專利名稱：脫毛蛋白酶、其制造方法、使用方法和產(chǎn)生此蛋白酶的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種堿性蛋白酶及其生產(chǎn)方法、其在生皮浸水、酶法脫毛和皮軟化工藝中的應(yīng)用和產(chǎn)生此蛋白酶的微生物。
過去十五年里，世界制革工業(yè)的重心逐漸移向了亞洲。中國皮革產(chǎn)量增加了八倍，其中豬皮年產(chǎn)量達(dá)1億張，居世界首位，牛皮5000萬張，羊皮7000萬張以上。1998年皮革及制品出口創(chuàng)匯達(dá)97億美元，為我國輕工行業(yè)創(chuàng)匯首位。我國在獲得經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境污染。隨著制革工業(yè)的迅速發(fā)展，這種污染的程度將會(huì)日益嚴(yán)重。
制革工業(yè)最嚴(yán)重的污染源主要來自傳統(tǒng)脫毛工藝中的硫化物。為了解決硫化物污染，研究人員曾做了多方面的努力。一方面是增加設(shè)備投資，對硫化物污水進(jìn)行處理，使之達(dá)到規(guī)定的排放標(biāo)準(zhǔn)(先污染、后處理)。這種方法耗資大，增加了成本。除了現(xiàn)有較大規(guī)模的200多家制革廠有“條件”治理污水外，其余遍及全國的數(shù)以千計(jì)的小廠根本無法處理含硫污水。實(shí)踐證明，行之有效的方法就是用酶法脫毛取代灰堿法脫毛，即將污染源消滅在生產(chǎn)工藝過程之中。
我國自1968年開始試驗(yàn)酶法脫毛工藝，到1973年在全國范圍內(nèi)全面推廣，由于對推廣中出現(xiàn)的一些實(shí)際問題沒有認(rèn)真加以研究解決，使酶法脫毛未能堅(jiān)持下去。出現(xiàn)這種狀況的最主要的原因是因?yàn)槲⑸锏鞍酌钢苿┏杀靖撸该撁蟪筛锶菀壮霈F(xiàn)松面，質(zhì)量低劣，安全系數(shù)低，如有不慎還會(huì)造成爛皮，釀成生產(chǎn)事故。究其原因，主要有以下兩個(gè)方面1、脫毛蛋白酶制劑品種少，選擇合適的酶制劑投入使用受到限制。常用的蛋白酶制劑有166、AS1398、3942中性蛋白酶和209、2709堿性蛋白酶。其中，只有166與209是專門為脫毛篩選的，其他幾種皆是行業(yè)引進(jìn)品種。因此，酶制劑品種少，難以滿足制革脫毛的特殊需要。再加上各應(yīng)用工廠在技術(shù)條件、管理、設(shè)備以及原料等方面的差異，酶的品種單一，造成無合適的選擇余地。在技術(shù)上，也只有豬皮脫毛基本過關(guān)。這是酶法脫毛難以長期推廣使用的原因之一。
2、脫毛酶制劑成份復(fù)雜、性能不穩(wěn)定，特異性差。在脫毛時(shí)，脫毛蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，然而因制劑中的蛋白酶種類甚多，每一種蛋白酶又各有其不同的特異性。它們對各種結(jié)構(gòu)極不相同的作用底物表現(xiàn)出來的水解能力很不一樣?，F(xiàn)在所用的蛋白酶制劑，僅僅是微生物在其代謝過程中所產(chǎn)生的各種活性物質(zhì)的混合物。這種粗酶制劑往往是以一種蛋白酶為主，同時(shí)又含有其他多種蛋白酶和各種雜酶(脂肪酶、糖化酶、淀粉酶)。它們不僅有能水解與脫毛有關(guān)的類粘蛋白和粘蛋白之類的糖蛋白水解酶，而且還有與皮軟化有關(guān)的彈性蛋白酶。此外，還含有能損傷生皮膠原的膠原水解酶，因而使得皮革生產(chǎn)的主要原材料—膠原常常遭到不同程度損傷，影響成革質(zhì)量。
目前進(jìn)行的酶法脫毛實(shí)際上是多種蛋白酶作用于生皮中多種蛋白質(zhì)底物的多種酶促反應(yīng)，但是，由于粗酶中含有大量的膠原水解酶(脫毛終點(diǎn)時(shí)，溶液中羥脯氨酸含量較脫毛開始時(shí)有顯著增加)，使得應(yīng)該保留的膠原蛋白受到了很大損失。這種“綜合性”的蛋白質(zhì)水解結(jié)果，極容易出現(xiàn)成革松面等毛病，造成成革質(zhì)量低劣。顯而易見，這種費(fèi)用高、產(chǎn)品質(zhì)量低、操作不方便的脫毛方法是難以堅(jiān)持的。
