiochemicals)和抗-FasC20通過蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測細胞溶胞產(chǎn)物以測定這些蛋白的總量。空心圓圏表示免疫沉淀物種的IgG重鏈，實心圓圏表示W(wǎng)TFas，箭頭表示截短的Pt2Fas蛋白。一些用抗-FasC20印跡的泳道中的上方條帶表示糖基化的Fas。圖5A示出了缺乏PLAD或配體結合的Fas突變體的表達和功能。利用N-末端Fas突變體的APO-1和FasL的結合。如圖1A中所示(除了用抗-HA代替抗-AU1)，用C-末端截短的HA標記的TNFR2(TNFR2)對所示的HA標記的Fas突變體、R86SFas突變體和對照轉(zhuǎn)染物進4亍染色以顯示細胞表面每種突變體的總表達。圖5B示出了Fas胞外結構域的相互作用依賴于該蛋白N-末端區(qū)域中的結構域。在泳道l-4中，用不含死亡結構域的AU-l標記的Fas1-210和所示的HA-標記的Fas突變體或?qū)φ誘NF2蛋白(HATNFR2ACD)共轉(zhuǎn)染293T細胞。溶胞產(chǎn)物用抗-AUl免疫沉淀并且用抗-HA探測以顯示共沉淀的蛋白。已經(jīng)證明使用了抗FasN-末端的抗體(WB抗-FasN)的對照印跡可祐月來測定溶胞產(chǎn)物中AU-1Fas1-210蛋白的量。該結果代表了三次獨立的轉(zhuǎn)染。泳道5-7示出了用與圖1C中所用的同樣的步驟，利用HAFasl-210:GFP進行的WTFas和FasR86S突變體的共沉淀?？招膱A圏表示免疫沉淀抗體的Ig重鏈，實心圓圈示出免疫沉淀的Fas的位置。圖5C說明了缺少自締合結構域的Fas分子無法誘導凋亡。用10ng用于所示Fas分子的表達載體轉(zhuǎn)染BW5147鼠胸腺瘤細胞。用500jag/ml可溶性APO-1i秀導凋亡并按圖IB中的方法進行定量。圖5D示出了無配體結合的R86SFas突變體對凋亡的誘導和抑制作用。用10ing的每種Fas表達載體和5|ug的GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BW細胞。按圖2C中的方法進行凋亡誘導和定量，除了用APO-1來誘導用空心條表示的樣品中的凋亡并且向用實心條表示的樣品中加入5%v/v的FasL上清。圖6A示出了Fas分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。點圖示出了所示共轉(zhuǎn)染子中CFP、YFP和FRET信號之間的關系。構建CFP和YFP融合蛋白并轉(zhuǎn)染到293T細胞中，在FACSvantage細^/f義上進行分析。數(shù)字為具有FRET信號的CFP或YFP陽性細胞的百分數(shù)(右上象限)。圖6B為全長和N-末端缺失的Fas受體之間FRET信號的比較。IRET信號的直方圖是在對CFP熒光設門的細胞中產(chǎn)生的。所有的轉(zhuǎn)染子的YFP熒5是相當?shù)摹４志€為共轉(zhuǎn)染細胞的信號，細線為每一對中單獨轉(zhuǎn)染CFP構建體的信號。圖6C示出了通過在單個細胞上進行YFP的顯微光漂白確定的所示CFP和YFP對的FRET效率(4-7個細胞區(qū)域的5次讀奶。該數(shù)字代表了每個質(zhì)|樹的平均E"/。和標準誤。圖7A說明了內(nèi)源Fas受體鏈的預締合。將lxlO'個H9淋巴瘤細胞用交聯(lián)劑DTSSP處理(Pierce,4'C下用10mM處理30分鐘，然后用10mMpH8的Tris-Cl終止15分鐘)和/或在所示##下用1/ig的拮抗抗體AP0-1或FasL刺激15分鐘。對于抗-Fas免疫印跡，在電泳之前用N-聚糖H"F(RocheMolecularBiochemicals)處理細胞i^胞產(chǎn)物，并用抗-FasC末端mAbBIO(SantaCruzBiotechnology)和抗-小鼠IgGl-HRP(SouthernBiotechnology)探領'J。圖7B,在用所示試劑處理后，將細胞自、免疫沉淀并按照先前所述(7i)進行FADD和半胱天冬l8印跡。用箭頭標出了兩種半胱天冬H"8酶原同種型(p54/52)和pll半胱天冬酶亞基蛋白酶解后半胱天冬酶-8的切割產(chǎn)物(p43/41)的位置。圖7C示出了PARP的切割。在37。C下將(A)和(B)中所用的細胞等^#另外培養(yǎng)4小時并且用抗-PARPmAb(ResearchDiagnosticsInc)對細胞溶胞產(chǎn)物進行印跡。上方的條帶為115kD全長PARP,下方條帶為標志物85kD的半胱天冬酶切割片段。該結果4議了每種M下至少三次獨立的實驗。圖8A說明了顯性干涉依賴于PLAD的N-末端。對選定的來自NIH所研究家族的ALPS患者(Pt)Fas突變進行比對。符號"X"表示點突變的位置。如圖，示出了通過共沉淀測試的與野生型Fas締合的能力(SA)和共轉(zhuǎn)染研究中Fasi秀導的凋亡的顯性抑制作用(DI)。示出了患者#1和#20的編碼顯性負性PLAD的序列，所述PLAD含有由突變編碼的多肽。從信號肽后的第一個氨基酸開始編號。斜體字母表示由移碼突變引入的額外的氨基酸。圖8B示出了無PLAD時沒有顯性干涉。Fas^t感性JurkatT、淋巴瘤細胞用10ng所示構建體和2.5mgGFP才艮告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后18小時，連續(xù)6個小時加入所示量的Apo-1并通過用膜^:蛋白V-PE(Pharmingen)染色iMt凋亡進行定量。百分itAM聯(lián)蛋白V染色陽性GFP(+)細胞的百分比。這些結果代表了三次獨立的轉(zhuǎn)染。圖9示出了用于確定p80嵌合受體或截短形式存在情況的免疫沉淀分析。用所示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞并收集細胞以便用抗-p80COOH-末端特異性抗體進行免疫共沉淀。^使用抗-HA抗體通過蛋白質(zhì)印跡^^斤法^^斤免疫沉淀物以確定p80嵌合受體或截短的存在情況(上即。下圖示出了全細胞溶胞產(chǎn)物中HA-標記蛋白的表達。圖10示出了重組細菌PLAD蛋白的表達。(a)PLAD如何幫助受體三聚體裝配以及配體結合反應性的模型?？扇苄訮LAD蛋白可以與單個的受體鏈締合、防止三聚受體裝配并從而阻斷配體-誘導的信號傳導。(b)純化的GST、P60PLAD-GST(P60)和P80PLAD-GST(P80)的^_電泳。左側示出了分子量標記，其大小以千道爾頓為單位。(c)使用抗P60PLAD(上圖)或P80PLAD(下圖)的單克隆抗體(MAb)的蛋白質(zhì)印跡分析。示出了P60PLAD(左圖)或P80PLAD(右圖)在最初的艦電泳中所使用的以iug蛋白為單位的滴定。圖ll示出了PLAD蛋白在TNF-ot誘導的細胞死亡中的作用。(a)用培養(yǎng)基、人TNF-oc(hTNF)(2ng)、TNF-oc(2ng)+P60PLAD(P60)(40pg)處理L929細胞后，利用流式細胞術評估的細胞死亡。插圖示出了相差顯微照片。右下角給出了被設門的活細胞的百分數(shù)。Y軸為^ft丙啶(PI)染色，X軸為FSC(前向角散射分布)。死亡細胞^4現(xiàn)出增多的PI染色和減少的FSC。(b)小鼠TNF-a(mTNF)(2ng)或hTNF(2ng)以及不同劑量的PLADP60(P60)蛋白誘導的細胞消亡。(c)mTNF(2ng)或hTNF(2ng)以及不同劑量的PLADCD40(CD40)蛋白誘導的L929細胞的消亡。(d)在存在或不存在P60PLAD(P60)、P80PLAD(P80)和GST的情況下，用TNF-oc或抗-Fas處理12小時后，42.3Jurkat細胞的消亡。TNF-oc(3ng)、P60L(低;4.5pg)、P60H(高；15jig)、P80L(低;4.5|ig)、P80H(高;15pg)、GST(15pg)、抗-Fas(10ng)。(e)通ii^存在或不存在P60PLAD(IOOjug)、依那西普(25jag)、英夫利昔單抗(20ng)的情況下，用mTNF-oc(4ng)處理的底物轉(zhuǎn)化的光密度(OD)來測量L929細胞中的半胱天冬l8活性。圖12示出了P60和P80PLAD蛋白對關節(jié)炎的作用，所述關節(jié)H由在BALB/c小鼠的關節(jié)內(nèi)注射TNF-ot以及在C3H/HeJ小鼠的關節(jié)內(nèi)注射細菌CpGDM來誘發(fā)的。(a)膝關節(jié)HE染色組織切片的^4性顯徵照片，示出了PBS;45ngTNF-oc;P60PLAD(IOOing)和45ngTNF-oc;P80PLAD(IOOjig)和45ngTNF-oc;CpGDNA(lnM);CpGDNA(lnM)和P60PLAD(100|ug)。箭頭表示炎癥的集中灶區(qū)。標記為C(軟骨)、JC(關節(jié)腔)、ST(滑膜組織)、B(骨)，且該箭頭指向滑膜組織的,iia層。(b、c)如圖所示，單獨用TNF-oc(TNF)或者用TNF-a加P60PLAD蛋白(P60)或者用TNF-a加P80PLAD蛋白(P80)處理的實驗組(11=5)的滑膜炎、血管翳、骨和軟骨侵蝕的定量組織分析。(d)每個實驗組(11=5)的滑膜炎、血管翳、骨和軟骨組織侵蝕的定量組織分析。這些分析要重復至少兩次。單獨的CpGDM(CpG)、CpGDNA加P60PLAD(P60)。數(shù)值為平均值土標準差(s.d.)，"為與對照組相比處理組的P<0.01。關節(jié)內(nèi)接種后3天處死小鼠以便進行組織病理學檢查。結果^C4了三次實驗。圖13示出了P60和P80PLAD蛋白對DBA/1J小鼠體內(nèi)CIA的作用。盲法實驗(a-f)。(a)用PBS或P60PLAD處理的CIA小鼠的足爪照片。(b)用PBS處理的初次免疫后75天或腹腔內(nèi)注射P60PLAD蛋白4周(每周三次，每次100iag)的CIA關節(jié)的HE染色切片。(c)用PBS(n-13只小鼠)(方刻、P60PLAD蛋白(P60)(n=12只小鼠)(菱形)和P80PLAD蛋白(P80)(n=13只小鼠)(橢圓)處理的CIA小鼠中關節(jié)炎的嚴重度、足爪厚度的測量以及體重。(d)PBS、P60和P80處理組中關節(jié)炎的發(fā)病率。(e)對按所示方法處理4周的CIA關節(jié)切片中滑膜炎、血管翳、骨和軟骨侵蝕的評估。(f)血清中IL-l和IL-6水平。*=與對照PBS纟M目比P<0.05。(g)艦內(nèi)注射兩周PBS(n=10只小鼠)(方W、P60PLAD蛋白(P60)(n=10只小鼠)(菱形)和依那西普(11=10只小鼠)(橢圓)后CIA小鼠體內(nèi)關節(jié)炎的嚴重度。f-與對照PBS組相比P〈0.05。(h)在所建立的CIA中P60PLAD蛋白的作用。皿內(nèi)注射兩周PBS(n=9只小鼠)(方W、P60PLAD蛋白(P60，每隔一曰400ng)(n=10只小鼠)(菱形)后所建立的CIA小鼠的關節(jié)iU^重度。*=與對照PBS《W目比P<0.05。圖14示出了關節(jié)炎關節(jié)中TNFR的表達、PLAD蛋白對TNF-oc結合的抑制以及NF-kB的活化。(a)用PBS或P60PLAD處理75天后處死的患有CIA的DBA/1J小鼠的關節(jié)炎關節(jié)中TNFRl和TNFR2的免疫組織化學。褐色表示表達TNFR的細胞。(b)在用50ng生物素化的人TNF-a(Bt-TNF-a)和不同劑量的P60PLAD蛋白預處理染色后，進行流式細胞術。曲線代表了單獨的Bt-TNF-a、Bt-TNF-ct加3ygP60PLAD、Bt-TNF-a加15jigP60PLAD、Bt-，-a加30pgP60PLAD、人TNF-a或陰性對照。(c)用所示的依那西普(l|ig)、P60(1ing)或P80(1|ag)PLAD蛋白(測試蛋白)免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-a的皿電泳。使用抗TNF-oc抗體進行的蛋白質(zhì)印跡。(d)在存在(+)或不存在(-)P60PLAD蛋白的情況下，使用NF-kB(左箭頭)或0CT1(右箭頭)的放射性標記寡核苷酸探針，對從經(jīng)TNF-ot處理的A3Jurkat細胞制得的核提取物進行的電泳遷移率變動檢測。^在或不存在P60(100jig)或(100jig)PLAD蛋白的情況下，在體外用mTNF-oc(2ng)處3g^TNFRl(e)或TNFR2(f)敲除(-/-)小鼠脾臟分離的單核細胞之后，對這些細胞中的NF-KBp65核易位進行的定量分析。*=與對照組相比P<0.05;**=與對照組相比P<0.01。在每個遺傳背景中P60和P80處理組之間的差異都是顯著性差異(P<0.01)。圖15示出了P60PLAD蛋白可抑制破骨細胞生成以及RANK和RANK配體(RANKL)的表達。(a)膠原初次免疫并用PBS或P6GPLAD蛋白處理75天后處死的DBA/1J小鼠的關節(jié)炎關節(jié)中降釣素受體的免疫組織化學的代表性顯孩t照片。淺色陰影箭頭標明了陽性染色(在原始彩色切片中為褐色)。(b)PLAD蛋白在體外的TNF-ct誘導的破骨細胞生成中的作用。用M-CSF和小鼠TNF-ot(10iug)、小鼠TNF-ot(10pg)力口32jagP60PLAD或PBS培養(yǎng)的骨髓巨噬細胞(B應)中TRAP-陽性破骨細胞的顯微照片。淺色陰影箭頭標明了耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)陽性》皮骨細4包。對用所示不同劑量的P60PLAD蛋白處理7^，B謹培養(yǎng)物的每個孔中的TRAP-陽性細胞的定量，用顯孩i鏡測定。(c)用膠原初次免疫然后用PBS、P60PLAD蛋白處理75天后處死的DBA/1J小鼠的關節(jié)炎關節(jié)中，RANK和RANKL染色的免疫組織化學的顯孩i照片。深色(在原始彩色切片中為褐色)染色部分表示陽性染色細胞。圖16示出了標準的單字母代碼形式的人PLAD-GST融M白的g,列。(a)所示^EL體和下劃線(M酸g230-282)為P60PLAD肽序列(SEQIDNO:59)。(b)所示粗^體和下劃線CtJ^酸戎基230-274)為P80PLAD肽序列(SEQIDNO:60)。這兩部分中以純文本形式給出的是GST蛋白序列。圖17示出了P60PLAD蛋白對L929細胞中TNF-oc誘導的細胞死亡的作用。用下列試劑處理了19個小時的細胞的相差顯微照片(a)單獨的培養(yǎng)基；(b)人TNF-a(2ng);(c)P60PLAD(3yg)+hTNF-oc(2ng);(d)P60PLAD(30jag)十hTNF-a(2ng);(e)英夫利昔單抗(1mg)+hTNF-ot(2ng);(f)依那西普(1jug)+hTNF-a(2ng);(g)P80PLAD(30/ag)+hTNF-a(2ng)。400倍放大;(h)在存在或不存在P60PLAD(50|ig)、依那西普(1jig)和英夫利昔單抗(1Jig)的情況下，由hTNF(2ng)誘導的L929細胞的消亡。圖18示出了GST蛋白和P80PLAD蛋白對炎性關節(jié)炎的作用。(a)單獨用TNF-a(45ng)(TNF)或TNF-a(45ng)加GST蛋白(GST，100|ag)處理的BALB/c小鼠實驗組(11=5)中滑膜炎、血管翳以及骨和軟骨組織的定量組織分析；(b)在C3H/HeJ小鼠中單獨4吏用CpGDNA(lnM)(CpG)或CpGDNA(lnM)加P80PLAD蛋白(P80,100pg)。數(shù)值為平均值士標準差。在關節(jié)內(nèi)接種后3天將小鼠處死以便進行組織病理學檢查。結果^4了三次實驗。(c)H&E染色切片的顯微照片，示出了進行了為期4周的P80PLAD蛋白(100jig)的J^M內(nèi)注射的初次免疫后75天的CIA關節(jié)的炎癥和破壞。200倍放大。(d)用P80PLAD蛋白處理4周的DBA/1J小鼠的CIA中滑膜炎、血管翳以及骨和軟骨侵蝕的定量組織分析。與對照組相比P〉0.05。圖19示出了免疫組織化學的顯微照片。(a)6個月時處死的TNF-oc轉(zhuǎn)基因小鼠關節(jié)炎關節(jié)中的TNFR1和TNFR2。TNFR1圖中的箭頭標出了表明受體表達的深色染色部分(在原始彩色切片中為褐色)。TNFR2圖中的箭頭標明了軟骨深部的軟骨細胞的高TNFR2表達。(b)6個月大時處死的TNF-oc轉(zhuǎn)基因小鼠的關節(jié)炎關節(jié)中的以;SJ寸照C57BL/6小鼠的使泉關節(jié)中的降4丐素受體。(c)6個月大時處死的TNF-cc轉(zhuǎn)基因小鼠的關節(jié)炎關節(jié)中以;Sjt常對照C57BL/6小鼠的健康關節(jié)中的RANK和RANKL染色。深色(在原始彩色切片中為褐色)染色表示陽性組織化學反應。300倍;改大。圖20示出了P60PLAD蛋白的免疫原性和半衰期。(a)基于從用膠原初次免疫然后用PBS、P60或P80PLAD蛋白處理后75天處死的DBA/1小鼠血清中純化的PLAD蛋白，與標準曲線相比的抗-PLADP60抗體水平。GST+是指加入GST以便從血清中去除GST抗體。(b)P60PLAD蛋白的半衰期。(c)P80PLAD蛋白的半衰期。圖21示出了PLAD蛋白可抑制TNF-oc誘導的IkBcc降解。蛋白質(zhì)印跡示出了在存在或不存在P60(10、50、100pg)或P80(10、50、100yg)的情況下，在體外用mTNF-a(2ng)處3g^TNFR1或TNFR2敲除(-/-)小鼠脾臟分離出的單核細胞5分鐘(b)、15分鐘(a)或者在存在或不存在GST(lO、50、100pg)的情況下，用mTNF-a(2ng)處理這些細胞l小時(c)后，這些細胞中的IkBoc降圖22示出了用不同量的斜I5西普和P60PLAD蛋白來免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-ot的凝膠電泳。(a)所示的依那西普(10pg)或P60PLAD蛋白(100g)(測試蛋白)。(b)所示的^^西普(0.1、1、10yg)或P60PLAD蛋白(O.1、1、lOjag)(測試蛋白)。箭頭標明了TNF蛋白在^MJi的位置。用抗TNF-oc抗體(Ab)進行蛋白質(zhì)印跡。圖23示出了TNFR1晶體結構(PDBID:1NCF)中二聚化的PLAD部分。深灰部分和淺灰部分表示PLAD二聚體的單個肽鏈。圓圈中標出了每個肽中His-34的鏡像(mirror)咪哇環(huán)。這些^i且氨酸在鏈間袋中互相固定。圖24示出了與,西普^/^的P80PLAD蛋白的免疫沉淀(IP)和蛋白質(zhì)印跡(WB)。圖25示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的MMP表達。注:左圖中深色(在原始彩色切片中為褐色)染色部分表示MMP表達。圖26示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的iNOS表達。注左圖中深色(在原始彩色切片中為褐色)染色部分表示iNOS表達。具體實施方式參照下文中關于本發(fā)明優(yōu)選實施方案和其中所含實施例的詳細描述，并參照附圖和關于它們的在上文和下文中的描述，可以更容易地理解本發(fā)明。根據(jù)上下文，說明書和權利要求中所用的"一，，可以表示一個(種)或多個(種)。因此，例如，提及"一種核酸"時是指使用了至少一種核酸。多肽本發(fā)明提供了一種包括前配體裝配域(PLAD)的分離的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還提供了一種由前配體裝配域的M酸序列組成的多肽。本發(fā)明的PLAD可以是TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-l)的PLAD、TRAIL的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD或TNFR超家族成員的任何其它PLAD結構域。由于PLAD結構域在TNFR超家族成員中是高度保守的，守基序來鑒定任何TNF受體的PLAD結構域。TNF受體樣受體中這些區(qū)域的鑒定是.通#文4^供的示例性PLAD序列以^J陣它們與該家族其它成員公開序列進行比較來以常規(guī)手段完成的(例如，參見圖3)。此外，本領域技術人員也應該能夠通過進行功能測定(例如實施例中所提供的功能測幻來鑒定PLAD。在一個實施方案中，所述功能性PLAD不是Fas/CD59的PLAD(83)。在另一個實施方案中，所述功能性PLAD不是Fas/CD59受(^末端的49個氨基酸(83)。本文所提供的PLAD可以僅包括成熟的TNF受體樣受體N-末端的38個氨基酸。成熟的TNF受體樣受體是不含信號序列的TNF受體樣受體。序列表中公開了PLAD的實例，該序列表包括含有其信號序列的頂F受>^#受體實例的M酸序列。參照表1中列出的這些TNF受^#受體的GenBank射己號可以找到各個受體的信號序列殘基。因此，所給的序列中公開了成熟TNF受體樣受體及其對應PLAD的序列。表3提供了關于本文所公開的TNF受體樣受體和受體配體的附加信息。它還提供了關于分離的PLAD以及含有本文所公開的分離的PLAD的多肽的用途的信息。