專利名稱：嗜堿芽孢桿菌物種α-淀粉酶變體、包括α-淀粉酶變體的組合物以及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文公開了芽孢桿菌屬物種CB""7/"s平)707的a-淀粉酶及其變體， 以及所述a-淀粉酶及其變體的組合物和用途。
背景技術(shù)：
淀粉由直鏈淀粉(15-30% w/w)和支鏈淀粉(70-85。A w/w)的混合物組 成。直鏈淀粉由分子量(MW)約60,000至約800，000的a-l，4-連接的葡萄糖 單元的線性鏈組成。支鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有一個a-l，6分支 點的分支聚合物；其MW可高達1億。
目前，通過酶催化的工藝自淀粉生產(chǎn)濃縮的葡萄糖漿形式的糖，該工 藝包括(l)用a-淀粉酶將固態(tài)淀粉液化(或降低粘度)為平均聚合度約7-10 的糊精，和(2)用淀粉葡萄糖苷酶(也稱作葡糖淀粉酶或GA)將所得的液化 淀粉(即淀粉水解產(chǎn)物)糖化。所得的漿液具有高葡萄糖含量。多數(shù)商品化生產(chǎn)的葡萄糖漿隨后被酶促異構(gòu)化為稱作異糖漿(isosyr叩)的葡萄糖/果糖 混合物。
a-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通過隨機切割內(nèi)部的a-l-4-糖苷鍵而水解淀粉、 糖原和相關(guān)的多糖。此類酶在諸如淀粉液化、紡織品退漿、紙和紙漿業(yè)中 的淀粉改性以及釀造中具有多種重要的商業(yè)應(yīng)用。這些酶也可以用于在餐 具洗滌和衣物洗滌期間去除含淀粉的污漬，并用于糖業(yè)、釀造業(yè)、酒業(yè)和 紡織品工業(yè)。a-淀粉酶分離自多種細菌、真菌、植物和動物源。工業(yè)上， 許多重要的a-淀粉酶分離自芽孢桿菌屬(j^c////)。
一種已祐束征的a-淀粉酶為嗜堿芽孢桿菌物種707的a-淀粉酶。芽孢 桿菌屬物種707主要生產(chǎn)五類呈現(xiàn)淀粉水解活性的酶。其分子量據(jù)估算為 大約110、 95、 85、 75和60 kDa。 A. Tsukamoto等人，"Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic i fl"'〃附 sp. #707 and structural similarity to liquefying type a-amylase，" 5/oc/re附. & O 附附.151(1): 25-31 (1988)。所鑒定的a-淀粉酶長度為518
個氬基酸，估算分子量為59,007.5道爾頓。Tsukamoto等人(l988)。頭33 個氨基酸為信號肽，參與該輸出蛋白質(zhì)的分泌。因此，胞外形式將具有485 個氛基酸，估算分子量為55,372道爾頓。編碼該酶的核酸如K. Kimura 等人，"Cloning of a gene for maltohexaose producing amylase of an alkalophilic j 鎖7/附and hyper-production of the enzyme in 5鎖7/ms1 sw&,7/y cells,"」尸/;/: Af/c/^A/o/. AV^cAwo/. 27: 372-377 (1988)中所討論的那 樣進行了克隆和表征。該a-淀粉酶為G6淀粉酶或產(chǎn)麥芽六糖淀粉酶(E.C. 3.2.1.98)，且屬于糖苷水解酶家族13。來自芽孢桿菌屬物種707的a-淀粉 酶的氨基酸序列與來自解淀粉芽孢桿菌(5 "7/附 "附j(luò)^"々we/ac/e附)(BAA)、地衣芽孢桿菌CB"c,7/"s //cAw/onw/s)(BLA)和嗜 熱脂肪芽孢桿菌(5"d//ws stefl/y)^w附o/;/^/附)的液化a-淀粉酶分別具有 65.5%、 65.9%和66.3%的同一性。R. K謹i等人，"Biochemical and crystallographic analyses of maltohexaose-producing amylase from alkalophilic 5ac/〃ws sp. 707,"祝oc/^附/Wo7 43: 14047-14056 (2004)。因此，芽孢桿菌屬物種707的G6-淀粉酶據(jù)推定與G4-淀粉酶在結(jié)構(gòu)上有所不 同。R. Kanai等人(2004)。
因此，需要芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶的變體，其具有增強的特性 和/或生產(chǎn)率。增加產(chǎn)量將會降低成本、提高利潤率、節(jié)省工廠生產(chǎn)能力及 產(chǎn)生更高活性的產(chǎn)品等。另外，增加比活同樣能夠由于例如需要更少的酶 而提高利潤率。
發(fā)明概述
因此，本文提供了組合物和使用所述組合物的方法，以及具有改進特 性a-淀粉酶在所述組合物和方法中使用的用途。
例如， 一方面考慮手工或自動餐具洗滌組合物，其包括芽孢桿菌屬物 種707 (x-淀粉酶或其變體，和表面活性劑、洗滌劑助劑、#劑、聚合物、 漂白體系、穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、抗污垢再沉積 劑、染料、殺細菌劑、助水溶物、晦暗抑制劑和香料中的一種或多種。餐 具洗涂組合物可以是用于手工或自動餐具洗滌的組合物。
另一方面考慮包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的洗衣洗滌 劑添加劑。
另一方面考慮洗衣洗滌劑，其包括上文所述的洗滌劑添加劑，并且還 包括下述之一種或多種表面活性劑、洗滌劑助劑、*劑、聚合物、漂 白體系、穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、抗污垢再沉積劑、 染料、殺細菌劑、助水溶物、熒光增白劑、織物調(diào)理劑和香料。
而另一方面考慮編碼芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的分離的 核酸，其中所述變體具有選自SEQIDNO: 3的M202、 M208、 S255、 R172 和/或M261的取代的殘基取代或缺失。M202變體可以是選自M202L、 M202V、 M202S、 M202T、 M202I、 M202Q和M202W的取代變體。S255 變體可以是S255N取代。R172取代可以是R172Q。也考慮具有這些取代 的組合的變體。也考慮在多肽序列中具有這些取代的a-淀粉酶多肽(有或沒 有信號序列)。
ii另一方面考慮含有編碼任何前述變體的核酸的載體。也考慮其中(例如 借助于載體)插入了所述核酸的分離的細胞。所述分離的宿主細胞可以是孩吏
生物，例如細菌或真菌。細菌可以是選自枯草芽孢桿菌(必""7/船5"&//&)、 地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(及/ew似s)、短芽孢桿菌(及6"Ws)、嗜熱脂
肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(及"汰"/<7/ / //"勾、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢
桿菌CB. o "g"/"/w)、環(huán)狀芽孢桿菌(必."7tm/"ws)、杣爛芽孢桿菌(及/fl","力、 蘇云金芽孢桿菌(及,/r"r!'"g/e"5^)、 變鉛青鏈霉菌(5yre/7似附y(tǒng)ces //vzV/""s)或 鼠灰鏈霉菌(51. w"W"附)的革蘭氏陽性菌；或革蘭氏陰性菌，其中所述革蘭 氏陰性菌為大腸桿菌(jE^c/^r/c/^fl co/Z)或假單胞菌屬CP^"^/m Wfls)物種。
另 一方面考慮本文所述多肽在衣物洗涂和/或餐具洗滌中的用途。這些 多肽變體可任選地為無粉塵顆粒、孩W立、穩(wěn)定的液體或受保護的酶的形式。 另 一方面考慮所述洗滌劑添加劑或洗滌劑組合物還包括酶，所述酶選自 纖維素酶、蛋白酶、?；D(zhuǎn)移酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧 化氫酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、 a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、oi-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、 卣代過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 氧化酶、果膠裂解(pectinolytic)酶、肽^J^氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、 過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰 胺酶、木聚糖酶、普魯蘭酶(pullulanase)、異淀粉酶、角叉菜聚糖酶 (carrageenase)或這些酶的任意組合。考慮用在組合物中的其他淀粉酶包括 兩種或多種其他a-淀粉酶、(3-淀粉酶、異淀粉酶或葡糖淀粉酶。
還考慮利用任何上迷組合物清潔紡織品和餐具或其他硬表面的方法。
另一方面考慮本文所述的a-淀粉酶或任何a-淀粉酶變體在紡織品退 漿組合物中的用途，其中所述組合物為水性溶液。也考慮利用所述組合物 使紡織品退漿的方法。
又一方面考慮用于淀粉加工的組合物，包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀 粉酶或其變體的水性溶液。也考慮利用這樣組合物加工淀粉的方法。所述 方法和組合物可以進一步包含葡糖淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶、植酸酶或其組合。而另一方面考慮生物膜水解組合物，包括在溶液或凝膠中的芽
孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體，且任選地還包括.纖維素酶、半纖維 素酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果膠酶、抗孩i生物劑或其任意組合。 也考慮利用所述組合物水解生物膜的方法。
另 一方面考慮用于糖化淀粉的組合物，包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀 粉酶或其變體的溶液。因此，也考慮糖化淀粉的方法，包括施用權(quán)利要求 33的組合物至足以糖化所述淀粉的一段時間。
另一方面考慮用于液化淀粉的組合物，包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀 粉酶或其變體的溶液。因此，也考慮液化淀粉的方法，包括施用所述組合 物至足以液化所述淀粉的一段時間。
而又一方面，考慮利用芽孢桿菌屬物種707 (x-淀粉酶或其變體的溶液 或凝膠的烘焙組合物。也考慮利用這樣的烘焙組合物進行烘焙的方法。
附圖簡述
附圖并入本說明書中并構(gòu)成其一部分，用于舉例說明實施方案。附圖
是所公開實施方案的舉例說明。


圖1. 在pH 8.0時比較Stainzyme (▲)、 OxAm (國)(Purastar⑧)和芽 孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶(口)的稻樣片測定。
圖2. 在pH 10.1時比較Stainzyme (粉色園)、OxAm (A)(Purastar⑥) 和芽孢桿菌屬物種707 ot-淀粉酶(橙色—的稻樣片測定。
圖3.圖3A顯示了編碼Pre-LAT信號肽的DNA序列(SEQIDNO: 1)。 圖3B顯示了天然芽孢桿菌屬物種707的a-淀粉酶基因(SEQ ID NO: 2)。
圖4. pICatH質(zhì)粒圖。
圖5.含Amy707基因序列的pICatH質(zhì)粒圖。
圖6.顯示了 Terg-o-tometer測定的結(jié)果。在芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶(O.l ppm)或Stainzyme (0.1 ppm)的存在下，試驗了包括活性Tide (Tide Active)(1.8 g/L)、滅活Tide (Tide Inactivated)(1.8 g/L)或AATCC (1.5 g/L)的洗滌劑組合物。在一些樣品中，還存在Purafect Prime (0.5 ppm)。測定在5 mM HEPES緩沖液中于74°F pH 7.5進行，7jc硬度為6 gpg (每加 侖的格令數(shù))。所試驗的樣片為著色的淀粉棉(EMPA161， 13-02)。 SRI百分 數(shù)(。/。SRI)代表去污指數(shù)百分數(shù)或清潔過程中去除的污漬的百分數(shù)。去污通 過測量未經(jīng)污染的樣片、徹底污染的樣片、以及已經(jīng)給予過一定清潔處理 的污染樣片來計算。利用CIEI^aA[^色空間通過反射計進行測量。通過清 潔和污染樣片之間的色差除以未經(jīng)污染和污染樣片之間的色差，取比值， 來計算。/。SRI。 "dE"代表CIE 1^*3*1)*色空間中各顏色組分色差平方之和的
平方根。每一種可察覺的顏色都能夠由色空間中的1^3* 3*坐標所表示。
"L"，表示標度0到100從純黑到純白的明度或灰階值，"3*，，表示紅色向綠 色的轉(zhuǎn)變，其中大的正值表示特別紅的色調(diào)，而大的負值表示特別綠的色 調(diào)。"W表示黃色向藍色的轉(zhuǎn)變，其中大的正值表示特別黃的色調(diào)，而 大的負值表示特別藍的色調(diào)。當(dāng)3*和1)*值均為0時，則沒有顏色，留下 其明度為1^值所定義的純灰色。所試驗的樣片為CS-2 (072，帶可可污漬)、 CS-37 (005，帶全卵污漬)或著色的淀粉棉(EMPA161,13-02)。
圖7. Lauder-o-meter測定結(jié)果，用5 g/L IEC A夫在40°F進行，漂白， 并且水石級為12 gpg。芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶和Stainzyme⑧以0.1 ppm的量存在。在5種不同的污漬樣片上對組合物進行了試驗。
圖8.顯示了芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶、Stainzyme⑧和OxAm (Purastar⑧)在歐洲條件下的自動餐具洗滌性能。去除米乳(rice milk)的洗 滌性能測量為與mg活性蛋白質(zhì)相比較的去污能力。
圖9.顯示了芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶、Stainzyme⑧和OxAm (Purastar⑧)在歐洲條件下的自動餐具洗滌性能。去除混合淀粉的洗滌性能 測量為與mg活性蛋白質(zhì)相比較的去污能力。
圖10.在有或無漂白的情況下在20。C對芽孢桿菌屬物種707a-淀粉酶 的M202—L (M202L)變體進行了測定。該清潔測定的吸光度在488 nm用 漸增量的酶進行測量(測量為每百萬份的份數(shù)，ppm)。將M202L變體與芽 孢桿菌屬物種707的野生型a-淀粉酶進行了比較。發(fā)明詳述
如下涉及化合物、組合物、制備所述化合物的方法，以及使用所述化
合物和組合物的方法，其中所述化合物為芽孢桿菌屬物種707的a-淀粉酶 或其變體。尋求在例如洗衣和餐具洗滌試驗中具有高性能的芽孢桿菌屬物 種707 a-淀粉酶形式及其變體。
芽孢桿菌屬物種707的a-淀粉酶具有8.8的最適pH，且在廣的pH范 圍內(nèi)(即pH4，7-10.8)穩(wěn)定。該多肽具有45。C的最適溫度。該酶在較低溫度 例如15-20。C時有活性。該酶在超過55。C的溫度孵育30分鐘后，保留不到 20%的其活性。
1.縮寫和定義
才艮據(jù)此發(fā)明詳述，應(yīng)用下面的縮寫和定義。必須注意，如本文所^_用， 除非上下文另有明確指明，否則單數(shù)形式"一"、"一個"和"該"涵蓋對復(fù)數(shù) 形式的提及。因此，例如，提及"一種酶"包括多種此類酶，而提及"該制劑" 包括一種或多種制劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同制劑，等等。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員通常所理解的含義。下面提供如下的術(shù)語。
1.1定義
術(shù)語"淀粉酶，，旨在包括任何淀粉酶，例如葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、(5-淀粉酶和芽孢桿菌屬物種如地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的野生型a-淀 粉酶。"淀粉酶"應(yīng)指這樣的酶，其能夠催化淀粉的降解等。淀粉酶是切割 淀粉中a-D-(1—4) O-糖苷鍵的水解酶。通常，將a-淀粉酶(EC 3.2.1.1; a-D-(l—4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定義為以隨機方式切割淀粉分子內(nèi) a-D-(l—4) O-糖苷鍵的內(nèi)切酶。與此相反，外切淀粉水解酶如P-淀粉酶(EC 3.2.1.2; a-D-(l—4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如產(chǎn)麥 芽糖(maltogenic) a-淀粉酶(EC 3.2.1.133)從底物的非還原末端切割淀粉分 子。卩-淀粉酶、a-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20; a-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3; a-D-(l—4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及產(chǎn)物特異性淀粉 酶可以從淀粉產(chǎn)生特定長度的低聚麥芽糖。
"芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶，，是來源于芽孢桿菌屬物種707的a-淀 粉酶。編碼該a-淀粉酶的基因可以是野生型基因，或編碼該a-淀粉酶的密 碼子優(yōu)化的多核苷酸。"芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶變體"表示野生型芽 孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶的變體，其包括芽孢桿菌屬物種707親本多肽 序列的序列取代、添加或缺失。芽孢桿菌屬物種707的成熟a-淀粉酶為(氨 基至JtJ^取向)(SEQ ID NO: 3):
hhngtngtmm qyfewylpnci grihwnrlnsd asnlkskgit avwippawkg 50
asqndvgyga ydlycilgefn qkgtvrtkyg trsqlqaavt slknngiqvy 10 0
gdvvmnhkgg adatemvrav evnpnnrnqe vtgeytieaw trfdfpgrgn 150
thssfkwrwy hfdgvdwdqs rrlnnriykf rghgkawdwe vdtengnydy 200
lmyadidmcih pevvnelrnw gvwytntlgl dgfridavkh ikysftrdwi 25〇
nhvrsatgkn mfavaefwkn dlgaienylq ktnvmhsvfd vp丄hynlyna 300
sksggny加r nifngtvvqr hpshavtfvd nhdsqpeeal esfveewfkp 350
layaltItre qgypsvfygd yygipthgvp amrskidpil earqkyaygk 4〇0
qndyldhhni igwtregnta hpnsglatim sclgaggskwm fvgrnkagqv 4 50
wsditgnrtg tvtinadgwg nfsvnggsvs iwvnk 4 85
如本文所使用，"親本酶"和"親本多肽"應(yīng)指芽孢桿菌屬物種707的多 肽。"親本核酸"表示編碼所述親本多肽的核酸序列。該芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶還可以在親本多肽的信號序列中或該a-淀粉酶親本多肽的別處包 括突變。因此，芽孢桿菌屬物種707a-淀粉酶可以為含有異源a-淀粉酶多 肽的融合蛋白質(zhì)的形式。它還可以包括嵌合體(即至少兩種a-淀粉酶的組 合)。例如，芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶可以包含來自另一 a-淀粉酶的信 號肽，例如地衣芽孢桿菌(LAT)。參見例如圖3A,其顯示了 LAT信號肽 的編碼序列。也考慮用不止一個氨基酸取代第一個丙氨酸(除纈氨酸之外的 任何取代)，例如一個、兩個或多個蘇氨酸。術(shù)語"變體"可與術(shù)語"突變體" 互換使用。變體應(yīng)包括編碼對芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶的另外的取代、 顛換、插入和缺失的多肽以及核酸。變體可以包括與能夠同本文所示核苷 酸序列雜交的序列相互補的序列。例如，變體核酸序列與能夠在嚴緊條件(例如50。C和0.2 xSSC{lxSSC = 0.15 MNaCl， 0.015 M檸檬酸三鈉，pH 7.0})下同本文所示核苷酸序列雜交的序列互補。術(shù)語變體核酸序列涵蓋與 能夠在高嚴緊條件(例如65。C和0.1 xSSC {1 xSSC = 0.15 M NaCl， 0.015 M檸檬酸三鈉，pH 7.0})下同本文所示核苷#列雜交的序列相互補的序列。
如本文所使用的術(shù)語"回收的"、"分離的"和"分開的"指化合物、蛋白 質(zhì)、細胞、核酸或氨基酸從與之天然相伴且天然存在的至少一種組分中移 開。
"純化的，，指物質(zhì)處于相對純的狀態(tài)，例如至少約卯％純的，或至少約 95%純的，或至少約98%純的。
"熱穩(wěn)定的，，指酶在暴露于升高的溫度后保留活性的能力。以酶的半衰
期來衡量酶(如(X-淀粉酶)的熱穩(wěn)定性。半衰期(ti/2)是在規(guī)定的條件下喪失
一半酶活性的時間(以分鐘、小時或天計)。通過測量殘留a-淀粉酶活性來 計算半衰期值。
"pH范圍"指酶在酸性到堿性^H中(跨越5個或更多個pH單位)下呈現(xiàn) 催化活性的能力。
如本文所使用，"pH穩(wěn)定的"指酶在預(yù)定的時間階段(例如，15分鐘、 30分鐘、1小時)內(nèi)在廣的pH范圍內(nèi)保留活性的能力。
如本文所使用，"氨基,列"與術(shù)語"多肽"和/或術(shù)語"蛋白質(zhì)"同義。 一些情況下，術(shù)語"氨基酸序列，，與術(shù)語"肽"同義。 一些情況下，術(shù)語"M 酸序列，，與術(shù)語"酶"同義。本文使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母代 碼。
術(shù)語"核酸，，包括單鏈或雙鏈的DNA、 RNA及其化學(xué)修飾。術(shù)語"核酸" 和"多核苷酸"在本文可互換使用。
如本文所使用，"核苷酸序列"或"核酸序列"指編碼芽孢桿菌屬物種 707 a-淀粉酶多肽或其變體的寡核苷^列或多核苷^列，及其片段和 衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因組的或合成的或重組的來源， 并且可以是雙鏈或單鏈(代表正義或反義鏈)。如本文所使用，術(shù)語核苷酸序列包括基因組DNA、 cDNA、合成的DNA和RNA。例如，DNA可以是 編碼芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的cDNA序列。由于遺傳密碼 是簡并的，可利用一種以上的密碼子編碼一種特定的氛基酸，故本發(fā)明涵 蓋編碼特定M酸序列的多種核苷酸序列。
"同源物"應(yīng)指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有 一定程度同一 性的實體。同源序列旨在包括與主題序列具有至少75%、80%、85%或卯％ 同一性、或至少95%、 96%、 97%、 98%或99%同一性的氨基#列。通 常，同源物將包括與主題M^列相同的活性位點。
如本文所使用，"雜交，，應(yīng)包括核酸鏈通過堿基配對與互補鏈結(jié)合的過 程，以及在聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)中進行的擴增過程。a-淀粉酶或其 變體核酸可以以單鏈或雙鏈DNA或RNA、 RNA/DNA異源雙鏈體或 RNA/DNA共聚物的形式存在。
如本文所使用，"合成的"應(yīng)指通過體外化學(xué)或S^1合成而產(chǎn)生的。其 包括，但不限于，制備的對于宿主生物如甲基營養(yǎng)酵母畢赤酵母屬(戶/d^")、 漢遜酵母屬(好aw^"w/")、鏈霉菌屬(A"/7to附y(tǒng)ce力、木霉屬(7Wc/io&r附")(例
如里氏木霉(r. "e^/))或其他表達宿主而言具有最佳密碼子使用的芽孢桿
菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的編碼核酸。
"7JC硬度"指用于洗滌目的的水中鈣和鎂的量(1.4-1.8 mmol/L)，以及用 于餐具洗滌目的的量。
如本文所使用，術(shù)語"轉(zhuǎn)化的"、"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的"和"轉(zhuǎn)基因的"用于述及 細胞時，表示細胞具有整合到其基因組中的或作為染色體外質(zhì)粒在多個世 代中維持的非天然(例如異源)核酸序列。
在向細胞中插入核酸序列的上下文中，術(shù)語"引入的"指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn) 化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括向真核或原核細胞中摻入核酸序列，其中核酸序列 可以摻入到細胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn) 換為自主復(fù)制子，或瞬時表達(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
如本文所使用，"轉(zhuǎn)化的細胞"應(yīng)包括通過重組DNA技術(shù)的應(yīng)用而已 被遺傳改變的細胞。轉(zhuǎn)化通常通過向細胞中插入一種或多種核苷酸序列而發(fā)生。插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列(即，對于待轉(zhuǎn)化的細胞而
言并非天然的序列，例如編碼融合蛋白質(zhì)或非天然序列的DNA序列)。
如本文所使用，"有效連接的"應(yīng)指所述及的組分之間的關(guān)系允許它們 以它們期望的方式發(fā)揮功能。與編碼序列有效連接的調(diào)控序列如此連接， 從而所述編碼序列能夠在與該控制序列相容的條件下獲得表達。
如本文所使用，"生物活性的，，應(yīng)指與天然存在序列具有相似的結(jié)構(gòu)功 能(但不必是相同的程度)和/或相似的調(diào)控功能(但不必是相同的程度)和/或 相似的生化功能(但不必是相同的程度)的序列。
"宿主菌林"或"宿主細胞"指對含有多核苷酸的表達載體或DNA構(gòu)建 體適宜的宿主，所述多核苷酸編碼根據(jù)本公開內(nèi)容的變體a-淀粉酶。尤其 是，宿主菌林優(yōu)選為細菌細胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，"宿主細胞，， 既指微生物菌林特別是芽孢桿菌屬物種的細胞，又指由所述細胞建立的原 生質(zhì)體。
術(shù)語"選擇標記，，指能夠在宿主中表達、允許輕松選擇含有所引入的核 酸或載體的那些宿主的基因。選擇標記的實例包括但不限于抗微生物劑(例 如潮霉素、博來霉素或氯霉素)，和/或賦予代謝優(yōu)勢(例如賦予宿主細胞營 養(yǎng)優(yōu)勢)的基因。
術(shù)語"培養(yǎng)"是指使微生物細胞群在適宜條件下在液體或固體培養(yǎng)基中 生長。在一個實施方案中，培養(yǎng)是指含有顆粒狀淀粉的淀粉底物發(fā)酵型生 物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物(通常是在容器或反應(yīng)器中)。發(fā)酵是微生物對有機物質(zhì)的 酶促和厭氧降解，以產(chǎn)生更簡單的有機化合物。雖然發(fā)酵在厭氧條件下發(fā) 生，但該術(shù)語并非旨在完全局限于嚴格的厭氧條件，因為發(fā)酵也可以在氧 的存在下發(fā)生。
"基因，，指參與產(chǎn)生多肽的DNA區(qū)段，并且包括位于編碼區(qū)之前和之 后的區(qū)域，以及位于個體編碼區(qū)段(外顯子)之間的居間序列(內(nèi)含子)。
"載體，，指設(shè)計用以將核酸引入到一種或多種細胞類型中的多核苷^f 列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、表達 盒等等。如本文所使用的"表達載體"表示含有有效連接于適宜控制序列的
DNA序列的DNA構(gòu)建體，所述控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA在適宜宿主中的表達。此類控制序列可以包括為實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、為控制轉(zhuǎn)錄的任選的操縱基因序列、編碼mRNA上的適宜核糖體結(jié)合位點的序列、增強子、以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。
"啟動子，，是參與結(jié)合RNA聚合酶以起始基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。本發(fā)明使用的優(yōu)選啟動子是地衣芽孢桿菌a-淀粉酶(AmyL)。
術(shù)語"有效連接的，，指元件的排列使之在功能上相關(guān)的毗鄰關(guān)系。因此，如本文所使用的，"有效連接的，，表示所述組分處于允許他們以其期望方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。例如，與編碼序列有效連接的調(diào)控序列如此連接，從而在與控制序列相容的條件下獲得編碼序列的表達。
"處于轉(zhuǎn)錄控制之下"是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語，表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的轉(zhuǎn)錄有賴于其與有助于轉(zhuǎn)錄起始或促進轉(zhuǎn)錄的元件的有效連接。
"處于翻譯控制之下"是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語，表示發(fā)生在mRNA已經(jīng)形成之后的調(diào)控過程。
"信號序列"表示結(jié)合在蛋白質(zhì)N-末端部分的氨基酸序列，其有助于成熟形式的蛋白質(zhì)分泌到細胞外側(cè)。信號序列的該定義為功能性定義。成熟形式的胞外蛋白質(zhì)缺乏信號序列，后者在分泌過程中被切割掉。
如本文所使用的，當(dāng)述及蛋白質(zhì)和編碼他們的基因時，用于基因的術(shù)語以斜體表示(例如，編碼amyL (地衣芽孢桿菌AA)的基因可以表示為
fl附j(luò)l)。用于蛋白質(zhì)的術(shù)語一般不以斜體表示，且首字母一般大寫(例如，fl附j(luò)l基因所編碼的蛋白質(zhì)可以表示為AmyL或amyL)。與此類似，本文提供的來自芽孢桿菌屬物種707菌株的淀粉酶基因和蛋白質(zhì)分別是柳,7和Amy707。
就多核苷酸或蛋白質(zhì)而言的術(shù)語"異源的，，指多核苷酸或蛋白質(zhì)并非天然存在于宿主細胞中。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)為具有商業(yè)重要性的工業(yè)蛋白質(zhì)。該術(shù)語旨在涵蓋由天然存在的基因、突變的基因和/或合成的基 因所編碼的蛋白質(zhì)。
就多核苷酸或蛋白質(zhì)而言的術(shù)語"內(nèi)源的"指多核苷酸或蛋白質(zhì)天然存 在于宿主細胞之中。
如本文所使用的，術(shù)語"表達"指基于基因的核 列產(chǎn)生多肽的過程。 該過程既包括轉(zhuǎn)錄又包括翻譯。
如本文所使用的，術(shù)語"比活"表示酶單位，定義為由酶制品在特定條
件下在單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)。比活表達為單位(U)/mg蛋白 質(zhì)。
"ATCC，，指位于馬納薩斯，Va. 20108的美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC)。
"NRRL，，指美國農(nóng)業(yè)研究服務(wù)培養(yǎng)物保藏中心，美國國家農(nóng)業(yè)利用研 究中心(而以前稱為USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoria, 111。
如本文所使用的，術(shù)語"包含/含有"及其同根詞以其包羅在內(nèi)的意義使 用；也就是說，等同于術(shù)語"包括"及其相應(yīng)的同根詞。
1.2縮寫
除非另有說明，否則適用下面的縮寫
AE 醇乙氧基化物
AEO 醇乙氧基化物
AEOS 醇乙氧基琉酸鹽
AES 醇乙氧基琉酸鹽
AFAU 酸性真菌a-淀粉酶單位
AGU 葡糖淀粉酶活性單位
AOS a-烯烴磺酸鹽
AS 醇硫酸鹽
BAA 解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶BLA 地衣芽孢桿菌(或LAT)
BSA 牛血清白蛋白
cDNA 互補DNA
CMC 羧甲基纖維素
DNA 脫氧核糖核酸
DP3 具有3個亞單位的聚合度
DPn 具有n個亞單位的聚合度
DS 干固形物
DTMPA 二亞乙基三胺五乙酸
EC 酶學(xué)委員會
EDTA 乙二胺四乙酸
EO 環(huán)氧乙烷
F&HC 織物和家居護理
FAU 真菌淀粉酶單位
GA 葡糖淀粉酶
gpg 每加侖的格令數(shù)
HFCS 高果糖玉米糖漿
HFSS 高果糖淀粉，漿
IKW 德國身體護理及洗滌工業(yè)協(xié)會
(Industrieverband Koerperpflege-und Waschmittd e. V.)
