專利名稱：內(nèi)切葡聚糖酶nce5及其含有內(nèi)切葡聚糖酶nce5的纖維素酶制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶，一種含有該內(nèi)切葡聚糖酶的纖維素酶制劑和一種利用該纖維素酶制劑處理含纖維素織物的方法。
目前，來(lái)源于木腐真菌木霉屬和腐質(zhì)霉屬的纖維素酶制劑被用于賦予被染色的粗斜紋布含纖維素織物以磨洗的外觀和改善其手感。這些纖維素酶制劑是多種纖維素酶組分的混合物。為了對(duì)所述含纖維素織物發(fā)揮所需的作用必須使用大量的纖維素酶制劑，由此造成的困難阻礙了纖維素酶制劑的實(shí)際應(yīng)用。
纖維素酶制劑的這種缺點(diǎn)有待通過使用含有一種大量的內(nèi)切葡聚糖酶的制劑而得到克服。例如，國(guó)際公布WO89/09259，WO91/17243，WO98/03640和WO94/21801公開了具有很高內(nèi)切葡聚糖酶活性的纖維素酶制劑。具體地是，WO91/17243公開了一種來(lái)源于腐質(zhì)霉屬的純化的43kD內(nèi)切葡聚糖酶組分(EGV)的牛仔褲磨蝕活性比常規(guī)已知的由多種纖維素酶組分組成的混合物形式的纖維素酶制劑的牛仔褲磨蝕活性高約100倍。還有，WO98/03640公開了一種來(lái)源于腐質(zhì)霉屬的內(nèi)切葡聚糖酶組分NCE4的牛仔褲磨蝕活性和lyocell絨毛去除活性比常規(guī)已知的由多種纖維素酶組分組成的混合物形式的纖維素酶制劑的牛仔褲磨蝕活性和lyocell絨毛去除活性分別高25倍和100倍。
為了賦予被染色的粗斜紋布含纖維素織物以磨洗的外觀并改善其手感利用纖維素酶進(jìn)行了這種處理，但是在這種情況下，在處理過程中往往出現(xiàn)一些問題如部分靛藍(lán)染料在衣服上再沉積或再染色，即逆染色。
有一種試圖降低逆染色程度的方法，其中通過添加一種試劑如表面活性劑而將靛藍(lán)染料分散在纖維素酶處理溶液中。然而，這種方法存在的問題是需要投入添加化學(xué)品的成本并且也給環(huán)境增加了排放廢水的負(fù)擔(dān)。
因此，人們已經(jīng)把注意力集中在提供一種活性高而逆染色程度低的纖維素酶上，該纖維素酶將被用于處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物。
本發(fā)明的公開目前，本發(fā)明人已經(jīng)分離出一種新型的分解纖維素織物活性高的來(lái)源于霉菌Humicola insolens的內(nèi)切葡聚糖酶NCE5和它的基因并且證實(shí)了這種酶具有一個(gè)對(duì)來(lái)源于腐質(zhì)霉屬的酶來(lái)說(shuō)沒有先例的結(jié)構(gòu)并且能夠水解纖維素織物，也就是說(shuō)這種酶具有約25kDa的小分子量而且其結(jié)構(gòu)中不存在纖維素結(jié)合域(CBD)。
還證實(shí)了，在采用通過利用Humicola insolens作為宿主表達(dá)酶NCE5所獲得的制劑處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物時(shí)，所述酶具有類似于NCE4的高活性，而令人驚奇的是所述酶的逆染色程度低于NCE4。
因此，本發(fā)明打算提供一種在處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中逆染色程度低的纖維素酶及其基因。
本發(fā)明還打算提供一種具有優(yōu)良特性的纖維素酶制劑。
另外，本發(fā)明打算提供一種利用所述酶處理含纖維素織物的有效和成本低的方法。
本申請(qǐng)包括申請(qǐng)?zhí)枮?000-150463的日本專利申請(qǐng)的說(shuō)明書和/或附圖中公開的部分或全部?jī)?nèi)容，該日本專利申請(qǐng)是本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)文件。
實(shí)施本發(fā)明的最佳實(shí)施方案以下詳細(xì)描述本發(fā)明。纖維素酶本發(fā)明提供的內(nèi)切葡聚糖酶NCE5的有利特性在于在處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中逆染色的程度低于NCE4。因此，本發(fā)明的酶，可以降低處理被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中化學(xué)品如表面活性劑的添加量，結(jié)果可以降低成本并且能夠減輕給環(huán)境造成的負(fù)擔(dān)。
該酶是一種新型蛋白質(zhì)，其與由S.Takashima等報(bào)道的灰色腐質(zhì)霉的egl4序列(S.Takashima等，生物技術(shù)雜志(Journal ofBiotechnology)，67，85-97(1999))具有同源性。該酶的特征在于具有約25kDa的小分子量而且其結(jié)構(gòu)中不存在纖維素結(jié)合域(CBD)。在原始狀態(tài)下，從腐質(zhì)霉屬中分離出的具有高的纖維素織物分解活性的所有的酶都含有纖維素結(jié)合域(CDB)(例如，WO91/17243已經(jīng)公開了一種來(lái)源于腐質(zhì)霉屬的純化的43kD內(nèi)切葡聚糖酶成分(EGV)，以及WO98/03640已經(jīng)公開了一種腐質(zhì)霉屬來(lái)源的內(nèi)切葡聚糖酶成分(NCE4))。然而，不含CBD而纖維素分解活性高的腐質(zhì)霉屬來(lái)源的酶還不為自然界所知。
作為一種來(lái)源于腐質(zhì)霉屬以外的其它霉菌的酶中不含CBD的內(nèi)切葡聚糖酶，JP-W-8-507695(本文中使用的術(shù)語(yǔ)“JP-W”是指一種“已經(jīng)公開的未審日本國(guó)際專利申請(qǐng)”)公開了從Trichodermalongibrachiatum中分離的EGIII具有一個(gè)從5.5至6.0的最適pH作為其CMC酶活性(Remazol亮藍(lán)羰甲基纖維素分析試驗(yàn))以及甚至在中性至堿性范圍內(nèi)的活性也比通常已知的木霉屬來(lái)源的纖維素酶的活性高。另一方面，本發(fā)明的酶的CMC酶活性具有一個(gè)從5.0至9.0的最適pH并且在更強(qiáng)的堿性范圍內(nèi)的活性比EGIII的活性高。
該酶是一種含有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或從第19位至第223位的序列的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“部分SEQ ID NO1所示序列”是指，例如一段可以作為探針的長(zhǎng)度，更明確地說(shuō)仍然保留了纖維素酶活性，具體地是內(nèi)切葡聚糖酶活性的部分序列。
一種在上述蛋白質(zhì)的N-端側(cè)還含有部分或全部的SEQ ID NO1所示的第1位至第18位的氨基酸序列的蛋白質(zhì)也被包括在本發(fā)明中。在這一點(diǎn)上，由于SEQ ID NO1所示序列中的第1位至第18位的氨基酸序列被認(rèn)為是信號(hào)肽，所以部分序列是指除了其保持信號(hào)肽活性的部分序列外，由于在被所述類型的表達(dá)宿主加工的位點(diǎn)上發(fā)生變化而仍然保留在N-端的一段序列。
上述蛋白質(zhì)的一種修飾蛋白質(zhì)也被包括在本發(fā)明中。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾蛋白質(zhì)是指一種上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中發(fā)生了至少一個(gè)，優(yōu)選地1至幾個(gè)氨基酸的修飾如添加、插入、刪除、缺失或取代的、而仍然保留了纖維素酶活性，尤其是內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。
可以從霉菌，明確地說(shuō)從一種屬于腐質(zhì)霉屬的微生物(例如Humicola insolens)中獲得。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列或其一種修飾蛋白質(zhì)的核苷酸序列。一旦給出了一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列，就很容易確定出編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列，因而可以選擇出編碼SEQ IDNO1所示氨基酸序列或其一種修飾蛋白質(zhì)的不同核苷酸序列。
