專利名稱：帶發(fā)光標記的低核苷酸探針的溶液中的淬火方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測用一種發(fā)光標記標記的低核苷酸標記的長度改變的方法。另外，本發(fā)明涉及通過用有探針功能的互補低核苷酸雜交檢測核酸序列的方法。
使用低核苷酸探針進行核酸檢測已成為用于特定目標檢測的標準方法。已有許多關(guān)于測定格式的描述。一般地，使核酸樣品雜交到一種被標記的特定目標探針中，將未結(jié)合的探針與雜交復(fù)體分開，并且用該標記檢測雜交復(fù)體的存在。雜交的和未雜交的探針的分離可以借助許多手段實現(xiàn)。例如，核酸樣品可以被固定在一種固體載體上并通過洗滌除去未雜交的探針，或者可以通過凝膠電泳法分離雜交復(fù)體和未結(jié)合的探針。一般來說，這些方法需要一個分離步驟，以使雜交后產(chǎn)生的信號可以與由未結(jié)合的標記的探針產(chǎn)生的背景信號區(qū)分開。
一些已經(jīng)描述的核酸檢測方法涉及在探針-目標雜交復(fù)體形成后選擇性地切開低核苷酸探針。檢測到切開后的探針表明雜交發(fā)生，從而表明存在目標序列。例如，Saiki等人在1985年Biotechnology 31008-1012中描述了“低聚物限制”檢測方法，在該方法中，特定目標探針的雜交產(chǎn)生限制性位點，然后通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將其分開。在專利公開文件WO 89/09284描述的方法中，使用RNA探針檢測DNA目標序列。用RNaseH切開雜交到DNA目標上的RNA探針，RNaseH選擇性地切開RNA-DNA雜交復(fù)體中的RNA。US 5210015所述的方法利用核酸聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性切開雜交到目標序列上的探針，從而釋放用于檢測的標記低核苷酸片段。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的發(fā)明，即一種擴增核酸的方法的發(fā)明能夠使檢測核酸大大增加敏感性和專一性。利用PCR，單個復(fù)制基因組DNA的片段可以在檢測前被選擇性地擴增到容易檢測到的水平。在US 4,683,202中描述了PCR方法。在US 4,683,195中以及歐洲專利公開EP 237,362中描述了PCR和利用一種能與擴增的目標核酸雜交的低核苷酸探針檢測PCR產(chǎn)物的方法。
上述的涉及在形成探針-目標雜交復(fù)體后雜交探針的選擇性切開的檢測核酸的方法已被用于檢測擴增的核酸。Saiki等人在1985年Science 2301350-1353中描述了使用“低聚物限制”檢測PCR擴增的核酸。上述US 5,210,015描述了利用一種核酸聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性切開雜交到目標序列中的標記探針分析PCR擴增產(chǎn)物的方法，還可參見Holland等人的1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280。在US 5,210,015的方法中，雜交到由擴增引物束縛的目標核酸的一個區(qū)上的探針被混入該擴增反應(yīng)混合物中。雜交的探針在引物延伸過程中被具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶切開。標記的片段的檢出表明引物延伸和探針雜交的發(fā)生，從而擴增特定的目標序列。
為了標記核酸已經(jīng)有許多探針或目標制劑，用于促進目標核酸的檢測。已經(jīng)描述的標記提供可通過熒光、放射性、比色法、X射線衍射或吸收、磁性和酶活性檢測到的信號，而且包括如熒光團、載色體、放射性同位素(特別是32P和125I)、電子-密集試劑、酶和有特定結(jié)合配偶體的配位體。標記可以通過許多手段完成，例如引物或探針的化學(xué)變化使與一個標記結(jié)合或使用聚合制劑使改性三磷酸核苷結(jié)合到一種延伸產(chǎn)物中。
在Morrison，1992，Nonisotopic DNA Probe Techniques，Kricka，ed.，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，Chapter 13；和Hellet and Morrison，1985，Rapid Detection andIdentification of Infections Agents，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，Pages 245-256中描述了在核酸雜交測定中使用用相互作用的熒光標記標記的低核苷酸探針。這些方法基于當適當?shù)臒晒鈽擞浛拷鼤r所出現(xiàn)的熒光的改變，在該文獻中描述成熒光能量轉(zhuǎn)移(FET)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，不輻射能量轉(zhuǎn)移，長距離能量轉(zhuǎn)移，偶極子-偶合能量轉(zhuǎn)移，或Frster能量轉(zhuǎn)移。
Morrison在上述1992年的文獻中描述了三種測定程式。在這些程式的兩個中，相互作用熒光標記被結(jié)合以分開低核苷酸，所述低核苷酸被探針雜交弄到一起或分開。根據(jù)探針—探針雜交能否與探針-目標雜交競爭而將這些測定程式描述成非競爭性的或競爭性的。兩種測定程式都要求合成兩種特定序列標記的探針。在第三種測定程式中，一個熒光標-記被結(jié)合到雜交探針上，第二個熒光標記通過插入到雙鏈的雜交復(fù)體而緊密接近。在插入的標記和在溶液中的未雜交的探針之間不發(fā)生顯著的相互作用。因為插入的標記可以插入到任何雙鏈核酸中，這種程式實際上只用于檢測單鏈目標核酸。