所述PLAD可^JI來研究干擾TNFR超家族受體介導的信號傳導途徑的意義。例如，如果經(jīng)由TNFR超家族受體的信號傳導是已知的或被證明與疾病途徑相關，則通過本發(fā)明的多肽抑制受體的前g己體裝配可以治療獲預防該疾病。例如，可凈皮治療的疾病包括癌癥、心臟病和炎性疾病。PLAD的修飾也會改變配體/受體相互作用的親和力，這可被用于體夕卜研究，例如測量配體和受體的結合、受體信號等。熒光標記的PLAD蛋白也可凈皮用作通過流式細胞術或熒光顯孩沐來確定細胞表面上特異性TNFR相對表達時的試劑。4^發(fā)明還4^供了^、有分離的PLAD的38至125個氨基酸的多肽。例如，所述肽可以是含有分離的PLAD的50至125個氨基酸的多肽。在一個進一步的實例中，所述多肽可以包括子序列R廣TNF受僻^羊受體PLAD-R2,其中R!和R2是任選的，當存在時它們可以是H、絲、NH2、絲酸或肽。當存在時，&和/或R2可以是^f可M酸。當Ri和/或R2;Ui時，該肽的長^l:可變的。例如，Ri和/或R2的長度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個絲酸，只要含有分離的TNF樣PLAD的整個肽不超過125個M酸g，而且其長度可以是38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125個絲酸。R1和R2也可以是TNF受偉樣受體的序列，所*列一^位于天然存在的TNF受>(^#受體中TNF受體樣受體PLAD的側面，其中所述含有TNF樣受體PLAD的多肽并不是TNF受體樣受體的整個胞外結構域。本發(fā)明進一步提供了任何大小的多肽，包括TNF受體樣受體的前配體裝配域(PLAD)的分離的氨基酸序列，其中所述多肽為Rl-TNF受體樣受體PLAD-R2,其中Rl或R2包括不位于天然存在的TNF受體樣受體中TNF受體樣受體PLAD側面的tt酸序列。Rl或R2(但并非兩者同時)可以是TNF受體樣受體的全部或部分序列，所述序列通常位于天然存在的TNF受*受體中TNF樣PLAD的側面。例如，PLAD可以來自TNF受體樣受體且R1或R2可以是不存在于所述TNF受體樣受體中或任何其它TNF受體樣受體中的M酸序列，所述多肽的TNF樣PLAD來自于所述TNF受體樣受體。Rl或R2可以是任何的氨基酸序列，只要R1-TNF樣PLAD-R2不^然存在的全長TNF受體樣受體。在另一個實例中，PLAD可以來自TNF受體樣受體且Rl或R2或兩者，如果存在的話，可以是來自另一個TNF受^#受體的^列。因此，本領域技術人員可以將一個TNF受^#受體的PLAD與來自一個不同的TNF受體沖羊受體的Rl或R2序列結*來以獲得這種多肽。由于已知的TNF受4^羊受體的序列是可公開獲得的，所以本發(fā)明的多肽的Rl和R2的結構4艮多，但也是已知的并被本文所考慮?；蛘?，Rl或R2可以是不與任何TNF受^f羊受體序列相關的^列。在一個實施方案中，所述含有分離的PLAD的多肽不是美國專利5，633，145(Feldmanetal.)中所v^開的成熟(不含信號序列)TNF1受體的124個虔基酸的序列。^^有上述子序列的多肽的實例包括R廠成熟p60的第1-38、1-39、1-40、1—41、1-42、1—43、1-44、1-45、1—46、1-47、1-48、1-49、1—50、1—51、1-52、1-53或1-54位M酸-R2(例如SEQIDNO:1);R廣成熟p80的第10-48、10-49、10-50、10-51、10-52、10-53或10-54位#^酸-112(SEQIDNO:2);R「成熟Fas的第1-38、1-39、1-40、1-41、1-42或1-43位絲酸-112(SEQIDNO:3);R廠成熟Fas的第1—38、1—39、1-40、1—41、1-42、1-43、1-44、1-45、1-46、1-47、1-48、1-49、1-50、1-51、1-52、1-53、1-54、1-55、1-56、1-57、1-58、1-59、1-60、1-61、1-62、1-63、1-64、1-65或1-66位絲酸-R2(SEQIDNO:4);R廣成熟LtpR的第13-50位絲酸-R2(SEQIDNO:5);R廠成熟CD40的第6-39位絲酸-R2(SEQIDNO:6);R廠成熟CD30的第11-49、11-50或11-51位絲酸-&(SEQIDNO:7);R廠成熟CD27的第7-42位氨基酸-R2(SEQIDNO:8)，R廣成熟HVEM的第6-37位絲酸-FUSEQIDNO:9);R廣成熟0X40的第3-36位絲酸-R2(SEQIDNO:10)以及R廠成熟DR4的第109-138位M酸-FUSEQIDNO:11)。成熟p60(TNFR1)多a始于祐耒示為SEQIDNO:12的全長p60編碼序列的第30位。因此，本發(fā)明提供了一種含有成熟p60蛋白的第l-M位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的30-83位絲酌、一種含有成熟p60蛋白的第1-53位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-82位M酌、一種含有成熟p60蛋白的1-52位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-81位M酌、一種含有成熟p60蛋白的第1-51位M酸的多肽(SEQIDN0:12的第30-80位M酌、一種含有成熟p60蛋白的第l-50位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-79位婁l船、一種含有成熟p60蛋白的第l-49位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-78位#^酌、一種含有成熟p60蛋白的第l-48位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-77位J^酌、一種含有成熟p60蛋白的第1-47位#^酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-76位絲紛、一種含有成熟p60蛋白的第1-46位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-75位絲酌、一種含有成熟p60蛋白的第1-45位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-74位M酌、一種含有成熟p60蛋白的第l-44位氨基酸的多肽(SEQIDN0:12的第30-73位M酌、一種含有成熟p60蛋白的第1-43位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-72位tt酌、一種含有成熟p60蛋白的第l-42位絲酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-71位M酌、一種含有成熟p60蛋白的第1-41位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-70位M酌、一種含有成熟p60蛋白的第1-40位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-69位M紛、一種含有成熟p60蛋白的第1-39位萄基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-68位M酌以及其它含有成熟p60蛋白的保持了PLAD活性的第l-54位氨基酸片段的多肽。成熟p80(TNFR2)多A^始于被表示為SEQIDNO:13的全長p80編碼序列的第23位。因此，本發(fā)明提供了一種含有成熟p80蛋白的第10-54位M酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-76位M酌、一種含有成熟p80蛋白的第10-53位氨基酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-75位M酌、一種含有成熟p80蛋白的第10-52位絲酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-74位絲酌、一種含有成熟p80蛋白的第10-51位絲酸的多肽(SEQIDN0:13的第32-73位M酌、一種含有成熟p80蛋白的第10-50位M酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-72位M酌以及其它含有成熟p80蛋白的保持了PLAD活性的第10-54位M酸片段的多肽。成熟Fas受體多^始于被表示為SEQIDNO:14的全長Fas編碼序列的第17位。因此，本發(fā)明提供了一種含有成熟Fas蛋白的第位#^酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-59位絲酌、一種含有成熟Fas蛋白的第1-42位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-58位#^酌、一種含有成熟Fas蛋白的1-41位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-57位M紛、一種含有成熟Fas蛋白的第1-40位絲酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-56位M酌、一種含有成熟Fas蛋白的第1-39位g酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-55位M酌以及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-43位氨基酸片段的多狀。本發(fā)明還提供了一種含有成熟Fas蛋白的第l-66位M酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-82位^J^酌、一種含有成熟Fas蛋白的第1-65位M酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-81位絲船、一種含有成熟Fas蛋白的第1-64位^J-酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-80位絲酌、一種含有成熟Fas蛋白的第1-63位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-79位M酌、一種含有成熟Fas蛋白的第1-62位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-78位M酌以及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-66位氨基酸片段的多肽。本發(fā)明還提供了一種含有^L4示為SEQIDNO:15的全長LTPR蛋白的第43-80位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:15的保持了PLAD活性的第43-80位M酸片段的多肽。本發(fā)明還提供了一種含有^^示為SEQIDNO:16的全長CD40蛋白的26-59位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:16的保特了PLAD活性的第26-59位J^酸片段的多肽。成熟CD30多Jlk^始于被表示為SEQIDNO:17的全長CD30編碼序列的第19位。因此，本發(fā)明提供了一種含有成熟CD30蛋白的第11-51位氨基酸的多肽(SEQIDNO:17的29-69位M酌、一種含有成熟CD30蛋白的第11-50位M酸的多肽(SEQIDNO:17的29-68位^J^酌、一種含有成熟CD30蛋白的第11-49位氨基酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-67位M酌、一種含有成熟CD30蛋白的第11-48位M酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-66位M酌、一種含有成熟CD30蛋白的11-47位M酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-65位M酌以及其它含有成熟CD30蛋白的保持了PLAD活性的第11-51位M酸片段的多肽。本發(fā)明還提供了一種含有^il4示為SEQIDNO:18的全長CD27蛋白的第27-62位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:18的保持了PLAD活性的第27-62位M酸片段的多肽。本發(fā)明還提供了一種含有被表示為SEQIDNO:19的全長HVEM蛋白的第42-75位氨基酸的多肽以及其它包含含有SEQIDNO:19的保持了PLAD活性的42-75位M酸的多肽片段的多肽。成熟0X40多J!^始于祐耒示為SEQIDNO:20的全長0X40編碼序列的第29位。因此，本發(fā)明提供了一種含有成熟0X40蛋白的第3-36位M酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-64位M酌、一種含有成熟0X40蛋白的3-35位絲酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-63位絲酌、一種含有成熟0X40蛋白的3-34位氨基酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-62位M劇、一種含有成熟0X40蛋白的3-33位g酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-61位M酌、一種含有成熟CD30蛋白的第3-32位氨基酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-60位以及其它包含含有成熟0X40蛋白的保持了PLAD活性的第3-36位氨基酸的多肽片段的多肽。本發(fā)明還提供了一種含有^L4示為SEQIDNO:21的全長DR4蛋白的第132-170位氨基酸的多肽以;^其它包含^^有SEQIDNO:21的保持了PLAD活性的第132-170位M酸的多肽片段的多肽。表1列舉了含有本發(fā)明的PLAD的TNF受體樣受體的實例。根據(jù)表1中列出GenBank躬己號可以找到這些受體的核苷酸和多M列。根據(jù)表1中列出GenBank躬己號所示出的核苦酸序列、多肽序列以及^f^f可信息(例如信號序列和成熟蛋白歹MJ^O的全部內(nèi)容通過引用的方式納入本說明書。例如，根據(jù)GenBank躬己號M75866可以找到p60的核苦酸序列、多肽序列和附加信息(例如信號序列和成熟蛋白殘基奶。根據(jù)GenBank躬己號M75866所示的這些p60序列和附加信息的全部內(nèi)容通過引用的方式納入本說明書。類似地，根據(jù)GenBank&己號M32315可以找到4十對p80所示出的核苷酸序列、多肽序列和附加信息(例如信號序列和成熟蛋白殘基奶。根據(jù)GenBank射己號M32315所示出的這些p80序列和附加信息全部通過引用的方式納^^說明書。通過訪問表l中列出的GenBank躬己號，本領域技術人員可以訪問到其中列出的附加GenBank躬己號以獲得與信號序列和成熟蛋白序列相關的附加信息。例如，當訪問GenBank射己號M75866時，本領域技術人員可以訪問到表示p60的信號序列和成熟蛋白序列信息的GenBank射己號AAA61201。該信息也可通過直^訪問GenBank射己號AAA51201(p60)、GenBank躬己號AAA59929(p80)、GenBank射己號AAA63174(Fas)、GenBank射己號AAA36757(LTBR)、GenBank射己號CAA43045(CD40)、GenBank射己號AAA51947(CD30)、GenBank躬己號AAA58411(CD27)、GenBank射己號AAB58354、GenBank躬己號CAA53576(0X40)、GenBank躬己號AAC51226(DR4)找到，該信息通過引用的方式納入本說明書。表1還提供了TNF樣受體的LocusLink射己號?，F(xiàn)在LocusLink射己號等同于在美國國立醫(yī)學圖書館的美國國家生物^支術信息中心可以訪問到的EntrezGene識別號(GeneID號)。例如，本領J^^支術人員可以通過訪問EntrezGene數(shù)據(jù)庫中的LocusLink號7132(3脈為EntrezGene中的GeneID7132)獲得關于p60的附加信息，包括核苷酸和蛋白序列。類似地，本領域技術人員可以通過訪問EntrezGene數(shù)據(jù)庫中的LocusLink號7133(現(xiàn)在為EntrezGene中的GeneID7133)獲得關于p80的附加信息，包括核苦酸和蛋白序列。因此，本領域技術人員通過訪問表l中所列的4^f可TNF樣受體在EntrezGene中的相應LocusLink(GeneID)號可以#^1易地獲得與它們相關的信息。所有根據(jù)表l中列出的LocusLink(GeneID)號提供的信息的4^P內(nèi)絲過引用的方式納入^^i兌明書。提供了含有vTNFR蛋白PLAD結構域的分離的J^^列的多肽(SEQIDNO:28-39)?？梢?吏用蛋白-蛋白BLAST數(shù)據(jù)庫的用于TNFR1和TNFR2PLAD序列的同源搜索來鑒定其它vTNFRPLAD。也包括每種vTNFR及其修飾蛋白的全長絲蔣列(SEQIDNO:44—55)。還提供了可被本領域技術人員用iMt其他vTNFRPLAD多肽進行鑒定、生產(chǎn)和功能測試的方法等。vTNFRPLAD結構域可以中斷宿主TNFR的自締合和/或隨后的配體結合以抑制抗病毒免疫和/或保護感染的細胞免遭TNF介導的細胞死亡。M-T2蛋白---種由粘液瘤病毒編碼的TNF受>^#蛋白一一可以保護粘液瘤感染的T細胞免遭TNF誘導的死亡并且不^其胞外TNF結合能力(82)。由于針對與宿主TNFRPLAD結構域結合的較高親和力的進化選擇，vTNFRPLAD序列可以用作比P60或P80PLAD本身更有效的TNF誘導作用抑制劑。在這點上，分離的病毒PLAD蛋白代表了用于阻斷與類風濕性關節(jié)炎和其他自身免疫性疾病相關的TNF-相關發(fā)病的臨床應用的改良試劑。應該理解的是，例如本文所述的這些技術，可被用于鑒定其它的微生物蛋白，所述蛋白與本文所述其它TNF受體樣受體(例如Fas)中存在的PLAD結構域具有同源性。例如公開了含有與所述FasPLAD結構域(SEQIDNO.41-43，56-58)同源的序列的微:生物多肽的三個實例。本文所用的"PLAD的分離的M齡列"是指M上不含在自然界中通常與所述M酸序列相關的天然存在的物質(zhì)的序列。本發(fā)明的多肽可以包括具有PLAD活性的PLAD結構域或其片段的整個M酸序列。本發(fā)明的多M其片段可通it^細胞中分離和純化所述多肽來獲得，其中這些多肽可天然產(chǎn)生或通it4iii^碼PLAD的外源核g產(chǎn)生。PLAD的片段可以通過肽的化學合成、通過PLAD或含有PLAD的多肽的蛋白水解切割以及通過用編碼目的部分的核酸合成來獲得。所述PLAD可以包括保守性置換，其中天然存在的氨基酸被具有類似性質(zhì)的氨基酸所置換。這類保守性置換不會改變該多肽的功能。通過產(chǎn)生各種氨基酸置換并iL4說明書中所述的結合測定中使用本領域普通技術人員可利用的技術對它們進行測試可以找到能增強結合和有效性的突變。因此，應該理解的是，如果需要，可以在編碼本發(fā)明多肽的核酸和/或本發(fā)明多肽的^J^酸序列中進行修飾和改變并且仍獲得具有類似的或所需的特征的多肽。這類改變可以存在于天然分離物中或者可以利用定點突變來通過合成手段引入，其方法(如錯配聚合絲iUJl(PCR))在本領域中是已知的。例如，多肽中的某些M酸可以凈皮其它氨基酸置換，同時沒有明顯的功能活性損失。因此，應該考慮到可以在所述PLAD的JIJ^酸序列(或其基礎核酸序列)中制造各種改變，同時沒有明顯的生物效用或活性損失并且這些效用或活性還可能增加。例如，p60TNFR天然序列中的Q24A突變、D49R突變和K19E突變不^有損PLAD的自締合。這些多肽也可以用本領域熟知的許多方法中的任何方法來獲得。一種產(chǎn)生多肽的方法是利用蛋白質(zhì)化學技術來將兩種肽或多M接起來。例如，可以通過Fmoc(9-芴曱氧mO或Boc(叔丁氧J^O化學，利用現(xiàn)在可獲得的實驗室4義器來化學合成肽或多肽(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)。本領域技術人員可以#^易地認識到可以通過標準的化學^來合^目當于特定蛋白的肽或多肽。例如，可以一種合成肽或多肽并且不將它從其合成樹脂上切下來，同時可以合成一種雜合肽的另一片段并I^將它從所述樹脂上切下來，從而暴露出該另一個片段上被功能性封閉的末端基團。