本發(fā)明的核苷酸序列既可以是天然來(lái)源的也可以是一種完全合成的產(chǎn)物，或者也可以是一種通過利用部分天然來(lái)源而合成的產(chǎn)物。獲得本發(fā)明核苷酸序列的方法的典型例子包括一種這樣的方法，在該方法中，通過采用一種遺傳工程領(lǐng)域中通常使用的技術(shù)，例如采用一種基于部分氨基酸序列的信息制備的一種合適的DNA探針從Humicolainsolens的cDNA文庫(kù)中篩選所述核苷酸序列。
編碼本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶NCE5的氨基酸序列的典型序列具有部分或全部的SEQ ID NO2所示核苷酸序列。SEQ ID NO2所示核苷酸序列具有一個(gè)起始于第一位至第3位的ATG和終止于第670位至第672位的TAA的可讀框。并且，第55位至第57位的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于由205個(gè)殘基組成的成熟蛋白質(zhì)的N-端氨基酸。
內(nèi)切葡聚糖酶的活性內(nèi)切葡聚糖酶活性是指“CMC酶活性”，也就是一種通常水解羧甲基纖維素的活性。一個(gè)單位的“CMC酶活性”被定義為形成相當(dāng)于1μmol葡萄糖的還原糖所需要的酶量，該酶量是通過包括以下步驟的方法測(cè)定的將待測(cè)蛋白質(zhì)與CMC溶液一起溫育一段固定的時(shí)間，然后測(cè)定被釋放出的還原糖。另外，“CMC酶活性”也可以通過一種以其中加入了待測(cè)蛋白質(zhì)的CMC溶液的粘度變化作為標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)測(cè)定。
在本發(fā)明中，按照Neena Din等的方法(Neena Din等，生物技術(shù)(Biotechnology)，9(1991)，1096-1099)，以脫脂棉原纖維-釋放活性作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活性。也就是說(shuō)，當(dāng)待測(cè)蛋白質(zhì)、不銹鋼珠和脫脂棉被加到50mM的磷酸鹽緩沖液(pH7)中時(shí)，從脫脂棉中釋放出來(lái)的原纖維在Launder Meter(L-12，Daiei Kagaku Seiki MFG.，日本)中于55℃下反應(yīng)120分鐘，然后在600nm的吸光度下測(cè)定從脫脂棉中釋放出來(lái)的原纖維的量。表達(dá)載體和被轉(zhuǎn)化的微生物本發(fā)明還提供了一種能夠在一種宿主微生物中復(fù)制編碼SEQ IDNO1所示氨基酸序列或其一種修飾蛋白質(zhì)的核苷酸序列(以下只描述為“本發(fā)明的DNA序列”)并且含有一種由此所編碼的蛋白質(zhì)能夠被表達(dá)的DNA序列的表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體能夠在一種自我復(fù)制載體如質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建，所述質(zhì)粒以一種獨(dú)立的形式存在于染色體外并且其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制。而且，本發(fā)明的表達(dá)載體可以是一種當(dāng)被引入宿主微生物時(shí)被整合進(jìn)宿主微生物的基因組中并且與被整合在其中的染色體一起進(jìn)行復(fù)制的載體。關(guān)于構(gòu)建本發(fā)明的載體的過程和方法，可以采用遺傳工程領(lǐng)域中通常使用的方法。
為了通過將本發(fā)明的表達(dá)載體實(shí)際引進(jìn)一種宿主微生物中來(lái)表達(dá)具有所需活性的蛋白質(zhì)，理想的是所述載體不僅含有本發(fā)明的DNA序列而且還含有其它元件如一種控制表達(dá)的DNA序列和一種用于篩選微生物的基因標(biāo)記。作為控制表達(dá)的DNA序列，其中包括一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)終止子和一個(gè)編碼一種信號(hào)肽的DNA序列。對(duì)所述的啟動(dòng)子沒有特別的限制，條件只是該啟動(dòng)子在一種宿主微生物中具有轉(zhuǎn)錄活性，并且可以用來(lái)作為控制編碼一種與宿主微生物的蛋白質(zhì)相同或不同的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的DNA序列。并且，對(duì)所述信號(hào)肽也沒有特別的限制，條件只是該信號(hào)肽能夠有助于宿主微生物中的蛋白質(zhì)分泌，而且可以從一種DNA序列中得到。該DNA序列來(lái)源于編碼一種與宿主微生物的蛋白質(zhì)相同或不同的蛋白質(zhì)的基因。另外，本發(fā)明的基因標(biāo)記可按照轉(zhuǎn)化體的篩選方法任意地進(jìn)行選擇，例如可以使用一種編碼藥物抗性的基因或一種補(bǔ)充輔源營(yíng)養(yǎng)的基因。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種被所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物。對(duì)該宿主載體系統(tǒng)沒有特別的限制，例如，可以使用一種利用了大腸桿菌、一種放線菌、一種酵母菌或一種霉菌的系統(tǒng)和一種利用了大腸桿菌、一種放線菌、一種酵母菌或一種霉菌的與其它蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。
而且，可以采用本領(lǐng)域中通常使用的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)用這種表達(dá)載體對(duì)一種微生物的轉(zhuǎn)化。
另外，利用合適的培養(yǎng)基對(duì)所得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，然后可以通過從該培養(yǎng)混合物中分離來(lái)獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種制備本發(fā)明新型蛋白質(zhì)的方法。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)及培養(yǎng)條件基本上與所使用的微生物的培養(yǎng)及培養(yǎng)條件相同。轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)結(jié)束后，利用本領(lǐng)域中通常使用的方法回收目的蛋白質(zhì)。
并且，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種能夠表達(dá)由本發(fā)明的DNA序列編碼的內(nèi)切葡聚糖酶的酵母細(xì)胞。本發(fā)明酵母細(xì)胞的實(shí)例包括屬于糖酵母屬、漢遜氏酵母屬或畢赤氏酵母屬的微生物，例如啤酒糖酵母。
本發(fā)明的宿主霉菌可以是一種屬于腐質(zhì)霉屬、曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬或支頂孢屬的霉菌。其優(yōu)選的實(shí)例包括Humicola insolens、黑曲霉或米曲霉、綠色木霉、尖孢鐮孢和纖維素溶解支頂孢(Acremoniumcellulolyticus)。微生物的保藏Humicola insolens MN200-1已被保藏在國(guó)家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，一個(gè)經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易和工業(yè)部下屬的獨(dú)立管理機(jī)構(gòu)，AIST TsukubaCentral6，Higashi1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏號(hào)為FERMBP-5977(原始保藏物FERM P-15736，原始保藏日期1996年7月15日)。被含有本發(fā)明的纖維素酶基因的質(zhì)粒pNCE5Bam轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109(參照實(shí)施例4)已于2000年4月18日被保藏在國(guó)家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，一個(gè)經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易和工業(yè)部下屬的獨(dú)立管理機(jī)構(gòu)，AISTTsukuba Central 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏號(hào)為FERM BP-7138。