US 5,210,015描述了使用雜交探針，所述探針用緊密接近的相互作用的熒光標記標記。該標記如此附著使得在擴增過程中探針降解使所述標記分開，從而產(chǎn)生熒光中的可測出的變化。這樣的多重標記的探針合成困難并且代價高。
在例如Sambrook等人，1985，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames and Higgns.eds.，1984)；和a series，Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)這些文獻中詳細描述了本領(lǐng)域的分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)。
一般來說本發(fā)明提供了通過用發(fā)光標記標記的低核苷酸的DNA結(jié)合的化合物進行重要的溶液中淬火的條件。這種淬火在標記的低核苷酸沒有雜交到它的互補序列的溶液中發(fā)生。本發(fā)明的這些方法利用了這種淬火對標記的低核苷酸的長度的依賴。短的標記的低核苷酸(約6個核苷酸或更少)的淬火比較長的標記的核苷酸的淬火更難測出。在此之前一直沒有關(guān)于通過用發(fā)光標記標記的一種低核苷酸的DNA結(jié)合的化合物發(fā)生在溶液中的淬火和這種淬火對低核苷酸的長度的依賴的描述。
本發(fā)明提供用于檢測標記的低核苷酸的長度變化的方法，所述變化基于在一種DNA結(jié)合的化合物存在下熒光的改變。特別是，本發(fā)明提供用于檢測低核苷酸在一種反應(yīng)混合物中的降解的方法，所述檢測不需要將切開的低核苷酸片段與未切開的低核苷酸分開。所述低核苷酸用一種發(fā)光的標記標記。一種可以與該標記相互作用以抑制該標記的發(fā)光的DNA結(jié)合的化合物被加入到該反應(yīng)混合物中。通過測定反應(yīng)后該標記的發(fā)光檢測低核苷酸的降解。由于淬火依賴于標記的低核苷酸的長度，低核苷酸的降解引起標記的核苷酸的發(fā)光的可檢出的變化。
本發(fā)明提供通過雜交到一種低核苷酸探針上來檢測樣品中的一種目標核酸的改進的方法。這些方法依賴于選擇性的切開雜交到目標核酸上的探針。利用本發(fā)明的方法切開的探針的檢測表明存在目標核酸。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，提供一種用于檢測樣品中的目標核酸的方法，其中所述方法包括(a)提供一種反應(yīng)混合物，該混合物包括該樣品和一種用一種發(fā)光標記標記的低核苷酸探針，其中所述探針含有一種能夠雜交到目標核酸上的序列，而且其中DNA結(jié)合的化合物能夠改變該標記的發(fā)光；(b)將一種DNA結(jié)合的化合物加到步驟(a)的反應(yīng)混合物的一份等分試樣中，并測定標記的發(fā)光；(c)在所述低核苷酸探針雜交到所述目標序列上和被切開的條件下處理所述混合物；(d)將一種DNA結(jié)合化合物加到步驟(c)的反應(yīng)混合物一份等分試樣中，并測定標記的發(fā)光；和(e)通過在步驟(b)和步驟(d)中測得的發(fā)光的差別確定是否存在目標序列。
雜交到目標核酸上的探針的選擇性的切開可以通過許多已知反應(yīng)的任何一種來完成。在Saiki等人的上述1985年的文獻；上述的專利公開WO 89/09284；和上述的US 5210015中描述了選擇性地切開雜交到一個目標序列的探針的適宜的反應(yīng)的實例。
本發(fā)明的檢測核酸的方法特別適合用于與擴增過程結(jié)合。這樣，在本發(fā)明的一個實施方案中，目標序列在步驟(c)之前或與步驟(c)結(jié)合被擴增。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供對在US 5,210,015中描述的均勻的PCR擴增和PCR產(chǎn)物驗定法的改進，所述專利使用一種用于引物延伸和雜交的標記探針切開的單一核酸聚合酶。本發(fā)明所提供的改進允許使用一種用一種單個發(fā)光標記標記的探針而無需為分離切開的和未切開的探針進行的反應(yīng)后處理。
這樣，本發(fā)明提供一種在一種樣品中檢測目標核酸的方法，該方法利用一種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中該方法包括(a)提供一種PCR混合物，該混合物含有所述樣品，一對低核苷酸引物，一種具有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶，和一種能夠通過低核苷酸引物結(jié)合雜交到目標該酸的一個區(qū)上的低核苷酸探針，而且其中所述探針用一種發(fā)光標記標記，并且其中DNA結(jié)合化合物能夠改變該標記的發(fā)光；(b)在一種DNA結(jié)合化合物存在下測定反應(yīng)混合物中該標記的發(fā)光；(c)在PCR條件下處理該PCR混合物，其中具有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶切開雜交到該目標序列上的探針；(d)在一種DNA結(jié)合化合物存在下測定該標記的發(fā)光；(e)通過在步驟(b)和步驟(d)之間發(fā)光的差別確定是否存在目標序列。


圖1涉及淬火對標記的低核苷酸長度，發(fā)光標記和DNA結(jié)合化合物的濃度的依賴，如實施例1所述。
圖2涉及淬火對所用的聚乙烯亞胺(PEI)的分子量和濃度的依賴，如實施例2所述。
圖3涉及在一種內(nèi)在量控制標準樣品存在下通過擴增目標核酸測定核酸量，如實施例3中所述。
為了幫助理解本發(fā)明，下面定義一些術(shù)語。