利用肽縮合反應，可以分別通itit些兩片段的g和M末端的肽鍵將它們共價連4!"起來形成較大的多肽(Grant,ASyntheticP印tides:AUserGuide,W.H.FreemanandCo.，N.Y.(1992)和BodanskyandTrost,Ed"PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-VerlagInc.,N.Y.(1993))?；蛘?，如上所述，可以在體內(nèi)獨立地合成所述肽或多肽。一旦分離，則可以通過類似的肽縮^^M將這些獨立的肽或多肽連^^形成較大的蛋白。例如，克隆的或合成的肽區(qū)段的SI^連接可使得能夠?qū)⑾鄬Χ痰碾钠芜B接起來以產(chǎn)生較大的肽片段、多肽或全蛋白結構域C^w/z^e/7Wa/.Biochemistry,30:4151(1991))?；蛘撸梢岳煤铣呻牡奶烊换瘜W連接來通過合成方法由較短的肽片段構建較大的肽或多肽。該方法由兩步化學Jl^組成(/feH^0/7e/"a/.ASynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation,Science,266:776-779(1994))。第一步是無保護的合成肽-%-疏酯與另一種含#^末端Cys殘基的無保護肽區(qū)段進行化學選擇反應以產(chǎn)生作為初始共價產(chǎn)物的硫酯連接性中間產(chǎn)物。在不改變反應條件的情況下，該中間產(chǎn)物經(jīng)歷了自發(fā)的快速分子內(nèi)反應從而在連接位置形成天然肽鍵。這種天然化學連接方法在蛋白分子全合成過程中的應用可通it^白細胞介素8(IL-8)的制備來i兌明(67a,i-Zew7ia/.FEBSLett.，307:97(1987)，6VarHew^y"a/,J.Biol.Chem.，269:16075(1994)，C/ayir-Zew^ya/.Biochemistry,30:3128(1991),和ia力ra^/a邁Wa/.Biochemistry,29:1689(1994))?；蛘?，無保護的肽區(qū)段可以是化學連接的，其中由于化學連接而在所述肽區(qū)段之間形成的鍵是非天然鍵(非肽鍵)CSt力加/zera/.Science,256:221(1992))。這種技術已經(jīng)被用來合成蛋白結構域的類似物以及大量具有完全生物活性的相對較純的蛋白(f/eZ/Wea/.ATechniquesinProteinChemistryIV，AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992))。本發(fā)明還提供了用于所公開多肽的g擬物。"g擬物"被定義為包括化合物或有機分子或任何其它肽才莫擬物，其結構是基于或書f生自蛋白的結合區(qū)域。例如，人們可以建立預測化學結構的模型以模擬結合區(qū)域(如PLAD)的結構，?？梢允褂脴藴史椒▉磉M行這種建模?；蛘?，也可以以和所述肽大致相同的方式來從組合化學文庫中選擇肽模擬物(Ostresh，J.M.a丄，Jcad5t/做j1994Nov8;91(23):11138-42;Dorner,B.a/.，A/oow#ecTC力e邁1996May;4(5):709—15;Eichler，J."a人，1995Nov;15(6):481-96;Blondelle，S.E."a厶5/oc力柳/1996Jan1;313(Pt1):141—7;Perez—Paya，E.a/.,/A/o/C力e邁1996Feb23;271(8):4120-6)。也可以利用功能測定iM^擇Ab^擬物。本發(fā)明的多肽可與另一部分例如核酸、蛋白、肽、配體、糖部分、病毒蛋白、單克隆抗體、多克隆抗體或脂質(zhì)體相連接。此外，也可以將兩個或多個含PLAD的多肽彼jtbf目連接。例如，可以制名^^有兩個或多個不同PLAD的雙功能或多功能多肽以使得所述多肽能夠調(diào)節(jié)多種TNF受>^#受體的活性。所述多肽也可以含有兩個或多個源自相同TNF受^#受體的PLAD以增加這種多M"特定TNF受^#受體的親合力。含PLAD的融^^構j^體本文公開了含PLAD的融合蛋白和編碼它們的核酸。所述融合蛋白可以包括本文所公開的連接了融合標簽的TNF受體樣受體PLAD。所述功能分子可以是抗體或其靶向部分或其它融合標簽。由于PLAD是在細I^面上的，所以所組成部分。例如，非TNF受^^羊標志物的配體的標志物結^P分可以與PLAD融合，所述標志物位于指定的靶細胞的表面。所述PLAD可以與各種載體蛋白例如免疫球蛋白或其它血清、可溶的和/或穩(wěn)定的蛋白融合。所述融合標簽可以是GST或其它有助于所述融^白純化的分子。含PLAD的融^白可以包括有助于重組表達的PLAD分泌的信號序列。也可以將編碼包括PLAD或由PLAD組成的多肽的核酸與其它核酸功能性地連接以編碼免疫粘合素。對本發(fā)明來i兌，術語"免疫粘合素"被定義為包括任何由核酸編碼的多肽，其中編碼非免疫球蛋白分子(例如PLAD)的核酸的至少一部分與編碼免疫球蛋白重鏈多肽(例如IgG)的核酸的至少"-^分偶聯(lián)。IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgE的Fc區(qū)也可^UUiM^^疫津t^素。在一個具體的實例中，所述融合蛋白包括與IgFc區(qū)部分一一特別是IgY4的Fc區(qū)部分一一融合的PLAD,。所述偶聯(lián)是通過一種確保所述核酸片段能進行功能性轉(zhuǎn)錄⑩譯并提供從其中分別獲得的信息的方式來實現(xiàn)的?？梢酝?各種哺乳動物宿主細胞以及桿狀病毒感染的細胞中的瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來表達PLAD多肽融合蛋白。所表達的融M白可以根據(jù)標準方法來純化。與抗體類似，IgG免疫粘合素可以通過一步蛋白A或蛋白G親和色語從被分泌了該免疫津給素的培養(yǎng)基中純化出來。轉(zhuǎn)基因提供了編碼PLAD的轉(zhuǎn)基因。"轉(zhuǎn)基因，，是指被^MlA為地插入到細胞中并成為該細胞及其子代細胞基因組的一部分的核酸序列。對于所述細胞來說，該轉(zhuǎn)基因可以是(但不一定;U部分或完全異源的(例如，來自不同的物種)。術語"轉(zhuǎn)基因"寬^J也指被導入到動物基因組中的^f可核酸，包括但不限于含有通?？赡懿淮嬖谟谒龌蚪M中的序列的基因或DNA、在給定基因組中存在但通常不會被轉(zhuǎn)錄和翻譯(表達)的基因或者人們希望導入到所述基因組中的4封可其它基因或DNA。這可包括可能通常存在于非轉(zhuǎn)基因基因組中但是人們希望改變其表達或者是人們希望以改變或變體形式導入的基因。轉(zhuǎn)基因可以包括一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和可能是所選定的核酸的最佳表達所需的任何其它核酸，例如內(nèi)含子。轉(zhuǎn)基因可以只有兩個核苷酸長，但是優(yōu)選地至少約50、100、150、200、250、300、350、400或500個核苷酸長或甚至更長。轉(zhuǎn)基因可以是編碼或非編碼序列或者其組合。轉(zhuǎn)基因通常包括能夠在適當M下促使一種或多種轉(zhuǎn)基因表達的調(diào)控元件。抗體本發(fā)明還提供了與TNF受體樣受體的PLAD特異性結合的抗體。例如，本發(fā)明的抗體可以是與TNF受體的PLAD特異性結合的抗體、與FAS的PLAD特異性結合的抗體或與DR4的PLAD特異性結合的抗體，僅舉這些為例。所述抗體(多克隆或單克隆)可以是指本文所提供的何所考慮到的任何多肽，天然存在的和重組的多M其免疫源片段。所述抗體可凈皮用于例如診斷、治療或疫苗接種等技術或方法中。也考慮到了抗-個體基因型抗體和親和力成熟抗體?？梢酝ㄟ^許多熟知的方法來制備抗體(例如，參見a/w/Za/e，"Antibodies;ALaboratoryManual"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,(1988))。簡言之，以足以引出免M答的量和間隔將純化的抗原注射到動物體內(nèi)?？贵w可以是直接純化的或者脾細胞可以是從動物體內(nèi)獲得的。然后可以將所述細胞與無限增殖細胞系融合并且篩選抗體分泌。所述抗體可用來篩選可分泌該抗原的細胞的核酸克隆文庫。然后對這些陽性克隆進行測序(例如，參見Kellyeta/.A/0/rec力/70/0^7，10:163—167(1992);&^//7^0/7Wa人Ar'o/7fec力加/^7，10:169—175(1992))。本發(fā)明也考慮了人源化抗體和嵌合抗體。可以通過熟知的方法來制備異源抗體(例如，參見美國專利5545806、5569825、5625126、5633425、5661016、5770429、5789650和5814318)。術語與多肽"特異性結合"是指可確定在一群異源蛋白和其他生物制品中是否存在所述蛋白的一種結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，與特定蛋白結合的特定抗體不與樣品中的其它蛋白以顯著量結合。在這類M下，與抗體的選擇性結合可能會需要根據(jù)它對特定蛋白的特異性而被選出的抗體。可以使用各種免疫測定形式來選擇會與特定蛋白選擇性結合的抗體。例如，通常使用固相ELISA免疫測定法^擇可選擇性地與蛋白進行免^L^應的抗體。關于可被用來確定選擇性結合的免疫測定形式和條件的描述請參見泡r/owa/"a/e"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,(1988)。核酸本發(fā)明還提供了編碼最長達125個氨基酸的多肽的核酸，所述多肽含有TNF受體樣受體的PLAD;以及提供了編碼由TNF受體樣受體PLAD組成的多肽的核酸。本發(fā)明還提供了編碼最長達125個氨基酸的多肽的核酸，所述多肽含有分離的PLAD,其中所述多肽含有子序列R廣PLAD-R2，其中H和&是^^的，并且當存在時，它們可以是H、、NH2、^J^酸和肽。本發(fā)明進一步提供了編碼這樣一種多肽的核酸，所述多肽含有TNF受體樣受體的前配體裝配域(PLAD)的分離的M酸序列，其中所述多肽為R廣TNF受體樣受體PLAD-R2，其中R!或R2包括不位于天然存在的TNF受體樣受體中TNF受體樣受體PLAD側面的M酸序列。本文所用術語"核酸"是指可以是DNA或RNA或其4^f可組合的單鏈或多鏈分子，包括對這些核酸的修飾。所述核酸可以代表編碼鏈或其互4喊或其任何組合。核酸的序列可以與本文所討論的任何新基因的天然存在序列相同或者可以包括編碼與天然存在序列中發(fā)現(xiàn)的M酸一樣的氨基酸的備選密碼子。也可以對這些核酸的典型結構進行修飾。這些修飾包括但不限于曱基化核酸、將磷酸殘基上的未橋接氧用硫(產(chǎn)生硫代磷自氧核苷酌、硒(產(chǎn)生硒代磷酸(phosphorselenoate)脫氧核苷酌或曱基基團(產(chǎn)生曱基膦皿氧核可以從通常存在編碼PLAD的核酸分子的生物體中將其分離。例如，可以構建基因組DM或cDNA文庫并篩選目的核M否存在。構建和篩選這類M的方法是本領域中已知的，用于進行所述構建和篩選步驟的試劑盒是市售的(，'H口，StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。一旦分離，就可以將所述核酸直接克隆到適當?shù)妮d體中，或者如果需要的話，可以對其進行修飾以幫助后續(xù)的克隆步驟。這些修飾步驟是常規(guī)的，一個實例是在所述核酸末端加入含有限制性位點的寡核苷酸接頭。i^邁6/w^efa/.,"MolecularCloning,aLaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中闡述了-"^:的方法。本發(fā)明也考慮了編碼PLAD的不含配體結合位點的核酸。一^SJ^得了所需的PLAD的核酸序列，就可以利用本領域中已知的技^任何具體的tt酸位置對編碼特定氨基酸的序列進行修飾或改變。例如，可以設計跨越所述一個或多個g酸位置的以>^任何#^酸可#:另一種氨基酸置換的PCR引物。然后可以擴增核酸并將其插入到野生型PLAD編碼序列中以獲得在所述PLAD的任何位置上的氨基酸的許多可能組合的任一種?；蛘?，本領域技術人員可以通過點突變技術在特定核酸序列中的任何位點引入特定的突變。5fe"力，M"Invitromutagenesis"Ann.Rev.Gen.，19:423-462(1985)和ZoZ/er,i/."Newmolecularbiologymethodsforproteinengineering"Curr.Opin.Struct.Biol.，1:605-610(1991)中闡述了一般的方法。這些技術可^^1來改變編碼序列而不改變所編碼的M酸序列。一種獲得編碼PLAD的DNA分子的方法的另一個實例是^^成編碼所述PLAD的重組DNA分子。例如，寡肽合成方法在是本領域中常規(guī)的，用于編碼特定蛋白區(qū)域的寡核苷^UL^易通過自動DNA合成來獲得的?？梢院铣呻p鏈分子一條漣的核酸并且使其與它的互^喊雜交。Ail']可以i殳計這些寡核苷酸^吏得所得的雙鏈分子具有內(nèi)部P艮制性位點或在末端含有適當?shù)?，或3，突出端以克隆到適當?shù)妮d體內(nèi)。通過下述方法可以#^易地合成編碼相對較大的蛋白的雙鏈分子首先構建幾種不同的編碼所述蛋白特定區(qū)域的雙鏈分子，之后將這些廳^"連接在-"^。例如，C畫/./^A2邁，e"丄，"Rec印torandAntibodyEpitopesinHumanGrowthHormoneIdentifiedbyHomolog-ScanningMutagenesis,"Science,243:1330-1336(1989)已經(jīng)通過首先構建重疊和互補的合成寡核苷酸并將這些片段連接起^而構建了編碼人生長激素基因的合^&因。也可參見ferre"/，a/.，Proc.Nat.Acad.Sci.82:599—603(1986)，其中/^開了用合成的寡核苷^L合成1057個絲對的合成的牛視紫紅質(zhì)基因。通過以這種方式構建PLAD,本領域技術人員可以;f膝易地獲;^f壬何特定的PLAD，所述PLAD在PLAD內(nèi)的任何一個或多個特定位置上具有所需氨基酸。也參見美國專利5，503,995,所述專利描述了一種制*成基因的酶模;^1>^應方法。這類技術在本領域中是常規(guī)的并且是有詳盡記錄的。然后可以按照下文所^體內(nèi)或體外表iiii些核酸或編碼PLAD的核酸片段。本發(fā)明還提供了編碼PLAD的分離的核酸，所述核酸位于適合于表達它的載體中。一旦對編碼特定的目的PLAD的核酸或該核酸的一個區(qū)域進行構建、修飾或分離后，就可以將該核^隆到適當?shù)妮d體中，所述載體可以指導該野生型和/或修飾后PLAD的體內(nèi)或體外合成。考慮到了所述載體應具有指導和調(diào)控插入基因或核酸轉(zhuǎn)錄所需的功能元件。這些功能元件包括但不限于啟動子、所述啟動子的上下游區(qū)域例如可能會調(diào)控所述啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增強子、復制起點、有助于所述啟動子附近的插入片段克隆的適當?shù)南拗菩晕稽c、抗生素抗性基因或能用來篩選含有所述載體或所述的含插入片段的載體的細胞的其它標記、RNA剪接點、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)或者能用來幫助所述插入基因或雜合基因表達的4^f可其它區(qū)(通常參見i^6rooi:efa人)。丑co7/(;tM埃希氏菌Cfoc力er/c力/aco/i))表達載體。其它適^H^吏用的微生物宿主包括桿菌例如枯草桿菌(勘c///^，以及其它腸桿菌(勘c///〃》例如沙門氏菌C^/MMey/a)、沙雷氏菌(5fem和名4f假單胞菌(AeW咖o加;y)種。在這些原核宿主中，人們也可以制備表達載體，所ii^達載體通常含有與所述宿主細船目容的表達控制序列(例如復制起點)。此夕卜，應存在^f可數(shù)量的各種已知啟動子，例如享Ut啟動子系統(tǒng)、色氨酸(Trp)啟動子系統(tǒng)、P-內(nèi),酶啟動子系統(tǒng)或入噬菌體的啟動子系統(tǒng)。所述啟動子通常會控制表達，任選地具有操縱子序列；并且應含有核糖體結合位點序列，例如用于啟動并完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。如果需要的話，可以通過插入5，端Met密碼子并符合讀框地插入下游核酸插入物來提供^J^末端曱減氨酸。也可以使用標準的寡核苷酸突變方法iM多除核酸插入片段的^^末端延伸部分。此外，可以使用酵母表達。酵母表達系統(tǒng)具有多種優(yōu)勢。首先，有證據(jù)表明酵母分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白呈現(xiàn)出具有正確的j^克鍵配對。其次，翻譯后糖基化是通過酵母分泌系統(tǒng)來有效地進行的。釀酒酵母CS^cc力aro邁ycescerew'w'ae)的前-原-oc因子前導區(qū)(由W-7基因編碼)通?？蒦^l來指導酵母的蛋白分泌C&"We，""，Alpha-Factor-DirectedSynthesisandSecretionofMatureForeignProteinsini^cc力aro,ce51cereWae.Proc.Nat.Acad.Sci.，81:4642-4646(1984))。前-原-oc因子的前導區(qū)含有信號肽和原區(qū)段，所ii^、區(qū)段包括由KEX2基因編碼的酵母蛋白酶的識別序列這種酶可切割Lys-Arg二肽切割信號序列的g側上的前體蛋白。所述核酸編碼序列可以在框內(nèi)與所述前-原-ot因子的前導區(qū)融合。然后將這種構建體置于強轉(zhuǎn)錄啟動子例如乙醇脫氫酶I啟動子或糖酵解啟動子的控制之下，。所述核酸編碼序列之后是翻*止密碼子，所述翻*止密碼子之后是轉(zhuǎn)錄終止信號?；蛘?，所述核酸編碼序列可以與另一種蛋白編碼序列(如Sj26或p-半乳糖苷酶)融合以便于通過親和色語來純化所述融M白。對于用于酵母表達的構建體來說，插入蛋白S^刀割位點來分離融M白的^^且成部分是可4亍的。也可以在桿狀病毒系統(tǒng)中實現(xiàn)有效的翻譯后糖基化和重組蛋白表達。哺乳動物細胞能在有利于重要的翻譯后修飾(例如折疊和半胱氨酸配對)的環(huán)境中表達蛋白、加入復雜的糖結構以及分泌活性蛋白。用于在哺乳動物細胞中表達活性蛋白的載體以在強病毒啟動子和多腺苷酸化信號之間插入了蛋白編碼序列為特征。所述載體可以含有賦予了用于基因擴增的潮霉素抗性、慶大霉素或G418抗性的基因，或者其它適^^被用作可篩選標記的基因或表型，或者的甲M呤抗性基因。使用曱呤抗性編碼栽體可以將所述嵌合蛋白編碼序列導入到中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系中或者使用適合的篩選標記將其導入到其他細胞系中。通過DNA印跡分析可以確證是否在轉(zhuǎn)化的細胞中存在所述載體DNA。通過RM印跡可以證實產(chǎn)生了對應于插入片段編碼序列的RM。本領域中已經(jīng)開發(fā)了許多其它適合的能夠分泌完整的人類蛋白的宿主細胞系，包括CHO細胞系、Hela細胞、骨髓瘤細胞系、Jurkat細胞等。用于這些細胞的表達載體可包括表達控制序列，例如復制起點、啟動子、增強子和必需的信息加工位點，例如核糖體結^^位點、RNA剪接位點、多腺苦酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達控制序列是來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒等的啟動子。通過已知的方法可以將含有目的核酸區(qū)段的載體轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，這些方法^^艮據(jù)細胞宿主的類型變化。例如，氯化鉤轉(zhuǎn)化通常祐JD于原核細胞，而磷酸釣、DEAE葡聚糖或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)介導的轉(zhuǎn)染或電穿孔可被用于其它真核細胞宿主。可釆用用于在哺乳動物細胞中表達基因或核酸的備選載體，那些載體與被開發(fā)用M達人Y-干擾素、組織纖溶酶原激活因子、凝血因子vm、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶Nexinl和嗜酸性粒細胞主要堿性蛋白的載體類似。此外，所述載體可以包括可以用于在哺乳動物細胞(如C0S-7)中表達插入核酸的CMV啟動子序列和多腺苷酸化信號。昆蟲細胞也能表達哺乳動物蛋白。在含有桿狀病毒載體的昆蟲細胞中生產(chǎn)的重組蛋白可經(jīng)過類似于野生型蛋白的翻譯后修飾。簡言之，用于在昆蟲細胞中表達活性蛋白的桿狀病毒載體以插入了苜蓿銀紋夜蛾(^^^ra/7力2'caca/27bi77/'ca)核型多角體病毒(AcNPV)啟動子下游的蛋白編碼序列為特征，所述啟動子是針對編碼主要的包涵體蛋白一一多角體蛋白的基因的。