被質(zhì)粒pEGD01轉(zhuǎn)化的一株大腸桿菌菌株(大腸桿菌/pEGD01)已被保藏在國(guó)家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，一個(gè)經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易和工業(yè)部下屬的獨(dú)立管理機(jī)構(gòu)，AIST Tsukuba Central 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏號(hào)為FERM BP-5973(原始保藏物FERM P-15729，原始保藏日期1996年7月12日)。纖維素酶/纖維素酶制劑的用途本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還提供了一種含有一種本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶及其修飾肽的纖維素酶制劑。本發(fā)明的纖維素酶制劑除了含有本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶及其修飾肽外，還可以含有其它類型的纖維素酶如纖維素生物水解酶、β-葡糖苷酶和除本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶以外的內(nèi)切葡聚糖酶，并且可以通過進(jìn)一步將所述的纖維素酶制劑與通常使用的組分如一種填料(例如乳糖、氯化鈉和山梨醇)、表面活性劑和防腐劑進(jìn)行混合來(lái)制備。還可以將本發(fā)明的纖維素酶制劑制成任何適宜的形狀如粉末或液體形式。
本發(fā)明還提供了一種使有色的含纖維素織物的顏色澄明的方法，該方法包括一個(gè)采用一種內(nèi)切葡聚糖酶或一種纖維素酶制劑處理有色的含纖維素織物的步驟，以及一種使有色的含纖維素織物發(fā)生局部顏色改變的方法，即一種為有色的含纖維素織物提供磨洗外觀的方法，該方法包括一個(gè)采用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理有色的含纖維素織物的步驟。
本發(fā)明的這類方法可以通過在洗滌過程中處理含纖維素織物來(lái)實(shí)施。然而，在某些情況下，織物的處理可以通過在浸泡或漂洗過程中向浸泡了或要浸泡的所述織物的水中添加本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶制劑來(lái)實(shí)施。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種降低含纖維素織物的起毛率或減少這種織物中的絨毛的方法；或者一種降低含纖維素織物變得硬挺的速率或降低這種織物硬挺度的方法。這些方法中的每一種方法都包括一個(gè)采用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理含纖維素織物的步驟。
考慮其它各種條件的同時(shí)可以適當(dāng)?shù)貨Q定諸如接觸溫度或內(nèi)切葡聚糖酶的使用量這樣的條件。例如，對(duì)于為了改善其手感和外觀而對(duì)含纖維素織物進(jìn)行失重處理的情況來(lái)說(shuō)，所述織物可以在約50至60℃的溫度下利用蛋白濃度為1至100mg/L的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行處理。并且，當(dāng)有色的含纖維素織物需要進(jìn)行局部顏色改變時(shí)，所述織物可以在約50至60℃的溫度下利用蛋白濃度為2至50mg/L的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行處理。
還有，當(dāng)降低含纖維素織物的起毛率或減少這種織物中的絨毛時(shí)，所述織物可以在約50至60℃的溫度下利用蛋白濃度為0.05至10mg/L的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行處理。
并且，通過在洗滌劑組合物中使用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶制劑，可以提高顆粒狀污垢的去除、使顏色澄明、去毛、消除起球和降低硬挺度的性能。本發(fā)明所指的洗滌劑組合物可含有一種表面活性劑(一種陰離子、非離子、陽(yáng)離子、兩性或兼性離子劑或其一種混合物)。
本發(fā)明的洗滌劑組合物還可含有本領(lǐng)域中已知的其它洗滌劑組分，如助洗劑、漂白劑、漂白活性劑、緩蝕劑、螯合劑、污斑離解聚合物、香料、其它的酶(如蛋白酶、脂酶或淀粉酶)、酶穩(wěn)定劑、配方助劑、光學(xué)增艷劑和泡沫促進(jìn)劑。陰離子表面活性劑的典型實(shí)例包括線性烷基苯磺酸鹽(LAS)、烷基硫酸鹽(AS)、α-烯屬磺酸鹽(AOS)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽(AES)和天然脂肪酸的堿金屬鹽。非離子表面活性劑的實(shí)例包括聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、蔗糖和葡萄糖的脂肪酸酯以及聚乙氧基化烷基葡糖苷的酯。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脫墨可以通過使本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶制劑與廢紙反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。因此，由廢紙制造循環(huán)利用紙的方法可以通過采用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行處理得到明顯的改進(jìn)。一般稱為廢紙的所有紙都可以被用作將被本發(fā)明利用的廢紙，而且它們的實(shí)例包括通過混合機(jī)械漿和化學(xué)漿生產(chǎn)的報(bào)紙，雜志和一級(jí)至二級(jí)的印刷紙、由化學(xué)漿組成的不含木質(zhì)的廢紙和廢印刷紙如涂布紙。
還有，本文使用的術(shù)語(yǔ)“脫墨劑”是指一種通常用于使廢紙脫墨的試劑，其實(shí)例包括一種堿性化合物如NaOH和Na2CO3，硅酸鈉、過氧化氫和磷酸鹽，以及陰離子和非離子表面活性劑、凈化劑如油酸和輔助劑如pH穩(wěn)定劑、螯合劑和分散劑。
并且，根據(jù)本發(fā)明，可以認(rèn)為采用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶處理紙漿使其打漿度得到可能的明顯改善而不會(huì)大大降低紙的強(qiáng)度。因此，本發(fā)明提供了一種改善紙漿的打漿度的方法，該方法包括一個(gè)采用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理紙漿的步驟?？梢酝ㄟ^本發(fā)明處理的紙漿的實(shí)例包括廢紙漿、循環(huán)利用紙板漿、牛皮紙漿、亞硫酸鹽漿和熱洗機(jī)械漿和其它高得率漿。
另外，消化動(dòng)物飼料中的葡聚糖的能力可以通過向該飼料中添加本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶來(lái)提高。因此，本發(fā)明提供了一種改善對(duì)動(dòng)物飼料的消化能力的方法，該方法包括一個(gè)采用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶制劑處理動(dòng)物飼料的步驟。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示質(zhì)粒pNCE5Bam的構(gòu)建。圖2表示pJND-c5的構(gòu)建。