IPTG 異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷
LAS 線性烷基M酸鹽
LOM Laimder-O-meter
LU Liquiphon單位
MW 分子量
MWU 改良的Wohlgemuth單位
NOBS 壬?；鵩tj^^^酸鹽
NT A 次氮基三乙酸PCR聚合酶鏈式反應(yīng)
PEG聚乙二醇
PVA聚乙烯醇
PVP聚乙烯吡咯烷酮
RNA核糖核酸
SAS仲烷基磺酸鹽
TAED四乙?；叶?br> TCA三氯乙酸
TSB胰蛋白胨大豆肉湯
UFC超濾濃縮(物)
w/v重量/體積
w/w重量/重量
wt野生型
1.3命名法
在本說明書和權(quán)利要求書中，使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母 代碼。為易于引述，本發(fā)明的a-淀粉酶變體通過使用如下命名法予以描述 原始氨基酸位置取代的氨基酸
例如，根據(jù)此命名法，242位上的絲氨酸被丙氨酸取代表示為
Ser242Ala或S242A
30位上的丙氨酸缺失表示為
Ala3(^或入30*或AA30
而插入額外的氨基酸殘基(例如賴氨酸)，則表示為 Ala30AlaLys或A30AK
連續(xù)一段氨基酸殘基(例如氨基酸殘基30-33)缺失，表示為(30-33)*或 A(A30-N33)或A30-33。兩個連續(xù)的氨基酸(例如氨基酸殘基R180-S181)缺 失，表示為ARS或A180-181。
在特定a-淀粉酶與其他a-淀粉酶相比含有"缺失"、且在這樣的位置上進行了插入的情況下，這表示為*36Asp或*36。表示在36位插入天冬氨酸。多重突變用加號分開，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S
表示30和34位的丙氨酸和谷氨酸分別被天冬酰胺和絲氨酸所取代的突變。
當(dāng)一個或多個可選的氨基酸殘基可插入在給定位置上時，其表示為A30N，E或者A30N或A30E
此外，當(dāng)本文鑒定了適于進行修飾的位置而未提出任何具體的修飾時，應(yīng)理解為可用任何氨基酸殘基取代處于該位置的氨基酸殘基。因此，例如，當(dāng)提及30位上的丙氨酸修飾卻未具體指定時，應(yīng)理解為該丙氨酸可以缺失或取代為任何其他氨基酸，即，如下任一
R， N， D， A， C, Q， E， G, H， I， L， K, M， F， P， S， T, W， Y， V。
此外，"A30X，，表示任一如下取代
A30R， A30N， A30D， A30C， A30Q， A30E， A30G， A30H， A30I, A30L，A30K， A30M， A30F， A30P， A30S， A30T， A30W， A30Y或A30 V;或簡寫為A30R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S,T，W，Y，V。如果用于編號的親本酶早已具有建議取代該位置的所討論氨基酸殘基，則使用如下命名法
"X30N，，或"X30N，V，，(例如在野生型中存在N或V中之一的情況下)因此，這表示其他相應(yīng)的親本酶30位被取代成"Asn"或"Val"。
1.4氨基酸殘基的特征
帶電荷氨基酸
Asp， Glu， Arg, Lys， His
帶負電荷氨基酸(帶最多負電荷的殘基列在第一位)Asp, Glu
帶正電荷氨基酸(帶最多正電荷的殘基列在第一位)
Arg， Lys， His
中性氨基酸
Gly， Ala, Val， Leu， lie, Phe， Tyr， Trp， Met， Cys， Asn， Gln， Ser， Thr，
Pro
疏水氨基酸殘基(最疏水的殘基列在最后) Gly, Ala, Val， Pro, Met, Leu， lie, Tyr， Phe， Trp， 親水氨基酸(最親水的殘基列在最后) Thr， Ser， Cys， Gln, Asn
1.5同源性(同一性)
多核苷酸或多肽與其他序列具有一定(例如80%、 83%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%)的序列同一性百分比，是指在比對時， 在兩序列的比較中，該百分比的威基或氨基酸殘基是相同的。這種比對以 及同源性或同 一性百分比可以利用任何本領(lǐng)域已知的適宜的軟件程序來確 定，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F, M. Ausubel等人(編輯)1987，增刊30， 7.7.18節(jié))中所描述的那些。優(yōu)選的程序 包括Vector NTI AdvanceTM 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)、 GCG Pileup程序、FASTA (Pearson等人(1988)7Vfir"，爿ow/. tASL4 85:2444-2448)和BLAST (BLAST Manual, Altschul等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf" Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda， Md.，和 Altschul等人，(1997) NAR 25:3389-3402)。另 一優(yōu)選的比對程序為ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA)，優(yōu)選寸吏用默i人參數(shù)。另一 種有用的序列軟件程序是TFASTA數(shù)據(jù)搜索程序，其可獲自6.0版序列軟 件包(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。
同源性可以確定為兩序列之間的同一性程度，表明第一序列自第二序 列的衍生。同源性可以適宜地通過本領(lǐng)域已知的計算機程序來確定，例如GCG程序包(如上文所述)中提供的GAP。因此，可利用GapGCGv8，使用默認的同一性計分矩陣和如下默認參數(shù)對于核酸序列比較，分別是空位創(chuàng)建罰分5.0和空位延伸罰分0.3;而對于蛋白質(zhì)序列比較，分別是空位創(chuàng)建罰分3.0和空位延伸罰分0丄GAP使用Needleman和Wunsch， (1970)，J. Mol. Biol. 48:443-453的方法進行比對和計算同一性。
Amy707 (SEQ ID NO: l)和例如另一 a-淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)比對可用來鑒定與Amy707具有高度同源性(例如80%、 85%、 90%、 95%、 97%或99%)的其他a-淀粉酶中的等同/相應(yīng)位置。獲得所述結(jié)構(gòu)比對的一種方法是利用來自GCG包的PileUp程序，使用默認值的空位罰分，即，空位創(chuàng)建罰分3.0，而空位延伸罰分0.1。其他結(jié)構(gòu)比對方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等人，(1987)， FEBS LETTERS 224， 149-155頁)和反向穿線(reverse threading) (Huber， T; Torda， AE， PROTEIN SCIENCE第7巻，第1期142-149頁(1998)。
1.6魁
可用于表征上述Amy707的寡核苷酸探針可適宜地基于所討論a-淀粉酶的全長或部分核苷酸或tt酸序列來制備。
測試雜交的適宜條件包括在5xSSC中預(yù)浸，并在40。C在20%甲酰胺、5xDenhardt溶液、50 mM磷酸鈉，pH 6.8和50 mg變性超聲破碎的小牛胸腺DNA的溶液中預(yù)雜交1小時，接著在補加100mMATP的相同溶液中在40。C雜交18小時，接著在2xSSC， 0.2% SDS中在40。C(低嚴緊度)洗滌濾膜3次，每次30分鐘，優(yōu)選在5(TC(中嚴緊度)，更優(yōu)選在65。C(高嚴緊度)，甚至更優(yōu)選在75。C(極高嚴緊度)。有關(guān)雜交方法的更多細節(jié)可見Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》第二版，冷泉港，1989。
在本上下文中，"來源于"不僅旨在指由所討論的生物林系產(chǎn)生或可由之產(chǎn)生的a-淀粉酶，而且指由分離自這樣的林系的DNA序列編碼、且在轉(zhuǎn)化了所述DNA序列的宿主生物中產(chǎn)生的a-淀粉酶。最后，該術(shù)語旨在指由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼、且具有所討論a-淀粉酶的識說 別特征的a-淀粉酶。該術(shù)語還旨在指親本a-淀粉酶可以是天然存在a-淀粉 酶的變體，即，由于天然存在a-淀粉酶中一個或多個氨基酸殘基的修飾(插 入、取代、缺失)而得到的變體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到，本發(fā)明涵蓋的序列也可以通過在嚴謹雜 交條件下與例示的a/wy707序歹'K例如，如圖3所示的SEQ ID NO:3)雜交 的能力來定義。當(dāng)單鏈形式的核酸能夠與另一核酸序列在適當(dāng)?shù)臏囟群腿?液離子強度條件下退火時，則該核酸可與另一核酸雜交。雜交和洗滌條件 在本領(lǐng)域眾所周知(參見例如Sambrook (1989)，見上，特別是第9和11 章)。在一些實施方案中，嚴謹條件相當(dāng)于65。C的Tm和O.lxSSC， 0.1% SDS。
1.7親本a-淀粉酶
根據(jù)本^Hf ，如上文所定義的任何Amy707 a-淀粉酶都可用作親本(即 骨架)a-淀粉酶。在優(yōu)選的實施方案中，親本a-淀粉酶來源于芽孢桿菌屬 物種707菌林，例如上文述及的那些之一，例如具有SEQIDNO: 1 (見圖 1)所示^J^酸序列的707 a-淀粉酶。
1.8改變的特性
如下章節(jié)描述了本文所述變體中存在的突變與可由此產(chǎn)生的期望特性 改變(相對于親本707 a-淀粉酶的特性而言)之間的關(guān)系。
如上文所述，本發(fā)明涉及可來源于芽孢桿菌屬物種707菌株的a-淀粉 酶及其具有改變特性的變體。
就具體考慮的改變的特性而言，具體考慮的親本707 a-淀粉酶有上述 親本707 a-淀粉酶，和包含至少一部分707 a-淀粉酶的親本雜合a-淀粉酶。
雖然利用芽孢桿菌屬物種707菌株a-淀粉酶(SEQ ID NO: l)作為出發(fā) 點，但是具有高度同源性的其他芽孢桿菌屬a-淀粉酶中的相應(yīng)位置應(yīng)理解 為也已公開并作具體考慮。
本發(fā)明一方面涉及如上文所述的具有改變特性的變體。第一方面，親本芽孢桿菌屬物種菌林a-淀粉酶的變體包含至少一種、或至少兩種如下改 變
(a) C-末端截短，
(b) 氨基酸202(即M202)取代，使用SEQ ID NO:l進行編號，或
(c) 選自R181、 G182、 H182和G184的至少兩個殘基缺失，使用SEQ ID NO:l進行編號，且其中所述變體具有oc-淀粉酶活性。
1.8.1穩(wěn)定性
就本文所述的變體而言，對于尤其是在高溫(即70-12(TC)和/或極端pH (即低或高pH，即分別為pH 4.0-6.0或pH 8.0-11.0)、特別是在游離(即非 結(jié)合的，因此處于溶液中的)釣濃度低于60ppm的情況下實現(xiàn)改變的(即
更高或更低的)穩(wěn)定性、特別是改善的穩(wěn)定性而言，重要的突變(包括M 酸取代和缺失)包括"改變的特性"一節(jié)中所列的任何突變。穩(wěn)定性可如下文
"方法"一節(jié)中所述來測定。 1.8.2 CaH定性
改變的C,穩(wěn)定性意味著酶在C,耗竭條件下的穩(wěn)定性已經(jīng)得到改 善，即更高或更低的穩(wěn)定性。就本文所述的變體而言，對于尤其是在高pH (即pH8.0-10.5)情況下實現(xiàn)改變的Ca"穩(wěn)定性、特別是改善的Ca"穩(wěn)定性 (即更高或更低的穩(wěn)定性)而言，重要的突變(包括氨基酸取代和缺失)包括 "改變的特性"一節(jié)中所列的任何突變。
1.8.3比活
又一方面，對于獲得尤其是在10-60°C、優(yōu)選20-5(TC、尤其是30-40。C 的溫度呈現(xiàn)改變的比活、特別是增加或降低的比活的變體而言，重要的突 變(包括氨基酸取代和缺失)包括"改變的特性"一節(jié)中所列的任何突變。比 活可如下文"方法"一節(jié)中所述來測定。1.8.4氧化穩(wěn)定性
所述的變體與親本a-淀粉酶相比，可以具有改變的氧化穩(wěn)定性，特別 是更高的氧化穩(wěn)定性。增加的氧化穩(wěn)定性在例如洗滌劑組合物方面有利， 而降低的氧化穩(wěn)定性可以在淀粉液化用組合物方面有利。氧化穩(wěn)定性可如 下文"方法"一節(jié)中所述來測定。
1.8.5改變的pH"i普
對于獲得尤其是在高pH (即pH S-10.S)或低pH (即pH 4-6)情況下具 有改變的pH譜、特別是改善的活性的變體而言，重要的位置和突變包括 緊臨活性位點殘基的氛基酸殘基的突變。
優(yōu)選的具體突變/取代是上文"改變的特性"一節(jié)中針對所討論的位置 所列的那些。適宜的測定法在下文"方法"一節(jié)中描述。
1.8.6洗滌性能
對于獲得尤其是在高pH (即pH 8.5-11)情況下具有改善的洗滌性能的 變體而言，重要的位置和突變包括上文"改變的特性"一節(jié)中針對所討論的 位置所列的具體突變/取代。洗滌性能可如下文"方法"一節(jié)中所述來測試。
2.芽孢桿菌屬物種707 ot-淀粉酶、其變體、及其生產(chǎn)方法 因此， 一方面提供了芽孢桿菌屬物種707 ot-淀粉酶序列用于創(chuàng)建包括 其他以前確定的M酸取代、缺失、顛換、插入及其組合的重組形式，以 產(chǎn)生芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶的變體。這些變體可以具有另外的生產(chǎn) 力增強、增加的pH穩(wěn)定性、增加的溫度穩(wěn)定性、減少的Ca"需求、增加 的比活、—增加的餐具洗滌或洗滌性能、增加的溶解性、增加的儲存穩(wěn)定性 或其組合。重組生成變體的方法可利用所提供的序列和載體、或利用本領(lǐng) 域已知的其他形式進行。
2.1克隆編碼a-淀粉酶的DNA序列可利用本領(lǐng)域眾所周知的多種方法，從產(chǎn)生所討論(X-淀粉酶的任何細
胞或微生物中分離編碼親本a-淀粉酶的DNA序列。首先，應(yīng)當(dāng)利用來自 產(chǎn)生欲研究a-淀粉酶的生物的染色體DNA或信使RNA，構(gòu)建基因組DNA 和/或cDNA文庫。其次，如果該a-淀粉酶的氨基酸序列已知，則可以合 成標記的同源寡核苷酸探針，并利用之從由所討論生物制備的基因組文庫 中鑒定a-淀粉酶編碼克隆?？蛇x地，可利用含有同源于已知a-淀粉酶基因 的序列的標記寡核苷酸探針作為探針，利用較低嚴緊度的雜交和洗滌條件， 來鑒定a-淀粉酶編碼克隆。