用病毒DNA和質(zhì)粒DNA的混合物轉(zhuǎn)染所培養(yǎng)的昆蟲細胞例如草地貪夜蛾GS^cto/^e"/y塔2》er^)細胞系并JJ^所述病毒子代進行平板培養(yǎng)。多角體蛋白基因的缺失或插入失活會導致產(chǎn)生包涵體陰性病毒，所述病4^形成與野生型包涵體陽性病毒明顯不同的蝕斑。這些特征性蝕斑形態(tài)允許可^li也篩選AcNPV基因已經(jīng)被選定的雜合基因所^l代的重組病毒。本發(fā)明還提供了含有預期核酸的載體，所述載體位于適合于表達所述核酸的宿主中。通過已知的方法可以將含有目的核酸區(qū)段的載體轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，這些方法會根據(jù)細胞宿主的類型變化。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導和電穿孔通常被用于原核細胞，而磷酸鈣、DEAE葡聚糖或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)介導的轉(zhuǎn)染或電穿孔可被用于其它細胞宿主?；蛘?，本發(fā)明的核酸可以與一個或多個指導和調(diào)控插入核酸轉(zhuǎn)錄的功能元件可操作地連接，且所述核酸可凈i^達。例如，核酸可以與細菌或噬菌體啟動子可^作地連接并且凈皮用來指導所述核酸的體外轉(zhuǎn)錄。一個進一步的實例包括在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)中使用本文提供的核酸，其中所述核酸指導轉(zhuǎn)錄且由此產(chǎn)生的RNA會被用作翻譯的模板以生產(chǎn)多肽。本領域技術人員應理肽來產(chǎn)生^體)中或口用在將所述多M予至細胞或受試者的方法中。結合載體進行的核g達可以是在體內(nèi)或在體外的。體內(nèi)合成包括轉(zhuǎn)化可以用作所述載體的宿主細胞的原核或真核細胞。或者，所述核酸的表達可以存在于體外表達系統(tǒng)中。例如，通常凈iU^來合成相對較大量的mRNA的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是市售的。在這類體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，編碼PLAD的核酸可被克隆到表達載體中并鄰近轉(zhuǎn)錄啟動子。例如，所述BluescriptII克隆載體和表達載體含有側面為強原核轉(zhuǎn)錄啟動子的多個克隆位點(StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。包含所有用于在體外根據(jù)DNA模板合成RNA的所需試劑(如Bluescript載#0的試劑^T是可以^^得的(StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。然后在體外通過這種系統(tǒng)產(chǎn)生的RNA可以在體外翻^f產(chǎn)生所需的PLAD多肽(StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。基因治療方法通過基因治療方法可以給予編碼含有PLAD或由PLAD組成的多肽的核酸。編碼本發(fā)明的多肽的核酸可被置于載體中并且在體內(nèi)或離體條件下通過標準方法將其送遞到受試者的細胞中。本發(fā)明的核酸編碼多肽可以被功能性地連接到可特異地用于該多肽分泌的特異性前導肽上。例如所述肽可以具有信號序列，例如鼠Ig-入信號序列Cff/ez//^erefa/.Nat.Biotechnol.17:343-8，1999)、大鼠胰島素前導序列(尸aiAra/Wa/.J.I咖unother.20:437-8，1997)、FGF-4信號序列(〃，e"/.Aterioscler.Thromb.Vase.Biol.,17:2453-2460,1997)、人生長激素信號肽WacfeWa/.GeneTher.6:385-92，1999)、P內(nèi)St^酶信號序列(#收力"Wa/.Hum.GeneTher.5:1445-55，1994)、牛促乳素j言號序列(fo/wa""a/.BranRes.Mol.BrainRes.44:143—146,1997)和其它類似的信號序列。對于體內(nèi)給藥，所述細胞可以是在受試者體內(nèi)的且所述核酸可以通過可藥用載體來給予。受試者可以是任何需要在細胞中選擇性表達核酸的動物。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的動物是人。此外，可以通過本發(fā)明的方法來治療的非人JI動物可包^^但不限于貓、狗、鳥、馬、奶牛、山羊、綿羊、豚鼠、倉鼠、沙鼠和兔以及任何其它可以按照本文所述方法在細胞中選擇性表達核酸的動物。在上述包括在受試者細胞中引入夕卜源DM的方法中(即基因轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染)，本發(fā)明的核酸可以是棵露DM形式或者所述核酸可以位于用來將所述核酸送送遞到細胞以便在細胞內(nèi)表達該核酸的栽體中。所述載體可以是市售的制品，例如腺病毒載體(QuantumBiotechnologies,Inc.(Laval,Quebec,Canada))?？梢酝ㄟ^各種機制將所述核酸或載體送遞到細胞中。作為一個實例，可以通itJ3旨質(zhì)體來進行送遞，佳月市售的脂質(zhì)體制品例如Lipofectin,Lipofectamine(GIBCO-BRL，Inc.,Gaithersburg，MD)、Superfect(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和Transfectam⑧(PromegaBiotec，Inc.,Madison,WI)，以及其它按照本領域的標準方法開發(fā)的脂質(zhì)體。此外，可以通過電穿孔以及Sonoporation儀器(ImaRxPharmaceuticalCorp-，Tucson,AZ)在體內(nèi)送遞本發(fā)明的核酸和載體，用于電穿孔的技術可以從Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)獲得。作為一個實例，可以通過病毒系統(tǒng)來進行載體送遞，例如可以包裝重組體逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。然后所述重組體逆轉(zhuǎn)錄病毒可被用來進行感染從而將核酸送遞到被感染的細胞中。將所述核酸導入哺乳動物細胞中的確切方法為，當然不限于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。其它可以被廣泛地用于該過程的技術包括^J^腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、慢病毒載體、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和痘病毒載體，例如痘苗病毒載體。也可以使用物理轉(zhuǎn)導技術，例如脂質(zhì)體送遞機制、受體介導的機制以及其它^4^制。本發(fā)明可以與任何的這些或其它通常使用的基因轉(zhuǎn)移方法一起使用。本發(fā)明的核酸和核酸送遞運載體(例如病毒；脂質(zhì)體、質(zhì)粒、載體)可以位于可藥用載體中以用于在體內(nèi)給予至受試者。"可藥用，，是指不嘸i在生物學上或其他方面具有不良作用的物質(zhì)，即可以將所述物質(zhì)與所述核酸或運載體一同給予受試者，同時不會引起任何不良的生物學影響或以有害的方式與含有它的藥物組合物的任何其他組分相互作用。應當然地選擇可使活性成分的任何降解降到最低并且使受試者體內(nèi)的任何不良副作用減到最小的載體，這是本領域技術人員所熟知的。所述核酸或運載體可以以下述方式給藥口服、腸胃夕卜(例如靜脈內(nèi))、通過肌內(nèi)注射、通it^內(nèi)注射、經(jīng)皮膚、體外、局部等。所需要的核酸或載體的確切量會隨受試者的不同而變化，這取決于受試者的物種、年齡、體重和總體狀況、進行治療的任何病癥的嚴重度或機理、所用的具^t酸或運載體、其給藥模式等。PLAD自締合抑制劑本發(fā)明進一步提供了一種包括PLAD自締^s抑制劑或TNF樣受體寡聚抑制劑的組合物。"抑制劑"被定義為一種可與PLAD結合的化合物或一種可與耙標的PLAD結合并且阻止PLAD活性的化合物(包括抗體)。一旦與PLAD結合，所述抑制劑可以中斷或防止PLAD自締合，因此抑制TNF受體樣受體的寡聚化。TNF樣受體寡聚化抑制劑可以是PLAD特異性結合的抗體(多克隆或單克隆)、與PLAD結合的配體、與PLAD結合的多肽、與PLAD或基于PLAD的g擬物結合的化合物。例如，包括PLAD或由PLAD組成的多肽可以與天然存在的TNF受>^=羊受體的PLAD締合，因此防止或抑制該TNF受^#受體與其它天然存在的TNF受體樣受體自締合。所述包括PLAD或由PLAD組成的多肽可以是可溶性PUD。也考慮了抗個體基因型抗體和親和力成熟抗體。其它抑制劑包括但不限于設計用于阻斷PLAD自締合的分子或化合物。所述抑制劑可以是抑制PLAD自締合的全蛋白或蛋白片段，因此防止了TNF受>^=羊受體的寡聚化。所述抑制劑可以是根據(jù)本文所述方法鑒定的有機分子。TNF受體及它們的寡M合體的晶體結構可被用來設計可中斷PLAD自締合的分子。也可以分析所述晶體結構以設計可模擬PLAD并且中斷PLAD自締合的分子。因此，提供了一種制備小分子抑制劑的方法，通過該方法生產(chǎn)該抑制劑。提供了干擾TNFR裝配和TNF結合的小分子(SM)和PLAD-肽衍生物。才艮據(jù)TNFR1蛋白二聚體的晶體結構，進行了PLAD締合結合表面搜索。結合了保守同源性檢索的上述搜索以及基于本文PLAD突變的數(shù)據(jù)使得可以鑒定一些潛在的鏈間締合位點。例如，如PLAD二聚體結構所示(圖23)，每條肽鏈第34位的兩個組氨酸環(huán)似乎在鏈間袋中彼此呈鏡像固定互相鏡鎖(mirror-lock)。由于組氨酸殘基的咪喳是中斷PLAD自締合的良好候選物，所以咪哇和咪哇衍生物可以是有效的受^#異性阻斷物并且可#皮用于治療TNF介導的疾病。本文公開了可干擾TNFR裝配和TNF結合的化合物。j來說，適合的抑制劑是那些可ii7v所述PLAD二聚結構的鏈間袋并且^"f擾位于第34位的兩個組氨酸環(huán)之間的相互作用的化合物。^J1個意義上講，不優(yōu)選含有較大取^基的抑制劑，所述取4^^^^礙i^到所述鏈間袋中或阻止第34位的兩個組氨酸之間相互作用的中斷。相反，優(yōu)選含有具有以下性質(zhì)的取代基的抑制劑，所述取^J^吏得ii^所述鏈間袋很容易并且可M插入和隨后第34位的兩個組氨酸之間的相互作用的中斷。此外，甚至更優(yōu)選含有具有以下性質(zhì)的取4m的抑制劑，所述:^^J^目對于所述鏈間袋中的其它g具有更高的親和力，因此可^t和/或增強PLAD二聚結構中抑制劑的結合。本領域技術人員可以用電腦分析假定的抑制劑以評估某些取^RJ^是否會增強或妨礙與所述PLAD二聚結構的結合。本文所用的術語"祐:取代的"應該被認為包括所有允許的有機化合物取代基。在一個廣義方面中，所述允許的取代基包括非環(huán)狀的和環(huán)狀的、支鏈的和非支鏈的、碳環(huán)的和雜環(huán)的以及芳香的和非芳香的有機化合物取代基。示例性的取代基包括例如下文所述的取代基。對于合適的有機化合物來說，所述允許的取^J^可以是一個或多個并且可相同或不同的。對于本公開來說，所述雜原子(如氮)可以具有氬取^J^和/或本文所述有機化合物的任何允許的取代基，所述取代基滿足雜原子的配價。本公開不意欲受到所述允許的有機化合物取代基的任何方式的P艮制。術語"取代"或"用…取代"也包括隱含的條件，即這種取代應依照被取代原子和取代基的許可配價且所述取代產(chǎn)生的是穩(wěn)定的化合物，例如不會自發(fā)地經(jīng)歷轉(zhuǎn)化的化合物，所述轉(zhuǎn)化例如重#、環(huán)4匕、消除等。本文中"A1，，、"A2，，、"A3，，和"A4，，^U^作通用符號以^^各具體的取^J^這些符號可以是4^f可取^C基，不限于本文所7>開的那些，并且當在一種情況下它們被限定為某些取^RJ^時，在另一種情況下它們可以被定義為某些其它的取儲。本文所用術語"烷基"為1至24個碳原子的支鏈或非支鏈飽和烴基，例如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、M、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。所ii^也可以;U皮:^代的或未^皮:^代的?？梢杂靡环N或多種基團來取代所ii^基，所述基團包括但不限于如下所述的烷基、卣代坑基、烷M、烯基、絲、芳基、雜芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、面化物、羥基、酮、硝基、甲^J^、辟i/R氧代(sulfo-oxo)、磺iH^、砜、亞mil巰基。在本說明書中，一般用來指未被取代的娛基基團和被取代的^i基團；但是，本文中也可以通過鑒定^^基團上的一個或多個特定^Mm來特指所述被取代的烷基基團。例如，術語"面代烷基"特指用一個或多個卣化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基基團。如下所述，術語"烷M烷基"特指用一個或多個烷lL^基團取代的烷基基團。如下所述，術語"烷M"特指用一個或多個氨基基團取代的烷基基團等等。當在一種情況下使用"烷基"而在另一種情況下使用特定的術語如"烷基醇，，時，并非意在暗示術語并不會也指特定的術語例如"烷基醇"等。該實踐也可被用于本文所述的其它基團。即，當術語如"環(huán)烷基"是指未被取代的和被取代的環(huán)烷基部分時，該取代的部M可被特別地指明；例如一種務本的被:^代的環(huán)^可以^皮稱為，例如";^環(huán)烷基"。類似地，一種被取代的烷絲可以被特異性地稱為，例如"卣代烷錄"、一種具體的被取代的烯基可以是，例如"烯基醇"等。同樣，使用上位術語例如"環(huán)^&"和下位術語例如";^環(huán)烷基'，的實踐也并非意在暗示該上位術語不包招4亥下位術語。本文所用術語"烷氧基"是通過單獨的末端醚鍵結合的烷基；即，"烷氧基"基團可以^X義為-0A1，其中(是如上所述的;^。本文所用術語烷氧基烷基是含有烷lL^取代基并且可被定義為-A1-0-A2的娛基基團，其中^和A2為娛J^基團。本文所用術語"烯基"為結構式中至少含有一個碳-碳雙鍵的具有2至24個碳原子的烴基。不對稱結構(如(W)C=C(A3A4))意在包括A和Z型異構體。這一點可以根據(jù)本文的結構式來推測，其中存在不對稱烯，或者可以通過鍵符號C=C來明確地標明。所述烯基可以被一個或多個基團所取代，所迷基團包括但不限于如下文所述的烷基、面代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、、羧酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、硝基、曱^m^、碌L代氧代、磺StJ^砜、亞mils^。本文所用術語為結構式中至少含有一個碳-碳三鍵的具有2至24個碳原子的烴基。所述炔基基團可以被一個或多個基團所取代，所逸基團包:^但不限于如下所述的烷基、卣代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、、羧酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、硝基、曱>^^、硫代氧代、磺^t^、砜、亞^iUl^本文所用術語"芳基"為含有任何基于碳的芳族基團的基團，所述芳族基團包括但不限于苯、萘、苯基、聯(lián)苯基、苯lL^苯等。術語"芳基"也包括"雜芳基"，所述雜芳基被定義為含有芳族基團并且至少具有一個摻入所述芳族基團環(huán)內(nèi)的雜原子的基團。雜原子的實例包括但不限于氮、氧、減和磷。同樣，術語"非雜芳基"也被包括在術語"芳基"內(nèi)，它的定義為^^有不含雜原子的芳族基團的基團。所述芳_^基團可以是凈皮^^代的或未#皮:^代的。所述芳基基團可以被一種或多種基團所取代，所述基團包括但不限于如本文所述的錄、卣代絲、烷絲、烯基、錄、芳基、雜芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、囟代物、羥基、酮、硝基、曱>^^、硫代氧代、磺絲、砜、亞砜或巰基。術語"聯(lián)芳基"是一種特定類型的芳基基團并且被包括在芳基的定義中。聯(lián)芳基是指通過稠環(huán)結構結合在一起的兩個芳基基團(如在萘中)或者是通過一個或多個碳-碳鍵連接的兩個芳基基團(如在^^基中)。本文所用術語"環(huán)烷基"是由至少三個碳原子構成的非芳族碳環(huán)。環(huán)烷基基團的實例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。術語"雜環(huán)烷基"為其中至少一個環(huán)上碳原子凈皮雜原子取代的如上所述環(huán)烷^^基團，所述雜原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。所述環(huán)M和雜環(huán)烷基基團可以^^皮^^代的或未^C^M、的。所述環(huán):^和雜環(huán)娛J^基團可以凈皮一個或多個基團所取代，所述基團包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、囟化物、羥基、酮、硝基、曱硅;^、硫代氧代、碌g、砜、亞m^統(tǒng)u^。本文所用術語"環(huán)烯基"是由至少三個碳原子構成并且含有至少一個雙鍵(即CO的非芳族碳環(huán)。環(huán)烯基的實例包括但不限于環(huán)丙稀基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基等。術語"雜環(huán)烯基"為一類如上文所定義的環(huán)烯基基團并且被包括在術語"環(huán)烯基"的含義中，其中所述環(huán)的至少一個碳原子#皮雜原子取_代，所述雜原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。所述環(huán)烯基基團和雜環(huán)烯基基團可以是被取代的或未被取代的。所述環(huán)烯基基團和雜環(huán)烯基基團可以被一個或多個基團所^L代，所逸基團包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酉旨、醚、由化物、羥基、酮、硝基、曱^)^、硫代氧代、磺?；?、砜、亞miL統(tǒng)u^。本文所用術語"環(huán)狀基團"是指芳基基團、非芳基基團(即環(huán)絲、雜環(huán)貌基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯J^基團)或兩者。環(huán)狀基團具有一個或多個被取代的或未被取代的環(huán)系統(tǒng)。環(huán)狀基團可以含有一個或多個芳基基團、一個或多個非芳J^基團或者一個或多個芳J^基團和一個或多個非芳^^基團。本文所用術語"醛，，可用式-c(o)hM示。在本說明書通篇中，"c(o)"是(H)的縮寫符號。本文所用術語"胺"或"M，，可用式狀^3"示，其中a1、f和a3可以獨立地為如上所述的氫、烷基、囟代烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)歸基、雜環(huán);^或雜環(huán)烯基基團。本文所用術語"羧酸"可用式-c(0)0H"示。本文所用"羧酸才艮"可用式-c(0)0—來表示。本文所用術語"酯"可用式-oc(0)V或-c(0)0^來表示，其中^可以^_如上所述的;^、卣代M、烯基、g、芳基、雜芳基、環(huán);^、環(huán)烯基、雜環(huán):^或雜環(huán)烯基基團。本文所用術語"醚"可用式a^^ij^示，其中(和a'可以獨立地為如上所述的M、卣代g、烯基、g、芳基、雜芳基、環(huán)g、環(huán)烯基、雜環(huán)^4或雜環(huán)烯J^基團。本文所用術語"酮，，可用式At(0)VM示，其中A'和A'可以獨立地為如上所述的M、面^^&、烯基、、芳基、雜芳基、環(huán)M、環(huán)烯基、雜環(huán):^或雜環(huán)烯J^基團。本文所用術語"卣化物"是指卣素氟、氯、溴和硪。本文所用術語"羥基"可用式-OHM示。本文所用術語"氮"可用式-N02i)t4示。本文所用術語"曱M基"可用式-SiAlW^^示，其中A1、V和尸可以獨立地為如上所述的氫、烷基、卣代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)坑基、環(huán)烯基、雜環(huán)M或雜環(huán)烯基基團。