將200ml所述粗纖維素酶制劑溶液加到硫酸銨終濃度為1M的溶液中，然后以20ml/分鐘的流速上樣到Source PHE柱子上(凝膠體積150ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，該柱子預(yù)先用1M硫酸銨溶液進(jìn)行了平衡。接下來(lái)，采用硫酸銨濃度為1.0M至0M的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以20ml/分鐘的流速進(jìn)行線性梯度洗脫并分步收集級(jí)分。在這些級(jí)分當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用硫酸銨濃度為0.3M時(shí)得到的部分級(jí)分中的棉花原纖維-釋放活性很強(qiáng)。因此，收集200ml的該級(jí)分。該步驟進(jìn)行兩次。
將400ml如此得到的活性級(jí)分加到硫酸銨濃度為1.5M的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，然后以20ml/分鐘的流速上樣到Source ISO柱子上(凝膠體積125ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，該柱子預(yù)先用1.5M硫酸銨的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)進(jìn)行了平衡。接下來(lái)，采用從硫酸銨濃度為1.5M的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)至超純水以20ml/分鐘的流速進(jìn)行線性梯度洗脫并分步收集級(jí)分。在這些級(jí)分當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用硫酸銨濃度為1.05M時(shí)得到的部分級(jí)分的脫脂棉原纖維-釋放活性很強(qiáng)。因此，收集200ml的該級(jí)分。
然后，將硫酸銨加到200ml如此獲得的活性級(jí)分中從而達(dá)到65％飽和度的水平，在4℃下將所述混合物攪拌60分鐘，然后以15000rpm離心從而回收沉淀。將該沉淀溶解在20ml的蒸餾水中并利用Ultrafree/Biomax-5K(Millipore)進(jìn)行脫鹽從而回收到40ml的溶液。
將30ml如此得到的活性級(jí)分加到50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)中，然后以5ml/分鐘的流速上樣到SP Sepharose FF柱子上(凝膠體積16ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，該柱子預(yù)先用50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)進(jìn)行了平衡。接下來(lái)，采用從50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)至1M NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)以4ml/分鐘的流速進(jìn)行線性梯度洗脫并分步收集級(jí)分。在這些級(jí)分當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)氯化鈉濃度約為0.12M時(shí)得到的部分級(jí)分的脫脂棉原纖維-釋放活性很強(qiáng)。因此，收集12ml的該級(jí)分。
此后，將6ml如此得到的活性級(jí)分加到50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)中，然后以1ml/分鐘的流速上樣到Mono S5/5HR柱子上(由AmershamPharmacia Biotech制造)，該柱子預(yù)先用50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)進(jìn)行了平衡。接下來(lái)，采用從50mM醋酸鹽緩沖液(pH4.0)至1M NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)以1ml/分鐘的流速進(jìn)行線性梯度洗脫并分步收集級(jí)分。在這些級(jí)分當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)氯化鈉濃度約為0.1M時(shí)得到的部分級(jí)分的脫脂棉原纖維-釋放活性很強(qiáng)。因此，收集1至3ml的該級(jí)分。該級(jí)分被分離成NCE5。通過SDS-PAGE分析，該NCE5具有一條25kD的帶。將上述純化NCE5的純化步驟重復(fù)50次，獲得了大量的純化樣品。
所述SDS-PAGE分析是利用Tefco提供的系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行的。即，使用了一個(gè)電泳槽(No.03-101)，一個(gè)電源(3540型)，一種8％的凝膠(01-015)和一個(gè)用于SDS-PAGE的緩沖液試劑盒(06-0301)。所述電泳條件是18mA/10分鐘，然后是20mA/90分鐘。為了電泳后進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定，利用電泳用2D-銀染色劑II“Daiichi”(由Daiichi Pure Chemicals制造)進(jìn)行銀染。利用由Bio-Red制造的SDS-PAGE分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白LowRange(161-0304)作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
通過Neen Din等的方法(Neen Din等，生物技術(shù)(Biotechnology)，9(1991)，1096-1099)的改進(jìn)方法測(cè)定脫脂棉原纖維-釋放活性。即，當(dāng)在下述條件下利用耐洗牢度試驗(yàn)儀進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，以600nm的吸光度測(cè)定從脫脂棉中釋放的原纖維量。
測(cè)量?jī)x器耐洗牢度試驗(yàn)儀L-12(Daiei Kagaku Seiki MFG.，日本)溫度 55℃時(shí)間 120分鐘反應(yīng)pHpH7(50mM磷酸鹽緩沖液)向所述處理溶液中加入適當(dāng)量的不銹鋼珠和脫脂棉以及內(nèi)切葡聚糖酶溶液。實(shí)施例2纖維素酶NCE5的部分氨基酸序列(1)N-端氨基酸序列的鑒定為了測(cè)定實(shí)施例1中純化的蛋白質(zhì)的N-端氨基酸序列，所述NCE5級(jí)分通過采用SDS-PAGE mini(由Tefco制造)來(lái)處理，通過電子印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用考馬斯亮藍(lán)R250(由Nakalai Tesque制造)染色，脫色，用水沖洗，然后風(fēng)干。當(dāng)從其中切下印跡了25kD蛋白質(zhì)的部分后，上樣到492型蛋白質(zhì)測(cè)序儀(由PE Applied Biosystems制造)以便分析N-端氨基酸序列，沒有獲得通過Edman降解的信號(hào)，因此，表明所述N-端氨基酸得到了修飾和保護(hù)。因此，將所述膜浸泡在0.5％的聚乙烯吡咯烷酮(分子量40000，由Sigma制造)/100mM醋酸溶液中于37℃下保持30分鐘從而封閉所述膜上蛋白質(zhì)未結(jié)合部分，通過采用Pfu焦谷氨酸氨基肽酶(由Kakara Shuzo制造)在50℃下處理5小時(shí)來(lái)除去所述被修飾的N-端殘基，然后再次進(jìn)行序列測(cè)定。如此獲得的序列如下所示。
NCE5的N-端氨基酸序列
Ser-Gly-Ser-Gly-Arg-Thr-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys)-Ala-Trp-Pro (20個(gè)殘基) (SEQ IDNO3)(2)肽作圖為了測(cè)定實(shí)施例1中純化的蛋白質(zhì)的內(nèi)部氨基酸序列，對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行還原烷基化，然后繪制其肽圖譜。