術(shù)語“核酸”和“低核苷酸”指的是探針和要被檢測的低聚物片段，并且是多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)和任何其它類型的是一種有嘌呤堿或嘧啶堿，或改性的嘌呤堿或嘧啶堿的N苷的多核苷酸的通稱。并不打算區(qū)分術(shù)語“核酸”和“低核苷酸”的長度，而且這些術(shù)語將被可交換地使用。這些術(shù)語僅指該分子的初級結(jié)構(gòu)。這樣，這些術(shù)語包括雙鏈DNA和單鏈DNA，以及雙鏈RNA和單鏈RNA。
術(shù)語“目標區(qū)”、“目標序列”和“目標核酸序列”指的是一個要被檢測的核酸區(qū)。
術(shù)語“探針”是指一種低核苷酸，典型的是標記的低核苷酸，由于互補堿基配對，所述低核苷酸與目標核酸序列形成復(fù)體結(jié)構(gòu)。該探針將包括一個“雜交區(qū)”，對應(yīng)于目標序列的一個區(qū)，所述雜交區(qū)優(yōu)選由l0至50個核苷酸組成，更優(yōu)選由20至30個核苷酸組成?！皩?yīng)”的意思是與所設(shè)計的核酸相同或互補。在本發(fā)明中，探針低核苷酸用一種熒光標記標記即結(jié)合到一種熒光標記上以能夠檢測。
術(shù)語“雜交”指的是由于互補堿基配對由兩種單鏈核酸形成一種復(fù)體結(jié)構(gòu)。雜交可以在完全互補的核酸鏈之間或者在含有較小的失配區(qū)的核酸鏈之間發(fā)生。只有完全互補的核酸鏈進行雜交所需的條件稱為“嚴格的雜交條件”兩種除了較小的失配區(qū)外是互補的單鏈核酸被稱為是“基本上互補的”。具有基本上互補的序列的穩(wěn)定的復(fù)體可以在較不嚴格的雜交條件下得到。核酸技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員可以考慮到包括例如低核苷酸的長度和堿基對濃度、離子強度和失配的堿基對的發(fā)生率根據(jù)經(jīng)驗確定復(fù)體穩(wěn)定性。
術(shù)語“特定序列的低核苷酸”和“SSO”是指低核苷酸探針，其中雜交區(qū)與要被檢測的序列嚴格互補。使用嚴格的雜交條件能夠測出特定目標序列，在所述條件下探針將只雜交到嚴格互補的目標序列上。嚴格的雜交條件是本領(lǐng)域中公知的，例如可參見Sambrook等人，1985，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork。嚴格地條件與序列有關(guān)，而且將在不同情況下有所不同。一般來說，選擇的嚴格的條件為在限定的離子強度和pH下對于特定的序列比熱熔點(Tm)低約5℃。Tm是在限定的離子強度和pH值下，在該溫度下50％的堿基對離解。松弛雜交條件的嚴格性要求將會允許序列失配；所允許的失配程度可以通過適當調(diào)整雜交條件來控制。
術(shù)語“子序列”在此是指含有另一序列內(nèi)的核苷酸序列。
術(shù)語“標記”正如在此使用的是指任何可以被附著到一種核酸上的原子或分子，而且它可以被用于提供一種可測出的信號或與一種第二標記相互作用以改變由第二標記提供的可測出的信號。優(yōu)選的標記是發(fā)光化合物，這種化合物靠熒光、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光產(chǎn)生一種可測出的信號。
術(shù)語“熒光團”是指一種化合物，該化合物能夠發(fā)熒光，即吸收一種頻率的光并放出另一頻率的光，一般是放出較低頻率的光。
術(shù)語“生物發(fā)光”是指一種形式的化學(xué)發(fā)光，其中發(fā)光化合物是一種在生物器官中發(fā)現(xiàn)的化合物。生物發(fā)光化合物的實例包括細菌熒光素酶和熒火蟲熒光素酶。
術(shù)語“淬火”是指減弱由第二化合物引起的第一化合物的熒光，而不管其機理。淬火一般要求化合物緊密接近。正如在此所用的，所說的化合物或化合物的熒火要被淬火，應(yīng)當理解成兩種說法指的是相同的現(xiàn)象。
術(shù)語“反應(yīng)混合物”是指一種含有進行給定反應(yīng)所需的試劑的溶液。“擴增反應(yīng)混合物”是指一種含有進行擴增反應(yīng)所需試劑的溶液，它典型地含有在一種適當?shù)木彌_液中的低核苷酸引物和DNA聚合酶。用于特定反應(yīng)的反應(yīng)混合物是本領(lǐng)域中公知的。
本發(fā)明的方法適用于低核苷酸的合成或切開的檢測。切開的低核苷酸的檢測在一種溶液中進行，所述溶液含有一種可與標記相互作用以減弱標記的發(fā)光的DNA結(jié)合的化合物。標記的低核苷酸的長度由合成或切開產(chǎn)生的變化導(dǎo)致附著的標記的發(fā)光的可檢出的變化。下面描述適合的發(fā)光標記和DNA結(jié)合化合物，它們可以相互作用而改變標記的發(fā)光。
在本發(fā)明的舉例說明的方法中，檢測出結(jié)合到單鏈低核苷酸上的發(fā)熒光的標記的發(fā)光。DNA結(jié)合化合物使標記熒光淬火的程度取決于所附著的低核苷酸的長度。由DNA結(jié)合化合物結(jié)合到單鏈低核苷酸上的發(fā)熒光標記的DNA結(jié)合化合物進行溶液中淬火的發(fā)生和淬火對低核苷酸的長度的依賴是現(xiàn)有技術(shù)所意想不到的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，DNA結(jié)合試劑是聚乙烯亞胺(PEI)，它是指一類具有各種分子量的氮丙啶的支鏈或無支鏈聚合物。PEI衍生物如羥乙基化的PEI可以適用于本方法中。其它的已經(jīng)表明在本發(fā)明的方法中有效的化合物包括精胺和亞精胺(Spermadine)。
支鏈PEI可從Polysciences，Inc.(Warrington，PA)購到，由粘度估計的分子量范圍從600高至至少60,000-80,000。分子量為600、1200、1800、10,000和60,000-80,000的PEI已被測試并表明在本發(fā)明方法中能夠用于區(qū)分長度為2的發(fā)熒光的標記的低核苷酸和長度為33的那些低核苷酸。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員能夠憑經(jīng)驗確定哪種大小的PEI最適合給定的用途。