而鑒定a-淀粉酶編碼克隆的另 一方法將包括向表達載體(如質(zhì)粒)中插 入基因組DNA片段，用所得的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化a-淀粉酶陰性細菌， 然后將轉(zhuǎn)化的細菌涂布在含a-淀粉酶底物的瓊脂板上，由此能夠鑒定表達 a-淀粉酶的克隆。
可選地，可以通過已確立的標準方法，例如，S. L. Beaucage和M. H. Camthers (1981)所述的亞磷酰胺法，或Matthes等人(1984)所述的方法， 來合成制備編碼該酶的DNA序列。在亞磷酰胺法中，寡核苷酸在例如自 動化DNA合成儀中合成，純化，退火，連接，并克隆在適當(dāng)?shù)脑泽w中。
最后，DNA序列可以是混合的基因組和合成來源，混合的合成和 cDNA來源，或混合的基因組和cDNA來源，按照標準技術(shù)，通過連接合 成、基因組或cDNA來源的片段(適當(dāng)?shù)那闆r下，所述片段對應(yīng)于完整DNA 序列的各部分)制備而來。DN A序列也可以利用特異性引物通過聚合i^ 式反應(yīng)(PCR)來制備，例如如美國專利No. 4，683，202或R. K. Saiki等人 (1988)所述的那樣。
2.2定點誘變
一旦已經(jīng)分離了編碼a-淀粉酶的DNA序列，并鑒定了期望的突變位 點，則可以利用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有側(cè)接期望突變 位點的核苷酸序列；突變的核苷酸在寡核苷酸合成期間插入。在一個具體 方法中，在攜帶a-淀粉酶基因的載體中創(chuàng)建橋接a-淀粉酶編碼序列的單鏈DNA缺口。然后使帶有期望突變的合成核苷酸與該單鏈DNA的同源部分 退火。隨之由DNA聚合酶I (Klenow片段)補平余下的缺口，并利用T4 連接酶連接該構(gòu)建體。此方法的具體實例在Morinaga等人(1984)中描述。 美國專利No. 4,760,025公開了通過對盒進行微'J、改變而引入編碼多重突變 的寡核苷酸。然而，Morinaga法能夠于任何一次引入甚至更多種突變，因 為能夠引入各種長度的多種寡核苷酸。
向編碼a-淀粉酶的DNA序列中引入變體的另一種方法在Nelson和 Long (1989)中描述。該方法包括3步生成含有通過利用化學(xué)合成的DNA 鏈作為PCR反應(yīng)引物之一而引入的期望突變的PCR片段?？赏ㄟ^限制性 內(nèi)切酶切割而從所述PCR生成的片段中分離攜帶突變的DNA片段，并重 新插入到表達質(zhì)粒中。
3. a-淀粉酶變體的生產(chǎn)
由本文所述方法或由任何本領(lǐng)域已知的替代方法所產(chǎn)生的、編碼芽孢 桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的DNA序列，能夠利用表達載體表達 為酶的形式，所逸表達栽體一般包括編碼適宜的啟動子、操縱基因、核糖 體結(jié)合位點、翻譯起始信號、和任選的阻遏基因和/或各種激活基因的控制 序列。
攜帶編碼a-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是任何可方 便地進行重組DNA操作的載體，并且載體的選擇通常將取決于其待引入 的宿主細胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外實體形式存 在的載體，其復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)，例如質(zhì)粒、噬菌體或染色體外元件、 微染色體或人工染色體。或者，載體可以是當(dāng)被引入到宿主細胞中后整合 到宿主細胞基因組中并與其所整合到的染色體一起復(fù)制的載體。該整合的 基因也可以通過使用可擴增構(gòu)建體來擴增，以在染色體中產(chǎn)生該基因的多 個拷貝，所述可擴增構(gòu)建體由抗生素選擇或者其它選擇壓力(例如必需調(diào)控 基因)來驅(qū)動，或者通過互補作用利用必需代謝途徑基因的劑量效應(yīng)來驅(qū) 動。載體中，DNA序列應(yīng)與適宜的啟動子序列有效連接。啟動子可以是任 何在所選宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并且可源自編碼與宿主 細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因?？捎糜谥笇?dǎo)編碼a-淀粉酶變體的DNA 序列轉(zhuǎn)錄(尤其在細菌宿主中)的啟動子實例有大腸桿菌lac操縱子的啟動 子、天藍色鏈霉菌(&"/^附y(tǒng)c" 0^//co/or)瓊脂糖酶基因dagA或celA啟 動子、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn) 麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(amyQ)的 啟動子、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。對于真菌宿主中的 轉(zhuǎn)錄，有用的啟動子的實例是源自編碼米曲霉(^f/^/^7/附TAKA 淀粉酶、米黑根毛霉(及/^o附Mtw鵬'e/i")天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉 (^印^^///附《^^)中性01-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉葡糖 淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶 或構(gòu)巢曲霉(A附Ww/fl附)乙酰胺酶的基因的那些啟動子。當(dāng)在諸如大腸桿菌 的細菌物種中表達編碼芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的基因時， 可以例如從噬菌體啟動子(包括T7啟動子和X噬菌體啟動子)中選擇適宜的 啟動子。適于在酵母物種中表達的適宜啟動子的實例包括但不限于釀酒酵 母C^cd^fw^c^ ccev/w'"e)的Gal 1和Gal 10啟動子和巴斯德畢赤酵母 (尸/d/a/7flsto^)的AOX1或AOX2啟動子。對于在里氏木霉中的表達，也 可使用CBHII啟動子。
表達載體也可包括與編碼芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的 DNA序列有效連接的適宜轉(zhuǎn)錄終止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序 列。終止序列和多腺苷酸化序列可適宜地但不必需源自與啟動子相同的來 源。
載體還可包括使載體能夠在宿主細胞中復(fù)制的DNA序列。此類序列 的實例A^粒pBR322、 pUC19、 pACYC177、 pUB110、 pE194、 pAMBl、 pICatH (圖4， Genencor International, Inc.)、 pHPLT和pIJ702以及由本
領(lǐng)域技術(shù)人員已知的必需元件構(gòu)建的載體的復(fù)制起點。
載體也可包括選擇標記，例如其產(chǎn)物能在宿主細胞中彌補缺陷的基因，例如來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的由/基因，或者賦予抗生素抗性 (例如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性)的基因。此外，載體
可包括曲霉屬(^^/^^///附)選擇標記，例如"/m/S、 "rg必、肌ViZ)和x^C(產(chǎn) 生潮霉素抗性的標記)，或者可通過諸如本領(lǐng)域已知的共轉(zhuǎn)化實現(xiàn)選擇。參 見例如，國際PCT申請WO 91/17243。
雖然細胞內(nèi)表達或固態(tài)發(fā)酵在一些方面可能是有利的，例如當(dāng)使用某 些細菌或真菌作為宿主細胞時，但一般酶的表達是在胞外且在培養(yǎng)基中。 一般，本文述及的芽孢桿菌屬物種707 oi-淀粉酶及其變體包括信號多肽形 式，允許所表達的酶分泌到培養(yǎng)基中。如果期望，這種信號多肽肽可由不 同的信號多肽代替，這可以通過編碼相應(yīng)信號多肽的DNA序列的取代而 方便地實現(xiàn)。所述信號多肽通常表征為具有三個結(jié)構(gòu)域，即N-末端結(jié)構(gòu)域、 H-結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域，且長度范圍在18-35個殘基。這些可以來自任 何野生型信號a-淀粉酶或其他來自細菌或真菌的分泌蛋白質(zhì)。
表達載體通常包括克隆載體的組分，例如允許載體在所選的宿主生物 中自主復(fù)制的元件和一種或多種用于選擇目的的表型可檢測標記。表達載 體通常包括控制核苷酸序列，例如啟動子、操縱基因、核糖體結(jié)合位點、 翻譯起始信號和任選的阻遏基因或者一種或多種激活基因。通常利用信號 序列將物質(zhì)靶向至細胞培養(yǎng)基，以易于酶收集和適用情況下的純化。
用于分別連接編碼芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶及其變體的DNA構(gòu) 建體、啟動子、終止子和其他元件，以及將它們插入到含有復(fù)制所需信息 的適宜載體中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見例如，Sambrook等人， 《分子克隆實驗室手冊》第二版，冷泉港，1989,和第三版，2001)。
有益地，將含有DNA構(gòu)建體或表達載體的分離的細胞用作重組生產(chǎn) 芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的宿主細胞。可用編碼變體的DNA 構(gòu)建體，通過將該DNA構(gòu)建體(以 一個或多個拷貝)整合到宿主染色體中而 方便地轉(zhuǎn)化細胞。通常認為這種整合是有利的，因為DNA序列更有可能 穩(wěn)定地維持在細胞中?？梢愿鶕?jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源重組實現(xiàn) DNA構(gòu)建體向宿主染色體的整合?；蛘?，可以用上述有關(guān)不同類型宿主細胞的表達載體轉(zhuǎn)化細胞。
適宜的細菌宿主生物的實例為革蘭氏陽性細菌物種，例如芽孢桿菌科
CB""7/"c^ie),包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢 桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽胞桿 菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5fl"7/ws w^tffeW"w)和蘇云金芽孢桿菌； 鏈霉菌屬物種如鼠灰鏈霉菌；乳酸細菌物種，包括乳球菌屬物種 (丄ff"oo cc"s1 spp.)， ^口專'L酸專L球菌(丄tfctoc0cc"s1 乳桿菌屬物種 (丄fl"o6ac/〃ws spp.)，包括羅伊氏乳桿菌(la"o6tfc/〃Ms "w,e〃〕；明串珠菌屬
物種(/^MCWIO加C Spp.)， 片球菌屬物種(JW/0CWC附Spp.)和鏈球菌屬物種
(S^/7似coccws spp.)?；蛘撸梢赃x擇屬于腸桿菌科CE"fero6flr"er/amie)(包 括大腸桿菌)或者屬于假單胞菌科(/Vw^wo" 的革蘭氏陰性細菌
物種的菌林作為宿主生物。適宜的酵母宿主生物可以選自生物技術(shù)相關(guān)酵 母物種，例如但不限于酵母物種，如畢赤酵母屬物種、漢遜酵母屬物種、 或克魯維酵母屬(/T/Mjn^w/y;c")、耶氏酵母屬(FarwHvVnVO物種，或酵母屬 (S"cc^flro附^M)物種，包括釀酒酵母；或?qū)儆诹阎辰湍笇?(Sd^仍acc/iflww^es)的物種，如粟酒裂殖酵母(51. /ww6e)物種。甲基營養(yǎng) 酵母物種巴斯德畢赤酵母的菌林可以用作宿主生物?；蛘?，宿主生物可以 是漢遜酵母屬物種。絲狀真菌中適宜的宿主生物包括曲霉屬物種，例如黑 曲霉、米曲霉、塔賓曲霉(^pe/^7/附似6Zge"wX)、泡盛曲霉(v4s/wgi7/"s "H^f附on)或構(gòu)巢曲霉?；蛘?，鐮孢霉屬CF"^w7Vi附)物種，i口尖鐮孢(iFYisflr/ww ax^/ww附)或根毛霉屬(/ /i/zcwiwcwO物種，如米黑才艮毛霉，可以用作宿主 生物。其他適宜的菌林包括嗜熱絲孢菌屬(77^f7mw^cM)和毛霉屬(Mwcw) 物種。
示例性酵母物種包括酵母屬或裂殖酵母屬的物種，例如釀酒酵母。絲 狀真菌可以有利地屬于曲霉屬的物種，例如米曲霉或黑曲霉。真菌細胞可 以通過包括原生質(zhì)體形成及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染、接著再生細胞壁的方法以 其本身已知的方式進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細胞的適宜操作包括例如 EP238023中所述的那些。再又一方面，提供了生產(chǎn)芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的方 法，該方法包括在有利于變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)上述宿主細胞，并從該細 胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是任何適于所討論宿主細胞生長和獲得芽
孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體表達的常規(guī)培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基和 培養(yǎng)基組分可獲自商品供應(yīng)商(例如Difco )，或可根據(jù)公開的配方制備(例 如按美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄所述)。所用的培養(yǎng)基將是最適合于正
在使用的宿主細胞的。例如下文所討論的用于培養(yǎng)地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基。
來源，連同無機鹽作為鈉、鉀、磷酸鹽、鎂和硫酸鹽的來源，以及微量元 素。通常，糖類來源如葡萄糖也是初始培養(yǎng)基的一部分。 一旦培養(yǎng)物自身 已經(jīng)建立并開始生長，便向罐中定量供應(yīng)糖類，以便如本領(lǐng)域已知的那樣 維持培養(yǎng)物。定期從發(fā)酵罐中取樣，以便利用例如比色測定法來測量酶滴 度。根據(jù)測量，當(dāng)酶生產(chǎn)速率停止增加時，中斷發(fā)酵過程。