要使酶法脫毛取代灰堿法脫毛并使之得以推廣應(yīng)用，關(guān)鍵在于脫毛用酶制劑存在的種種問題能否得到解決。
中國專利(申請?zhí)?5197015.1)涉及到用酶進(jìn)行生皮脫毛的方法，它包括以下步驟①將生皮浸泡；②將經(jīng)過浸泡的生皮進(jìn)行主浸泡；③通過加入水、在機(jī)械作用和至少一種蛋白酶的作用下對經(jīng)上述處理的生皮進(jìn)行脫毛。在步驟①至③中，生皮至少經(jīng)過了一次至少一種蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原劑的作用，這種方法有以下幾個(gè)缺點(diǎn)1、該專利用任何一種蛋白水解酶或它們的混合物進(jìn)行脫毛，而損傷生皮膠原的膠原蛋白酶也屬于蛋白水解酶，若按中國專利(申請?zhí)?5197015.1)的方法用膠原蛋白酶進(jìn)行生皮脫毛，將使皮革生產(chǎn)的主要原材料—膠原遭到損傷，甚至導(dǎo)致爛皮事故。
2、操作難度較大。例如果蛋白質(zhì)二硫化物氧化還原劑和蛋白酶這兩種酶分別顯示的最適pH值十分不同，它們就必須相繼加入，而且要進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。
中國專利(申請?zhí)?5193076.1)也涉及到酶法脫毛，但使用其專利的堿性蛋白酶的脫毛效果非常不好；或者即使脫毛完全，也將生皮變成橡膠塊的硬塊，失去生產(chǎn)價(jià)值。
本發(fā)明的目的是提供一種可用于制革工業(yè)的浸水工藝、脫毛工藝和軟化工藝的蛋白酶、制造這種蛋白酶的方法、這種蛋白酶在制革工業(yè)中的應(yīng)用和產(chǎn)生這種蛋白酶的微生物，以增加蛋白酶的特異性和單一性，使酶法脫毛時(shí)不損傷生皮膠原，簡化操作，保證成革質(zhì)量。
因此，本發(fā)明提供了這種新的蛋白酶、它的生產(chǎn)方法、用途和產(chǎn)生這種蛋白酶的微生物。產(chǎn)生酶的微生物產(chǎn)生本發(fā)明酶的微生物是芽孢桿菌屬的一種與短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)在細(xì)菌學(xué)上密切相關(guān)的菌株UN-31-C-42。細(xì)菌學(xué)特性與本發(fā)明相關(guān)的芽孢桿菌屬菌株UN-31-C-42具有下列的細(xì)菌學(xué)特性(a)形式芽孢桿菌(b)革蘭氏染色陰性(c)孢子的產(chǎn)生陽性(d)孢子的形狀橢園(e)移動(dòng)性陽性(f)對氧的反應(yīng)需氧菌(g)過氧化氫酶的產(chǎn)生陽性(h)在厭氧條件下的生長陰性(i)伏一普二氏反應(yīng)(VP)反應(yīng)陽性(j)酸的產(chǎn)生葡萄糖陰性阿拉伯糖陽性甘露糖醇陰性(k)由葡萄糖產(chǎn)氣陽性(l)明膠的液化作用陽性(m)淀粉的降解陽性(n)能利用草酸銨，尿素、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀及磷酸氫二銨，而不利用硝酸銨。
(p)碳源的利用能以麥芽糖、半乳糖、果糖和蔗糖為碳源，不能以乳糖和山梨糖為碳源。
根據(jù)Bergey的系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(Vo1.2，William和Wilkins，1986)，初步鑒定為短小芽孢桿菌，定名UN-31-C-42。
此外，屬于所說菌株UN-31-C-42的蛋白酶生產(chǎn)力改進(jìn)突變體(通過自發(fā)或者誘導(dǎo)突變而得)可以作為產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的細(xì)菌。為了制備這些突變體，可以使用常規(guī)的方法，例如由紫外線照射或者誘變劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)對原始菌株誘導(dǎo)突變后，將培養(yǎng)物接種到含有酪蛋白的瓊脂培養(yǎng)基中。