根據(jù)經(jīng)驗確定DNA結(jié)合化合物的適合的濃度。一般來說，DNA結(jié)合化合物的最適宜濃度受所述的發(fā)光標記的種類和反應(yīng)試劑的濃度的影響。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鹽濃度影響PEI的最適宜濃度。在某些反應(yīng)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)向反應(yīng)混合物中加入一種螯合劑(例如約1.5mM EDTA)拓寬了PEI的范圍，在所述整個范圍內(nèi)，窗口(window)接近最大值。DNA結(jié)合的化合物的濃度的常規(guī)最優(yōu)化可以基本上按照下面的實施例1和2所述進行，所述最優(yōu)化提供在長的和短的標記的低核苷酸的熒光之間的最大差別。
本領(lǐng)域中記載的許多發(fā)光化合物適用于作為本發(fā)明方法中的低核苷酸標記。理想的是熒光團應(yīng)當有高的司托克斯頻移(即最大吸收波長和最大放出波長之間的大的差值)以使由散射激發(fā)的光產(chǎn)生的干擾最小。本領(lǐng)域中已知的適宜的化合物包括但不限于熒光素和衍生物如熒光素(FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)、和二氯二甲基熒光素(JOE)；若丹明和衍生物如Texas Red，若丹明(ROX)、和四甲基若丹明(TAMRA)；瑩蝦屬黃(Lucifer Yellow)，和香豆素衍生物如7-Me2N-香豆素-4-乙酸鹽、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸鹽、和7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸鹽(AMCA)。FAM、HEK、TET、JOE、ROX和TAMRA由perkin Elmer，Applied BiosystemsDivision(Foster City，CA)出售。Texas Red和許多其它適宜的化合物由Molecular Probes(Eugene，OR)出售?？梢赃m合用作能量供體的化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光化合物的實例包括魯米諾(氨基鄰苯二酰肼)和衍生物，和熒光素酶。
低核苷酸可以通過任何適當?shù)姆椒ㄖ苽?，所述方法包括如用限制性?nèi)切酶進行適當序列的克隆和分離和通過一種方法如Narang等人，1979，Meth.Enzymol.6890-99的磷酸三酯法；Brown等人，1979，Meth.Enzymol.68109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人，1981，Tetrahedron lett.221859-1862的二乙基氨基磷酸酯法；和US 4,458,066的固體載體法進行直接的化學(xué)合成。Agrawal和Zamecnik，1990，Nucl.Acids.Res.18(18)5419-5423；Macmillan和Verdine，1990，J.Org.Chem.555931-5933；Pieles等人，1989，Nucl.Acids.Res.17(22)8967-8978；Roget等人，1989，Nucl.Acids.Res.17(19)7643-7651；和Tesler等人，1989，J.Am.Chem.Soc.1116966-6976中描述了用于合成標記的低核苷酸的方法。在Goodchild，1990，Bioconjugate Chemistry 1(3)165-187中提供了合成方法的回顧。
本發(fā)明的方法特別適用于檢測擴增的核酸，即DNA或RNA。除了PCR(US 4,683,195；4,683,202，和4,965,188)外適當?shù)臄U增方法包括但不限于下述Ligase Chain Reaction(LCR，Wuand Wallace，1989，Genomics 4560-569和Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193)；Polymerase Ligase Chain Reaction(Barany，1991，PCR Methods和Applic.15-16)；Gap-LCR(專利公開WO90/01069)；Repair Chain Rdaction(EP公開439，182)，3SR(Kwoh等人；1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA861173-1177；Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878；專利公開WO92/08800A)，和NASBA(US5,130,238)。本發(fā)明不限于任何具體的擴增體系。由于其它體系被開發(fā)，那些體系可以通過實施本發(fā)明而獲益。在Abramson和Myers，1993，Current Opinion inBiotechnology 441-47中公開了擴增體系的最近的綜述。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例對上述US 5,210,015和Holland等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280所述的方法提供改進方案。本方法利用一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性從雜交復(fù)體上切開退火的標記低核苷酸探針并釋放標記的片段用于檢測。利用DNA聚合酶的5′至3′外切核酸酶活性切開本發(fā)明的標記的探針，使標記游離到反應(yīng)混合物中。由DNA結(jié)合化合物進行淬火的溶液中信號當熒光團結(jié)合到全長未切開的低核苷酸探針上時顯著地大于結(jié)合到變短的切開的片段上時的信號。觀測到的熒光表明探針切開增加，這必然表明目標序列的存在和探針/目標雜交的發(fā)生。