可通過/>知的方法從培養(yǎng)基中回收由宿主細胞分泌的芽孢桿菌屬物種 707 a-淀粉酶或其變體，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞，通過 諸如硫酸銨的鹽沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分，隨后使用諸如離子交換色譜、 親和色鐠等的色譜方法。
可在允許芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體表達的適宜條件下培 養(yǎng)宿主細胞。蛋白質(zhì)的表達可以是組成型的，從而它們可以連續(xù)生產(chǎn)，或 是誘導(dǎo)型的，從而需要刺激來起始表達。在誘導(dǎo)型表達的情況下，當(dāng)需要 時可以通過例如向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物(例如地塞米木^或IPTG或 Sepharose)來起始蛋白質(zhì)生產(chǎn)。也可以在體外無細胞體系(例如TnT1 (Promega)兔網(wǎng)織紅細胞體系)中重組生產(chǎn)多肽。
也可以在有氧條件下，于對宿主適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達芽孢桿菌屬 物種707 a-淀粉酶或其變體的宿主。可以提供振蕩或攪拌及通風(fēng)的組合， 在對于該宿主適合的溫度例如約30。C至約75。C進^"生產(chǎn)，這取決于宿主的 需要以及生產(chǎn)期望酶的需要。培養(yǎng)可以進行約12至約100小時或更長(以及其間的任何小時時間值)，或例如24-72小時，或者約75小時至約120 小時。通常，培養(yǎng)物肉湯pH約5.5至約8.0，這也取決于宿主細胞相對于 酶生產(chǎn)而言所需的培養(yǎng)條件。
用于確定活性的測定法在本領(lǐng)域公知。參見例如美國專利No. 6,297,037。例如，可實施可溶底物測定法來確定變體的活性。這可例如通 過基于Megazyme (Aust.) Pty, Ltd.提供的終點測定試劑盒所開發(fā)的速率測 定法來進行。將底物對硝基苯麥芽七糖苷(p-nitrophenyl maltoheptaoside， BPNPG7)溶于10 mL無菌水中，接著在測定緩沖液(50 mM馬來酸鹽緩沖 液，pH 6.7， 5 mM氯化釣，0.002% Tween 20)中進行1比4的稀釋。通過在 25。C向比色管的7卯nL底物中加入10pL a-淀粉酶來進行測定。水解速率 測定為75秒延遲后410 nm處吸光度的變化速率。該測定通常是線性的， 至高達0.4個吸光度單位/分鐘的速率。酶濃度可以利用例如基于M. Bradford, /4wfl/. 5/oc/^附.72:248 (1976)方法的Bio-Rad測定(Bio-Rad Laboratories)和利用牛血清白蛋白標準品來測量。
可執(zhí)行用以評估變體活性的另一測定法是淀粉水解測定法。這可以例 如按如下進行?？墒褂糜糜跍y定Spezyme⑧AA20 a-淀粉酶活性的標準方 法，或本領(lǐng)域已知的其他可選方法。Spezyme AA20測定法描述在例如美 國申請No. 07/785,624的實施例1中，并入本文作為參考。天然淀粉與硪 形成藍色，但當(dāng)其水解成較短的糊精分子時則不能如此。底物可為溶于磷 酸鹽緩沖液，pH 6.2 (42.5克/升磷酸二氫鉀、3.16克/升氫氧化鈉)中的5 g/L 可溶Lintner淀粉。將樣品添加在25 mM氯化鈣中，活性測量為在30°C 孵育時給出陰性碘檢查所需的時間?；钚杂涗洖槊靠嘶蛎縨L的liquefon (LU),按照如下公式計算
LU/mL或LU/g = (570) x D
Vxt
其中LU = liquefon單位；V =樣品體積(5 mL); t =糊精化時間(分鐘)； D=稀釋因子=稀釋體積/mL或g所加入的酶。4. a-淀粉酶變體的純化
發(fā)酵、分離和濃縮技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且可以使用常規(guī)方法以制 備濃縮的含有芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的溶液。
發(fā)酵后，獲得發(fā)酵肉湯，通過常規(guī)分離技術(shù)除去微生物細胞和各種懸 浮的固形物(包括殘留的發(fā)酵原料)以便獲得含酶溶液。通常使用過濾、離 心、微量過濾、轉(zhuǎn)鼓真空過濾、超濾、提取或色鐠法等。
為優(yōu)化回收，濃縮含酶溶液是值得的。為收集純化的含酶沉淀物，未 濃縮溶液的使用需要增加的孵育時間。
可以使用任何本領(lǐng)域已知的可得方式濃縮含有芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的溶液，直到獲得期望的酶水平。例如，可通過上文討論 的任何技術(shù)實現(xiàn)含酶溶液的濃縮。例如可以應(yīng)用轉(zhuǎn)鼓真空蒸發(fā)和/或超濾或 單獨的超濾。
用于純化目的的"沉淀劑，，指有效從濃縮的酶溶液中以固體形式(不管 其性質(zhì)如何，即晶體、無定形或兩者混合物)沉淀芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的化合物。
例如，可以使用金屬卣化物沉淀劑進行沉淀。金屬卣化物沉淀劑包括 但不限于堿金屬氯化物、堿金屬溴化物和這些金屬囟化物中兩種或更多 種的混合物。示例性金屬卣化物包括氯化鈉、氯化鉀、溴化鈉、溴化鉀和 這些金屬卣化物中兩種或更多種的混合物?；蛘撸蓮穆然c和氯化鉀中 選擇金屬卣化物。至于氯化鈉，其既可用作金屬囟化物沉淀劑，又可用作 防腐劑。
以有效沉淀芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的量使用金屬卣化 物沉淀劑。在常規(guī)試驗后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以顯而易見地至少選擇 出能夠有效地致使酶沉淀的金屬卣化物的有效量和最佳量、以及實現(xiàn)最大 回收的沉淀條件，包括孵育時間、pH、溫度和酶濃度。
通常，向濃縮的含酶溶液中加入至少約5% w/v (重量/體積)至約25% w/v的金屬卣化物，且通常是至少8。/。w/v。通常，向濃縮的含酶溶液中加 入不超過約25% w/v的金屬卣化物，且通常是不超過20% w/v。金屬卣化物沉淀劑的最適濃度將取決于例如芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體 的性質(zhì)及其濃度等。
另一可選的實現(xiàn)酶沉淀的方法是有機化合物的應(yīng)用，其可以添加到濃 縮的酶溶液中。有機化合物沉淀劑可以包括4-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲 酸的堿金屬鹽、4-羥基苯甲酸的烷基酯、以及這些有機化合物中兩種或更 多種的混合物。所述有機化合物沉淀劑的添加可以在金屬卣化物沉淀劑的 添加之前、與其同時或在其后發(fā)生，并且兩類沉淀劑(有機化合物和金屬閨 化物)的添加都可順序進行或同時進行。
有關(guān)進一步的說明，參見例如美國專利No， 5,281,526。通常，有機化 合物沉淀劑選自4-羥基苯甲酸的堿金屬鹽(例如鈉或鉀鹽)，以及4-羥基苯 甲酸的線性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12個碳原子)，以及這些有機 化合物中兩種或更多種的混合物。有機化合物沉淀劑可以是例如4-羥基苯 甲酸的線性或分支的烷基酯(其中烷基含有l(wèi)-10個碳原子)，以及這些有枳i 化合物中兩種或更多種的混合物。例如，有機化合物可以是4-羥基苯曱酸 的線性烷基酯(其中烷基含有1-6個碳原子)，以及這些有機化合物中兩種或 更多種的混合物。也可以使用4-羥基苯甲酸的曱基酯、4-羥基苯甲酸的丙 基酯、4-羥基苯甲酸的丁基酯、4-羥基苯甲酸的乙基酯以及這些有機化合 物中兩種或更多種的混合物。其它有機化合物還包括但不限于4-羥基苯甲 酸甲酯(稱為甲基PARABEN)、 4-羥基苯甲酸丙酯(稱為丙基PARABEN), 兩者也是淀粉酶防腐劑。
所述有機化合物沉淀劑的添加提供了沉淀條件高度靈活性的優(yōu)勢(就 pH、溫度、酶濃度、沉淀劑濃度和孵育時間而言)。
以有效提高金屬囟化物沉淀劑引起的酶沉淀的量使用有機化合物沉淀 劑?；诒景l(fā)明公開，在常規(guī)試驗后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將可以顯而易 見地至少選擇出有機化合物沉淀劑的有效量和最佳量、以及用于實現(xiàn)最大 回收的沉淀條件，包括孵育時間、pH、溫度和酶濃度。
通常，向濃縮的含酶溶液中加入至少0.01% w/v (重量/體積)的有機化 合物沉淀劑，且通常至少0.02% w/v。通常向濃縮的酶溶液中加入不多于0.3% w/v (重量/體積)的有機化合物沉淀劑，且通常不多于0.2% w/v。
必然地根據(jù)待純化的酶，可調(diào)整含有金屬閨化物沉淀劑和有機化合物 沉淀劑的濃縮酶溶液的pH。通常，將pH調(diào)整至芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的等電點附近。通常，將pH調(diào)整至處于如下范圍的pH: 低于等電點(pl)約2.5個pH單位至高于等電點約2.5個pH單位。為舉例 說明目的，可將濃縮的含酶溶液調(diào)整至約5.5-9.7的pH或約6.5-9.0的pH。 可以類似地制定芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的pH范圍變化。
獲得純化的酶沉淀物所需的孵育時間取決于具體酶的性質(zhì)、酶濃度、 以及具體的沉淀劑(一種或多種)及其濃度。通常，有效沉淀酶的時間為約1 至約30小時之間；通常不超過約25小時。在有機化合物沉淀劑存在下， 孵育時間還可以減至小于約10小時，且在大多數(shù)情況下甚至是約6小時。
通常，孵育期間的溫度為約4。C至約50。C。通常，在例如約10。C至約 45。C或約20。C至約40。C的溫度進行所述方法。用于誘導(dǎo)沉淀的最佳溫度根 據(jù)溶液條件和所用酶或沉淀劑而變化。
可以通過攪拌包括酶、添加的金屬囟化物和添加的有機化合物的溶液， 來提高純化的酶沉淀物的總回收率以及該方法的實施效率。在添加金屬鹵 化物和有機化合物期間，以及在隨后的孵育期均可以進行攪拌步驟。適宜 的攪拌方法包括才幾械攪拌或振蕩、強有力的通風(fēng)或任何類似的技術(shù)。
孵育期后，隨之通過常規(guī)分離技術(shù)，例如過濾、離心、孩史量過濾、旋 轉(zhuǎn)真空過濾、超濾、壓濾、交叉膜微量過濾(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量過濾等，自解離的色素以及其他雜質(zhì)中分 離和收集純化的酶?？梢酝ㄟ^用水洗滌沉淀物獲得對純化的酶沉淀物的進 一步純化。例如，用含有金屬卣化物沉淀劑的水，或用含有金屬卣化物和 有枳i化合物沉淀劑的水來洗滌純化的酶沉淀物。
培養(yǎng)期間，淀粉酶胞外累積在培養(yǎng)物肉湯中。為了分離和純化期望的 芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體，離心或過濾培養(yǎng)物肉湯以除去細 胞，并利用所得的無細胞液體進行酶純化。在一個實施方案中，使用約70% 飽和度的硫酸銨對無細胞肉湯進行鹽析；然后將70%飽和度沉淀的級分溶解在緩沖液中并施加到諸如S印hadex G-100柱等柱中，然后洗脫以回收酶 活性級分。為了進一步的純化，可使用諸如離子交換色謙等常規(guī)方法?？?選地，可應(yīng)用有機絮凝劑絮凝細胞或細胞碎片，以通過過濾或離心除去細 胞及細胞碎片。絮凝劑可單獨或與金屬卣化物或本文所述的任何步驟組合 使用。通常，酶濃度可以是4 g/L或更高的數(shù)量級，且在一些應(yīng)用中超過 25g/L或更高。
純化的酶可用于通常利用該酶的所有應(yīng)用中。例如，它們可以用于洗 衣洗滌劑和除斑劑，用于食品工業(yè)，用于淀粉加工和烘焙，且可作為消化 助劑用于藥物組合物?？梢詫⑺鼈冎瞥梢后w(溶液、漿液)或固體(顆粒、粉 末)終產(chǎn)物。本文描述了純化的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的制 劑。
可如本文一般性描述的那樣來部分地純化酶。這包括用聚合物通過絮 凝除去細胞，或者使用膜和可用材料進行」微量過濾、超濾濃縮。對于一些 應(yīng)用，可能不需要純化酶，可以裂解全肉湯培養(yǎng)物，且無需進一步處理而 4吏用之，或加工成顆?；蛭㈩w粒。
5.清潔和餐具洗滌組合物及用途
可以將本文討論的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體配制在用于 清潔餐具的洗滌劑組合物中或其他清潔組合物中。這些組合物可以是粉末 或液體。例如，組合物可以是顆?；蛭㈩w粒的形式。多肽可按已知的方法 進一步被穩(wěn)定化。組合物可以包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體 (單獨地)、其他淀粉分解酶、其它清潔酶以及清潔組合物常用的其他組 分。
組合物可以包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體作為主要的酶 組分，例如單組分組合物。或者，組合物可以包括多種酶活性，例如氨肽 酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷 酶、葡糖淀粉酶、oi-葡萄糖苷酶、j5-葡萄糖苷酶、囟代過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂 解(pectinolytic)酶、肽基谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、 過氧化物酶、 植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖 酶。這些其他酶可通過屬于曲霉屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬(i/w附/"/")及鐮孢
霉屬的樣i生物生產(chǎn)。示例性曲霉屬成員包括棘孢曲霉(A flCW/efl似s)、泡盛
曲霉、黑曲霉或米曲霉。示例性腐質(zhì)霉屬成員包括特異腐質(zhì)霉(好M/m'co/" /wm/^w);示例性鐮孢霉屬成員包括桿孢狀鐮孢(尸.6flC,V//wV^s)、 F. cemi//51、 F. m^wZ/mse 、 大刀嫌抱(尸.cw/附ori/附)、禾本科嫌抱(F. gr"附/rte"/"M附)、禾赤錄抱(尸.gm附/履附)、異抱錄抱(F. /r"ems/wi/附)、合 歡木鐮孢(F. M^""力)、尖鐮孢、多枝鐮孢(F. "http://c /W"/w)、粉紅鐮孢(尸. raseM附)、接骨木錄抱(尸.s"附6wc/WW附)、狹色錄抱(77. 5YWCOcArOM附)、石危色
錄抱(F. 5^//7/rwre"附)、K ,orw/osew附、才以絲抱錄抱(F. Zn'cAo幼ec/0iVifey)和jF.