本文所用術語"硫代氧代'，可用式-s(o)a1、-s(0)2A1、-0S(0)^或-os(o)2(^i^示，其中v可為如上所述的氫、m、卣^m^、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán);^或雜環(huán)烯1^基團。在本說明書通篇中，"S(0)"是S=0的縮寫符號。本文所用術語"磺?；?是指可用式-S(0)^來表示的碗代氧代基團，其中^可以^_如上所述的氫、烷基、鹵代烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)m或雜環(huán)烯j^基團。本文所用術語"磺隨基"或可用式-S(0)2冊-絲示。本文所用術語"砜"可用式AS(0)^來表示，其中l(wèi)和f可以獨立地為如上所述的烷基、卣代烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)m或雜環(huán)烯基基團。本文所用術語"亞砜"可用式^S(0)f^示，其中Y和A'可以獨立地為如上所述的烷基、卣代龍基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)坑基、環(huán)烯基、雜環(huán)m或雜環(huán)烯j^基團。本文所用術語可用式-SHij^示。本文所用的"R1，，、"R2，，、"R3，，、"Rn"(其中n為整奶可以獨立地具有一個或多個上逸基團。例如，如果W為直^^基團，那么所述^^基團的一個氫原子任選地可以被羥基基團、烷lL^基團、^J^基團、卣化物等所取代。根據(jù)所選的基團，可以將一個第一基團摻入到第二基團中或者可以將所述第一基團懸吊(即連接)到所述第二基團上。例如，對于短語"含g基團的烷基基團"，所述l^^基團可以被摻入到^^基團的骨架上?；蛘?，所述^J^基團可被連接到所ii^^基團的骨架上。所選基團的性質(zhì)將會決定所述第一基團是被^v還是被連接到所述第二基團上。除非另作說明，含有的化學^^僅以實線而未以楔形或虛線示出的化學式考慮了每種可能的異構體，，例如每種對映異構體和非對映異構體以及異構體的混合物，如外消旋或非消旋手性(scalemic)混合物。提供了一種通*予有效量的咪哇或咪哇衍生物來抑制配體與TNF受體樣受體結合的方法。本文所考慮到的抑制劑的實例通常為5元含氮雜環(huán)，所述雜環(huán)通過各種取^J^來起作用。這類抑制劑的實例在下文中示出，并且一般通過未4皮:^代的鉢雜環(huán)結構的名稱來確定(即，其中R"為H)。異噁唑異噻唑在具有上述結構的抑制劑的許多實例中，r1、r2、r3、r4和R5若存在，則獨立地為H、烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、囟化物、羥基、酮、硝基、曱^S、硫代氧代、磺g、砜、亞sUi^。在具體的實例中，R1—5獨立地為d-C6;^、"-C6烷M^i^d-C6烷llj^基團。示例性C廠C6^^基團和C「C4^^基團包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、異丁基、戊基、異戊基、己基、2-乙基丁基、2-曱基組等。對應的C「C6烷tt含有與l^子鍵合的上述C廠C6絲，所述luf、子也與所述陽離子環(huán)鍵合。烷lLj^^基團含有與烷基鍵合的醚基并且最多總共含有六個碳原子。應該注意到有兩種異構的1，2，3-三唑。本發(fā)明也考慮到了靶向TNF受體樣受體的其它區(qū)域，使得與該區(qū)域一旦結合后，所述受體中PLAD的構象就會被破壞，從而阻止它與另一個PLAD締合。例如，本領域技術人員可以耙向p60TNFR的CRD3，使得p60TNFR的CRD3區(qū)一JS^皮結合，所述受體的構象就會被改變，從而防止p60TNFR的PLAD與另一個PLAD締合。因此，本發(fā)明還提供了一種通*予有效量的TNF受M受體寡聚化抑制劑來抑制細胞中TNF受>^=羊受體寡聚化的方法。本發(fā)明也考慮到了通過增強PLAD自締合來增強TNF受>^#受體的作用。例如，存在需要增強TNFR信號傳導的情況。在這類情況下，PLAD自締合激動劑可^J]來將由于弱PLAD相互作用而對TNFR作用具有抗性的細胞轉(zhuǎn)化成對TNFR作用銅:感的細胞，所iiJt動劑例如某些可與PLAD結合并且具有增強PLAD自締合的特定性質(zhì)的抗體或分子。這類增強的PLAD自締合可以提高配體結合以及信號傳導。需要這類增強的PLAD相互作用的疾病狀態(tài)的實例包括但不限于自身免疫性淋巴組織增生綜合征(ALPS)和高IgM綜合征。本發(fā)明還提供了利用PLAD作為靶向部分來將生物試劑送遞到細胞中。例如，與毒素相連的PLAD可被送遞到細胞中，使得與TNF-R上的天然存在的PLAD一結合，寡聚化就受到抑制，并且所述天然存在的TNF-R—內(nèi)化，與毒素連接的PLAD就會被內(nèi)化，從而將所述毒素iHit到細胞中。本文通篇所用的"TNF受體樣受體"是指TNF受體超家族的^f可成員，包括但不限于TNF-R、p60(也稱為p55和TNFR1)、p80(也稱為p75、TNFR2)、Fas(CD95/APO—1)、TRAIL受體、LTPR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4、TR0Y、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4—1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1和DCR2(參iL41)。才艮據(jù)表1中給出的GenBank射己號而列出的核苷酸序列、多肽序列以及^^f信息(例如信號序列和成熟蛋白殘基奶的4^P內(nèi)^it過引用的方式納7^^i兌明書。如先前所述，TNF受體樣受體寡聚的抑制劑包括與PLAD特異性結合的抗體、配體、肽模擬物、化合物和多肽。這些多肽包括含有PLAD或由分離的(例如可溶的)PLAD組成的多肽。本發(fā)明還提供了一種通#予有效量的TNF受體樣受體寡聚化抑制劑來抑制配體與TNF受^4羊受體結合的方法。例如，通*予一種抑制劑(如包括TNFR-PLAD或由TNFR-PLAD組成的多肽)，可以抑制TNF受體寡聚化，從而防止TNF-a與TNF受體結合并且減小TNF-a的有害作用。類似地，給予含有CD40受體-PLAD(CD40R-PLAD)的多肽可抑制CD40R寡聚化，從而防止CD40配體與CD40R結合并且減小CD40R對病情(如同種*移植物排斥、類風濕性關節(jié)炎和全身性紅斑狼疳)的有害作用。抑制配體與TNF受^#受體結^^導致抑制借助于TNF受體樣受體的信號轉(zhuǎn)導，從而提供了一種調(diào)節(jié)借助于TNF受體樣受體的信號傳導的方法。此外，本發(fā)明已經(jīng)證實TNF受體樣受體通過同型締合來結合配體和傳導信號，即TNFR-PLAD與TNFR-PLAD相互作用；Fas-PLAD與Fas-PLAD相互作用；CD40-PLAD與CD40-PLAD相互作用等。因此，利用PLAD自締合來干擾肽和g擬物的治療可以確保受體特異性治療，因為本發(fā)明證明了每種受體僅^it過所述PLAD與其自身締合。例如干擾TNF-R1功能而不影響TNF-R2優(yōu)于現(xiàn)在的非選擇性治療。類似地，特異性干擾特定的TNF受體樣受體功能而不影響其它TNF受體樣受體功能是非常理想的，并且可由本文教導提供。蛋白治療方法本發(fā)明還提供了一種通#予有效量的PLAD自締合抑制劑來治療受試者體內(nèi)的炎癥的方法。本發(fā)明還提供了一種通it^予有效量的PLAD自締合抑制劑來治療受試者體內(nèi)與自身免疫性疾病相關的炎癥的方法。這類疾病包括但不限于周期熱綜合征、膿毒病綜^^征和成^v呼吸窘迫綜^^征。因此，提供了一種其中所述炎癥與膝勤生關節(jié)炎有關并且所述抑制劑是TNF受體樣受體的可溶性PLAD的方法。在本發(fā)明中，所述受試者可以是^^可哺乳動物，優(yōu)逸人，并且可以包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狗、山羊、猴子、馬和猩猩。本文所用"治療"描述了患者臨床狀態(tài)的改善。所述改善包括從減輕炎性應答到完全改善炎性疾病。本文所用"自身免疫性疾病"描述了一種受試者的身體對其自身的身體成分產(chǎn)生了伴有有害作用的功能障礙性免疫應答的疾病狀態(tài)或綜合征，。這可以包括B細胞的產(chǎn)生或者可包括T細胞的產(chǎn)生，所述B細胞^4十對所有抗原、變應原或主要組織相容性(MHC)抗原產(chǎn)生特異性抗體，所述T細胞具有可識別自身成分并產(chǎn)生會引起炎癥的細胞因子的受體。自身免疫性疾病的實例包括但不限于潰瘍性結腸炎、克羅恩病、多發(fā)性石更化、類風濕性關節(jié)炎、膿毒性關節(jié)炎、糖尿病、惡性貧血、自身免疫性胃炎、銀屑病、白塞氏病、韋格納氏肉芽肺病、結節(jié)病、自身免疫性曱狀腺炎、自身免疫性卵巢炎、大皰性類天皰疫、天皰掩、多內(nèi)分泌腺疾病、斯提勒爾氏病、蘭伯特—尹頓肌無力綜合征、重癥肌無力、古德帕斯徹氏綜合征、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性葡萄膜炎、全身性紅斑狼齊、斯耶格倫氏綜合征和強直性脊柱炎。由于某些TNFR受體(如HVEA)是病毒受體JJt些受體^l賴于寡聚化作用，本發(fā)明也考慮到了通過P且止PLAD裝配來阻斷病毒進入。所用的最佳劑量應根據(jù)所治療的個體以及所用的抑制劑而變化。抑制劑的量也應根據(jù)個體的年齡、身材、體重、狀況等而變化。本領域技術人員應認識到執(zhí)業(yè)醫(yī)師所優(yōu)化的劑量是最佳的，并且例如，^邁27^0/7」州ar側ce"〃ca/iWe/ces中描述了用于確定劑量和用藥方案以及制備劑型的方法。例如，通過與目前在炎癥或自身免疫性疾病的治療或預防中所用的藥劑比較，可以確定適合的劑量和給藥方案。通常，根據(jù)所要獲得的臨床反應可以按0.1至100mg/kg體重的劑量范圍來口服給予或腸胃外給予本發(fā)明的抑制劑。例如，當所述抑制劑是可溶性PLAD或含PLAD化合物時，可以以0.5至100mg/kg的量^M^予所述抑制劑，例如5mg/kg。在一個進一步的實例中，當所述抑制劑是可溶性(分離的)p60PLAD且所述疾病是關節(jié)炎(例如膿毒性關節(jié)j^)時，可以以每個關節(jié)0.5至100mg的劑量iM^予所述PLAD。例如，關節(jié)內(nèi)給予劑量為4mg/kg或腸胃外給予16mg/kg的P60PLAD可有效地治療脈^毒性關節(jié)炎。在疾病征候和癥狀長期緩和或穩(wěn)定后可以完全停止抑制劑的給藥并且在所述疾病征候或癥狀惡化后或者在免疫狀態(tài)明顯變化后可以再次給藥，這可以通過本領域醫(yī)師所熟知的常規(guī)隨訪免疫研究來確定。通過評估病史、征候、癥狀以;s^:觀實驗室測試的具體方面來確定所給予的特定劑量的抑制劑在治療本文所述的炎癥或自身免疫性疾病方面的效果，所述客觀實驗室測試在評估所治療的特定病癥的病理生理活性方面具有證明性用途。這些征候、癥狀以^^觀實驗室測試可根據(jù)所治療的具體病癥而變化，這是本領域4^f可醫(yī)師所熟知的。例如，根據(jù)與適當?shù)膶φ战M的比較以及關于所述疾病在"-^A群或特定個體中的正常進程的知識，如果l)證明了受試者的復發(fā)頻率或嚴重度獲得了改善；2)證明了疾病或病癥進程得到了穩(wěn)定；3)減少了使用其它免疫抑制藥劑的需求，則可以認為一種特定的治療是有效的。一旦證實通過一種特定抑制劑可以顯著改善或穩(wěn)定疾病活動后，就可以依照簡化的或不連續(xù)的治療方案來評估特定的征候、癥狀或?qū)嶒炇覝y試。根據(jù)評估本文所述的特定征候、癥狀或^^見實驗室測試的標準方法，如果疾病活動復發(fā)，那么可以再次開始治療。此外，通過長期評估標準征候、癥狀和^C實驗室測試(本領域技術人員已知的)可以確定所給予的特定劑量的肽配體在預防受試者自身免疫性疾病方面的效果，所述受試者未患有自身免疫性疾病Mt艮出自身免疫性疾病的危險。該時間間隔可以很長(即，數(shù)年/數(shù)十年)。根據(jù)目前關于本領域醫(yī)師和研究人員所熟悉的特定疾病的已知危險因素的知識(如特別強的疾病家族史或者暴露于或獲得了可能導致產(chǎn)生自身免疫性疾病的因素或M)可以確定有狄出自身免疫性疾病風險的患者。"可藥用"是指不會在生物學上或其他方面具有不良作用的物質(zhì)，即可以將所述物質(zhì)與所選的化合物一同給予個體，同時不會引起任何不良生物效應或以不良方式與含有它的藥物組合物的任何其他組分相互作用。載體的選擇取決于給藥方法和務沐的患者。給藥方法可以是口服的、舌下的、粘膜的、吸入的、吸收的或通過注射。也應該注意并非所有的給予本文所述TNF受體樣受體寡聚抑制劑的方法都需凓^可藥用載體。本發(fā)明中，可以口月l給予或胃腸外給予在用于人受試者的可藥用載體中的PLAD自締合或TNF樣寡聚抑制劑。適合用于口月l或^L^給藥的載體可以包括一種或多種用于人受試者的可藥用載體。適合用于口服的載體包括一種或多種也可用作調(diào)p未劑、潤滑劑、助懸劑或4呆護劑的物質(zhì)。適合的固態(tài)載體包括磷酸鈣、碳酸鈣、硬脂酸鎂、糖、淀粉、明膠、纖維素、羧聚曱烯(carboxypolymethylene)或環(huán)糊精。適合的液態(tài)載體包括水、不含熱原的鹽水、可藥用油或<^阿這些的混合物。所述液體也可以含有其它適合的藥物添加劑例如緩沖劑、防腐劑、調(diào)味劑、粘度或滲透調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或助懸劑。適合的液態(tài)載體的實例包括含有或不含各種添加劑的水，所述添加劑包括作為ph-調(diào)節(jié)膠的羧聚乙烯。所述抑制劑可以被包含在腸溶膠嚢中，所，溶膠嚢可將多肽釋放腸道中以避免胃內(nèi)破壞作用。為了經(jīng)腸胃外給予拮抗劑，用可含添加劑(如油酸乙酯或異丙基肉豆蔻酸酯)的鹽水制備無菌溶液或懸液并且可以將其注射到例如皮下或肌內(nèi)組織中以及靜脈內(nèi)。篩選方法一種篩選PLAD締合抑制劑的方法，包括a)用以下兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細胞，其中一種質(zhì)粒含有包括編碼一種分離的PLAD的核酸序列的核酸，另一種質(zhì)粒含有編碼另一種分離的PLAD的核酸序列；b)將所述細胞與假定的抑制劑接觸；并c)測量PLAD的自締合，其中同未與所述假定抑制劑接觸的細胞中的PLAD締合相比，步驟b)的細胞中PLAD締合的減少表明了存在PLAD締合抑制劑。本篩選方法的一個實例是一種篩選PLAD-締^s押制劑的方法，包括a)用以下兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細胞，其中一種質(zhì)粒含有的核酸包括編碼與熒光供體功能性連接的分離的PLAD的核酸序列，另一種質(zhì)粒含有的含有編碼與熒光受體功能性連接的分離的PLAD的核酸序列；b)將所述細胞與所述抑制劑接觸；并c)測量FRET,其中同未與所述抑制劑接觸的細胞中的FRET測量相比，F(xiàn)RET的下降表明存在PLAD締^^抑制劑。本發(fā)明還提供了一種篩選PLAD締合激動劑的方法，包括a)用以下兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細胞，其中一種質(zhì)粒含有包括編碼一種分離的PLAD的核酸序列的核酸，另一種質(zhì)粒含有編碼另一種分離的PLAD的核酸序列；b)將所述細胞與假定激動劑接觸；c)測量PLAD的自締合，其中同未與所述假定激動劑接觸的細胞中的PLAD締合相比，步驟b)的細胞中PLAD締合的增加表明存在PLAD締合激動劑。下面的實例舉例說明了使用FRET來測量PLAD締合。此外，在進行上述篩選方法時，可以使用單個質(zhì)粒來送遞多個編碼PLAD的核酸。在包括FRET分析的方法中，可以使用單個質(zhì)粒來送遞多個編碼PLAD的核酸，所述PLAD與熒光M或受體功能性M接?；蚣涌箘?。也可以通過使用細胞測定法來鑒定PLAD締合的抑制劑或激動劑，所述細胞測定法可以包括但不限于細胞凋亡誘導、NF-KB誘導、淋巴細胞成熟或活化以及壞死i秀導(3、4、8、15、29、33、42、45)。下述實施例中更加具體地描述了本發(fā)明，所述實施例僅意在舉例說明，因為其中的許多修改和變4樹本領域技術人員來i)U^而易見的。實施例1洗滌H9S沐巴瘤細胞并重懸于PBS中。然后在4"C下用100ng/ml的人重組體TNFoc(R&DSystems)旋轉(zhuǎn)孵育細胞l小時。然后用2mM交聯(lián)劑DTSSP(Pierce)處理細胞30分鐘并用20mMTris.Cl[pH7.5]在冰上終止所itA應15分鐘。用加入了蛋白酶抑制劑(BoehringerMannheim)的150mMNaCl、20mMTris.Cl[pH7.5]、1mMEDTA、30mMNaF、2mMb-甘油鱗酸酯和1mM原釩酸鈉裂解細胞。在非還原(不含P-巰基乙醇)或還原(含有280mMP-巰基乙醇)的條件下將等量的溶胞產(chǎn)物電泳并且用特異性抗體分析p60和p80復合沐(19)。用KodakImageStation440it:^f亍光密度分析。發(fā)現(xiàn)p80復合沐所示出的分子大小是單元大小的約三倍，符^t基化和iMt基化三聚體(圖1A)。令人驚奇的是，在存在或不存在TNFoc的情況下均可有^i也捕^1^p80復M(通過光密度分析測得占鏈的65-70%，圖1A,泳道3和4)。盡管事實是大多數(shù)p60存在于高爾基體中并且無法接觸到交聯(lián)劑(7)，無論是否加入TNFoc，都有差不多15-20。/。的p60鏈被交聯(lián)成明顯的三聚體以及不連續(xù)的較高級的復合體(圖1A,泳道11和12)。對照實驗顯示沒有可檢測的內(nèi)源TNFoc且沒有顯示出其它蛋白(如p80)與p60復*交聯(lián)。蛋白質(zhì)印跡分析證實溶胞產(chǎn)物中不含TNFot。佳月抗-p60抗體的交^1合*的免疫沉淀顯示蛋白質(zhì)印跡中的p60復M中沒有可檢測水平的p80。通過用統(tǒng)u^乙醇切割交聯(lián)劑可將所述復^^分解成單體(圖1A，泳道7、8、15和16)。因此，這些結a明在配體結合前p60和p80鏈會自締合。為驗證非配體，性自裝配的可能性，鑒定了介導這種現(xiàn)象的TNFR的結構域。已經(jīng)確定當過表達時，p60的胞質(zhì)死亡結構域可以自締合并且^^觸發(fā)凋亡(8)。但是，由于所觀察的預裝配復M顯然是非信號傳導性的，所以人們假設所述裝配域存在于胞質(zhì)區(qū)外。人^們發(fā)現(xiàn)在酵母雙雜交相互作用測定中，p60和p80的ECD的N末端區(qū)可以特異性地自締合(9)。通過聚合HMiC^應(PCR)可以產(chǎn)生p60、p80、HVEM、DR4和CD40的各種截短形式和突變形式并且將它們測序。簡言之，擴增p80的前導序列和前10個氨基酸殘基使得可以在3，端包括HA表位標簽以在受體的N-末端產(chǎn)生HA標簽。用BamHI和EcoRI消化所述PCR產(chǎn)物并將其克隆到pcDNA3中。然后通過EcoRI和Xhol位點將含有受體片段的PCR片段導入至該質(zhì)粒中。對于所述GFP/CFP/YFP嵌M來說，可通過PCR擴增所述片段并將其符^^讀框地導入p60ACD-HA的XhoI和XbaI位點中。按照每個制造商的說明書用Fugene6(BoehringerMannheim)轉(zhuǎn)染293T細胞。用150mMNaCl、20mMTris.Cl[pH7.5]、1mMEDTA、30mMNaF、2mM0-甘油磷酸酯、1mM原釩^#)、5mM橫乙酰胺、2niM二碌L蘇糖醇(DTT)、TRITONX-IOO和蛋白酶抑制劑(BoehringerMannheim)裂解細胞。在用蛋白G瓊脂糖孩i球(BoehringerMannheim)和正常小鼠IgG預清除后，用2mg抗-GFP和蛋白G瓊脂糖孩O求將蛋白^y^斤iij^胞產(chǎn)物中免疫沉淀下來。用含0.5MNaCl的肖緩沖液將所述免疫復合體洗滌兩次，然后用常規(guī)裂解緩沖液洗滌三次。在Tris/甘氨,(Novex)上辨析免疫復M。Jurkat細胞的轉(zhuǎn)染顯示了類似的結果。在哺乳動物細胞中，人們發(fā)現(xiàn)嵌合p60受體會與無尾p60(p60ACD-HA)強烈地相互作用而不會與TNFR樣受體皰滲病4^^調(diào)控因子(HVEMACD-HA)相互作用，所述嵌合p60受體的胞質(zhì)結構J^凈皮鄉(xiāng)錄色熒光蛋白(GFP)所^^a(圖1B，比較泳道2和3)。GFP無法單獨與p60ACD-HA締合(圖1B,泳道5)。觀察到全長p80和無尾p80之間有類似的彭卜部分同型相互作用(圖1C，泳道6)。此外，僅移除p80的第10-54位氨基酸(a.a.)，即重疊CRD1，會完全阻止與完整p80的非配體絲性締合(圖1C，泳道7)。