一般來說樣品中的核酸是一種DNA序列，最常見的是基因組DNA。然而本發(fā)明還可用其它核酸如信使RMA、核糖體RNA、病毒RNA、或克隆DNA實施。適宜的核酸樣品包括用于本發(fā)明的單或雙鏈DNA或RNA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會清楚，根據(jù)切開標記的低核苷酸探針所用的反應(yīng)，而不論核酸的種類，只通過對所用的方法進行適當?shù)那夜J的改變就可檢測核酸。
樣品的制備將根據(jù)樣品的來源、要被檢測的目標和在測定中所用的低核苷酸降解反應(yīng)而改變。每次測定要求目標樣品在一種可與測定試劑混溶的緩沖液中。如果在檢測探針切開之前或與之同時將目標擴增，目標核酸必須在一種可與擴增目標所用的酶相混溶的緩沖液中。目標核酸可從各種生物物質(zhì)中分離，所述生物物質(zhì)包括組織、體液、糞便、痰、唾液、植物細胞、細菌培養(yǎng)物等。
本領(lǐng)域中例如上述Sambrook等人描述了適用于每種測定的樣品制備方法。Higuchi，1989，in PCR Technology(Erlich ed，Stockton Press，New York)，和in PCR Protocols，Chapters18-20(Innis等人，ed.，Academic Press，1990)描述了制備用于目標序列的PCR擴增的樣品的簡單且快速的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠選擇并憑經(jīng)驗優(yōu)化一種適當?shù)牟莅浮?br> 在一種溶液中的標記的發(fā)光用一種光譜熒光計測量，所用光譜熒光計例如一種Hitachi/Perkin Elmer Model 650-40(PerkinElmer，Norwalk，CT)或者一種PTILS-100 LuminescenceSpectrophotometer(Photon Technology International，London，Ontario，Canada)。根據(jù)所用的具體裝置的性能，光譜熒光計提供了調(diào)整激發(fā)和放出的波長以及頻帶寬度的可能性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道如何確定適合檢測特定標記的發(fā)光的波長和頻帶寬度設(shè)定值。在例如The Merck Index，(eds.Budavari等人，1989，Merck Co.Inc.Rahway，NJ)和the Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oregon)Catalog，1990，Haugland中可找到一般性的指導(dǎo)。雖然每種標記有不連續(xù)地發(fā)光光譜，但寬范圍的檢測波長適用于實施本發(fā)明。
由探針切開引起的發(fā)光的改變優(yōu)選通過比較在探針切開之前和之后測得的發(fā)光來計量。可供選擇的是，可以在探針切開的同時通過將DNA結(jié)合劑混入反應(yīng)混合物中并在反應(yīng)進行的同時連續(xù)或間歇地監(jiān)測探針熒光來計量發(fā)光的變化。在這種情況下，優(yōu)選使用的反應(yīng)容器還適用于測量發(fā)光，所述容器允許直接測量發(fā)光而不必打開反應(yīng)容器。然而，由于具體的DNA結(jié)合試劑可能抑制具體的探針切開反應(yīng)，所以可能需要從反應(yīng)混合物中除去DNA結(jié)合試劑。在這種情況下，可以用一種完全一樣的反應(yīng)混合物進行反應(yīng)前測量。一般地，反應(yīng)混合物在進行反應(yīng)前被分開，一部分不在反應(yīng)條件下的反應(yīng)混合物用于反應(yīng)前發(fā)光測量。一般地，最方便的是在完成反應(yīng)后測量反應(yīng)前發(fā)光和反應(yīng)后發(fā)光。
在核酸檢測方法與PCR擴增結(jié)合的優(yōu)選方法中，如上所述，擴增反應(yīng)作為一種自發(fā)過程進行。目前可從Perkin Elmer(Norwalk，CT)購得熱循環(huán)控制裝置，這種裝置使用一種能夠夾持高達48或96個反應(yīng)管的加熱組合單元。從而，高達96個擴增反應(yīng)可以同時進行。
Higuchi等人在上述1992年的文獻，Higuchi等人在上述1993年的文獻和歐洲專利公開512,334中描述了用于測量在PCR擴增中從所有管中放出的光的適宜的光學(xué)系統(tǒng)。在一種這樣的光學(xué)系統(tǒng)中，使用多根光導(dǎo)纖維將激發(fā)光從光源傳導(dǎo)到反應(yīng)管并測量從每個管發(fā)出的光。只需要一個光譜熒光計讀出來自反應(yīng)管的熒光，因為每根光導(dǎo)纖維可以同時快速讀出一個數(shù)。一種可供選擇的光學(xué)系統(tǒng)使用一個攝像機同時測量多個反應(yīng)容器的熒光。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，顯然還有可供選擇的檢測設(shè)備適合于本方法。