從在菌落周圍形成較大清晰環(huán)帶的菌落中選擇具有極好生產(chǎn)力的突變體；配合通過搖瓶實(shí)驗(yàn)測定蛋白酶活性，以及脫毛實(shí)驗(yàn)等，得到產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的微生物菌株。產(chǎn)生蛋白酶的方法任何能夠使產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的微生物生長并產(chǎn)生所說的蛋白酶的培養(yǎng)基都可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白酶。
例如，可以使用葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、糊精作為碳源，使用無機(jī)的氮化合物(如草酸銨、氯化銨、硝酸鉀、磷酸氫二銨等)或有機(jī)氮化合物(如酪素、大豆餅、玉米浸液、黃豆粉等)作為氮源，此外還要加入礦物質(zhì)，如磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽和鈣鹽。培養(yǎng)基的初始pH值為7.5-10。在本發(fā)明中，將培養(yǎng)物在需氧的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為36小時(shí)到48小時(shí)，即可得到最大產(chǎn)量的酶。
可以按照常規(guī)的分離和純化方法對通過以上過程獲得的培養(yǎng)物進(jìn)行純化。通過鹽析沉淀蛋白質(zhì)、噴霧干燥方法、凍干法等，將可溶性鹽加入到所得的上清液或?yàn)V液(所說的上清液和濾液是通過離心或者過濾菌體細(xì)胞和培養(yǎng)基的固體剩余物而得到的)中，即可獲得了本發(fā)明的蛋白酶。可以結(jié)合使用其它的純化方法(如離子交換層析和凝膠過濾層析)來進(jìn)一步純化所說的酶。發(fā)明人把通過上述方式所獲得的本發(fā)明的蛋白酶命名為BP-Ap42。通過下述方法測定蛋白酶的活性并測試它的脫毛活性。
1、蛋白酶活力的測定1ml酶液在50℃，pH9.6條件下測定，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。
2、脫毛活性的測試用硼砂一氫氧化鈉緩沖液(pH9.6)將酶液調(diào)至400U/ml，于250mL三角瓶內(nèi)裝酶液50mL，放入清洗后的豬臀部鹽腌皮(10×15cm)3塊，37℃恒溫?fù)u床(轉(zhuǎn)速160r/min)上脫毛，定時(shí)觀察脫毛情況。蛋白酶的特性本發(fā)明所獲得的蛋白酶的物理和化學(xué)特性如下1、底物特異性此蛋白酶能降解酪蛋白。
2、最適pH值
用不同pH值的緩沖液稀釋酶液，50℃下測定酶活性，結(jié)果如附

圖1所示。在pH6-9.6的范圍內(nèi)，酶活隨pH升高而升高，其中在pH7-pH8.5范圍內(nèi)曲線較平坦；在pH10-11范圍內(nèi)隨pH升高而下降。因此最適pH值為9.6。
3、最適反應(yīng)溫度以硼砂-氫氧化鈉緩沖液(pH9.6)稀釋酶液，在不同反應(yīng)溫度下測定酶活。結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，超過50℃酶活迅速降低(見附圖2)。
4、抑制劑的影響使用了6種不同的抑制劑，測定了它們對該蛋白酶的影響。以未加入抑制劑的樣品酶活作為100％，加入抑制劑后的樣品的酶活進(jìn)行換算后為剩余相對酶活，結(jié)果示于表1。
表1 抑制劑對于發(fā)酵液中堿性蛋白酶活的影響抑制劑 二鉀砷EDTA EGTA PMSF DFP苯甲醚(使用濃度均為1mM/L) 酸鈉剩余相對酶活(％)14.7 12.7 2.1 2.1 90.3 93.4結(jié)果表明，特異性抑制絲氨酸蛋白酶的抑制劑PMSF，DFP能完全抑制該蛋白酶的活性，表明該蛋白酶為一種絲氨酸蛋白酶。EDTA，EGTA對該酶也能抑制，表明該蛋白酶的活性需要金屬離子的參與。
5、分子量通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得的此酶的分子量為40,000道爾頓。