因此，餐具洗滌洗滌劑組合物可以包括表面活性劑。表面活性劑可以 是陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性離子型或這些類型的混合。洗滌 劑可以含有0%至約90%的非離子表面活性劑，例如低泡或無泡型乙氧基 化丙氧基化直鏈醇。
在洗滌劑應(yīng)用中，芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體可用在含丙 二醇的液體組合物中。例如通過在含有10%氯化鈣的25%體積/體積丙二 醇溶液中循環(huán)，使芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體溶解于丙二醇。
洗滌劑組合物可含有無才幾和/或有機類型的洗滌劑助劑鹽。洗滌劑助劑 可細分為含磷和不含磷的類型。洗滌劑組合物通常含有約1%至約卯％的 洗滌劑助劑。當(dāng)存在含磷的無積減性洗滌劑助劑時，其實例包括水溶性鹽， 尤其是堿金屬焦磚酸鹽、正磷酸鹽和聚磷酸鹽。當(dāng)存在含磷的有機堿性洗 涂劑助劑時，其實例包括水溶性膦酸鹽。當(dāng)存在不含磷的無機助劑時，其 實例包括水溶性堿金屬碳酸鹽、硼酸鹽和硅酸鹽以及多種類型的水不溶性 晶體或無定形硅鋁酸鹽，其中沸石是最為公知的代表。
適宜的有機助劑的實例包括堿金屬；銨鹽和取代的銨鹽；檸檬酸鹽；琥珀酸鹽；丙二酸鹽；脂肪酸磺酸鹽；氣基甲氧基琥珀酸鹽；聚乙酸銨； 羧酸酯；聚羧酸酯；氨基聚羧酸酯；聚乙?；人狨ズ投嗔u基磺酸酯 (polyhydroxsulphonates)。
其它適宜的有機助劑包括已知具有助劑性能的較高分子量的聚合物和 共聚物，例如適當(dāng)?shù)木郾┧?、聚馬來酸和聚丙烯^/聚馬來酸共聚物，及 它們的鹽。
清潔組合物可含有氯/溴類型或氧類型的漂白劑。無機氯/溴類型漂白 劑的實例是鋰、鈉或鈣的次氯酸鹽和次溴酸鹽，以及氯化磷酸三鈉。有機 氯/溴類型漂白劑的實例是雜環(huán)N-溴和N-氯亞胺，如三氯異氰脲酸、三溴 異氰脲酸、二溴異氰脲酸、和二氯異氰脲酸，及其與7JC增溶性陽離子(如鉀 和鈉)的鹽。乙內(nèi)酰脲化合物也是適宜的。
清潔組合物可含有氧漂白劑，例如無機過酸鹽的形式，任選地還含有 漂白前體，或作為過氧酸化合物的形式。適宜的過氧漂白化合物的典型實 例是堿金屬過硼酸鹽(四水合物和一水合物)，堿金屬過碳酸鹽、過硅酸鹽 和過磷酸鹽。示例性的活性劑材料包括TAED和三乙酸甘油酯。
可使用常規(guī)用于酶的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定清潔組合物，例如多元醇如丙二醇、 糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如硼酸芳香酯)。
清潔組合物也可含有其它常規(guī)洗滌劑成分，例如反絮凝劑材料、填充 劑材料、消泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、多價螯合劑、防污垢再沉積劑、脫 水劑、染料、殺菌劑、熒光劑、增稠劑和香料。
芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體可用于常規(guī)餐具洗滌洗滌劑 中，例如用于任何如下專利公開中所述的任何洗滌劑中(考慮該芽孢桿菌屬 物種707 a-淀粉酶或其變體可包含信號序列，例如來自例如如下專利和專 利申請中所列任何芽孢桿菌屬a-淀粉酶的信號序列)CA 2006687、 GB 2200132、 GB 2234980、 GB 2228945、 DE 3741617、 DE 3727911、 DE 4212166、 DE 4137470、 DE 3833047、 DE 4205071、 WO 93/25651、 WO 93/18129、 WO 93/04153、 WO 92/06157、 WO 92/08777、 WO 93/21299、 WO 93/17089、 WO 93/03129、 EP 481547、 EP 530870、 EP 533239、 EP554943、 EP 429124、 EP 346137、 EP 561452、 EP 318204、 EP 318279、EP 271155、 EP 271156、 EP 346136、 EP 518719、 EP 518720、 EP 518721、EP 516553、 EP 561446、 EP 516554、 EP 516555、 EP 530635、 EP 414197、美國專利No. 5,112,518、美國專利No. 5,141 ，664和美國專利No. 5,240,632。這些組合物既可用在手工又可用在自動餐具洗滌條件。示例性制劑包括但不限于如下
1) 粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑0.4-2.5%;偏硅酸鈉
0- 20%;焦硅酸鈉3-20%;三磷酸鈉20-40%;碳酸鈉0-20%;過硼酸鈉2-9%;四乙?；叶?TAED)l-4o/o;硫酸鈉5-33%;和酶0.0001-0.1%。
2) 粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)
1- 2%;焦硅酸鈉2-30%;碳酸鈉10-50%;膦酸鈉0-5%; 二水合檸檬酸三鈉9-30%;次氮基三乙酸鈉(NTA)0-20。/。； 一7JC合過硼酸鈉5-10%;四乙酰基乙二胺(TAED); 1-2%聚丙烯酸聚合物(例如馬來^/丙烯酸6-25%共聚物)；酶0.0001-0.1%;香料0.1-0.5%;和水5%-10%。
3) 粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)1-2%;焦硅酸鈉2-30%;碳酸鈉10-50%;膦酸鈉0-5%; 二7JC合檸檬酸三鈉9-30%;次氮基三乙酸鈉(NTA)0-20。/。； 一水合過硼酸鈉5-10%;四乙?；叶?TAED) 1-2%;聚丙烯酸聚合物(例如馬來i^/丙烯酸6-25%共聚物)；酶0.0001-0.1%;香料0.1-0.5%;和水5%-10%。
4) 粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-2%;沸石MAP15-42%;焦硅酸鈉30-34%;檸檬酸鈉0-12%;碳酸鈉0-20%; —7JC合過硼酸鈉7-15%;四乙?；叶?TAED) 0-3%;聚合物0-4%;馬來^/丙烯酸共聚物0-5%;有機膦酸鹽0-4%;粘土 1-2%;酶0.0001-0.1%;制劑余量為硫酸鈉。
5) 粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-2%;沸石MAP15-42%;焦硅酸鈉30-34%;檸檬酸鈉0-12%;碳酸鈉0-20%; —水合過硼酸鈉7-15%;四乙?；叶?TAED) 0-3%;聚合物0-4%;馬來l丙烯酸共聚物0-5%;有機膦酸鹽0-4%;粘土 1-2%;酶0.0001-0.1%;制劑余量為硫酸鈉。
6) 粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-2%;沸石MAP15-42%;焦硅酸鈉30-34%;檸檬酸鈉0-12%;碳酸鈉0-20%; —水合過硼酸鈉7-15%;四乙?；叶?TAED) 0-3%;聚合物0-4%;馬來^/丙烯酸共聚物0-5%;有機膦酸鹽0-4%;粘土 1-2%;酶0.0001-0.1%;制
劑余量為硫酸鈉。
7) 非水性液體自動餐具洗滌組合物液體非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)2.0-10.0%;堿金屬珪酸鹽3.0-15.0%;堿金屬磷酸鹽20.0-40.0%;從高級二元醇、聚二元醇中選擇的液體載體25.0-45.0%;多
氧化物、二元醇醚穩(wěn)定劑(例如，磷酸的部分酯和0.5-7.0%<:16-<:18烷醇)；
抑泡劑(例如，聚珪氧烷)0-1.5%;和酶0.0001-0.1%。
8) 非水性液體餐具洗滌組合物液體非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)2.0-40.0%;硅酸鈉3.0-15.0%;堿金屬碳酸鹽7.0-20.0%;檸檬酸鈉0.0-1.5%;穩(wěn)定體系(例如，細粒0.5-7.0%聚硅氧烷和低分子量二烷基聚二元醇醚的混合物)；低分子量聚丙烯酸聚合物5.0-15.0%;粘土凝膠增稠劑(例如斑脫土) 0.0-10.0%;羥丙基纖維素聚合物0.0-0.6%;酶0.0001-0.1%;和余量的從高級二元醇、聚二元醇、多氧化物和二元醇醚中選擇的液體栽體。
9) 非水性液體餐具洗滌組合物液體非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)2.0-40.0%;珪酸鈉3.0-15.0%;堿金屬碳酸鹽7.0-20.0%;檸檬酸鈉0.0-1.5%;穩(wěn)定體系(例如，細粒0.5-7.0%聚硅氧烷和低分子量二烷基聚二元醇醚的混合物)；低分子量聚丙烯酸聚合物5.0-15.0%;粘土凝膠增稠劑(例如斑脫土) 0.0-10.0%;羥丙基纖維素聚合物0.0-0.6%;酶0.0001-0.1%;和余量的從高級二元醇、聚二元醇、多氧化物和二元醇醚中選擇的液體載體。
10) 液體自動餐具洗涂組合物醇乙氧基化物0-20%;脂肪酸酯磺酸鹽0-30%;十二烷基硫酸鈉0-20%;烷基多苷0-21%; 酸0-10%; —水合焦硅酸鈉18-33%; 二7jc合檸檬酸鈉18-33%;硬脂酸鈉0-2.5%; —水合過硼酸鈉0-13%;四乙?；叶?TAED) 0-8%;馬來^/丙烯酸共聚物
11) 液體自動餐具洗滌組合物醇乙氧基化物0-20%;脂肪酸酯磺酸鹽0-30%;十二烷基^L酸鈉0-20%;烷基多苷0-21%;油酸0-10%; —水合焦硅酸鈉18-33%; 二7jc合梓樣酸納18-33%;石更脂酸鈉0-2.5%; —7jc合過硼酸鈉0-13%;四乙酰基乙二胺(TAED) 0-8%;馬來^/丙烯酸共聚物4-8%;和酶0.0001-0.1%。
12) 如1)、 2)、 3)、 4)、 6)和IO)中所述的自動餐具洗滌組合物，其中過硼酸鹽被過碳酸鹽代替。
13) 如l)-6)中所述的自動餐具洗滌組合物，還含有錳催化劑。
6.洗衣洗滌劑組合物及用途
根據(jù)一個實施方案，通常一種或多種芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體可為洗衣洗滌劑組合物的組分。同樣地，其可以以無粉塵顆粒、穩(wěn)定的液體或受保護的酶的形式包括在洗滌劑組合物中。干燥制劑可以是顆粒或孩l顆粒的形式。可以例如，按美國專利No. 4，106，991和4,661,452所公開的那樣來生產(chǎn)無粉塵顆粒，并且可任選地由本領(lǐng)域已知的方法進行包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實例是平均分子量為l，OOO至20,000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG);具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20個碳原子，且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油單酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英國專利No. 1483591給出了適于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實例?？衫缤ㄟ^加入多元醇諸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法來穩(wěn)定液態(tài)酶制品。其它酶穩(wěn)定劑是本領(lǐng)域公知的。可按照例如EP申請No. 238,216公開的方法來制備受保護的酶。長期以來多元醇被公認為蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，而且可以提高蛋白質(zhì)的溶解性，參見例如，J. K. Kaushik等人，"Why is trehalose an exceptional protein stabilizer Ananalysis of the thermal stability of proteins in the presence of thecompatible osmolyte trehalose" / 5,7 /. C7^附.278: 26458-65 (2003)以及其中引用的參考文獻；和M. Conti等人"Capillary isoelectric focusing: theproblem of protein solubility," / C7if0附atogra/7/^ 757: 237-245 (1997)。
組合物可以包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體作為主要的酶組分，例如單組分組合物?；蛘撸M合物可以包括多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖普酶、P-葡萄糖苷酶、卣代過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂解(pectinolytic)酶、肽基谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶，以及下文所討論的其他酶。這些其他酶可通過屬于曲霉屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬(例如特異腐質(zhì)霉)及鐮孢霉屬的微生物生產(chǎn)。示例性曲霉屬成員包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉。示例性鐮孢霉屬成員包括桿孢狀錄孢、F附"r/"附cemi//s\ F"s肌'w附m^w/Zm^ 大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、石克色鐮孢、F附tfW"附torM/仍ew柳、擬絲孢鐮抱和F附ar/w附micw幽附。
洗滌劑組合物可以是任何便利的形式，例如粉末、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是水性的，通常含有高達約70%的水和0%至約30%的有機溶劑。其也可以是只含有約30。/。水的壓縮膠(compact gel)類型的形式。酶可以用在與酶的穩(wěn)定性兼容的任何洗滌劑組合物中。通?？梢杂靡阎陌鼑盎问?例如通過在水凝膠中?；蚋綦x)來保護酶免于遭遇有害組分。酶，尤其是a-淀粉酶，不局限于洗衣和餐具洗滌應(yīng)用，而且可用于表面清潔劑，以及用于由淀粉或生物質(zhì)(biomass)生產(chǎn)乙醇。
洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，其中每種都可以是陰離子型、非離子型、陽離子型或兩性離子型。洗滌劑將通常含有0%至約50%的陰離子表面活性劑，例如線性烷基M酸鹽(LAS); a-烯烴磺酸鹽(AOS);烷^i^危酸鹽(月旨肪醇硫酸鹽)(AS);脂肪醇乙氧^5克酸鹽(AEOS或AES);仲烷基磺酸鹽(SAS); a-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。組合物也可含有0%至約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、或多羥基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。
洗滌劑組合物可另外包括一種或多種其他酶，例如脂肪酶、角質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶、過氧化物酶、和/或漆酶的任何組合。
洗滌劑可任選地含有約1%到約65%的洗滌劑助劑或^^劑，如沸石、二砩酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、 二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如，來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑也可以是未加強的，即基本上不含洗滌劑助劑。
洗涂劑可任選地包括一種或多種聚合物。實例包括羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來^/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可任選地含有漂白體系，這可包括11202來源(例如過硼酸鹽或
過碳酸鹽)，其可以與形成過酸的漂白活性劑，如四乙?；叶?TAED)或壬?；趸交撬猁}(NOBS)聯(lián)用?；蛘?，漂白體系可包括過氧酸(例如酰胺、亞胺或砜類過氧酸)。漂白體系也可以是i^l漂白體系，其中過水解酶(perhydrolase )活化過氧化物，如例如WO 2005/056783中所述的那樣。
可使用常規(guī)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定洗滌劑組合物中的酶，穩(wěn)定劑例如多元醇如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制組合物。
洗滌劑也可含有其它常規(guī)洗滌劑成分，例如織物調(diào)理劑，包括粘土、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺細菌劑、熒光增白劑或香料。pH (在使用濃度下于水性溶液中測量)通常是中性或堿性，例如pH約 7.0至約11.0。
包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的洗滌劑組合物可以配制 成的具體形式包括