一種可供選擇的適合的檢測方案使用96室微滴定器程式。這種程式在分析實驗室中對于大規(guī)模的樣品篩選經(jīng)常是理想的，例如用于遺傳分析如用于血庫篩選程序中鐮狀細胞貧血癥或AIDS病毒的篩選。本發(fā)明適用于這種分析并且避免了許多洗滌和提取步驟，所述步驟對于公知的“管內(nèi)”測定步驟如ELISA型程式或其它光學(xué)的基于密度的方法是需要的，這些方法參見如Kolber等人，1988，J.Immun.Meth.108255-264，Huschtscha等人1989，In VitroCelland Dev.Biol.25(1)105-108，和Voller等人，1979，TheEnzymeLinked Immunosorbent Assay，Dynatech Labs，Alexandria，VA。本檢測法還允許用一種類似于ELISA板式讀出器的設(shè)備直接進行發(fā)光測量，所述設(shè)備設(shè)計成激發(fā)并測量熒光。例如，由Millipore(Bedford，MA)制造的CytoFluorTM2300適合于這種方法。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見，本發(fā)明的方法并不限于具體的檢測方法、熱循環(huán)控制裝置或信號測量機、或者反應(yīng)器的數(shù)量。
本發(fā)明的方法可被用于同時檢測多個目標序列。專門對每個目標的探針存在于反應(yīng)混合物中。對于存在于樣品中的每個目標核酸來說，相應(yīng)的探針將雜交并被切開。為了單獨地檢測切開的探針，每種探針用一種標記標記，所述標記以清楚的可測出的波長放出光。然后通過適當選擇測量的波長單獨檢測每種探針。
這樣，本發(fā)明的方法可用于在檢測一個樣品中的幾個目標的PCR共同擴增法中檢測擴增產(chǎn)物。本發(fā)明特別是可用于定量比較在相同樣品中的兩種不同的核酸目標。在US 5,219,727中描述了測定核酸量的方法。所描述的定量方法是基于PCR的方法，這些方法使用一種內(nèi)部標準分別確定目標的相對量或者精確測量擴增前存在的目標量。
短的和長的標記低核苷酸的有差別的淬火還可以被用于測定核苷酸的并入一種合成的低核苷酸。例如，DNA聚合酶活性驗定法測量核苷酸的并入速率。為了測定核苷酸的并入，提供一種反應(yīng)混合物，該混合物含有標記的dNTPs以及其它的用于低核苷酸合成所需的試劑，如一種在適當?shù)木彌_液中的DNA聚合酶。在一種DNA結(jié)合化合物的存在下測量合成前反應(yīng)混合物的熒光。合成前，所有標記被結(jié)合到單個的核苷酸上并且淬火是最小的。合成后，在DNA結(jié)合化合物存在下測量反應(yīng)混合物的熒光。低核苷酸的合成導(dǎo)致標記的核苷酸量的降低。因為較長的、新合成的低核苷酸被DNA結(jié)合化合物進行的淬火更有效，所以dNTP并入低核苷酸導(dǎo)致熒光的減弱。
下面提出的本發(fā)明的實例只用于說明目的而且不限制本發(fā)明的范圍。這些實例后面所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)的本發(fā)明的許多實施方案對于閱讀了上文和后面的實例的本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
實施例1依賴長度的PEI淬火本實例描述了溶液中的標記的低核苷酸的依賴長度的淬火。長度為33和長度為2的低核苷酸用一種發(fā)熒光的標記標記，而且每種低核苷酸的熒光在含有PEI的溶液中測量。用含有各種濃度的PEI的溶液重復(fù)測量以確定PEI的最適宜濃度，在該濃度時長度為33和長度為2的低核苷酸之間的信號差別最大。
在一種ABI 394 DNA合成器(Perkin Elmer ABD，F(xiàn)oster City，CA)中以1微摩爾規(guī)格合成探針。在低核苷酸合成過程中使用熒光標記的Amidites以直接提供一種5′標記的低核苷酸。由于用于實施例2中所述的方法中，合成長度為33的在3′端有一個PO4基的探針。長度為33的每個標記的探針的核酸序列為SK535(SEQ ID NO1)5′-AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT。長度為2的探針的核酸序列由5′-AG組成，它相應(yīng)于長度為33的探針的降解產(chǎn)物。
下面列出所用的熒光標記，而且下面表示出每種標記的激發(fā)和放出波長。還表明如下所述的用于檢測每種標記的濾波器的縫隙寬度用于熒光測量的濾波器(以毫微米表示的波長和寬度)標記 激發(fā)最大值放出最大值熒光素(FAM) 485(20) 530(25)六氯熒光素(HEx) 530(25) 590(35)二氯二甲基熒光素(JOE) 490(40) 580(50)若丹明(ROX) 590(40) 645(40)四甲基若丹明(TAMRA) 560(20) 620(40)對于下列每種探針，同樣的測定溶液含有1μM探針和50μl緩沖液(50mM N-二(羥乙基)甘氨酸，100mM KOAc(pH8.3)，3.6mMMn(OAc)2)，將上述溶液加到微滴定盤的室中。制備一系列濃度為0.016％、0.008％、0.004％、0.002％和0.001％的含PEI(分子量1200，產(chǎn)自Polysciences Inc.，Warrington，PA)的溶液。將50μl體積的水加到一個室中用作最大信號對照。將50μl PEI溶液加到剩余的每個室中。在一個Millipore Cytofluor 2300微滴定器盤式讀出器中用上表提供的激發(fā)和放出波長進行熒光測量。
本發(fā)明的方法依賴于短的和長的標記的低核苷酸的淬火方面的差別。這種與一種“窗口”有關(guān)的淬火差的數(shù)值從下述的單獨的熒光測量結(jié)果計算出。首先，測量只由緩沖液產(chǎn)生的淬火的本底水平，并在每個探針熒光測量值中減去該水平。第二，以在PEI存在時探針的熒光與沒有PEI時相同探針的熒光的比值計算剩余熒光，并表示為未淬火的熒光的百分比。最后，以長度為2的標記低核苷酸的剩余熒光和長度為33的低核苷酸的剩余熒光之間的差值計算窗口。窗口是長度為33的標記探針降解成長度為2的片段所導(dǎo)致的信號改變的度量。提供最大窗口的PEI濃度在本發(fā)明的檢測法中提供最大的靈敏度。