也就是，將300μg的純化蛋白質(zhì)溶解在被裝在一支試管中的500μl還原烷基化緩沖液(0.5M tris，7M鹽酸胍，10mM EDTA·2Na2)中，然后向其中加入1mg的DTT。用氮?dú)庵脫Q所述試管中的空氣，將所述內(nèi)容物在室溫下保持5小時(shí)從而進(jìn)行所述蛋白質(zhì)的還原反應(yīng)。還原反應(yīng)后，向其中加入2.5mg的一碘代乙酸從而在室溫下進(jìn)行30分鐘的烷基化暗反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水對(duì)所述反應(yīng)混合物進(jìn)行透析以便脫鹽，然后進(jìn)行凍干，將如此獲得的粉末用作一種還原性烷基化NCE5。
將該粉末溶解在0.1M的碳酸氫銨緩沖液(pH8.0)中。將該溶液與基于蛋白質(zhì)的約1/50摩爾量的胰蛋白酶(由Promega制造)混合并在37℃下反應(yīng)過夜。通過利用172μ型的制備型HPLC系統(tǒng)(由PE AppliedBiosystems制造)對(duì)所述的消化產(chǎn)物進(jìn)行柱層析(柱子C18 220×2.1mm，0.1％TFA的5％乙腈至0.085％TFA的35％乙腈梯度)，分離出5種肽。每一種如此獲得的肽片段的氨基酸序列通過492型的蛋白質(zhì)測(cè)序儀(由PE Applied Biosystems制造)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得的結(jié)果如下所示T-28.8Leu-Lys-Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg(8個(gè)殘基) (SEQ ID NO4)T-32.6Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys(6個(gè)殘基) (SEQ ID NO5)T-35.9Trp-Asp-Asn-Pro-Leu-Phe-Asp-Gly-Gly-Asn-Thr-Arg(12個(gè)殘基)(SEQ ID NO6)T-35.9Glu-Trp-Cys-Cys-Ala-Cys-Tyr-Glu-Leu-Thr-Phe-Thr(12個(gè)殘基)(SEQ ID NO7)T-43.0Phe-Asp-Trp-Phe-Leu-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Val-Asn-Trp-Arg******* (15個(gè)殘基)(SEQ ID NO8)在通過肽作圖獲得的N-端氨基酸序列和氨基酸序列中，4種肽與由S.Takashima等(S.Takashima等，生物技術(shù)雜志，67，85-97(1999))報(bào)道的灰色腐質(zhì)霉eg14序列相同。然而，在T-43.0中沒有發(fā)現(xiàn)相同的序列。因此表明盡管所述序列具有同源性，但是它是不同的因而是一種新型蛋白質(zhì)。
制備下列與由*所示肽T-43.0的N-端和部分氨基酸序列對(duì)應(yīng)的合成寡核苷酸作為引物。
N-端5′-TAY TGG GAY TGY TGY AAR CC-3′(20聚體)(SEQ ID NO9)T-43.05′-TCI GCR TTI ARR AAC CAR TC-3′(20聚體)(SEQ ID NO10)以1μg的cDNA作為模板，在下列條件下于含1.25個(gè)單位的LA TaqDNA聚合酶(由Takra Shuzo制造)和其中所附的緩沖液、0.2mM dNTP、10％DMSO和1μM的各種引物的50μl反應(yīng)溶液中進(jìn)行PCR。在94℃下保持1分鐘，(94℃，30秒鐘，55.0℃，30秒鐘，72.0℃，1分鐘)×25次，然后在72.0℃下保持5分鐘。
通過該反應(yīng)擴(kuò)增了一個(gè)約500bp的DNA片段，利用DYEnamic ET終止子循環(huán)測(cè)序預(yù)混試劑盒(由Amersham Pharmacia Biotech制造)和ABI PRISM 310基因分析儀(由PE Applied Biosysytems制造)并按照其中所附的使用說(shuō)明書進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果，由如此測(cè)定的核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列含有所有實(shí)施例2中獲得的部分氨基酸序列。因此，將該序列作為以下篩選實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)探針。(3)纖維素酶組分NCE5基因的克隆(i)通過噬菌斑雜交的篩選將通過PCR擴(kuò)增的100ng的500bp DNA片段預(yù)先用ECL直接DNA/RNA標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)(由Amersham Pharmacia Biotech制造)進(jìn)行標(biāo)記。
將在(1)-(iv)中制備的噬菌斑轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍轉(zhuǎn)移膜(由Amersham Pharmacia Biotech制造)上，采用0.4N氫氧化鈉進(jìn)行堿處理從而使膜上的重組噬菌體DNA變性為單鏈DNA，用5×SSC(1×SSC15mM檸檬酸三鈉，150mM氯化鈉)沖洗，然后風(fēng)干固定所述的DNA。接下來(lái)，按照試劑盒中的使用手冊(cè)進(jìn)行雜交和檢測(cè)反應(yīng)，然后對(duì)富士醫(yī)用X光膠片(FUJI MEDICAL X-RAY FILM)(由Fuji Photo Film制造)進(jìn)行感光處理從而得到6個(gè)陽(yáng)性克隆。(ii)噬菌體DNA的制備按照試劑盒所附的使用手冊(cè)由陽(yáng)性克隆制備作為質(zhì)粒DNA的DNA。
由氨芐青霉素抗性大腸桿菌菌株SOLRTM制備一種其中所述DNA片段被克隆到pBluescript SK(-)中的質(zhì)粒，在與上述相同的條件下以所述質(zhì)粒為模板并利用步驟(2)中使用的N-端和T-43.0引物進(jìn)行PCR。結(jié)果，從一個(gè)質(zhì)粒中得到一個(gè)500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。由于據(jù)推定所述目的DNA被克隆到了該質(zhì)粒中，所以采用EcoRI進(jìn)行消化并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
結(jié)果表明，所述質(zhì)粒含有一個(gè)大約1kbp的EcoRI片段。(4)cDNA核苷酸序列的測(cè)定插入到步驟(3)-(ii)中獲得的陽(yáng)性重組pBluescript SK(-)質(zhì)粒中的大約1kbp的EcoRI片段的核苷酸序列通過利用T3和T7引物的相同方法來(lái)測(cè)定。結(jié)果，該核苷酸序列含有一個(gè)672bp可讀框，由該可讀框分別推導(dǎo)出的核苷酸序列和氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO2和SEQ ID NO1表示。
而且，由于從所推導(dǎo)出的這種蛋白質(zhì)的N-端數(shù)第18位氨基酸以后的序列與實(shí)施例2的步驟(1)中測(cè)定的25kDa蛋白質(zhì)的N-端序列相同，所以表明該基因編碼25kDa蛋白質(zhì)。
另外，還認(rèn)為所述可讀框的第1個(gè)至第18個(gè)氨基酸的序列是一個(gè)用于將所述蛋白質(zhì)分泌到胞外部分的信號(hào)序列。
將如此制備的原生質(zhì)體懸浮在1ml的SUTC緩沖液中，將100μl的該懸浮液與10μg的DNA(TE)溶液(10μl)進(jìn)行混合后在冰浴中保持5分鐘。接下來(lái)，與400μl的PEG溶液(60％ PEG4000，10Mm氯化鈣，10mM Tris-HCl(pH7.5))混合，將該混合物在冰浴中保持20分鐘，與10ml的SUTC緩沖液混合，然后以2500rpm離心10分鐘。將如此收集的原生質(zhì)體懸浮在1ml的SUTC緩沖液中，以4000rpm離心5分鐘并最終懸浮在100μl的SUTC緩沖液中。