通狄p60中進行類似的缺失(a.a.1-54)可以消除自締合(參見下幻。通過將p80的N-末端部分(a.a.10-54)附加到p60受體上，然后所述p60受體與全長p80相互作用，可進一步說明該p80的N-末端部分的重要性(圖1D,比較泳道3與泳道4和5，圖9)。因此，該結構J^UL以介導異源受體的特異性締合。該締合是非配體依賴性的，因為嵌合p8(Ws46055—211(111)具有兩個由EcoRI限制性位點編碼的絲酸，所述限制性位點被插A^Lp80和p60序列的4^^處，所述M酸中止了TNFoc的結合(圖1E,圖片k和l)。因此，在缺少配體的情況下，一種與TNFR-ECD的配體結合袋不同的新的功能結構域介導了自裝配。自此，該結構域被稱為前配體裝配域(PLAD)。p60或p80中缺失所述PLAD可完全消除配體結合(表2和圖1E，比較圖片d、f和h)。然而，加入p80的PLAD^f吏得缺失PLAD的p60可以與TNFoc結合，但是如上所述，通過插入兩個由EcoRI位點編碼的M酸可以阻止這種結合(圖1E,圖片j和1)。因此，TNFR與TNFot的有效結^^取決于受體的自裝配?；蛘?，移除PLAD可以z皮壞整個ECD結構。由于先前的結果顯示移除CRDl不會破壞p60ECD的正確折疊(7》，所以后一種可能性是不可能的。然而，為明確地辨清這些可能性，在p60ACD-HA的CRDl-3中引入M酸置換并且測定它們對p60ACD-GFP-HA相互作用的影響。按照每個制造商的說明書使用Quikchange法(Stratagene)進^f亍誘變。通過DNA測序證實所述突變。p60和p80中除K19夕卜，所有置換的M酸都是保守性的。p80中對應的g為E22。PLAD中的兩種置換KY19/20AA和K32A(力消除了自締合(圖2A，比較泳道3和5與泳道2)并且排除了TNFoc結合(表2),所述置換并不欲中斷直接的配體接觸。PLAD中另一個殘基的置換一一Q24A不影響自締合或TNFoc結合(圖2A，泳道4和表2)。表2中所指的^J^bl^于p60的成熟序列的。CRD2配體結合袋中PLAD外側的兩種其它置換——E57A和N66F會中斷TNFot結^(a對受體自締合幾乎沒有影響(表2和圖2A,泳道6和7)。人們^現(xiàn)缺少胞質(zhì)尾區(qū)的突變受體與野生型ECD的締合與它顯性干涉p60誘導的凋亡方面的能力有關，表明了所述突變受體通過PLAD進入內(nèi)源功能性p60受體復*(表2)。這些結果顯示PLAD本身與配員觸結構域不同但是對于有效的TNFa結合和受體功能來il^仍是必要的。與單體受體鏈不同，預計預裝配受體復合體中受體鏈的胞質(zhì)部分彼*說其接近。這樣TNFa結^St成胞質(zhì)結構域較緊密的締合，從而導致了信號傳導蛋白的募集。為評估這一假說，采用了實施例II(7力中所述的新型流式細胞方法來分析兩種GFP光i普變體之間的焚光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，青色熒光蛋白(CFP)作為熒光餅，黃色熒光蛋白(YFP)作為熒光受體(12)。FRET是一種有效的測量活細胞中分子相互作用的方法。由于當焚光團之間距離增加時能量轉(zhuǎn)移迅逸減弱，所以GFP變體t間的FRET允許檢測100A內(nèi)的分子間相互作用。產(chǎn)生了嵌合蛋白，其中用CFP或YFP置換p60和p80的l&^區(qū)并且進行測試以確定不同的受體對之間是否發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。用雙激光FACSvantage儀器進行FRET，在514nm處激發(fā)YFP蛋白，然后在413nm處激發(fā)CFP蛋白。然后通過檢測546nm處的發(fā)itiM^測CFP到YFP的能量轉(zhuǎn)移。用遠遠多于CFP蛋白的YFP蛋白來轉(zhuǎn)染細胞。然后4MFlowjo程序(TreestarInc.)分析CFP陽'It^的FRET。觀察到了p60ACD-CFP和p60ACD-YFP之間的能量轉(zhuǎn)移，所述能量轉(zhuǎn)移M上是在加入TNFct后增加的(圖2B，圖片a)。通過缺失PLAD或通過可防止PLAD締合的K32A突變來阻止該FRET(圖2B，圖片b和c)。類似的p80厶CD-CFP:p80ACD-YFP對分析顯示了通iiio入TNFot而再次增加的強FRET信號(圖2B,圖片d)。使用p60ACD-YFP作為受體和p80ACD-CFP或CFP-p80ACD(與胞外結構域的N-末端融合的CFP)作為供體的對照顯示沒有FRET(圖2B,圖片e和f)。這些數(shù)據(jù)-~^證明了在活細胞中，p60和p80鏈自身都極M^JL配體可誘導復合沐的變化，所述變化會導M質(zhì)中的CFP和YFP部分發(fā)生緊密的締合。p60和p80的PLAD與TNFR家族中許多受體的第一CRD的比較顯示出形成所述結構域的二硫鍵支架的半皿酸"卜的保守性(圖3A，p80中的Y23、P36、G37和T50)。某些其它^^有DR4和Fas的TNFR樣受體顯示出CRD1的4呆守性較差，由此產(chǎn)生了這些受體中是否存在PLAD樣結構域的疑問。本發(fā)明探究了TNFR超家族其它成員中是否存在非配體,性自締合。令人吃驚的是，TRAIL受體1(DR4)和CD40的ECD掀自締合，但與其它TNFR樣受體的ECD相互作用不顯著(圖3B)。這些嵌^M^4現(xiàn)出了同型特異性FRET(圖3C)。如實施例II中所述，F(xiàn)as(CD95/AP0-l)也可以與其自身特異性締合U力。因此，通過PLAD的自裝配是TNFR家族的一個保守性特征。本發(fā)明表明了在缺少配體的情況下，p60和p80TNFR通過被稱為PLAD的新型N-末端結構域可預裝配成功能性復^。這揭示了CRD1是如何在p60和p80的配體結合和受體信號傳導中起到重要作用的(M。到目前為止，通過TNFR超家族成員進行信號傳導的^i^t念是配體可使單體受體鏈附著到三倍復合體上，這會導致M信號轉(zhuǎn)導蛋白的募集(入乂乂6。該模型很大程度上是以與配體復合的p60的晶體結構為基礎的，該晶體結構表明三個受體鏈環(huán)繞著所i^聚配體的亞基間溝，持分開至少40A。所述配體與延伸的CRD2和CRD3結構域接觸，而CRD1結構域不與配體相互作用或彼此不相互作用(J)。近來關于DR5/TRAIL復M結構的描i^示出了類似的受體-配體相互作用UJ)。然而，所述結合了配體的結構似乎并不會反映配體結合前的受體結構?，F(xiàn)在人們已經(jīng)清楚細胞表面上的p60和p80會自締合,如果缺失PLAD,則它們僅以單體形式存在。交聯(lián)內(nèi)源p60和p80受體表明三聚體是占優(yōu)勢構象，但是也可以存在其它的寡聚復M。由于現(xiàn)在已經(jīng)清楚前締合是TNFoc結合所需的，所以關于配體如何與預締合受體復^相互作用受到極大的關注。利用兩大類模型的其中之一可以解釋TNFR信號傳導，所述模型為l)鏈旋轉(zhuǎn)和重排；和2)超團簇(supercluster)形成模型(圖3D)。在鏈旋轉(zhuǎn)和重排模型中，配體^v預形成的受體三聚體中，導致PLAD接觸被中斷以及鏈被旋#重排成三聚體，所iiX聚體^lit過與配體三聚,觸而被穩(wěn)定化?；蛘撸潴w結合可能會觸發(fā)預裝配的TNFR三聚體的聚簇，其中所述PLAD接觸未被完全中斷。PLAD-介導的預裝配的TNFR三聚體的存在重新闡明了通過該受體大家族所進行的信號傳導的重要方面，已知該受體家族中許多成員對于淋巴細胞功能和穩(wěn)態(tài)是至關重要的(》。特異性同型ECD接觸以及PLAD中關鍵殘基的保守性是TNFR超家族成員的特征，所述超家族包M過死亡結構域進行信號傳導的受體(p60、DR4和Fas)以及不通過死亡結構域進行信號傳導的受體(p80和CD40)。在細l&4面上將鏈預分類為同型復合體可以促進應答的有效性和特異性。"受體干擾"應該被狄，在所述受體干擾例如p80鏈(缺少死亡結構樹^皮TNFot募集到與p60構成復合體，并且導致對凋亡的明顯抑制。p80通過提供獨立的促凋亡信號實際增強了p60-誘導的凋亡這一事實支持了這一觀點(7力。預形成的三聚體也可以避免常規(guī)摸型可能要求的必^降，即連續(xù)地募集受體鏈以"建立"復合體，因此導致可通過TNFR樣受體進行快速信號傳導(。對其它受體家族的預裝配已有記載，特別是IL-1和IL-2，它們由不同多肽的異聚體構成(M。特別值得注意的是最近關于紅細胞生成素受體二聚體預締合的描述，所述二聚體顯然經(jīng)歷了"剪刀式，，運動以接納配體u;)。如果是那樣的話，則可通過同樣的M酸接觸來進行受體鏈自締合，所述M酸接觸對于配體結合是至關重要的U》。相反，TNFR超家族利用了與CRD2/3配體接觸區(qū)不同的專用自締合結構域。PLAD的鑒定可提供通過特異性抑制TNFR樣受體的前配體裝配并因而阻止信號傳導的療法來治療TNFa或相關配體導致的疾病的新療法。實施例II在人自身免疫性淋巴組織增生綜合征(ALPS)中，編碼異常形式Fas(CD95/APO-1)的雜合突變會顯性干涉Fas誘導的淋巴細胞凋亡。本發(fā)明證明了這種情況來源于利用胞外結構域的野生型和突變體Fas受體的預締合，而不依賴于配體誘導的受體寡聚化。發(fā)現(xiàn)預締合的Fas受體復M是信號轉(zhuǎn)導所必需的，并JUfit^色熒光蛋白(GFP)變朱t間的FRET的新的應用在活細胞中證實了預締合的Fas受體復*。這些結果提供了一種用于人疾病中Fas信號傳導和顯性干涉的新的M機制。Fas(APO-1/CD95)是轉(zhuǎn)導對于免疫穩(wěn)態(tài)和耐受至關重要的凋亡信號的細月汰面受體("-i7)。Fas是具有三個富含半M酸的胞外結構域(CRD)的317個氨基酸的1型膜糖蛋白，所iil&外結構^Ut瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的特征。對于人類，攜帶雜合Fas突變的患有1A型ALPS的患者的淋巴細胞具有減少的Fas誘導的凋亡，并且突變體等位基因的轉(zhuǎn)染會導致對Fas誘導的凋亡的顯性干涉(W-M。這被認為是由于配體介導的交聯(lián)將野生型和有缺陷的Fas鏈交聯(lián)成了混合的不能募集下游信號分子的三聚體復合本。然而，已經(jīng)研究了通過改變的RNA剪接導致大多數(shù)CRD2的l^卜結構域(ECD)缺失(Pt2，缺失a.a.52-96)的顯性干涉突變。Fas-陰性293T細胞上該突變的表*明該突變體不與對抗性抗體結合(圖4A)("、JJ)。該突變體也不能與三聚化的FasL結合，而胞質(zhì)死亡結構域中的ALPS突變(例如Pt6,A241D)并不影響FasL結合或AP0-1結合(圖4A)。甚至在未與對抗性抗體或FasL結合的情況下，Pt2突變體也能以幾乎與Pt6死亡結構域突變體一樣的效率顯性干涉Fas誘導的凋亡(圖4B)。共轉(zhuǎn)染細胞的表面染色表明與那些單獨用WTFas轉(zhuǎn)染的細船目比，F(xiàn)as表達沒有減少，排除所述突變體Fas分子抑制正常等位基因表達的可能性(J6。因此，通過常規(guī)的由FasL誘導的受M體交聯(lián)的信號傳導模型不能解釋顯性干涉，因為在該過程中Pt2突變體Fas分子不會成為混合受體復合體的"~#分。因此，使用構建體測試了Pt2Fas和野生型Fas之間的非配體，'f封目互作用，在所述構建體中野生型Fas的l^f結構域一皮綠色熒光蛋白(GFP)所置換(HA-Fas1-210:GFP)，以避免由所述死亡結構域?qū)е碌男蹦炕プ饔肬《"。在缺少FasL的情況下，用Fas1-210:GFP嵌^^免疫共沉淀全長Fas受體和Pt2Fas受體(圖4C)。該相互作用是特異性的，因為TNFR家族的另一成員——與GFP融合的皰療病4^A介質(zhì)(HVEMACD:GFP)——不與Fas免疫沉淀。為進行這些免疫沉淀研究，按照制造商的i兌明書用Fugene6(BoehringerMannheim)轉(zhuǎn)染293T細胞。用150mMNaCl、20mMTris.Cl[pH7.5]、1mMEDTA、5mM碘乙纖、2mM_^>危蘇糖醇(DTT)、10%甘油、1%TRITONX-100和蛋白酶抑制劑(BoehringerMannheim)裂解細胞。在用蛋白G瓊脂糖孩姊(BoehringerMannheim)和正常小鼠IgG預清除后，用1mg抗-GFP(RocheMolecularBiochemicals)和蛋白G瓊脂糖孩姊免疫沉淀蛋白。用自緩沖液洗滌免疫復^^三次。用2y1抗AU1(Covance)和蛋白A微球免疫沉淀AUl。將蛋白在Tris/甘氨酸凝膠(Novex)上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并且用指定的抗體進行印跡。將條帶用SuperSignalWestDura(Pierce)顯影。用ID圖像分析軟件(Kodak)進行光密度分析。在實施例I中，描述了被稱為"前配體裝配域"(PLAD)的保守性N-末端結構域，所述結構域介導TNFR超家族其它成員的特異性自締合。然而，F(xiàn)as的N-末端缺少;W在其它TNFR家族受體中保守的關鍵性M酸，因此產(chǎn)生了Fas是否含有功能性PLAD的疑問。構建了截短或去除了第一CRD的N-末端Fas突變體，并且測試了配體結合、Fas-Fas締合以及凋亡功能(圖5)。用適當?shù)囊锖蚉wo高^聚合酶(RocheMolecularBiochemicals)通過PCR誘變產(chǎn)生Fas截短突變體。對于AU-1標記的受體，使用了一種具有預先插入到FasCRD1上游區(qū)中的AU-1標簽的模板。為進行HA標記，將突變克隆到&造的pcDNA3載體的EcoRI/XhoI位點中，所述栽體在HA標簽序列之前含有p80的前導序列。點突變是^J)Quickchange技術(Stratagene)來產(chǎn)生的，用Pwo代替Pfu聚合酶。通過限制酶作圖和自動測序來驗證突變。上述研究表明成熟Fas蛋白中的形成第一CRD亞結構域的起始43個M酸(a.a.)的缺失可顯著減少配體結合但不會阻止AP0-1激動性抗體的結合(劉。缺失編碼整個CRD1的起始66個M酸會阻斷與FasL和APO-1的結合(圖5A)。這兩種缺失表現(xiàn)出了由APO-1抗體啟動的凋亡中的相應缺陷(圖5C)以及所述截短鏈與具有不同標簽的Fas1-210蛋白的共沉淀的缺乏，所述Fas1-210蛋白含有完整的ECD(圖5B，泳道1-4)。因此，盡管有部分的FasL結合和正常的APO-1結合，從FasN-末端移除僅43個氨基酸即會阻止凋亡誘導，這與這些截短型受體與野生型Fas的締合的缺失相關?；诖蠖鄶?shù)所預測的與FasL的接觸均存在于CRD2和CRD3中這一事實，由66個氨基酸(構成CRD1)的缺失導致的FasL結合的缺失是令人意外的(22、23)。通過比較這些結果與那些在實施例I中用p60和p80獲得的結果，假設了Fas受體復合本的非配體依賴性前裝配對提供有效的FasL結合和受體信號傳導可能是至關重要的。為進一步探究受體自締合中配體結合的必要務降，測試了一種Fas點突變-R86SUJ),這一R86S突變移除了對于結合FasL非常重要的一個CRD2接觸殘基，發(fā)現(xiàn)它在細胞表面表達時不與FasL結合(圖5A，下圖)。如利用兩種不同的對抗性抗-Fas抗體的染色結果所示，整個受體結構是保存完整的(圖5A和C勸)；并且如免疫共沉淀所示，仍舊會發(fā)生完整Fas的自締合(圖5B,泳道5-7)。甚至更加有意義的是，當與野生型(WT)受體共表達時，該突變體會顯性干涉FasLi秀導的凋亡，同時其自身不與FasL結合(圖5D，實心^")。用APO-1抗體在相同細胞中誘導的凋亡在所有轉(zhuǎn)染中均未受損，表明了兩種受體都在細胞表面上功能性表達(圖5D，空心條)。因此，顯性干涉不依賴于天然存在和基因工程改造的Fas突變體的S5體結合。相反，F(xiàn)as功能與自締合能力有關。為定量測定活細胞中的Fas受體自締合，開發(fā)了基于具有不同光鐠的GFP突變體一_青色萸光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的流式細胞測定和顯微測定。CFP和YFP具有有利于FRET的光潛性質(zhì)，因為CFP的最;^j^射波長接近于YFP的最大吸收波長(M。由于這些蛋白間的FRET在距離大于50-IOOA時^il下降，所以CFP和YFP融M白之間存在FRET則表明它們的焚光蛋白結構域非常接近。當將C-末端符合讀框地融合了CFP和YFP(在第210位代替了所述死亡結構樹的Fas受體共轉(zhuǎn)染到293THEK細胞中時，它們在細胞表面上得以適當表達(劃。通過標準PCR克隆技術來使Fas和其它TNF家族受體與CFP和YFP產(chǎn)生符合讀框的融合，利用蛋白質(zhì)印跡和熒M孩沐來證實正確的蛋白表達。用1jag所述的YFP融合蛋白構建體和2jag所述的CFP構建體轉(zhuǎn)染293T細胞。24-36小時后，用PBS收集細胞并且用FACSvantage細胞/f3U^行分析，用于CFP時將氪激光器(Spectrophysics)調(diào)到413皿，用于YFP時將ILT氣冷^tit器調(diào)到514nm。用470nm/20nm帶通濾波器檢測CFP。用546nm/10nm帶通濾波器檢測YFP和FRET，分別佳月514nm和413nm激光器產(chǎn)生的信號。然后用514和413nm激光器連續(xù)照射細胞使得可以從每個細胞中檢測到全部三種信號。采用^hf嘗校正以使得在單獨用CFP或YFP轉(zhuǎn)染的細胞中不存在可見的FRET信號。從每個樣品中收集50，000次事件并且利用FlowJo軟件包(Treestar)分析數(shù)據(jù)。為測量FRET的效率，在利用505-545nm帶通濾波器用通過5分鐘的照射漂白YFP之前和之后，用焚M微鏡測量共轉(zhuǎn)染細胞的CFP發(fā)射強度。對照表明這種大強M^上徹底地漂白了YFP，同時^沒有直接漂白CFP。針對這種直接漂白進行了校正。使用下述公式來計算FRET效率E%=[l-(YFP漂白前的CFP發(fā)射/YFP漂白后的CFP發(fā)射)]x100%。當利用流式細胞^測時，由于FRET，用CFP和YFPFas融M白共轉(zhuǎn)染的細胞的CFP發(fā)射觸發(fā)了YFP波長處的強熒光發(fā)射(圖6A，F(xiàn)as1-210:CFP/Fas1-210:YFP)，特別是在YFP高水平表達時。使用了一種通過9個氨基酸的肽連接物將CFP與YFPM融合(CFP-YFP)的構建體作為陽'l"生對照("。在這些細胞中，緣測到了錄ii7K平線性增長的強FRET信號。在含有或不含所述死亡結構域的Fas融^^白之間檢測到了FRET,但是在Fas和TNF家族成員TNFR1或HVEM之間未檢測到FRET(圖6A和B)。當與Fas1-210共表達時，截短或移除了PLAD的N-末端截短形式的Fas產(chǎn)生的FRET信號降低(圖6B)。為定量測量這些不同受體突變體之間的FRET效率，對選擇性光漂白YFP受體分子后的CFP脫淬滅(dequenching)(FRET的另一特征)進行了基于顯微鏡的測定(W、2力(圖6C)。缺少死亡結構域的Fas的自締合產(chǎn)生了觀測效率為16°/。的FRET。當兩個分子上均帶有死亡結構域時，F(xiàn)RET效率升至27。/。，這表明了死亡結構域的寡聚性質(zhì)(幼。Pt2Fas產(chǎn)生了與Fas1-210相近的FRET效率，顯示了接近正常的自締合，但是使用Fas43-210時信號減弱，使用Fas67-210時沒有明顯的FRET效率。這些結a明Fas^在細l^4面上特異性自締合，并M—性質(zhì),于PLAD。為測試天然Fas受體是否會在未轉(zhuǎn)染的T淋巴細胞表面上自締合，進行了化學交聯(lián)研究(圖7)。加入不能穿透細胞的可切割巰基的交聯(lián)劑3，3，-^f克雙磺基琥珀酰亞胺丙酸酯(DTSSP)會將去糖基化細胞i^胞產(chǎn)物中Fas的表觀分子量從45變?yōu)?40kD,狄應于形成Fas三聚體(圖7A，泳道2)。與單體條帶的光密度比較表明有60%的Fas鏈被交^三聚體。用二疏蘇糖醇(DTT)切割交聯(lián)劑會將大多數(shù)三^l^ii原為單體態(tài)(圖7A，泳道5-8)。DTSSP誘導的復M類似于那些在使用APO-1對抗性抗體或FasL激發(fā)而未進行化學交聯(lián)后存在的復M(圖7A,泳道3-4)U力。激動劑誘導的復^f^是通過襯間^^鍵連接的，這可通過DTT還原來證明(圖7A,泳道7-8)。對這些細胞的免疫沉淀的Fas信號傳導復M進行的檢測表明，抗體或配體^m會觸發(fā)FADD和半胱天冬酉l"8的募集并且導致半胱天冬il"8被蛋白酶解成其41和43kD的加工后形式(圖4B)以及聚(ADP-核糖)聚合酶的半胱天冬SI^賴性切割(圖7C)。然而，用DTSSP處理過的細胞中的信號傳導復^^表現(xiàn)出中度的FADD締合，但沒有半胱天冬酶-8結^^或加工并且沒有PARP切割，表明預締合受體復合體的化學交聯(lián)不足以觸發(fā)凋亡信號。值得注意的是，DTSSP的預處理可防止響應于隨后的AP0-1處理的活性信號傳導復合體的形成(圖7B)。