6、穩(wěn)定性在4℃穩(wěn)定性好。堿性蛋白酶的使用方法1、生皮浸水時(shí)酶的用法用鹽濕皮，進(jìn)行皮回軟。牛皮浸水時(shí)酶用量50U/g，山羊皮、綿羊皮、豬皮酶用量均為30U/g。鼓內(nèi)溫度18℃，液比3，加碳酸鈉調(diào)節(jié)pH10，回軟時(shí)間15h。
2、堆置酶法脫毛的用法鹽濕皮按上述浸水的條件浸水回軟；滴干水后用于堆置酶法脫毛。牛皮、山羊皮、綿羊皮、豬皮堆置酶法脫毛過程中所采用的條件均是溫度18℃，用pH10的碳酸鈉溶液稀釋酶液，酶用量為100U/g，堆置16h，即可達(dá)到很好的脫毛效果。
3、堿性蛋白酶對皮軟化的用法經(jīng)過浸水，脫毛、浸灰、復(fù)灰、脫灰后的皮在鼓內(nèi)，溫度38℃，pH10，軟化2h，液比2，牛皮、山羊皮、綿羊皮軟化的酶用量為100U/g，豬皮軟化的酶用量為150U/g。
表2 不同蛋白酶活性測定結(jié)果 -未測酶活性很顯然，云南產(chǎn)的AS1398蛋白酶活性高于無錫產(chǎn)蛋白酶，因而對照試驗(yàn)時(shí)選用云南產(chǎn)的AS1398蛋白酶。(2)皮浸水時(shí)酶濃度的確定用鹽濕皮，進(jìn)行皮回軟試驗(yàn)，其回軟條件是蛋白酶濃度10，30，50，70U/mL，鼓內(nèi)溫度18℃，液比3，加碳酸鈉調(diào)節(jié)pH10，回軟時(shí)間15h。
蛋白酶濃度對皮浸水效果的影響見表3。
表3 蛋白酶濃度對皮浸水效果的影響 皮浸水效果+差，++一般，+++較好表3結(jié)果表明，牛皮用50U/mL，其余3種皮用30U/mL的蛋白酶就能使皮達(dá)到快速浸水的要求。
加酶浸水后，皮的充水度較高，皮回軟效果較理想。其中，山羊皮的回軟增重比最高(表4)。
表4鹽濕皮浸水前后增重比(千克) 實(shí)施例4、堿性蛋白酶BP-Ap42的堆置酶法脫毛試驗(yàn)(1)堿性蛋白酶BP-Ap42用于堆置酶脫毛時(shí)最適pH值的確定在本發(fā)明中，采用堆置酶法脫毛。脫毛用皮按上述確定的條件浸水回軟，滴干水后待用。
堆置酶脫毛過程中所采用的條件是溫度18℃，用pH9，10，11的碳酸鈉溶液按每克皮用200U的酶稀釋酶液。
不同pH值對堆置酶法脫毛效果的影響見表5。在pH10條件下，豬皮的脫毛效果稍差，牛皮、綿羊皮和山羊皮的脫毛效果均很好。
表5 pH值對堆置酶法脫毛效果的影響 脫毛能力++++輕推即掉；+++重推可掉；++拔可掉；+用力拉可掉-拉不掉(以下各表符號(hào)同此表)(2)堿性蛋白酶BP-Ap42用于堆置酶脫毛時(shí)最適酶量的確定為了獲得堆置酶法脫毛時(shí)酶的最佳用量，采用的脫毛條件是溫度18℃，pH10，堆置12-16h，酶使用濃度為50，100，200U/g。酶濃度對堆置酶法脫毛效果的影響見表6。
表6 酶濃度對堆置酶法脫毛效果的影響 從4種皮的脫毛效果來看，用200U/g酶濃度堆置16h，脫毛效果很好。(3)BP-Ap42和AS1398蛋白酶在堆置酶法脫毛中的比較BP-Ap42和用于對照實(shí)驗(yàn)的AS1398蛋白酶均用200U/g。實(shí)驗(yàn)用皮從背脊線對剖。脫毛條件室溫20℃，堆置15-24h；AS1398反應(yīng)pH8；BP-Ap42反應(yīng)pH10。
表7 BP-Ap42和AS1398蛋白酶脫毛對比試驗(yàn) 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明BP-Ap42的脫毛速度快，15h即可；AS1398一般要24h左右。BP-Ap42蛋白酶的豬皮脫毛效果稍遜于AS1398酶；對綿羊皮的脫毛兩者差不多；對山羊皮和牛皮，BP-Ap42脫毛效果好，尤其是牛皮的脫毛效果更好。該蛋白酶脫毛的裸皮粒面效果較AS1398脫毛的皮潔白，細(xì)致，柔軟，絲光感也較強(qiáng)。從感官和手感鑒定的各項(xiàng)指標(biāo)來看，BP-Ap42脫毛效果優(yōu)于AS1398。
整張皮的放大試驗(yàn)，每次50張，能較好地重復(fù)小試的結(jié)果。(4)豬皮臀部和山羊皮頸部的脫毛試驗(yàn)由于豬皮臀部和山羊皮頸部的毛難于脫盡，因而在堆置酶法脫毛前，先用BP-Ap42預(yù)處理。豬皮脫脂后用400U/g的BP-Ap42酶液包臀部4h，然后再用200U/g的BP-Ap42蛋白酶脫毛，這樣既減少了部位差，又有助于臀部的脫毛。