將如此處理的原生質(zhì)體與YMG軟瓊脂一起鋪在一種含潮霉素(200μg/ml)的YMG培養(yǎng)基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.2％麥芽提取物、1％瓊脂(pH6.8))上并在37℃下培養(yǎng)5天，將如此形成的菌落用作轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例5pJND-c5轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和鑒定(1)通過SDS-PAGE進(jìn)行評(píng)價(jià)將質(zhì)粒pJND-c5引進(jìn)上述的Humicola insolens MN200-1中并篩選出40個(gè)具有潮霉素抗性的菌株。利用(N)培養(yǎng)基將這些菌株在37℃下培養(yǎng)5天，通過12％-SDS-PAGE mini(由Tefco制造)電泳分析如此獲得的培養(yǎng)物上清液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12個(gè)克隆中的一種被認(rèn)為是NCE5的25kDa蛋白質(zhì)的含量增加得尤其明顯。(2)重組NCE5的N-端氨基酸殘基的鑒定為了證實(shí)在上述步驟(1)中大量表達(dá)的所述蛋白質(zhì)是由NCE5基因編碼的，對(duì)該蛋白質(zhì)的N-端氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定。首先，通過12％-SDS-PAGE mini電泳對(duì)所述培養(yǎng)物上清液進(jìn)行分離，按照實(shí)施例2中的方法將得到的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到一種PVDF膜上，分子量為25kDa的蛋白質(zhì)經(jīng)過處理除去了其被修飾的N-端氨基酸殘基后進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的測(cè)定。結(jié)果，其序列與由質(zhì)粒pJND-c5的核苷酸序列推導(dǎo)出的纖維素酶NCE5的N-端氨基酸序列一致。實(shí)施例6評(píng)價(jià)由Humicola insolens表達(dá)的NCE5磨蝕被染色的粗斜紋布含纖維素織物的活性在下述條件下，利用實(shí)施例5中獲得的表達(dá)NCE5基因的Humicolainsolens的培養(yǎng)液以及Humicola insolens的培養(yǎng)液，對(duì)一條退漿12盎司的藍(lán)色牛仔褲進(jìn)行磨蝕處理。按照國(guó)際公布WO98/03640的說(shuō)明書通過對(duì)將表達(dá)質(zhì)粒pEGD01引進(jìn)Humicola insolens MN200-1后得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行振蕩培養(yǎng)來(lái)得到表達(dá)NCE4基因的Humicola insolens的培養(yǎng)液。在37℃下利用(N)培養(yǎng)基將所述轉(zhuǎn)化體振蕩培養(yǎng)5天。所述Humicola insolens的培養(yǎng)液通過在37℃下將Humicola insolensMN200-1振蕩培養(yǎng)5天來(lái)得到。
試驗(yàn)機(jī)器20kg滌衣機(jī)(由Sanyo Electric制造的全自動(dòng)洗衣機(jī)SCW5101)溫度65℃時(shí)間60分鐘pH 6.2(6.7mM磷酸鹽緩沖液)向處理溶液中加入適量的橡膠球和每種纖維素酶制劑的溶液。
利用分光光度計(jì)(由Minolta制造，CM-525i)測(cè)定一種實(shí)驗(yàn)室顯示系統(tǒng)L值(亮度)來(lái)作為磨蝕度。通過計(jì)算相對(duì)對(duì)照(未處理的織物)增加的L值(增加的亮度)，即ΔL值，來(lái)評(píng)估磨蝕度，也就是說(shuō)，對(duì)每種測(cè)試的粗斜紋布測(cè)定10個(gè)點(diǎn)的ΔL值(n＝10)，然后計(jì)算出它們的平均值。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算出作為獲得ΔL值約為6所必需的蛋白質(zhì)的內(nèi)切葡聚糖酶的濃度。
通過利用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(由Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室制造)制作牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定所述蛋白質(zhì)的濃度。
結(jié)果見表1。
表1樣品 蛋白質(zhì)濃度Humicola insolens培養(yǎng)液80.0mg/升表達(dá)NCE4基因的Humicola insolens的培養(yǎng)液6.0mg/升表達(dá)NCE5基因的Humicola insolens的培養(yǎng)液6.0mg/升實(shí)施例7 評(píng)價(jià)由Humicola insolens表達(dá)的NCE5在磨蝕被染色的粗斜紋布含纖維素織物的過程中的逆染色在各種溫度下利用實(shí)施例5中獲得的表達(dá)NCE5基因的Humicolainsolens的培養(yǎng)液和表達(dá)NCE4基因的Humicola insolens的培養(yǎng)液對(duì)被染色的粗斜紋布含纖維素織物進(jìn)行磨蝕。需要加入的酶濃度被定義為在65℃下獲得ΔL值大約為6所必需的量。
試驗(yàn)結(jié)束后，為了評(píng)估逆染色，利用分光光度計(jì)(由Minolta制造，CM-525i)以實(shí)驗(yàn)室顯示系統(tǒng)L值(亮度)的形式測(cè)定縫在所述被染色的粗斜紋布含纖維素織物組織上的一塊白棉布的白度。L值較高意味著白布較白且逆染色度較低。
所述結(jié)果見表2。與NCE4相比，在每一反應(yīng)溫度下，NCE5都具有較高的磨蝕度和較低的逆染色度，因此該結(jié)果表明NCE5的逆染色度較低。
表2酶反應(yīng)溫度磨蝕度(ΔL)逆染色度(L)NCE5 65℃6.00 74.9955℃8.32 75.1045℃7.74 75.33NCE4 65℃5.88 74.5355℃7.29 74.1745℃6.30 74.56實(shí)施例8利用耐洗牢度試驗(yàn)儀評(píng)價(jià)由Humicola insolens表達(dá)的NCE5去除再生纖維素織物上的絨毛的作用按照下述方式評(píng)價(jià)實(shí)施例5中獲得的由Humicola insolens表達(dá)的NCE5從再生纖維素織物的一個(gè)典型例子，lyocell進(jìn)行上去除絨毛的活性。
在一個(gè)大洗衣機(jī)中與一種表面活性劑和橡膠球一起進(jìn)行洗滌，使得一塊被預(yù)先染色的lyocell針織布(由日本Toyoshima制造)的表面起毛。然后在下列條件下對(duì)這種起毛的lyocell針織布(由日本Toyoshima制造，10cm×10cm)進(jìn)行去除lyocell絨毛的處理從而計(jì)算出完全去除所形成的絨毛所需要的由Humicola insolens表達(dá)的NCE5的蛋白質(zhì)濃度。
試驗(yàn)機(jī)器滌衣機(jī)L-12(日本Daiei Kagaku Seiki MFG.)溫度55℃
時(shí)間60分鐘反應(yīng)溶液40ml反應(yīng)pH pH5(10mM醋酸鹽緩沖液)向處理溶液中加入適量的橡膠球和所述的內(nèi)切葡聚糖酶溶液。
結(jié)果表明通過加入蛋白質(zhì)濃度為6mg/L的酶完全去除了所述的絨毛。實(shí)施例9評(píng)價(jià)由Humicola insolens表達(dá)的NCE5當(dāng)被配制成洗滌劑時(shí)去除棉織品上的絨毛的作用按照下述方式評(píng)價(jià)實(shí)施例5中獲得的由Humicola insolens表達(dá)的NCE5去除棉織品上的絨毛的活性。即在一個(gè)大洗衣機(jī)中利用實(shí)施例5中制備的表達(dá)NCE5的Humicola insolens培養(yǎng)物上清液與一種表面活性劑和橡膠球一起進(jìn)行洗滌，使得一塊針織棉布(2cm×15cm)的表面起毛。然后在下列條件下進(jìn)行去除絨毛的處理。計(jì)算出完全去除所形成的絨毛所需要的蛋白質(zhì)濃度。