這些結果表明Fas受體的非共^m締合不依賴于過表達。配體結合觸發(fā)了受體復M結構的變化，所述結構變化與鏈間二硫鍵形成和分子內(nèi)信號傳導有關。Fas受體的化學交聯(lián)似乎會捕獲非信號傳導態(tài)的預締合復合體。保守性N-末端PLAD;^^揮適當?shù)腇as受體功能所必需的，并且因此可以在ALPS的顯性干涉中起到關鍵作用。比較了國立衛(wèi)生研究院所研究的大量ALPS患者的結構、顯性干涉(DI)和Fas-Fas自締合(SA)(W、(圖8),yU門發(fā)現(xiàn)每個與疾病相關的顯性干涉突變樣品中,留了PLAD，包括影響了Fas胞外或胞內(nèi)部分的突變。在Ptl和20中，突變產(chǎn)生了僅編碼成熟Fas蛋白的前57和62a.a.的提前終止多肽，表明PLAD本身足以進行顯性干涉(圖8A)。利用點突變移除全部或部分死亡結構域(Pt5、30或33)或消除其FADD結合功能(Pt3、6、26、29或31)會產(chǎn)生有效的顯性干涉Fas分子(^)。因此，測試了通過去除了死亡結構域的Fas的基因工程終止突變體(Fas1-210)進行的顯性干涉是否需要PLAD。結果表明N-末端截短破壞了通過Fas1-210進行的顯性干涉(圖8B)。來自ALPS患者(ALPSPt26，D244V)的Fas死亡結構域點突變體中的PLAD截短(最多缺失至a.a.42)消除了該天然突變體的顯性抑制作用(圖8B)。這些發(fā)現(xiàn)j重新明確了ALPS中Fas突變顯性干涉正常Fas功能的枳逸。顯然顯性干涉Fas突變保留了N-末端PLAD,因為該結構域負責野生型和突變體Fas分子間的復M形成。遺傳顯性干涉的主^子原理是突變體蛋白必須充分地與特異性功能復合體中的野生型蛋白相互作用(43)。先前，與人疾病相關的顯性負性突變已經(jīng)被證明^if過掩蔽配體、阻斷細胞內(nèi)信號傳導或阻止WT鏈被轉(zhuǎn)運到細^4面來干擾正常的受體信號傳導(44)。對于Fas而言，所述數(shù)據(jù)表明顯性干涉來源于一種新的機制，所i^L制包括在配體結合前，由PLAD介導的野生型和突變體受體之間的締合。這些發(fā)現(xiàn)解釋了為什么雖然ALPSPt2體內(nèi)的異常Fas蛋白和其它FasECD突變體不能結合FasLM會產(chǎn)生足以導致疾病的顯性干涉。由于PLAD的移除可以消除含有缺失或突變的死亡結構域的Fas分子的顯性負性功能，所以PLAD^^導的相互作用也^^導致大量攜帶會影響Fas死亡結構域的突變的ALPS患者的顯性干涉相互作用。PLAD相互作用也可能參與了Fas誘導的凋亡的下調(diào)，所述下調(diào)是通過含有全部該結構域的可溶性^^選剪接形式的Fas來進行的(45)。預計不編碼功能性PLAD的天然受體突變體不是顯性干涉的。PLAD介導的顯性干涉也可以在通過誘騙受體進行的信號傳導調(diào)節(jié)中起作用(20),并且會在由TNF家族其它成員的異源遺傳異常導致的疾病發(fā)病中起作用。這些結果M出了一種新的用于理解由Fas進行的跨膜信號傳導的模型，所述模型包括通過配體將預締合三聚體轉(zhuǎn)化成信號傳導態(tài)而不是配體誘導的單個受體鏈的寡聚。FRET研究使得可以評估在缺少配體的情況下，細l&4面上CFP和YFP標記的Fas分子間的距離。對于隨;W^向的CFP和YFP而言，F(xiàn)6rster半徑-R。為50A(2JD。假設與Fas融合的CFP和YFP是等量表達、彼此之間隨才脈向并且隨才M目配成等ii^聚體，那么所觀察到的FRET效率(圖3C)表明與全長Fas分子融合的CFP和YFP生色團之間的距離上P艮是57A,與Fas1-210融合的CFP和YFP生色團之間的距離上限是65A。由于在Fas和其它TNFR家族受體之間未觀察到FRET,所以這些距離比，見察到的在細J^4面上隨機分布的M之間的距離要近得多并且是特異性的。FRET需要閾水平的YFP表達(圖3A,FAS1-210:CFP/FAS1-210:YFP)這一事實反映了混合的CFP標記的Fas和YFP標記的Fas的統(tǒng)計或者預締合實際上依賴于受體密度。由于預締合增強了Fas信號傳導，因此通過改變Fas表達或其它方法來調(diào)控受體預締合量是一種新的用于調(diào)節(jié)凋亡信號傳導的機制。通過受體復合體重排進行的信號傳導可能是廣泛使用的機制，以確保對配體的快速和特異性細胞響應。然而，這一信號傳導機制也賦予了對于由ALPS中天然存在的受體變體或病原性異源突變導致的顯性干涉的易感性。實施例in方法小鼠和試劑BALB/c、C57BL/6、DBA/1J、C3H/HeJ、C3H/HeN、TNFR1和TNFR2敲除小鼠購自JacksonLaboratory,TNF-a轉(zhuǎn)基因小鼠購自Taconic。所有實驗中均使用6-8周齡的雄性小鼠并且將其祠養(yǎng)在免疫實驗室(NIAID、NIH)的動物房中。利用CBER合成CpGDNA。CpGDM1668序列為5，-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3，(SEQIDNO:61)(J幼。通過^JDP60PLAD和P80PLAD制備抗P60(1H11)或抗P80PLAD(3H11)的小鼠單克隆抗體(MAb)。PLAD-GST融M白的純化按照文獻所述的方法進行PLAD-GST融^白的克隆和純化(7勸。用4-20%Tris-甘氨酸皿和質(zhì)語來驗證純化的PLAD-GST融合蛋白并且儲存在-80。C下。用Detoxi-GelAffinityPak柱(Pierce)移除LPS。P60和P80PLAD蛋白的體外測試用胰蛋白酶處理后收集L929細胞。用不同劑量的PLAD蛋白預處理細胞30分鐘，之后加入TNF-ot(2ng)。類似地，用PLAD蛋白和GST預處理42.3細胞。在30分鐘預處理后，加入TNF-oc(3ng)、Fas的抗體U力(10ng)和蛋白A(20ng)并在37匸下培養(yǎng)。利用血細胞計數(shù)器或流式細胞#規(guī)定的時間點對細胞死亡進行定量測定。按照制造商的說明書(R&Dsystems)測量TNF-oc結合。PLAD蛋白的免疫原性和半衰期采用ELISA來研究PLAD蛋白的體內(nèi)免^^、性和半衰期。PLAD蛋白可以引發(fā)抗體應答，其中至少一半是針對所述GST部分(附圖5a)。利用在各個時間所取樣的血液，采用ELISA測量P60PLAD或P80PLAD蛋白的體內(nèi)半衰期，其半衰期接近5小時(附圖5b、c)。采用PLAD蛋白療法的由TNF-oc、CpGDNA觸發(fā)的關節(jié)炎的j^在存在或不存在100"gPLAD蛋白的情況下，將TNF-a、CpGDNA或LPS關節(jié)內(nèi)注射到小鼠膝關節(jié)中。注射后3天處死小鼠并且取出關節(jié)以進行組織病理學檢查。CIA的i秀導和用PLAD蛋白治療CIA將用等體積的完全弗氏佐劑(Sigma)乳化II型雞膠原(Sigma),將0.1ml含100ngII型^f的乳液真皮內(nèi)注射至雄性DBA/1J小鼠的^C^部。在21天時，給小鼠追加100ng用等體積的不完全弗氏佐劑(Sigma)乳化的II型膠原。在首次免疫后的22天，開始用PLAD蛋白或PBS進^f亍預防性處理，按編號方式(incodedfashion)每周蒯溪內(nèi)給藥三次直至第52天。在小鼠已經(jīng)產(chǎn)生關節(jié)炎后三天開始用P60PLAD蛋白或PBS進行治療性處理。腹膜內(nèi)給予P60PLAD蛋白(每隔一天給予400pg)兩周，然后在各組之間轉(zhuǎn)換(switch)所述處理。在"盲法"實驗中，由兩名不知道所述處理的獨立的檢查員每三天對小鼠進行一次分析并且評估關節(jié)炎的程度；ot脹度和臨床評分。通過用測徑器測量足爪厚度來測定關節(jié)腫脹。使用下述評分級別來評估臨床關節(jié)炎0級，無腫脹；l級，輕;U3t脹和紅斑；2級，明顯肺脹；3級，關節(jié)僵直。以0-3級和最大可能評分12對每只動物各肢分級。關節(jié)的組織病理學檢查在將組織常規(guī)固定、脫鉤和石蠟包埋后，制作關節(jié)切片并且用蘇木精和伊紅染色。由研究人員對所有切片進行編號并且進行盲法評估。按照從0級(無炎癥跡象)、1級(滑膜^L^層增生的輕度炎癥，最低限度為沒有軟骨破壞)到2和4級(逐漸增加的炎性細胞浸潤或軟骨和骨破壞的程^)的級別來判斷滑膜炎、血管翳形成或者骨/軟骨破壞的程度。體外破骨細胞形成測定從BALB/c小鼠的脛骨中提取骨髓細胞，并JL^含有M-CSF的oc-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3天后，在存在或不存在PLAD蛋白的情況下，用TNF-oc(20ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)進一步誘導骨髓巨噬細胞4天。然后固定細胞并且按照制造商的i兌明書(Sigma)針對破骨細胞標志物TRAP進行染色。免疫熒光(^)在存在或不存在P60和P80PLAD蛋白的情況下，在體外用TNF-ot處S^TNFR1或TNFR2敲除小鼠的脾臟分離的單核細胞。用抗NF-kBp65的兔抗體(C-20，SantaCruz)對經(jīng)固定和透化的細胞進行染色。然后洗滌細胞并用FITC-偶聯(lián)的驢抗兔抗體孵育細胞。用共聚焦顯孩i鏡以盲法方式分析核NF-kB并且進^Sf分。統(tǒng)計分析分別使用Fisher檢驗和Mann-WhitneyU檢驗分析各組中的發(fā)病率和嚴重度的不同。P《0.05#皮^人為著的。結果重組體PLAD-GST融合蛋白為獲#^有人P60或P80TNFR的PLAD結構域的可溶性蛋白，制備谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白。親和性純化提供了全長分子量分別為34kD和33kD漆于絲齡列的預期大小)的P60和P80PLAD-GST融^白(圖lb和附圖l)。進行蛋白質(zhì)印跡并通ii^:鐠進行蛋白質(zhì)測序以確證:m^Ji的兩條帶都為P60或P80PLAD蛋白(圖lc)。PLAD蛋白抑制TNF-oti秀導的細胞死亡進行該實驗以確定純化的PLAD蛋白是否會抑制TNF-oc對L929細胞的細胞病變作用(M。純化的P60PLAD蛋白以劑量依賴方式明顯地抑制了小鼠和人TNF-a誘導的細胞死亡(圖2a、b)。該保護作用與英夫利昔單抗和依那西普相當(附圖2)。相反，對照CD40PLAD蛋白沒有作用(圖2c)。也測試了需要來自P60和P80的信號以經(jīng)歷由TNF-ocC^誘導的死亡的人42.3細胞。人們發(fā)現(xiàn)P60或P80PLAD蛋白會抑制TNF-ot誘導的細胞死亡但不抑制抗-Fas誘導的細胞死亡(圖2d)。僅GST蛋白不會抑制TNF-a誘導的或抗-Fas誘導的細胞死亡。此外，P60PLAD蛋白與依那西普和英夫利昔單抗一樣有效地抑制L929細胞中TNF-oc誘導的半胱天冬H"8激活(圖2e)。因此，純化的人P60或P80PLAD蛋白有效地阻斷AJL小鼠TNF-oc。P60PLAD抑制TNF-oc或CpGDNA誘導的關節(jié)炎也測試了PLAD蛋白是否^^抑制體內(nèi)TNF-oti秀導的關節(jié)炎。在加入或不加入100ygPLAD蛋白的情況下，通過關節(jié)內(nèi)注射小鼠TNF-oc(45ng)來誘導關節(jié)炎。P60PLAD蛋白強力抑制了TNF-ot誘導的關節(jié)炎的特征，包括滑膜炎、血管翳和骨侵蝕(圖3a、b)。相反，單獨的P80PLAD或GST蛋白并不明顯地影響疾病(圖3a、c)(附圖3a)。TNF-ct在SA的發(fā)病機制中起到重絲用(W、M、M。含CpG的細菌DNA和LPS都是能強烈地誘導可觸發(fā)關節(jié)炎的TNF-ot從單核細胞和巨噬細胞中釋放出來的細菌成分(W、"。共同注射100|LigP60PLAD蛋白可以顯著減輕CpGDM誘導的關節(jié)炎中的血管翳和骨破壞(P〈0.05)(圖3a、d)，但是100pgP80PLAD則不能(附圖3b)。P60PLAD蛋白而非P80PLAD蛋白可顯著地減輕LPS誘導的關節(jié)炎。P60PLAD抑制膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)中的MMP表達基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是關節(jié)炎過程中軟骨和骨破壞的重^h質(zhì)，TNF-oc可以誘導MMP表達。因此，該實驗確定了P60-PLAD蛋白是否抑制CIA中的MMP表達。結a明P60PLAD蛋白顯著地抑制了CIA的匿表達(圖25)。注左圖中的深色(在原始彩色切片中為褐色)染色部分表示MMP表達。P60PLAD抑制M^、i秀導的關節(jié)炎(CIA)中的iNOS表達一氧化氮(NO)是短效自由基氣體。過量的一氧化氮是有毒的并且會導致慢性炎癥。重要的是，已經(jīng)證明TNFoc可通微活可誘導的一氧化氮合酶(iNOS)刺激巨噬細胞/單核細胞產(chǎn)生一氧化氮并且提高NO水平，由此導致局部關節(jié)損害。因此來確定P60PLAD蛋白是否會抑制CIA中的iNOS表達。結果顯示P60PLAD蛋白顯著抑制受CIA^Jl的關節(jié)中的iNOS表達(圖26)。注左圖中的深色(在原始彩色切片中為褐色)染色部分表示iNOS表達。這些結果支持了本文的教導，即通過干擾TNFR裝配，P60PLAD阻斷CIA中TNF-ct誘導的組織損害。結論本發(fā)明的結果證實了TNFR1中的PLAD為重要的治療乾標。人們發(fā)現(xiàn)CD95PLAD通過介導顯性干涉來參與ALPS的發(fā)病機制(77)。P60和P80PLAD蛋白可阻斷TNF-cc與TNFRl結合但不會直接與TNF-oc結合。最重要的是，通過全身以及關節(jié)內(nèi)給藥，在幾種關節(jié)炎的小鼠模型中，P60PLAD表現(xiàn)出顯著的改^用。此外，通過P60PLAD治療可以顯著地減少關節(jié)的炎性細胞浸潤。在先前的實例中，人們發(fā)現(xiàn)P60和P80PLAD的同型結^^^選擇性的并且不^^彼此間交叉結合或與CD95PLAD交叉結合U7J》。那些實驗逸實P60和P80PLAD優(yōu)先作用于對應的受體^a是可能不4^是完全特異性的(圖5e、f)。此外，P60PLAD可以在幾種關節(jié)炎的小鼠模型中抑制所述疾病過程的關鍵方面?？傊?，我們的數(shù)據(jù)顯示PLAD是一種重要的關節(jié)炎藥物耙標。P60PLAD蛋白可有效地抑制由TNF-a產(chǎn)生的NF-kB誘導。P60和P80PLAD蛋白可以受體優(yōu)先方式抑制TNF-a誘導的NF-kB易位。此夕卜，NF-kB是RANKLi秀導的破骨細胞形成所需的(7力。破骨細胞介導的骨和軟骨侵蝕會導致關節(jié)炎中的大多數(shù)永久損傷(W、M、M。本發(fā)明的結果顯示出了血管翳中的破骨細胞激活以及TNF-a轉(zhuǎn)基因小鼠中骨破壞的位點。在TNF-a轉(zhuǎn)基因小鼠的關節(jié)炎關節(jié)和M^i秀導的關節(jié)炎中存在大量的RANK和RAML表達(W。P60PLAD治療顯著地減少了被^i:和血管翳中的RANK和RANKL。英夫利昔單抗和依那西普都可以直接結合并且阻斷TNF-a的作用，并且現(xiàn)在它們已被廣i^用于RA和其它疾病的治療中(領。然而，已，見察到了副作用例如狼齊樣疾病、分枝桿菌感染和淋巴瘤發(fā)病率升高("-7J)。兩種藥物都直接阻斷TNF-oc與兩種TNFR的結合。因此，它們可有效地抑制TNFR2所介導的藥效同時阻斷TNFR1的疾病誘導作用。P60PLAD是可以優(yōu)先地乾向TNFR1的小蛋白結構域。在我們的模型中，約4mg/kg(關節(jié)內(nèi))或16mg/kg(腸胃外)的P60PLAD蛋白劑量具有與英夫利昔單抗(IOmg/kg)(7^)和依那西普(0.4mg/kg)"劑量類似的作用，所述英夫利昔單抗和依那西普的劑量已經(jīng)在臨床上被用于改善關節(jié)炎。P60PLAD蛋白提供了一種抑制TNF-a的致病作用的新方法所述方法可以用于治療RA。實施例IVPLAD蛋白直接與TNF受體結合為確定PLAD蛋白是否會直接與TNFR結合，將P80-PLAD蛋白與,西普通過與P80PLAD蛋白混合來測試含有TNFR2的完整胞外結構域的TNFR2融M白。免疫沉淀(IP)和蛋白質(zhì)印跡(WB)的結果顯示P80-PLAD-GST蛋白而非單純的GST蛋白可與依那西普締合，表明了PLAD蛋白可與TNFR直接結合開且問jwi^f市i』_inot'/吝'r生、閨2^。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>氺p60-特異性單克隆抗體MAB225(R&DSystems)的染色。通過區(qū)分MAB225陽性細胞的百分數(shù)和HA陽性細胞百分數(shù)，將數(shù)值根據(jù)HA表位標各的染色標準化。t將用p60-特異性單克隆抗體4.12(Zyme)的染色根據(jù)HA染色來標準化。J使用生物素?；问降腡NFa來測定TNFa結合并且根據(jù)HA染色進行標準化(25)。S在所述293T暫態(tài)轉(zhuǎn)染中通過免疫沉淀測定自締^i2)。NT，夫測試。，如所述測定顯性干涉(26)。利用p60ACD-HA進行的顯性抑制至少為p60ACD野生型(+)的50。/。。在所有的實驗中，p6055_211、KY19/20AA和K32A不^^產(chǎn)生4^f可對抗TNFi秀導的死亡(-)的4呆護作用(<5%)。所述抗體和TNFa與p60ACD的結合^A為地設定為1。結果代表了三次獨立的實驗。200680029841.9勢溢也被57/80:a;ilTNF/TNFR超家族成員<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>下頁中繼續(xù)表l續(xù)<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>在本申請中，參考了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容4r^通過引用的方式納4申請中，以便更加充分的描述本發(fā)明所屬