山羊皮浸水后，用400U/g的BP-Ap42酶液涂領(lǐng)鬃部3h，再用200U/g的BP-Ap42蛋白酶脫毛，15h后整張皮的毛完全脫盡，領(lǐng)鬃部不留余毛，且背脊線不明顯。實(shí)施例5、堿性蛋白酶BP-Ap42對皮的軟化試驗(yàn)(1)皮軟化時(shí)酶濃度的確定經(jīng)過浸水、脫毛、浸灰、復(fù)灰、脫灰后的皮，鼓內(nèi)溫度38℃，反應(yīng)pH10，軟化2h，酶用量為50，100，150，200U/g，液比2。
表8 蛋白酶濃度對皮軟化的影響 皮軟化效果+較差，++一般，+++較好試驗(yàn)結(jié)果表明，豬皮軟化用150U/g，牛皮和羊皮軟化用100U/g即可。(2)BP-Ap42和胰酶軟化皮效果的比較胰酶和BP-Ap42蛋白酶用量相同豬皮150U/g，牛羊皮100U/g；溫度38℃，軟化2-3h(轉(zhuǎn)停結(jié)合)，液比2，胰酶反應(yīng)pH8，BP-Ap42反應(yīng)pH10。對比結(jié)果示于表9。
表9 BP-Ap42蛋白酶和胰酶的皮軟化對比試驗(yàn) 實(shí)施例6、酶法脫毛和軟化成革的物性檢測試驗(yàn)由不同試驗(yàn)所獲得的羊皮鞋面革和豬皮鞋面革進(jìn)行皮革成品理化檢驗(yàn)，結(jié)果示于表10和表11。
表10 羊皮成革物性檢測 * 1.AS1398脫毛/BP-Ap42軟化 4.BP-Ap42脫毛/BP-Ap42軟化2.AS1398脫毛/胰酶軟化5.BP-Ap42脫毛/胰酶軟化3.AS1398脫毛/不軟化 6.BP-Ap42脫毛/不軟化羊皮測試結(jié)果表明
(1)兩種酶脫毛的皮均能達(dá)到了國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，但AS1398脫毛的皮(1，2，3)強(qiáng)度比BP-Ap42脫毛的皮(4，5，6)要低一些，說明AS1398對皮膠原的水解作用要強(qiáng)一些，相對來說，BP-Ap42的作用要緩和得多；(2)同種酶脫毛后用不同的酶軟化，可以看出不軟化的皮(3，6)強(qiáng)度較高，胰酶軟化的皮(2，5)較低，BP-Ap42軟化的皮(1，4)稍高。說明胰酶對膠原的水解作用要強(qiáng)于BP-Ap42。表11豬皮成革物性 * 1.AS1398脫毛/BP-Ap42軟化 4.BP-Ap42脫毛/BP-Ap42軟化2.AS1398脫毛/胰酶軟化5.BP-Ap42脫毛/胰酶軟化3.AS1398脫毛/不軟化 6.BP-Ap42脫毛/不軟化豬皮的試驗(yàn)結(jié)果與羊皮大致相同，說明BP-Ap42蛋白酶脫毛作用強(qiáng)于AS1398；軟化效果優(yōu)于胰酶。
為了比較短小芽孢桿菌堿性蛋白酶和灰堿法脫毛對皮革物性的影響，我們對2種方法獲得的羊皮進(jìn)行了軟化對比試驗(yàn)，結(jié)果示于表12。
表12軟化對比試驗(yàn) * 1.BP-Ap42脫毛/胰酶軟化 4.硫化堿脫毛/胰酶軟化2.BP-Ap42脫毛/BP-Ap42軟化 5.硫化堿脫毛/BP-Ap42酶軟化3.BP-Ap42脫毛/不軟化兩種脫毛方法的軟化對比試驗(yàn)成革物性檢測表明(1)硫化堿脫毛的皮革強(qiáng)度普遍高于BP-Ap42酶脫毛的皮革。說明酶對皮膠原的水解作用強(qiáng)于堿，針對不同的革品種如軟革的生產(chǎn)，在制定工藝時(shí)可以考慮使用酶處理，以達(dá)到制造軟革的目的；(2)同種酶脫毛(1，2，3)不同酶軟化，BP-Ap42酶軟化的皮強(qiáng)度還是要比胰酶軟化的高，這與表11，12的結(jié)論相一致。
由此可以說明，BP-Ap42蛋白酶確實(shí)也是一種良好的軟化劑。
結(jié)論(1)短小芽孢桿菌所產(chǎn)生的堿性蛋白酶BP-Ap42可用于制革過程中的浸水，脫毛和軟化。浸水時(shí)間從常規(guī)的24小時(shí)縮短到15小時(shí)；脫毛效果徹底，毛孔清晰，粒面完整；用于軟化時(shí)的皮面更潔白，柔軟，粒面更細(xì)致，是一種優(yōu)良的新型酶制劑。