1) 具有體積密度(bulk density)為至少600 g/L的顆粒劑形式的洗滌劑 組合物，包括約7%至約12%的線性烷基恭璜酸鹽(按酸計算)；約1%至約 4%的醇乙氧基石克酸鹽(例如<:12-18醇，1-2環(huán)氧乙烷(EO))或烷基琉酸鹽(例 如<:16-18);約5。/。至約9。/。的醇乙氧基化物(例如dws醇，7EO);約14%至 約20y。的碳酸鈉(例如Na2CO3);約2%至約6%的可溶性硅酸鹽(例如 320， 2SK)2);約15%至約22%的沸石(例如NaAlSiO"; 0%至約6%的石危酸鈉(例 如Na2S04);約0%至約15%的檸檬酸鈉/檸檬酸(例如C6H5Na307/C6H807); 約11%至約18Vo的過硼酸鈉(例如NaB03H20);約2%至約6%的TAED; 0%至約2。/。的羧曱基纖維素(CMC); 0-3%的聚合物(例如馬來^/丙烯酸共 聚物，PVP, PEG); 0.0001-0.1%蛋白質(zhì)的酶(按純酶計算)；和0-5%次要 成分(例如抑泡劑、香料、熒光增白劑、光漂白劑)。
2) 具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括 約6%至約11%的線性烷基笨璜酸鹽(按酸計算)；約1%至約3%的醇乙氧 基硫酸鹽(例如<:12-18醇，1-2 EO)或烷基硫酸鹽(例如C16.18);約5%至約9% 的醇乙氧基化物(例如C"-,5醇，7 EO);約15%至約21%的碳酸鈉(例如 Na2C03);約1%至約4%的可溶性硅酸鹽(例如Na20， 2Si02);約24%至 約34%的沸石(例如NaAlSi04);約4%至約10%的石充酸鈉(例如Na2S04); 0%至約15%的檸檬酸鈉/檸檬酸(例如C6H5Na307/C6H807); 0%至約2%的 羧甲基纖維素(CMC); 1-6%的聚合物(例如馬來^/丙烯酸共聚物，PVP， PEG); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；0-5%的次要成分(例如抑泡 劑、香料)。
3) 具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括 約5%至約9%的線性烷基笨璜酸鹽(按酸計算)；約7%至約14%的醇乙氧 基化物(例如(:12.15醇，7 EO);約1%至約3%的皂如脂肪酸(例如(:16_22脂肪酸)；約10%至約17%的碳酸鈉(如Na2C03);約3%至約9%的可溶性珪 酸鹽(例如Na20， 2Si02);約23%至約33%的沸石(如NaAlSiO。； 0%至約 4。/。的硫酸鈉(例如Na2S04);約8%至約16%的過硼酸鈉(例如NaB03H20); 約2%至約8%TAED; 0%至約1%的膦酸鹽(例如EDTMPA); 0%至約2% 的羧甲基纖維素(CMC); 0-3%的聚合物(例如馬來^/丙烯酸共聚物，PVP, PEG); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；0-5%的次要成分(例如抑泡 劑、香料、熒光增白劑)。
4) 具有體積密度為至少600g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括 約8%至約12%的線性烷基笨璜酸鹽(按酸計算)；約10%至約25%的醇乙 氧基化物(例如<:12.15醇，7 EO);約14%至約22%的碳酸鈉(如Na2C03); 約1%至約5%的可溶性硅酸鹽(例如Na20， 2Si02);約25%至約35%的沸 石(例如NaAlSK)4); 0%至約10%的硫酸鈉(例如Na2S04); 0%至約2%的 羧甲基纖維素(CMC); 1-3%的聚合物(例如馬來^/丙烯酸共聚物，PVP， PEG); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-5%的次要成分(例如抑 泡劑、香料)。
5) 水性液體洗滌劑組合物，包括約15%至約21%的線性烷基笨璜酸 鹽(按酸計算)；約12%至約18%的醇乙氧基化物(例如(:12-15醇，7 EO或 dw5醇，5 EO);約3%至約13%的皂如脂肪酸(例如油酸)；0%至約13% 的烯基琥珀酸(<:12_14);約8%至約18%的氨基乙醇；約2%至約8%的檸檬 酸；0%至約3%的膦酸鹽；0%至約3。/。的聚合物(例如PVP， PEG); 0% 至約2%的硼酸鹽(例如B407); 0%至約3%的乙醇；約8%至約14%的丙 二醇；0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-5%的次要成分(例如分 散劑、抑泡劑、香料、熒光增白劑)。
6) 水性結(jié)構(gòu)型液體洗滌劑組合物，包括約15%至約21%的線性烷基 笨璜酸鹽(按酸計算)；3-9%的醇乙氧基化物(例如Cms醇，7 EO或C12-1S 醇，5 EO);約3%至約10%的皂如脂肪酸(例如油酸)；約14%至約22%的 沸石(如NaAlSK)4);約9%至約18%的檸檬酸鉀；0%至約2%的硼酸鹽(例 如B407); 0%至約2。/。的羧甲基纖維素(CMC); 0%至約3%的聚合物(例如PEG, PVP); 0%至約3。/。的錨定聚合物(anchoring polymer),例如甲 基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩爾比25:1， MW 3800); 0%至約5%的 甘油；0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-5%的次要成分(例如分 散劑、抑泡劑、香料、熒光增白劑)。
7) 具有體積密度為至少600 g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括 約5%至約10%的脂肪醇硫酸鹽；約3%至約9%的乙氧基化脂肪酸單乙醇 酰胺；0-3%的皂如脂肪酸；約5%至約10%的碳酸鈉(例如Na2C03);約 1%至約4%的可溶性硅酸鹽(例如Na20， 2Si02);約20%至約40%的沸石 (例如NaAlSK)4);約2%至約8%的硫酸鈉(例如Na2S04);約12%至約18% 的過硼酸鈉(例如NaB03H20);約2%至約7%的TAED;約1%至約5% 的聚合物(例如馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋 白質(zhì)計算)；和0-5%的次要成分(例如熒光增白劑，抑泡劑、香料)。
8) 顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約8%至約14V。的線性烷基M
酸鹽(按酸計算)；約5%至約11%的乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺；0%至約
3%的皂如脂肪酸；約4%至約10%的碳酸鈉(例如Na2C03);約1%至約 40/o的可溶性硅酸鹽(Na20， 2Si02);約30%至約50%的沸石(例如 NaAlSiO》；約3%至約11%的石危酸鈉(例如Na2S04);約5%至約12%的 檸檬酸鈉(例如C6H5Na307);約1%至約5。/。的聚合物(例如PVP，馬來l 丙烯酸共聚物，PEG); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-5%的
次要成分(例如抑泡劑、香料)。
9) 顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約6%至約12%的線性烷基^ 酸鹽(按酸計算)；約1%至約4。/。的非離子表面活性劑；約2%至約6%的 皂如脂肪酸；約14%至約22%的碳酸鈉(例如Na2C03);約18%至約32% 的沸石(例如，NaAlSi04);約5%至約20%的硫酸鈉(例如Na2S04);約3% 至約8%的檸檬酸鈉(例如C6H5Na307);約4%至約9%的過硼酸鈉(例如 NaB03H20);約1%至約5%的漂白活性劑(例如NOBS或TAED); 0%至 約2。/。的羧甲基纖維素(CMC);約1%至約5%的聚合物(例如聚羧酸酯或 PEG); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-5%的次要成分(例如，200880015125.4 10) 水性液體洗滌劑組合物，包括約15%至約23%的線性烷基笨璜酸 鹽(按酸計算)；約8%至約15%的醇乙氧基硫酸鹽(例如C12_15醇，2-3 EO); 約3%至約9。/。的醇乙lL&化物(例如<:12_15醇，7 EO或<:12-15醇，5 EO); 0% 至約3%的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；約1%至約5%的氨基乙醇；約5% 至約10%的檸檬酸鈉；約2%至約6%的助水溶物(例如甲笨璜酸鈉)；0% 至約2%的硼酸鹽(例如B407); 0%至約1%的羧甲基纖維素；約1%至約 3%的乙醇；約2%至約5%的丙二醇；0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計 算)；和0-5%的次要成分(例如聚合物、M劑、香料、熒光增白劑)。
11) 水性液體洗滌劑組合物，包括約20%至約32%的線性烷基笨璜酸 鹽(按酸計算)；6-12%的醇乙氧基化物(例如<:12.15醇，7 EO或C,w5醇，5 EO);約2%至約6%的氨基乙醇；約8%至約14%的檸檬酸；約1%至約 3%的硼酸鹽(例如B407); 0%至約3%的聚合物(例如馬來^/丙烯酸共聚 物，錨定聚合物例如曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；約3%至約8%的 甘油；0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-5%的次要成分(例如助 水溶物、*劑、香料、熒光增白劑)。
12) 具有體積密度為至少600 g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包 括約25%至約40%的陰離子表面活性劑(線性烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽、 a一烯烴磺酸鹽、a-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸鹽、皂)；約1%至約10%的 非離子表面活性劑(例如醇乙氧基化物)；約8%至約25%的碳酸鈉(例如 Na2C03);約5%至約15%的可溶性硅酸鹽(例如Na20， 2Si02); 0%至約 5。/。的硫酸鈉(例如Na;jS04);約15%至約28。/。的沸石(NaAlSi04); 0%至約 20%的過硼酸鈉(例如NaB03.4H20);約0%至約5%的漂白活性劑(TAED 或NOBS); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；0-3%的次要成分(例如 香料、熒光增白劑)。
13) 如上面組合物1)-12)所述的洗滌劑組合物，其中所有或者部分的
線性烷基^酸鹽被(<:12-<:18)烷基硫酸鹽代替。
14) 具有體積密度為至少600 g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包括約9%至約15%的(<:12.(:18)烷基琉酸鹽；約3%至約6%的醇乙氧基化物； 約1%至約5%的多羥基烷基脂肪酸酰胺；約10%至約20%的沸石(例如 NaAlSiO。；約10°/。至約20%的層狀焦珪酸鹽(例如來自Hoechst的SK56); 約3%至約12%的碳酸鈉(例如Na2C03); 0%至約6%的可溶性珪酸鹽(例 如Na20， 2Si02);約4%至約8%的梓檬酸鈉；約13%至約22%的過碳酸 鈉；約3%至約8%的TAED; 0%至約5%的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-5%的次要成分(例如熒光增白 劑、光漂白劑、香料、抑泡劑)。
15) 具有體積密度為至少600 g/L的顆粒劑形式的洗滌劑組合物，包 括約4%至約8%的(<:12_<:18)烷基硫酸鹽；約11%至約15%的醇乙氧基化 物；約1%至約4%的急；約35%至約45%的沸石MAP或沸石A;約2% 至約8%的碳酸鈉(如Na2C03); 0%至約4%的可溶性硅酸鹽(例如Na20， 2Si02);約13%至約22%的過碳酸鈉；1-8%的TAED; 0%至約3%的羧 甲基纖維素(CMC); 0%至約3%的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP); 0.0001-0.1%的酶(按純酶蛋白質(zhì)計算)；和0-3%的次要成分(例如熒光增白 劑、膦酸鹽、香料)。
16) 上面1)-15)所述的洗滌劑制劑，其含有被穩(wěn)定化的或嚢化的過酸 作為額外組分或者作為已經(jīng)述及的漂白體系的替代物。
17) 上面1)、 3)、 7)、 9)和12)所述的洗滌劑組合物，其中過硼酸鹽被 過碳酸鹽代替。
18) 上文1)、 3)、 7)、 9)、 12)、 14)和15)所述的洗滌劑組合物，還含 有錳催化劑。錳催化劑是例如"Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching," A^"re 369: 637-639 (1994)中所述的化合物之
19) 配制成非水性洗滌劑液體的洗滌劑組合物，包括液態(tài)非離子表面 活性劑，例如，線性烷氧基化伯醇、助洗劑體系(例如磷酸鹽)、酶和堿。 該洗滌劑也可包括陰離子表面活性劑和/或漂白體系。
20) 水性液體洗衣洗滌劑組合物，包括A)選自陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、兼性表面活性劑及其組合的至
少一種表面活性劑；B)聚硅氧烷材料摻合物小滴，所述摻合物包括i)含 胺或銨基團的官能化聚硅氧烷材料，其a)已通過這樣的方法制備，所述 方法固有地在所產(chǎn)生的官能化聚硅氧烷材料中留下可固化的/反應(yīng)性的基 團；b)具有低于約30%的含可固化/反應(yīng)性基團的硅原子與不含可固化/ 反應(yīng)性基團的末端硅原子的摩爾比；c)具有的氮含量以重量計約0.05%至 約0.30%;和d)20。C具有約0.00002 m;2;/s至約0.2m;2;/s的粘度；和 ii)無氮的未官能化聚硅氧烷材料，具有粘度約0.01m;2;/s至約2.0m;2; /s，且以這樣的量存在，從而在所述摻合物中官能化聚硅氧烷材料與未官 能化聚硅氧烷材料的重量比為約100:1至約1:100;和C)選自染料轉(zhuǎn)移抑 制劑、熒光增白劑及其組合的至少 一種另外的非聚硅氧烷洗衣輔助劑。
芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體可以按常規(guī)采用的濃度摻入洗 滌劑中。目前i人為在洗滌劑組合物中可以按相當(dāng)于每升洗液0.00001-1.0 mg (按純酶蛋白質(zhì)計算)酶的量加入芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變 體。
在另一實施方案中，可將2，6-p-D-果聚糖水解酶摻入洗滌劑組合物中 并用于家居物品和/或工業(yè)紡織品/衣物上存在的生物膜的去除/清潔。
例如，可以將洗涂劑組合物配制成手洗或機洗的洗衣洗滌劑組合物， 包括適于污染的織物預(yù)處理的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物軟化劑 組合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或 者配制以用于手洗或機洗的餐具洗滌操作。
一個具體的方面，洗滌劑組合物還可以包括2，6-p-D-果聚糖水解酶， 芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體之外的一種或多種a-淀粉酶，和一 種或多種其它清潔酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、糖酶、纖維素酶、 果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、 漆酶和/或過氧化物酶和/或其組合。
通常，所選酶的特性應(yīng)與選擇的洗滌劑兼容(例如最適pH、與其他酶 和非酶成分的兼容性等)，且所述酶應(yīng)以有效量存在。蛋白酶適宜的蛋白酶包括動物、植物或樣i生物來源的那些。包括經(jīng) 化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)改造的突變體，以及天然加工的蛋白酶。蛋白酶可以是 絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，例如堿性微生物蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶 或糜蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶(subtilisin), 尤其是源自芽孢桿菌屬的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白 酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白 酶168 (參見例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例 如源于豬或牛)和鐮孢霉屬蛋白酶(參見例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的實例也包括但不限于WO 92/19729、 WO 98/20115、 WO 98/20116和WO 98/34946中所述的變體。示例性市售可得 的蛋白酵包括Alcalase 、 Savinase 、 PrimaseTM、 DuralaseTM、 Esperase 和KannaseTM (Novo Nordisk A/S); Maxatase⑧、MaxacalTM、 MaxapemTM、 Properase 、 Purafect 、 Purafect OxPTM、 FN2預(yù)和FN3TM (Ge醒cor International, Inc.)。