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76YTPPNGKCKDTEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQCSEQIDNO:40成熟TNF1的1-124位氨基酸VCPQGKYfflPQ麗SICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCSEQIDNO:41假定蛋白的139-171位氨基酸(空腸彎曲桿菌RM1221)GenBank登記號Genbank登記號CP000025AW35633麵SEGMEDLSFDDDAQDDNANKTLETQNLEHDSEQIDNO:42假定蛋白的438-454位氨基酸(布氏錐蟲)GenBank登記號AC091702Genbank登記號AAX79885TEINELROTITDVETNLSEQIDNO:43假定蛋白的488-517位氨基酸(金黃色葡萄球-菌-)GenBank登記號BA000017Genbank登記號BAB56791DENSKELERLQKIAFNVETKTLESLVDEGQSEQIDNO:44T2蛋白的全長序列(粘液瘤病毒)GenBank登記號M95181326個氨基酸MFRLTLIXAYVACVYGGGAPYGADRGKCRGNDYEKDGLCCTSCPPGSYASRLCGPGSDTVCSPCKNETFTASTNHAPACVSCRGRCTGHLSESQSCDKTRDRVCDCSAGNYCLLKGQEGCRICAPKTKCPAGYGVSGHTRTGDVLCTKCPRYTYSDAVSSTETCTSSFNYISVEFNLYPVNDTSCTTTAGPNEWKTSEFSVTLNHTDCDPVFHTEYYGTSGSEGAGGFFTGMDRYQNTTKMCTLNIEIRCVEGDAVRTIPRTSDGVGVLSHSETITVIGGCLSDVNVD正YSDSNHPEEVDDFVEYHWGTRLRLFPSPKRCRLVSSEQIDNO:45s002R蛋白的全長序列(肖普纖維瘤病毒)GenBank登記號AF170722325個氨基酸MLRLIALLVCWYVYGDDWYSSNQGKCGGHDYEKDGLCCASCHPGFYASRLCGPGSNTVCSPCEDGTFTASTNHAPACVSCRGPCTGHLSESQPCDRTHDRVCNCSTGNYCLLKGQNGCRICAPQTKCPAGYGVSGHTRAGDTLCEKCPPHTYSDSLSPTERCGTSFNYISVGFNLYPVNETSCTTTAGHNEVIKTKEFrVTLNYTDCDPVFHTEYYATSGKEGAGGFFTGTDIYQNTTKVCTDWEIQCSEGDDIHTLQKTOGGSTMPHSETrrVVGSCLSDVNVDMYSDTNHPGEVDDFVEYHWGTRLRFFPLPKRCTPVSSEOIDNO:46UL144蛋白的全長序列(HCMV)GenBank登記號AF179208175個氨基酸MKPLVMLICFAVILLQLGVTKVCQHNEVQLGNECCPPCGSGQRVTKVCTDYTSVTCTPCPNGTYVSGLYNCTDCTECNDTEVTIRNCTSTNNTVCASKNYTSFSISGVQHHKQRQ麗TAHVTVKQGKSGRHTLARLSLFIFLVGnLLILYLIAAYRSEKCQQCCSIGKIFYRTLSEQIDNO:47CrmC蛋白的全長序列(牛痘病毒)GenBank登記號AF482758186個氨基酸MDIKNLLTVCTILYISTLVTADIPTSSLPHAPVNGSCDDGEYLDKTHNQCCNRCPPGEPAKJRCSGSDNTKCERCPPHTYTTVPNYSNGCHQCRKCPTGSFDKVKCTGTQNSKCSCLPG，CATDSSKTEDCRDC]PKRKCPCGYFGGIDELGNPLCKSCCVGEYCDDIRNHRVGPFPPCKLSKCNSEQIDNO:48CrmC(AHR)蛋白的全長序列(痘苗病毒)GenBank登記號AJ416893186個氨基酸MDIKNLLTACTIFYITTLATADIPTSSLPHAPVNGSCDEGEYLDKRHNQCCNRCPPGEFAKVRCNGNDNTKCERCPPHTYTAIPNYSNGCHQCRKCPTGSFDKVKCTGTQNSKCSCLPGWYCATDSSQTEDCRDCIPKRRCPCGYFGGIDEQGNPICKSCCVGEYCDYLRNYRLDPFPPCKLSKCNSEQIDNO:49CrniD蛋白的全長序列(牛j^病毒)GenBank登記號U87581148個氨基酸MMKMTPSYILLVYMFVVVSGDWYE麗GKCNGTDYNSNSNNLCCKQCDPGMYMTHSCNTTSNTKCDKCPDGTFTSIPNHIPTCLSCRGKCSSNQVETKSCSNTQAEYVSVHPDTTANLKDQMVAGYVYHKQSVILVTAYMATHLKEMSEQIDNO:50CnnE蛋白的全長序列(牛痘病毒)GenBank登記號AJ272008167個氨基酸MTKVHILGFLnNTNSLSMKCEQGVSYYNSQELKCCKLCKPGTYSDHRCDKYSDTICGHCPSDTFTSIYNRSPWCHSCRGSCGTNRVEVTPCTPTTNRICHCDSNSYCLLKASDGNCVTCAPKTKCGRGYGKKGEDEMG麗CKKCRKGTYSDIVSDSDQCKPMTRSEQIDNO:510RF167L假定蛋白的全長序列(淋巴嚢腫病病毒)GenBank登記號AY380826289個氨基酸MMLFELFLLPITVHTATDCPPGYYISKVYPAGTPMCSPCSPGTYTGLQNSLRKCLRCSTCSHNEEPKVACSTTSDVQCQCRQGYYYDPESEMCFPCSNCESSKVKVTTCNRTHDTVCKCKEGYYDKNGVCVKCGNCYLGEGVKSKCANNTDVTCELCKNGTFSDKVSSSNICYLYTMCTLGLTQLNFNVTWFDTICINCSMSTDLLDLETFFTINFVTQRRFPEDDLKNMFRLTYNKTRNDIDSANRDDVEGSFTYDPNLPYTMKQLDYLIASKFLMTAYKKISQICQLSEQEDNO:52EVMO(B蛋白的全長序列(小鼠脫腳病病毒)GenBank登記號NC—004105320個氨基酸—MMKMTPSYUXVYMFVWSGDVPYTPINGKCNGTDYNSNNLCCKQCNPGMYMTHSCNTTSNTKCDKCPDDTFTSIPNHSPACLSCRGKCSSNQVETKSCSNTQDRVCVCASGYYCEFEGSNGCRLCVPQTKCGSGYGVYGYSSKGDVICKKCPGMDICCDLSFNSIDVEINMYPVNKTSCNSSIGSSSTISTSELTrrLTHEDCTPWIGDYYSVVDKLATSGFFTM)KVHQDLTTQCKINLEIKCNSGRESRQLTPTTKVYFMPHSETVTWGDCLSNLDVYIVYANTDAIYSDMDVVAYHTSYILNVDHIPPNDCERDSB(2IDNO:53CrraB蛋白的全長序列(駱駝痘病毒)GenBank登記號AF438165349個氨基酸MKSVLYSYILFLSCIIINGRDVTPYAPSNGKCKDNEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCr)SKTNTQCTPCGSGTFTSRNNHLPACLSCNGRCDSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYYCILKGSSGCKACVSQTKCGIGYGVSGHTSAG簡CSPCGLGTYSRTVSSADKCEPVPSNTFNYIDVEINLYPVNDTSCTRTTTTGISESISTSELTITMNHKDCDPWREEYFSVLNKVATSGFFTGENRYQMSKVCTLNFEIKCNNKGSSSKQLTKAKNDDG層HSETVTLVGDCLSSVDIY1LYSNTNTQDYETDTISYHAGNVLDVDSHMPGSCDIHKIJTNSKPTHFLSEQIDNO:54TNFR2同系物蛋白的全長序列(猴痘病毒)GenBank登記號DQ011155348個氨基酸逢SVLYSYILFLSC畫GRDLAPHAPSNGKCKDNEYRSKNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQCTPCGSDTFTSHNNHLQACLSCNGRCDSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYYCLLKGSSGCRTCISKTKCGIGYGVSGYTSTGDVICSPCGPGTYSHTVSSTDKCEPVTSNTFNYIDVEINLYPVNDTSCTRTTTTGLSESISTSEUnTMNHKDCDPWRAEYFSVLNNVATSGFFTGENRYQNTSKICTLNF孤CNNKDSSSKQLTKTKNDTIMPHSETVTLVGDCLSSVDlYILYSNTNTQDYETDTISYHMGNVLDVNSHMPASCDIHKLrTNSQNPTHLSEQEDNO:55G2R蛋白的全長序列(類天花病毒)GenBank登記號U88151349個氛基酸MKSVLYLYILFLSCGRDAAPYTPPNGKCKDTEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQCTPCGSGTFTSRNNHLPA(XSCNGRCNSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYYCLLKGSSGCKACVS(2TKCGIGYGVSGHTSVGDVICSPCGFGTYSYTVSSTDKCEPWNNTFNYIDVEITLYPVNDTSCTRTTTTGLSESILTSELTITMNHTDCNPWREEYFSVLNKVATSGFFTGENRYQNISKYCTLNFEIKCNNKGSSFKQLTKAKNDDGMMSHSETVTLAGDCLSSVDIYILYSNTNAQDYETDTISYRVGNVLDDDSHMPGSCDIHKLITNSKPTRFLSEQIDNO:56假定蛋白的全長序列(空腸彎曲桿菌RM1221)GenBank登記號CP000025547個氨基酸MKHXLNENPWSRLVSLSAKKMSYDFEELNAYSENLGNYDVIVVDSDTP肌KILKEKCDRLIFLAPRNQNVEDIDAQILQKPFLPTDHLNIXNNKDANKHTSIDLPMLSNDENPYADISLDLDNLNLDDLPDENSL畫SEGMEDLSFDDDAQDDNANKTLETQNLEHDNLEQETKEQTQEDTQTDLDLTLEDSESEKEDLSQEHTALDTEPSLDELDDKNDEDLEIKEDDKNEE正KQELLDDSKTNTLEMQEELSESQDDNANKTLETQNLEHDNLEQETKJ3QTQEDTQTDLDLTLEDGESEKEDLSQEHTALDTEPSLDELDDKNDEDLEDNKELQ扁SDFDDLPEVEEQEKEMDFDDLPEDAEFLGQAKYNEESEENLEEFAPVVEEDVQDEIDDFASNLSTQDQIKEEIAQLDELDYGIDSDNSSKVLEDFKDEPILDDKELGTNEEEWWNLNISDFDTLKESDIQEALGEEILEKNEEPIVSDVTKDDNSEmVNELSQSIAGAITSSKDDTLKAALKGMNMNININISFKEDSEQIDNO:57假定蛋白的全長序列(布氏錐蟲)GenBank登記號AC091702496個氨基酸MLRCRVADWSSDQMCEMTOFPPVQATVGYVQLLRRLSFKREFFVTFWTKHVIFTFQTKNPLEEGKVKDEVTDLVSHYFNWIRERGVYSFQILQLYVCILSGCTVVVIECPDTLTTLDVHSFSQEPEAPTVGKRRVLVFPCDNDEISDSELESNYYIVPTCTLCAERLEPTLTGYSSPTCSCVDGRECRCLLEQSSCWCQTSITMQHESQKVQCEQCSRTGDPWICLVCGYVGCSRYQAKHAREHYLQHKHLFSMSLLTQQIWDYDSDAFVHRVVVLLDNATGAVNRVQYPDRDNIPSSLADEYVDAAAEKVSKKHINAKEDSKVETSNEQLALMnSBLNTRRVEYETEMHGGSHHLNDELMGDPSLCSVIVAERACAASRERWWQLHNANECSIQEELMQRRREEEAHQKTIDELQQELRSVVQHYATREYSLLTEINELRQTITDVETNLRTFAKLSRGLGNDTLEHVRIVGGTKEPKPKRRGGNNTRDGRASE(2IDNO:58假定蛋白的全長序列(金黃色葡萄球菌)GenBank登記號BA000017680個氨基酸MEIFETttJFIAWILSSFVHTFIPKVPLAFIQIFLGMLLFITPIPVQFNFDSELFMVTMIAPLLFVEGVNVSRVHLRKYIKPVMMMALGL曹TVIGVGLFmWIWPDLPIGAAFAIAAILCPTDAVAVQAITKGKVLPKGAMTILEGESLLNDAAGIISFKIAVGVLVTGAFSLVDAVQLFLIASIGGAWGLLIGMALVRFRLTLMRRGYENINMFTnQLLTPFVTYLIAELFHASGIIAAVVAGLVHGFERDRIMQVRTQLQMSYNHTWNILGYVLNGFVFSILGFLVPEVHKUKTEPHNLIFUGmVVALAVYLFRFVWVYVLYPYFYLAISPFQKMMTKNDDDNPTTEKPPKRSLYAL]MTLCGVHGTISLAIALTLPYFLAGHHAFTYRNDLLFIASGMVnSLWAQVLLPLLTKPAPKTVIGNMSFKVARIYILEQVIDYLNQKSTFETSFKYGNVKEYHDKLAFLKTVEKDDENSKELERLQKIAFNVETKTLESLVDEGQITNSVLENYMRYAERTQVYRQASLIRRMIVLLRGALLKRRVQTRVNSASSLSVTDNLMELNKINKLVHYNWSRLSKETTKDNTLEIGMVCDGYLMRIENLTPSNFFNSASEDTITK1KLNALREQRRILREIJDTDEVSEGTALKLREAINYDEMVIVDSMTSEQIDNO.59MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAnRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSICYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSPEFLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCREFPGRLERPHRDSEQIDNO:60MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAHRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATIOTCm丁SDTVCDEFPGRLERPHRDSEQIDNO.61TCCATGACGTTCCTGATGCT權利要求1.一種38個至125個氨基酸的多肽，包括TNF受體樣受體的前配體裝配域(PLAD)的分離的氨基酸序列。2.權利要求1的多肽，其中所述PLAD選自TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD、NGFR的PLAD、Troy的PLAD、EDAR的PLAD、XEDAR的PLAD、DcR3的PLAD、AITR的PLAD、4-1BB的PLAD、DR3的PLAD、RANK的PLAD、TACI的PLAD、BCMA的PLAD、DR6的PLAD、OPG的PLAD、DRS的PLAD、DcRl的PLAD和DcR2的PLAD。3.—種由TNF受體樣受體的前配體裝配域的M酸序列組成的多肽。4.一種包括TNF受體樣受體的前配體裝配域(PLAD)的分離的M酸序列的多肽，其中所述多肽為R廣TNF受體樣受體PLAD-R2，其中R:或112包括在天然存在的TNF受體樣受體中不位于TNF受體樣受體PLAD側翼的氨基酸序列。5.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廠TNF受體樣受體PLAD-R2,其中Ri為H、?；H2、絲酸或肽，R2為H、醃基、NH2、絲酸或肽。6.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廣p60的氮基酸1-54(SEQIDN0:1)-R2，其中&為H、?；H2、絲酸或肽，112為H、?；H2、氨基酸或肽。7.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廣p80的氨基酸10-54(SEQIDN0:2)-R2,其中K為H、?；?、NH2、絲酸或肽，112為H、酰基、NH2、氨基酸或肽。8.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廣Fas的氨基酸1-43(SEQIDN0:3)-R2，其中Ri為H、絲、NH2、絲酸或肽，112為H、喊、冊2、氨基酸或肽。9.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廣Fas的氨基酸1-66(SEQIDN0:4)-R2,其中l(wèi)為H、絲、NH2、絲酸或肽，112為H、、NH2、氨基酸或肽。10.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R「LTPR的氨基酸13-50(SEQIDN0:5)-R2,其中Ri為H、?；?、NH2、絲酸或肽，112為H、酰基、NH2、氨基酸或肽。11.權利要求1的多肽，其中所述多肽為Ri"CD40的氨基酸6-39(SEQIDN0:6)-R2，其中Ri為H、酰基、NH2、絲酸或肽，112為H、?；?、NH2、氨基酸或肽。12.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R「CD30的氨基酸11-51(SEQIDN0:7)-R2，其中&為H、?；?、NH2、絲酸或肽，112為H、酰基、NH2、氨基酸或肽。13.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R「CD27的氨基酸7-42(SEQIDN0:8)-R2,其中R!為H、錄、麗2、絲酸或肽，112為H、絲、NH2、氨基酸或肽。14.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廣HVEM的氨基酸6-37(SEQIDN0:9)-R2，其中&為H、酰基、麗2、絲酸或肽，112為H、?；H2、氨基酸或肽。15.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廣0X40的氨基酸3-36(SEQIDN0:10)-R2，其中&為H、絲、冊2、絲酸或肽，！^為H、綠、NH2、絲酸或肽。16.權利要求1的多肽，其中所述多肽為R廣DR4的氨基酸109-138(SEQIDN0:11)-R2，其中Ri為H、絲、NH2、絲酸或肽，112為H、綠、NH2、絲酸或肽。17.權利要求3的多肽，其中所述PLAD選自頂F-R的PLAD、Fas(CD95/AP0-1)的PLAD和TRAIL的PLAD。18.—種編碼權利要求1的多肽的分離的核酸。19.權利要求18的分離的核酸，所述核酸在載體中。20.—種適合用于在宿主中表ii^利要求19所述核酸的載體。21.—種通*予有效量的權利要求1或3的多肽來抑制細胞中TNF受體寡聚化的方法。22.—種通it^予有效量的權利要求1或3的多肽來抑制細胞中Fas寡聚化的方法。23.—種通it^予有效量的權利要求1或3的多肽來抑制TNF受體樣受體與配體結合的方法。24.—種通*予有效量的權利要求1或3的多肽來抑制Fas與配體結合的方法。25.—種通it^予有效量的權利要求1或3的多AUM臺療受試者體內(nèi)炎癥的方法。26.權利要求25的方法，其中所述炎癥與自身免疫性疾病相關。27.權利要求25的方法，其中所述炎癥與類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎或l^毒性關節(jié)炎相關。28.—種包括PLAD締^^抑制劑的組合物。29.權利要求25的方法，其中所述抑制劑為與TNF受體樣受體的PLAD特異性結合的抗體。30.權利要求25的方法，其中所述抑制劑為TNF受體樣受體的PLAD。31.權利要求30的方法，其中所述可溶性PLAD為p60的PLAD。32.—種篩選PLAD締^^抑制劑的方法，包括a)用以下兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細胞，其中一種質(zhì)粒含有的核酸包括編碼與熒光供體功能性連接的分離的PLAD的核酸序列，另一種質(zhì)粒含有的含有編碼與熒光受體功能性連接的分離的PLAD的核酸序列；b)將所述細胞與假定的抑制劑相接觸；并且c)測量FRET，其中同未與所述假定抑制劑接觸的細胞中的FRET測量結果相比，F(xiàn)RET下降表明存在PLAD締合抑制劑。v33.—種篩選PLAD締合抑制劑的方法，包括a)用以下兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細胞，其中一種質(zhì)粒含有包括編碼一種分離的PLAD的核酸序列的核酸，另一種質(zhì)粒含有編碼另一種分離的PLAD的核酸序列；b)將所述細胞與假定的抑制劑相接觸；c)測量PLAD的自締合，其中同未與所述假定的抑制劑接觸的細胞中的PLAD締合相比，步驟b)細胞中PLAD締合的減少表明了存在PLAD締合抑制劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種包括TNF受體樣受體的前配體裝配域(PLAD)的分離的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還提供了一種包括一種前配體裝配域(PLAD)的分離的氨基酸序列的多肽，其中所述PLAD選自TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL受體的PLAD、LT/βR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、OX40的PLAD和DR4的PLAD。TNF-R、p60、p80、Fas、TRAIL受體、LT/βR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、TROY、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4-1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1和DCR2全部為TNF受體超家族或TNF樣受體家族的成員。本發(fā)明還提供了TNF受體超家族其它成員的PLAD。本發(fā)明的多肽可被用于抑制TNF受體超家族成員的寡聚化。這些多肽也可被用于抑制TNF受體超家族成員的配體結合。本發(fā)明還提供了一種包括TNF受體寡聚化抑制劑的組合物。本發(fā)明進一步提供了缺少PLAD的TNF受體超家族成員。文檔編號C07K14/435GK101273060SQ200680029841公開日2008年9月24日申請日期2006年6月26日優(yōu)先權日2005年6月24日發(fā)明者F·K-M·陳,G-M·鄧,L·鄭,M·萊納多申請人:美國政府(由衛(wèi)生和人類服務部、國立衛(wèi)生研究院的部長所代表)