(2)該堿性蛋白酶與AS1398蛋白酶在脫毛，軟化上比較，脫毛更徹底，對膠原水解更弱，軟化皮更柔軟。
實(shí)施例7、羊皮鞋面革工藝方案1、浸水液比3.0，酶30U/g，鼓內(nèi)溫度為常溫，時(shí)間12-15h，pH10；2、堆置酶法脫毛酶用量200U/g，pH10，常溫，轉(zhuǎn)15min，出鼓堆置15-24h，待毛脫完后水洗；3、膨脹NaOH 1％，Ca(OH)23％，液比3.0，常溫，轉(zhuǎn)60min，停鼓過夜；4、復(fù)灰Ca(OH)25％，轉(zhuǎn)60min，水洗10min；5、脫灰液比2.5，32℃，(NH4)2SO42％轉(zhuǎn)60min；6、軟化液比1.2，38℃，pH10.0，BP-Ap42酶100U/g(浴液)，轉(zhuǎn)120min；7、浸酸液比0.5，常溫，食鹽6％，轉(zhuǎn)10min，甲酸1％(1∶10稀釋)，轉(zhuǎn)10min，硫酸1.2％(1∶10稀釋，4×1/4)，轉(zhuǎn)60min，pH2.5停鼓過夜，次日轉(zhuǎn)30min，排液，約剩余1/3浸酸廢液；8、鉻鞣陽離子油1％，轉(zhuǎn)20min，鉻粉6％，NaAc 1％，轉(zhuǎn)60min，檢查全透。小蘇打1.2％，分4次加入，每次轉(zhuǎn)15min，至pH3.8，補(bǔ)加50℃熱水至液比2.5，調(diào)節(jié)鼓內(nèi)溫度至38℃，轉(zhuǎn)60min，停鼓過夜，次日轉(zhuǎn)30min(pH3.8)，出鼓搭馬24h；9、片皮后削勻，然后修邊；10、回軟液比3.0，溫度40℃，滲透劑0.3％，轉(zhuǎn)120min，停鼓過夜；11、復(fù)鞣液比2.0，常溫20℃，AA 3.0％，轉(zhuǎn)30min，調(diào)節(jié)pH4.5，MB-14.0％，201 1.0％，轉(zhuǎn)60min，鉻粉4.0％，轉(zhuǎn)90min，調(diào)節(jié)pH4.0，水洗10min，小蘇打0.6％，甲酸鈉1.0％，轉(zhuǎn)60min，pH6.5，溴甲酚綠檢查是否中和透，水洗20min；12、染色加油液比1.5，40℃，酸性黑ATT 1％，直接耐曬黑2％，轉(zhuǎn)30min，補(bǔ)加水至液比2.0，調(diào)節(jié)鼓內(nèi)溫度55℃，201 12％，801 2％，L-3 3％，ST 2％，亞硫酸化魚油1％，轉(zhuǎn)60min，甲酸0.5％×2，每次轉(zhuǎn)20min，pH3.8，水洗，出鼓搭馬；13、底涂黑膏1％，BS-100 1.5％，302 2％，蠟0.2％；14、中層黑膏1％，絡(luò)合黑0.1％，PUC-9702 0.8％，PUC-9703 1.5％，PUC-333 1.5％，蠟0.2％；15、頂層PUC-333 1.5％，蠟0.5％，手感劑0.01％，光亮劑0.03％；注浸水，脫毛，軟化中調(diào)節(jié)pH均用碳酸鈉。
實(shí)施例8、豬皮鞋面革工藝方案1、浸水液比3.0，常溫，pH10，BP-Ap42酶30U/g(浴液)，轉(zhuǎn)30min，停鼓過夜；2、脫脂液比2.5，32℃，純堿4％，平平加4％，轉(zhuǎn)60min；3、浸堿液比2.5，NaOH 1％，轉(zhuǎn)30min，停鼓過夜；4、脫堿水洗10min，液比1.5，32℃，硫酸銨1％，轉(zhuǎn)60min；5、脫毛BP-Ap42酶200U/g，pH10，滾酶30min，堆置15h；6、軟化液比1.2，38℃，BP-Ap42酶100U/mL，轉(zhuǎn)30min，水洗10min；