結(jié)果示于圖1中，其中圖示出使用各種探針標記得到的窗口與PEI濃度的關(guān)系。標識線指的是如下標記的低核苷酸hexx2HEX標記的低核苷酸其中標記通過一個隔離物附著到低核苷酸的5′端。
fam2FAM標記的低核苷酸。
hex2HEX標記的探針，其中標記直接附著到低核苷酸的5′端。
joeJOE標記的低核苷酸。
roxROX標記的低核苷酸。
tamTAMRA標記的低核苷酸。
由圖1可看出，對于每種標記在某些PEI濃度時觀察到顯著的窗口。窗口的大小取決于標記和PEI濃度。HEX標記通過一個隔離物附著到低核苷酸上被觀察到降低了在PEI濃度的測試范圍內(nèi)獲得的窗口大小。
實施例2PEI分子量的影響在本例中，描述PEI的分子量和濃度對帶發(fā)熒光的標記的探針的淬火的影響。實驗基本上如實施例1所述用FAM標記的低核苷酸進行，但是使用各種大小的PEI并且濃度范圍比實施例1大。
從Polysciences Inc.，Warrington，PA購得分子量為600、1200、1800和10000千道爾頓的PEI。在含有由50mM N-二(羥乙基)甘氨酸、115mM KOAc乙酸鉀(pH8.3)和8％甘油組成的緩沖液的測定溶液中進行發(fā)光測量。對于每種大小的PEI，將PEI混入濃度從0.000013％至0.02％(w/V)的測定溶液中。對于每種PEI大小和濃度，如實施例1計算窗口。
結(jié)果示于圖2中?？煽闯雒糠NPEI大小都能用于本發(fā)明方法中，盡管用不同大小的PEI得到窗口大小的差別較小。對于每種大小的PEI，最佳的PEI濃度即提供最大的窗口的PEI濃度可由圖2確定。上述實驗舉例說明了PEI大小和濃度的常規(guī)最優(yōu)化法，這種方法可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員用于進行每種檢測驗定法。
實施例3由PCR擴增定量本實例描述用本發(fā)明方法的核酸的定量。本例中，在帶發(fā)熒光標記的探針存在下由RT-PCR擴增由丙肝C病毒(HCV)RNA組成的一個目標。具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶切開雜交到擴增引物下游的目標序列上的標記的探針，從而釋放探針的小的標記的低核苷酸片段到反應(yīng)混合物中。擴增后，將PEI加到反應(yīng)混合物中并測量標記的探針的熒光。短的標記的低核苷酸降解產(chǎn)物的產(chǎn)生導(dǎo)致測得的熒光的增加，因為降解產(chǎn)物并不象全長的、未降解的探針那樣多地被PEI淬火。因為探針降解與目標擴增同時發(fā)生，熒光增加表明目標序列的擴增。
通過比較由目標序列的擴增導(dǎo)致的熒光的增加與由第二核酸序列擴增獲得的熒光增加能獲得初始目標序列復(fù)制數(shù)的定量估計。按已知的復(fù)制數(shù)將第二核酸序列加到反應(yīng)中，從而提供一種內(nèi)部定量標準(IQS)，未知樣品的擴增與該標準比較。用一種放出確切的波長的光的第二熒光標記完成第二核酸序列的檢測。
擴增兩種目標RNA序列在各自反應(yīng)中擴增。用一種單個的引物對KY78和KY80同時擴增兩種目標核酸序列。本例中，目標RNA序列由轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒產(chǎn)生。在EP公開529493和Young等人，1993，J.Clin.Microbiol.31(4)882-886中描述了含有HCV序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和用途、擴增引物、和RT-PCR擴增。第一目標序列由一個來自HCV 5′非編碼區(qū)的區(qū)組成。用作IQS的第二目標核酸序列包括相同的兩個引物結(jié)合位點，與該位點側(cè)面相接的核酸序列含有一個交替的探針結(jié)合位點。從而兩種目標序列用相同的引物對擴增，但兩種目標序列可以獨立地使用不同的特定序列的探針被檢測。在Mulder等人，1994，J.Clin，Microbiology 34(2)292-300中描述了IQS的結(jié)構(gòu)和用途。
在FAM標記的專門用于HCV目標序列的探針和HEX標記的專門用于IQS的探針存在下進行擴增。FAM和HEX的最大發(fā)光是在不同的波長處，這允許通過適當?shù)剡x擇測得的頻率獨立地檢測探針。探針的核酸序列以5′至3′定向表示。探針用如上所述的在5′端處的標記合成。每種探針合成為有3′-PO4而代替3′-OH以阻斷在擴增反應(yīng)期間由Taq聚合酶進行的任何延伸。在上述Young等人在1993年發(fā)表的文獻中描述了用于檢測HCV目標序列的FAM標記的探針的序列，稱為KY88。HEX標記的用于檢測IQS的探針的序列提供在上述實施例1中(SEQ ID NO1)。
在含有下列試劑的100μl反應(yīng)物中進行擴增HCV目標序列(復(fù)制數(shù)如下所述)1000個IQS復(fù)制50mMN-二(羥乙基)甘氨酸100mM KOAc，pH8.33.6mM Mn(OAc)2每種引物0.4μM每種探針1μM每種dUTP，dATP，dGTP，dCTP 0.2mM20單位rTth DNA聚合酶*2單位Amperase Uracil-N-Glycosolase*8％甘油*由Hoffmann-La Roche研制和由Perkin Elmer，Norwalk，CT銷售。
用0-107個HCV目標復(fù)制進行擴增。除了進行PCR熱循環(huán)的反應(yīng)混合物外，制備并貯存(無溫度循環(huán))另外兩種反應(yīng)混合物用作測量對照。在Gene Amp 9600 Thermal Cycler(Perkin Elmer，Norwalk，CT)中反應(yīng)混合物進行下列擴增程序50℃ 2分鐘60℃ 30分鐘
95℃ 1分鐘2個循環(huán)95℃ 15秒60℃ 20秒46個循環(huán)90℃ 15秒60℃ 20秒72℃至少5-10分，高至1小時擴增后，反應(yīng)物保持在4℃直至分析完畢。