試驗(yàn)機(jī)器滌衣機(jī)L-12(日本Daiei Kagaku Seiki MFG.)溫度40℃時(shí)間120分鐘反應(yīng)溶液40ml反應(yīng)pH pH9.3(5mM碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)(非離子表面活性劑)Persoft NK-100(由Nippon Oil & Fats制造)0.20g/L(陰離子表面活性劑)LAS(由Wako Pure Chemical Industries制造)0.10g/L向處理溶液中加入適量的橡膠球和所述的內(nèi)切葡聚糖酶溶液。
結(jié)果表明通過加入蛋白質(zhì)濃度為45mg/L的酶完全去除了所述的絨毛并使得布的顏色能夠變得澄明。
另外，還按照J(rèn)IS L1096的45°懸臂式方法測(cè)定了棉針織物的抗彎曲性。結(jié)果表明如果不加入所述的酶處理，被測(cè)試的針織棉布片的遷移長(zhǎng)度為127mm，如果加入15mg/L(蛋白質(zhì)濃度)的NCE5進(jìn)行處理，被測(cè)試的針織棉布片的遷移長(zhǎng)度為81mm，顯然它被軟化了。實(shí)施例10評(píng)價(jià)由Humicola insolens表達(dá)的NCE5提高紙漿的打漿度的效果將蛋白質(zhì)量為60μg的表達(dá)NCE5的Humicola insolens培養(yǎng)液加到6g干重的來(lái)源于寬葉樹的未漂白牛皮紙漿中，然后在50℃下于270ml的50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中反應(yīng)1小時(shí)。通過將所述混合物煮沸10分鐘使得所述酶失活，然后按照J(rèn)IS P-8121測(cè)定打漿度(CSF)。
結(jié)果見表3。
表3樣品 CSF(ml)未加入酶試驗(yàn)區(qū) 492表達(dá)NCE5的Humicola insolens培養(yǎng)液 519本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容被引入本申請(qǐng)的說(shuō)明書中作為參考。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶NCE5可被用于洗滌劑組合物中而且還可用于使廢紙脫墨、提高紙漿的打漿度和改善含纖維素織物的性能，如絨毛的去除、手感及外觀的改善、使顏色澄明、顏色的局部改變和硬挺度的降低。
序列表<110>Meiji Seika Kaisha，Ltd.<120>含內(nèi)切葡聚糖酶NCE5的纖維素酶制劑<130>PH-1228-PCT<160>12<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>223<212>PRT<213>Humicola insolens<400>1Met Gln Leu Pro Leu Thr Thr Leu Leu Thr Leu Leu Pro Ala Leu Ala1 5 10 15Ala Ala Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys20 25 30Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr35 40 45Cys Asp Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser50 55 60Gly Cys Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro65 70 75 80Trp Ala Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile85 90 95Ala Gly Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr100 105 110Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser115 120 125Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro130 135 140Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala145 150 155 160Pro Pro Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His165 170 175Glu Cys Asp Ala Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg180 185 190Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln195 200 205Val Ser Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg210 215 220<210>2<211>672<212>DNA<213>Humicola insolens<400>2atgcagctcc ccctgaccac gctcctcacc ctcctccccg ccctcgcggc ggcccagtcc 60ggcagcggcc gcaccacgcg ctactgggac tgctgcaagc cgtcgtgcgc gtggcccggc 120aagggcccgg cgcccgtgcg gacgtgcgac cggtgggaca acccgctgtt cgacggcggc 180aacacgcgca gcgggtgcga cgcgggcggc ggcgcctaca tgtgctcgga ccagagcccg 240tgggcggtca gcgacgacct ggcgtacggc tgggcggccg tcaacattgc cggctccaac 300gagaggcagt ggtgctgcgc ctgctacgag ctgaccttca ccagcgggcc ggtggcgggc 360aagaggatga ttgtgcaggc gagcaacacg ggaggcgatt tggggaacaa ccactttgat 420attgctatgc ccggcggtgg cgtcggtatc ttcaacgcct gcaccgacca gtacggcgcg 480ccccccaacg gctggggcca gcgctacggc ggcatcagcc aacgccacga gtgcgacgcc 540ttccccgaga agctcaagcc cggctgctac tggcgctttg actggttcct caacgccgac 600aacccgagcg tcaactggcg gcaggtcagc tgcccggccg agattgtggc caagagcggc 660tgctcgcgtt aa 672<210>3<211>20<212>PRT<213>Humicola insolens<400>3Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Serl 5 10 15Cys Ala Trp Pro20<210>4<211>8<212>PRT<213>Humicola insolens<400>4Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg1 5<210>5<211>6<212>PRT<213>Humicola insolens<400>5Tyr Trp Asp Cys Cys Lys1 5<210>6<211>12<212>PRT<213>Humicola insolens<400>6Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>Humicola insolens<400>7Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr1 5 10<210>8<211>15<212>PRT<213>Humicola insolens<400>8Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg1 5 10 15<210>9<211>20<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<400>9taytgggayt gytgyaarcc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<220><221>n<222>3<223>肌苷<220><221>n<222>9<223>肌苷<400>10tcngcrttna rraaccartc 20<210>11<211>38<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<400>11ggggatcctg ggacaagatg cagctccccc tgaccacg 38<210>12<211>38<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述合成DNA<400>12ggggatcctg catttaacgc gagcagccgc tcttggcc 38