7、浸酸液比0.5，常溫，食鹽6％，轉(zhuǎn)10min，甲酸1％(1∶10稀釋)，硫酸1.2％(1∶10稀釋，4×1/4)，轉(zhuǎn)60min，pH2.5，停鼓過夜，次日轉(zhuǎn)30min；8、鉻鞣倒去浸酸廢液(留1/3)，陽離子油1％，轉(zhuǎn)20min，鉻粉6％，醋酸鈉1％，轉(zhuǎn)30min，檢查全透。小蘇打1.2％，分4次加入，每次轉(zhuǎn)15min，pH3.8，補(bǔ)加50℃熱水至液比2.5，調(diào)節(jié)鼓內(nèi)溫度38℃，轉(zhuǎn)60min，停鼓過夜，次日轉(zhuǎn)30min(pH3.8)，出鼓搭馬24h；9、片皮后削勻，然后修邊；10、回軟液比3.0，40℃，滲透劑0.3％，轉(zhuǎn)120min，停鼓過夜，換液，液比2.5，40℃，滲透劑0.3％，甲酸0.5％，轉(zhuǎn)30min；11、復(fù)鞣液比2.0，常溫，AA3.0％，轉(zhuǎn)30min，MB 4.0％，L-3 1.0％，轉(zhuǎn)60min，鉻粉4.0％，轉(zhuǎn)90min，pH4.0，水洗10min；12、中和液比2.0，小蘇打1.0％，醋酸鈉0.6％，轉(zhuǎn)60min，pH6.5(溴甲酚綠檢查是否全透)水洗20min；13、染色加油液比2.0，55℃，酸性黑ATT 1％，直接耐曬黑2％，大紅0.01％，轉(zhuǎn)30min，201 6％，801 3％，L-36％，ST 2％，亞硫酸性魚油1％，改性羊毛脂2％，轉(zhuǎn)60min，甲酸0.5％×2/20min，pH3.8，水洗，出鼓。
注浸水，脫毛，軟化中調(diào)節(jié)pH均用碳酸鈉。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)脫毛反應(yīng)不一定要多種蛋白酶參與，通過加入水、在機(jī)械作用和本發(fā)明蛋白酶的作用下就完全可以完成整個(gè)脫毛反應(yīng)；并且本發(fā)明的蛋白酶不僅可以脫毛，而且可以使膠原纖維分散而達(dá)到使皮革軟化的目的；也可用于浸水工藝。本發(fā)明的蛋白酶對豬皮、綿著皮和山羊皮和牛皮均具有良好的脫毛效果，對羊皮和牛皮的脫毛效果尤佳。采用本發(fā)明的蛋白酶的脫毛實(shí)驗(yàn)規(guī)模放大到50張/批時(shí)，效果依然非常好。利用本發(fā)明的蛋白酶進(jìn)行的皮革軟化試驗(yàn)表明該蛋白酶對豬皮、羊皮和牛皮均具有良好的軟化效果。軟化的成革物性均達(dá)到國際標(biāo)準(zhǔn)。因此本發(fā)明的蛋白酶不僅解決了目前化學(xué)方法脫毛的污染問題，也克服了常規(guī)酶法脫毛的性能不穩(wěn)定，易損傷皮膠原又不好操作的缺點(diǎn)，而且本發(fā)明的蛋白酶還可用于制革工業(yè)中的浸水工藝和軟化工藝。
本發(fā)明蛋白酶活性高，作用條件溫和，活性保持時(shí)間長，受環(huán)境因素影響少，可按常規(guī)方法分離純化。產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的微生物菌株，其培養(yǎng)基成份普通，培養(yǎng)方法簡便。
權(quán)利要求
1.一種堿性蛋白酶，其特征是滿足下列(a)-(d)所規(guī)定的至少一個(gè)條件(a)、室溫下，在1mM的EDTA作用下，剩余活力達(dá)14.7％；(b)、室溫下，在1mM的EGTA作用下，剩余活力達(dá)12.7％；(c)、室溫下，在1mM的二鉀砷酸鈉作用下，剩余活力達(dá)90.3％；(d)、室溫下，在1mM的苯甲醚作用下，剩余活力達(dá)93.4％。
2.按照權(quán)利要求1的堿性蛋白酶，其特征是所說的堿性蛋白酶具有下列特性(1)、作用此蛋白酶能水解蛋白質(zhì)和肽；(2)、最適pH50℃下在pH9.6時(shí)酶活最高；(3)、穩(wěn)定pH范圍50℃下在pH6-pH11范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定；(4)、最適溫度該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃；(5)、分子量通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得的該酶的分子量為40,000道爾頓。
3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的堿性蛋白酶，其特征是所說的堿性蛋白酶是由屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物產(chǎn)生的。