分析將含有0.8mM EDTA的0.004％PEI(分子量1200)50μl加入到50μl擴增后的每種反應(yīng)混合物中以及未在擴增條件下的兩種對照反應(yīng)混合物的一種中。用CytoFluorTM2300(Millipore，Location)微量滴定盤讀出器測量熒光。在室溫下使用485nm激發(fā)濾波器(20nm帶通寬)和530nm發(fā)光濾波器(25nm帶通寬)測量FAM標記的探針的熒光。在室溫下用530nm激發(fā)濾波器(25nm帶通寬)和590nm發(fā)光濾波器(35nm帶通寬)測量HEX標記的探針的熒光。
測得的每種探針標記的熒光通過扣除無探針的未循環(huán)反應(yīng)混合物的熒光來矯正，兩者都是在適合標記的波長下測量的。結(jié)果示于圖3中，以熒光比(HCV/IQS)的對數(shù)(Log)與HCV目標復(fù)制數(shù)的對數(shù)(Log)的關(guān)系曲線表示。由該數(shù)據(jù)的最小二乘法線性擬合制出“標準曲線”。
由上述實驗產(chǎn)生的標準曲線能使未知HCV樣品定量。為了定量一種未知的HCV樣品，用上述已知量的IQS擴增HCV核酸。計算測得的熒光變化的比值的對數(shù)，從標準曲線方程確定相應(yīng)的HCV復(fù)制數(shù)。
序列一覽(1)一般性信息(i)申請人F.Hoffmann-La Roche AG(ii)發(fā)明名稱用于檢測用發(fā)光標記標記的低核苷酸標記的長度改變的方法(iii)序列數(shù)1(iv)通訊地址(A)收件人F.Hoffmann-La Roche AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)州BS(E)國家Switzerland(F)郵編CH-4002(V)電訊信息(A)電話061 688 7493(B)傳真061 688 13 95(2)SEQID NO1信息(i)序列特性(A)長度33個堿基對(B)種類核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(Xi)序列表述SEQ ID NO1AGAAGGTGAG ATGACCAGAG GACTGAGTCC AAT
權(quán)利要求
1.一種檢測用發(fā)光標記標記的低核苷酸長度變化的方法，該方法包括(a)在導(dǎo)致所述低核苷酸長度變化的條件下在反應(yīng)混合物中進行反應(yīng)；(b)在一種DNA結(jié)合化合物存在下在所述反應(yīng)混合物中測量所述標記的發(fā)光，所述化合物能與所述標記相互作用以改變所述標記的發(fā)光，其中相互作用取決于所述低核苷酸的長度；和(c)通過步驟(b)測得的發(fā)光檢測所述低核苷酸長度改變
2.權(quán)利要求1的方法，用于檢測樣品中的目標核酸，其中該方法包括(a1)提供一種用于反應(yīng)的反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物包括所述樣品和用發(fā)光標記標記的單鏈低核苷酸，其中所述低核苷酸含有能夠雜交到所述目標核酸上的序列，而且其中只有當所述低核苷酸被雜交到所述目標核酸上時所述反應(yīng)才催化所述低核苷酸的切開；(a2)在所述低核苷酸雜交到所述目標序列上并被切開的條件下處理所述混合物；(b)在DNA結(jié)合化合物存在下測量在所述反應(yīng)混合物中的所述標記的發(fā)光，所述化合物能夠改變所述標記的發(fā)光，其中相互作用取決于所述低核苷酸的長度；和(c)通過步驟(b)中測得的發(fā)光確定是否目標存在。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述目標序列在步驟(b)之前擴增。
4.權(quán)利要求3的方法，包括(a1)提供一種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)混合物，該混合物包括所述樣品、一對低核苷酸引物、一種有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶和一種能夠雜交到所述目標核酸的一個區(qū)上的低核苷酸，其中所述低核苷酸在被所述低核苷酸引物結(jié)合的所述目標核酸序列內(nèi)雜交，而且其中所述低核苷酸探針用一種發(fā)光標記標記；(a2)在PCR條件下處理PCR混合物，其中具有5′至3′核酸酶活性的核酸聚合酶切開雜交到目標序列上的低核苷酸；(b)在DNA結(jié)合化合物存在下測量在所述反應(yīng)混合物中的所述標記的發(fā)光，所述化合物能夠改變所述標記的發(fā)光，其中相互作用取決于所述低核苷酸的長度；和(c)通過步驟(b)中測得的發(fā)光確定是否目標序列存在。
5.權(quán)利要求1至4的任何一個的方法，其中所述DNA結(jié)合化合物是聚乙烯亞胺或其衍生物。
6.權(quán)利要求1至5的任何一個的方法，其中所述標記選自由熒光素、若丹明及其衍生物組成的組。
全文摘要
本發(fā)明通過在與標記相互作用以改變標記的發(fā)光的DNA結(jié)合化合物存在下測量發(fā)光提供檢測用發(fā)光標記標記的低核苷酸長度變化的方法，其中相互作用程度取決于低核苷酸的長度。所述方法一般適用于核酸序列檢測驗定，所述驗定利用一種導(dǎo)致雜交的低核苷酸探針的選擇性切開的反應(yīng)，而且特別是可適用于擴增/檢測驗定，其中雜交的探針在引物延伸的同時被切開。
文檔編號C12Q1/68GK1133888SQ95121850
公開日1996年10月23日 申請日期1995年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月23日
發(fā)明者T·K·H·皮孔 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司