權(quán)利要求
1.一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有部分SEQID NO1所示的氨基酸序列或從第19位至第223位的序列，或其一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的修飾蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或其一種修飾蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)在N-端側(cè)還含有SEQ ID NO1所示的從第1位至第18個(gè)位的氨基酸序列的一部分序列或全部序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的酶，其中該酶來(lái)源于霉菌。
4.如權(quán)利要求3所述的酶，其中所述霉菌屬于腐質(zhì)霉屬。
5.如權(quán)利要求4所述的酶，其中所述霉菌屬于Humicolainsolens。
6.一種含有編碼權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)或酶的DNA序列的DNA組分。
7.一種含有SEQ ID NO2所示DNA序列或其修飾序列的DNA組分。
8.一種含有如權(quán)利要求6或7所述的DNA序列的表達(dá)載體。
9.一種被權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是一種酵母菌或霉菌。
11.如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中所述酵母菌屬于糖酵母屬、漢遜氏酵母屬或畢赤氏酵母屬。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中所述酵母菌是啤酒糖酵母。
13.如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中所述霉菌屬于腐質(zhì)霉屬、曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬或支頂孢屬。
14.如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中所述霉菌是Humicolainsolens、黑曲霉或米曲霉、綠色木霉、尖孢鐮孢或纖維素溶解支頂孢。
15.一種制備如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶的方法，包括以下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的宿主細(xì)胞，然后從所述宿主細(xì)胞和/或其培養(yǎng)混合物中收集如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的酶、蛋白質(zhì)或其修飾蛋白質(zhì)。
16.一種通過權(quán)利要求5所述方法制備的內(nèi)切葡聚糖酶。
17.一種纖維素酶制劑，其含有如權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)質(zhì)或酶。
18.一種處理含纖維素織物的方法，其包括一個(gè)使得所述含纖維素織物與權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶接觸或與權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑接觸的步驟。
19.一種降低含纖維素織物的起毛率或減少含纖維素織物中產(chǎn)生絨毛的方法，其包括一個(gè)使得所述含纖維素織物與權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶接觸或與權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑接觸的步驟。
20.一種對(duì)含纖維素織物進(jìn)行失重處理從而改進(jìn)其手感和外觀的方法，其包括一個(gè)使得所述含纖維素織物與權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶接觸或與權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑接觸的步驟。
21.一種使有色的含纖維素織物的顏色澄明的方法，其包括一個(gè)采用權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求和權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑對(duì)有色的含纖維素織物進(jìn)行處理的步驟。
22.一種使有色的含纖維素織物發(fā)生局部顏色改變的方法，其包括一個(gè)采用權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑對(duì)有色的含纖維素織物進(jìn)行處理的步驟。
23.一種降低含纖維素織物變得硬挺的速率或降低含纖維素織物硬挺度的方法，其包括一個(gè)采用權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑對(duì)含纖維素織物進(jìn)行處理的步驟。
24.如權(quán)利要求18至23中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過浸泡、洗滌和漂洗織物來(lái)對(duì)織物進(jìn)行處理。
25.一種洗滌劑添加劑，其含有以一種非散射顆粒形式或一種穩(wěn)定化液體形式存在的權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑。
26.一種洗滌劑組合物，其含有權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑。
27.一種用于廢紙脫墨的方法，該方法包括在一個(gè)通過采用脫墨劑處理廢紙來(lái)進(jìn)行脫墨的步驟中使用權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑。
28.一種提高紙漿的打漿度的方法，該方法包括一個(gè)采用權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑處理紙漿的步驟。
29.一種改善對(duì)動(dòng)物飼料的消化能力的方法，該方法包括一個(gè)采用權(quán)利要求1至5和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)、其修飾蛋白質(zhì)或酶或權(quán)利要求17所述的纖維素酶制劑對(duì)含纖維素纖維進(jìn)行處理的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種內(nèi)切葡聚糖酶，該酶可用于減少含纖維素纖維的絨毛、改善其手感和外觀、使顏色澄明、局部改變顏色、降低硬挺度并可用于洗滌劑組合物中，還可用于使廢紙脫墨和提高紙漿的打漿度等。從Humicola insolens中克隆了一種編碼內(nèi)切葡聚糖酶NCE5的cDNA并測(cè)定了其DNA序列和由該DNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列。
文檔編號(hào)D21C9/00GK1436243SQ01811284
公開日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2001年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月22日
發(fā)明者村島弘一郎, 中根公隆, 西村智子, 古賀仁一郎, 河野敏明, 隅田奈緒美, 矢內(nèi)耕二, 村上健 申請(qǐng)人:明治制果株式會(huì)社