4.按照權(quán)利要求3的堿性蛋白酶，其特征是所說的產(chǎn)生堿性蛋白酶的微生物是短小芽孢桿菌UN-31-C-42(保藏號(hào)CGMCC NO.0518)。
5.一種生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法，其特征是從產(chǎn)生權(quán)利要求1-4所說的堿性蛋白酶產(chǎn)生菌短小芽孢桿菌UN-31-C-42(保藏號(hào)CGMCC NO.0518)或其變種培養(yǎng)物中獲得所說的蛋白酶。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其特征是所說的微生物是短小芽孢桿菌UN-31-C-42(保藏號(hào)CGMCC NO.0518)。
7.一種產(chǎn)生堿性蛋白酶的微生物，其特征是它是短小芽孢桿菌UN-31-C-42(保藏號(hào)CGMCC NO.0518)和它的突變體。
8.浸水脫毛軟化劑，其特征是其中包括權(quán)利要求1-4所規(guī)定的堿性蛋白酶。
9.一種浸水脫毛軟化劑，其特征是其中包含權(quán)利要求1-4所規(guī)定的堿性蛋白酶。
10.一種可用于制革工業(yè)的浸水工藝的制劑，其特征是其中包含權(quán)利要求1-4所規(guī)定的堿性蛋白酶。
11.一種可用于制革工業(yè)的脫毛工藝的制劑，其特征是其中包含權(quán)利要求1-4所規(guī)定的堿性蛋白酶。
12.一種可用于制革工業(yè)的軟化工藝的制劑，其特征是其中包含權(quán)利要求1-4所規(guī)定的堿性蛋白酶。
13.一種生皮浸水的方法，其特征是用權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所規(guī)定的蛋白酶和水在機(jī)械作用下浸泡生皮。
14.一種生皮脫毛的方法，其特征是使權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所規(guī)定的蛋白酶與生皮毛囊蛋白質(zhì)或者肽反應(yīng)。
15.一種可用于制革中的軟化工藝的方法，其特征是使用權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所規(guī)定的蛋白酶與皮反應(yīng)，致使皮軟化的方法。
16.按照權(quán)利要求13的方法，其特征是所說的方法具體步驟為用鹽濕皮，進(jìn)行浸泡回軟；生皮浸水時(shí)酶用量30U/g或50U/g，鼓內(nèi)溫度18℃，液比3，加碳酸鈉調(diào)節(jié)pH10，回軟時(shí)間15h。
17.按照權(quán)利要求14的方法，其特征是所說的方法具體步驟為鹽濕皮按權(quán)利要求16的浸水的條件浸水回軟；滴干水后用于堆置酶法脫毛；脫毛過程中所采用的條件為溫度18℃，用pH10的碳酸鈉溶液稀釋酶液，酶用量為100U/g，堆置16h。
18.按照權(quán)利要求15的方法，其特征是所說的方法具體步驟為經(jīng)過浸水、脫毛、浸灰、復(fù)灰、脫灰后的皮在鼓內(nèi)，溫度38℃，pH10，軟化2h，液比2，酶用量為100U/g或150U/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的芽孢桿菌屬未知菌株(保藏號(hào)CGMCC NO.0518),通過培養(yǎng)所說的菌株或其突變體所獲得的、具有下列特性的蛋白酶、此蛋白酶的產(chǎn)生方法及其用途。該酶能水解蛋白質(zhì)和肽;在50℃下,在pH9.6時(shí)的酶活最高;在50℃下,pH6－pH11范圍內(nèi)酶活力穩(wěn)定;最適反應(yīng)溫度50℃;分子量為40,000道爾頓。本發(fā)明的蛋白酶可以對豬皮、羊皮、牛皮具有非常好的脫毛效果,且不損傷皮膠原;也可用于制革中的浸水工藝和軟化工藝。
文檔編號(hào)C14C1/00GK1361278SQ0012064
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月29日
發(fā)明者張義正, 劉德明, 劉彥, 程昌鳳, 黃慶 申請人:四川大學(xué)