脂肪酶適宜的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾、 蛋白水解修飾或蛋白質(zhì)改造的突變體。有用的脂肪酶的實例包括但不限于 來自腐質(zhì)霉屬(與嗜熱絲孢菌屬同義)的脂肪酶，例如來自疏毛腐質(zhì)霉(i/. /做"g/"we)(疏棉狀嗜熱絲孢菌(7: /"""g/mw"勻)(參見例如，EP 258068和 EP 305216)、來自特異腐質(zhì)霉(參見例如，WO 96/13580);假單胞菌屬 (」P^"甴wowas)脂肪酶(例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(尸.fl/c"/^ew")或類產(chǎn)堿假 單胞菌(尸./7^"^"/c"http://gew^);參見例如EP 218 272),洋蔥假單胞菌(尸. c印""'")(參見例如EP 331 376)、斯氏假單胞菌(尸.W"&eW)(參見例如GB 1，372，034)、熒光假單胞菌(尸.yZ柳"sce附)、假單胞菌屬物種菌林SD 705 (參 見例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、 P> n^sco附,Vie附/s (參見例如WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌屬脂肪酶(例如來自枯草芽孢桿菌；參見例如 Dartois等人，腸cA麵ca "腸/ /i戸ca勿"，1131 : 253-360 (1993))，嗜熱 脂肪芽孢桿菌(參見例如JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(及/;"iw7"s)(參見例 如WO 91/16422)的脂肪酶?？紤]在制劑中使用的其它脂肪酶變體包括例如在WO 92/05249、 WO 94/01541、 WO 95/35381、 WO 96/00292、 WO 95/30744、 WO 94/25578、 WO 95/14783、 WO 95/22615、 WO 97/04079、 WO 97/07202、 EP 407225和EP 260105中描述的那些。 一些市售可得的 脂肪酶包括Lipolase⑧和Lipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S)。
聚酯酶組合物中可以包括適宜的聚酯酶，適宜的聚酯酶包括例如在 WO 01/34899和WO 01/14629中描述的那些。
淀粉酶組合物可以與其它a-淀粉酶組合，例如非產(chǎn)量提高型的a-淀粉酶。這些可以包括市售可得的淀粉酶，例如但不限于Duramy條、 Termamyl 、 Fungamyl 和BAN (Novo Nordisk A/S); Rapidase⑧和 Purastar (來自Genencor International, Inc.)。
纖維素酶可以向組合物中加入纖維素酶。適宜的纖維素酶包括細菌 或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)改造的突變體。適宜的纖 維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢霉屬、梭孢殼 屬(77i/e/av/")、枝頂孢屬(Jcre/m rt/"/w)的纖維素酶，例如如美國專利No. 4,435,307; 5,648,263; 5，691，178和5,776,757及國際PCT WO 89/09259公
開的自特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉(A^C^I'0/7/l^W"狄M附0/7/l"")和尖鐮孢產(chǎn)生 的真菌纖維素酶?？紤]-使用的示例性纖維素酶為對于紡織品具有顏色護理
益處的那些。此類纖維素酶的實例是例如EP 0495257、 EP 0531372、 WO 96/11262、 WO 96/29397和WO 98/08940中描述的纖維素酶。其它實例是 纖維素酶變體，例如WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315;美國專利No. 5,457,046; 5,686,593和 5,763,254中描述的那些。市售可得的纖維素酶包括Celluzyme⑧和 Carezyme (Novo Nordisk A/S); ClazinaseTM和Puradax HA (Genencor International, Inc.);以及KAC-500(B)TM (Kao Corporation)。
過氧化物酶/氧化酶考慮用于組合物的適宜過氧化物酶/氧化酶包括 植物、細菌或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)改造的突變體。 示例性過氧化物酶包括來自鬼傘屬(0^nVi附)，例如來自灰蓋鬼傘(C. c/"e"ws)的過氧化物酶，及其變體，如在WO 93/24618、 WO 95/10602和
55WO 98/15257中所述的那些。市售可得的過氧化物酶包括例如 GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S)。
可通過添加含有一種或多種酶的分開的添加劑，或通過添加包括所有 這些酶的組合的添加劑而在洗滌劑組合物中包括洗滌劑酶?？梢詫⑾礈靹?添加劑，即分開的添加劑或組合的添加劑，配制成例如顆粒、液體、漿液 等。示例性的洗滌劑添加劑劑型包括但不限于顆粒，特別是無粉塵顆粒； 液體，特別是穩(wěn)定的液體，或漿液。
可例如按照美國專利No. 4,106,991和4,661,452所公開來生產(chǎn)無粉塵 顆粒，并且可任選地用本領(lǐng)域已知的方法進行包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實例 是平均分子量為1,000至20,000的聚環(huán)氧乙烷產(chǎn)物(如聚乙二醇，PEG); 具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇 含有12-20個碳原子且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸； 以及脂肪酸的甘油單酯和甘油二酯及甘油三酯。例如GB 1483591給出了 適于通過流化床^L術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實例。可例如通過加入多元醇 諸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法來穩(wěn)定液態(tài)酶制 品?？砂凑杖鏓P 238,216公開的方法來制備受保護的酶。
通常，洗滌劑組合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、粉末、顆 粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是水性的，通常含有高達約70%的水，和 0%至約30%的有機溶劑。也可以考慮含有約30%或更少水的壓縮 (compact)洗涂劑凝膠。
洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，該表面活性劑可以是 非離子型，包括半極性和/或陰離子型和/或陽離子型和/或兩性離子型。表 面活性劑一般按以重量計約0.1%-60%的寬范圍存在。
當(dāng)包括在洗滌劑中時，洗滌劑典型地將含有約1%至約40%的陰離子 表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽、ot-烯烴磺酸鹽、烷基^l酸鹽(脂肪醇 硫酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、a-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或 烯基琥珀酸、或皂。
當(dāng)包括在洗滌劑中時，洗滌劑通常將含有約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二曱 基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷
基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-?；?N-烷基衍生物("葡糖酰胺")。
洗滌劑可含有0%至約65。/。的洗滌劑助劑或絡(luò)合劑(complexing agent),例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、 次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、 二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯 基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如來自Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可包括一種或多種聚合物。實例有羧曱基纖維素(CMC)、聚乙 烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶國N陽 氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、馬來^/丙烯酸共聚物) 和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可含有漂白體系，這可包括11202來源(例如過硼酸鹽或過碳酸 鹽)，其可以與形成過酸的漂白活性劑(如四乙酰基乙二胺或壬?；趸?br> 磺酸鹽)聯(lián)用?；蛘?，漂白體系可包括過氧酸(例如酰胺、亞胺或砜類過氧 酸)。漂白體系也可以是SI^漂白體系。
可使用常規(guī)的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定洗滌劑組合物中的酶，穩(wěn)定劑例如多元 醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳
族酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-曱?；交鹚??？砂凑誛O 92/19709
和WO 92/19708所述配制組合物。
洗滌劑也可含有其它常規(guī)洗滌劑成分，例如織物調(diào)理劑，包括粘土、 增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺細菌劑、 熒光增白劑、助水溶物、晦暗抑制劑或香料。
目前認為在洗滌劑組合物中，尤其是芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或 其變體，可以按相當(dāng)于每升洗液約0.01至約100 mg酶蛋白質(zhì)(例如每升洗 液約0.05至約5.0 mg酶蛋白質(zhì)，或每升洗液約0.1至約1.0 mg酶蛋白質(zhì)) 的量力口入。
7.方法
577.1濾膜篩選測定
下文所討論的測定法可用于篩選與親本a-淀粉酶相比，在高或低pH 和/或在Ca^耗竭條件下具有改變的穩(wěn)定性的Amy707 a-淀粉酶變體。
7.2高PH濾膜測定
將芽孢桿菌文庫涂布在具有10 jig/ml卡那霉素的TY瓊脂板上的醋酸 纖維素(OE 67， Schleicher & Schuell, Dassel， Germany)和硝化纖維素濾膜 (Protran-Ba 85， Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)夾層上，37。C至少 21小時。醋酸纖維素層位于TY瓊脂板上。
在涂板之后但是在孵育之前，用針對各濾膜夾層作出明確標記，以便 能夠定位濾膜上的陽性變體，將帶有結(jié)合的變體的硝化纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到 含有甘氨酸-NaOH緩沖液，pH 8.6-10.6的容器中，并在室溫(可在10-60。C 變動)孵育15分鐘。帶有菌落的醋酸纖維素濾膜室溫儲存在TY板上備用。 孵育后，在含有1%瓊脂糖、0.2。/。淀粉的板上于甘氨酸-NaOH緩沖液，pH 8.6-10.6中檢測殘留活性。具有硝化纖維素濾膜的測定板與濾膜夾層以相 同方式標記，并在室溫孵育2小時。在取出濾膜之后，測定板用10% Lugol 液染色。淀粉降解變體檢測為深藍背景上的白斑，隨之在儲存板上鑒定之。 陽性變體在與第一次篩選相同的條件下復(fù)篩兩次。
7.3低4丐濾膜測定
將芽孢桿菌文庫涂布在具有相應(yīng)抗生素(例如卡那霉素或氯霉素)的 TY瓊脂板上的醋酸纖維素(OE 67， Schleicher & Schuell, Dassd， Germany) 和硝化纖維素濾膜(Protran-Ba 85， Schleicher & Schuell， Dassel, Germany) 夾層上，37。C至少21小時。醋酸纖維素層位于TY瓊脂板上。
在涂板之后但是在孵育之前，用針對各濾膜夾層作出明確標記，以便 能夠定位濾膜上的陽性變體，將帶有結(jié)合的變體的硝化纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到 含有pH 8.5-10碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液和不同濃度EDTA (0.001 mM-100 mM)的容器中。濾膜在室溫孵育l小時。帶有菌落的醋酸纖維素濾膜室溫儲存在TY板上備用。孵育后，在含有1%瓊脂糖、0.2。/。淀粉的板上于pH 8.5-10碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液中檢測殘留活性。具有硝化纖維素濾膜的測 定板與濾膜夾層以相同方式標記，并在室溫孵育2小時。在取出濾膜之后， 測定板用10。/。Lugol液染色。淀粉降解變體檢測為深藍背景上的白斑，隨 之在儲存板上鑒定之。陽性變體在與第 一次篩選相同的條件下復(fù)篩兩次。
7.4低pH濾膜測定
將芽孢桿菌文庫涂布在具有10 ng/ml氯霉素的TY瓊脂板上的醋酸纖 維素(OE 67, Schleicher & Schuell， Dassel， Germany)和硝化纖維素濾膜 (Protran-Ba 85， Schleicher & Schuell， Dassel， Germany)夾層上，37。C至少 21小時。醋酸纖維素層位于TY瓊脂板上。
在涂板之后但是在孵育之前，用針對各濾膜夾層作出明確標記，以便 能夠定位濾膜上的陽性變體，將帶有結(jié)合的變體的硝化纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到 含有pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液的容器中，并在8(TC孵育20分鐘(當(dāng)篩選野生 型骨架的變體時)或在85。C孵育60分鐘(當(dāng)篩選親本a-淀粉酶的變體時)。 帶有菌落的醋酸纖維素濾膜室溫儲存在TY板上備用。孵育后，在含有1% 瓊脂糖、0.2%淀粉的測定板上于pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中檢測殘留活性。 具有硝化纖維素濾膜的測定板與濾膜夾層以相同方式標記，并在50。C孵育 2小時。在取出濾膜之后，測定板用10。/。Lugol液染色。淀粉降解變體檢 測為深藍背景上的白斑，隨之在儲存板上鑒定之。陽性變體在與第一次篩 選相同的條件下復(fù)篩兩次。
7.5 二次篩選
從儲存板上挑取復(fù)篩后的陽性轉(zhuǎn)化株，進行二次板測定試驗。陽性轉(zhuǎn) 化林在37。C在5ml LB+氯霉素中生長22小時。在pH 4,5的檸檬酸鹽緩沖 液中于卯。C孵育各陽性轉(zhuǎn)化林的芽孢桿菌培養(yǎng)物，以及作為對照表達相應(yīng) 骨架的克隆，并在0、 10、 20、 30、 40、 60和80分鐘取樣。將3 pl樣品 點種在測定板上。測定板用10。/。Lugol液染色。改進的變體被視為比骨架
59具有更高殘留活性(以測定板上的暈圈檢觀'J)的變體。通過核苷酸測序?qū)Ω?進的變體予以確定。
7.6未純化變體的穩(wěn)定性測定
變體的穩(wěn)定性可測定如下表達欲分析的變體的芽孢桿菌培養(yǎng)物在10 mlLB+氯霉素中于37。C生長21小時。將800 pl培養(yǎng)物與pH 4.5的200 pl 檸檬酸鹽緩沖液混合。在PCR管中制備對應(yīng)于取樣時間點數(shù)的多個70 nl 等分試樣，并在PCR儀中于7(TC或卯。C孵育不同時間點(一般5、 10、 15、 20、 25和30分鐘)。O分鐘的樣品不在高溫孵育。樣品中的活性通過將20 pl轉(zhuǎn)移到200 pi a-淀粉酶PNP-G7底物MPR3 ((Boehringer Mannheim Cat. no. 1660730)中進行測量，如下文"a-淀粉酶活性測定"所述。結(jié)果繪圖為相 對于時間的活性百分比(相對于0時間點)，或表述為孵育一定時間段后的 殘留活性百分比。
7,7 a-淀粉酶變體的發(fā)酵和純化
持有相關(guān)表達質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌菌抹可如下發(fā)酵和純化菌株自 -80。C的母板劃線到具有10照/ml卡那霉素的LB瓊脂板上，并在37。C過 夜生長。將菌落轉(zhuǎn)移到500 ml搖瓶中補加有10照/ml氟*素的100 ml PS-1 培養(yǎng)基中。
PS-1培養(yǎng)基的組成
珍^MI ( pearl sugar) 100 g/1
大豆豆粕 40 g/1
Na2HP04， 12 H20 10 g/1
PluronicTM PE 6100 0.1 g/1
CaC03 5 g/1
培養(yǎng)物在37。C以270 rpm振蕩5天。通過4500 rpm離心20-25分鐘從發(fā)酵肉湯中除去細胞和細胞碎片。然 后過濾上清液，以獲得完全清亮的溶液。濾液在UF-濾膜(10000截斷膜) 上濃縮和洗滌，并將緩沖液更換為pH 5.5的20 mM乙酸鹽。將UF-濾液 上樣到S-sepharose F.F.柱，通過用0.2 M NaCl在相同緩沖液中逐步洗脫 來進行洗脫。洗脫物以pH 9.0的10 mM Tris進行透析，上樣到Q-sepharose F.F.柱上，并用0-0.3 M NaCl線性梯度經(jīng)6倍柱體積進行洗脫。合并包含 活性(通過Phadebas測定來測量)的級分，調(diào)整pH至pH 7.5，并通過用0.5% 重量體積比的活性炭處理5分鐘來除去余色。
7.8比活確定
比活利用Phadebas⑧測定(Pharmacia)確定為活性/mg酶。遵循生產(chǎn)商 的說明(還請參見下文"a-淀粉酶活性測定")。
7.9等電點的確定
pl通過等點聚焦(ex: Pharmacia, Ampholine， pH 3.5-9.3)來確定。 7.10加速穩(wěn)定性測定
在50 ml丙烯管中加入IO ml目的洗滌劑。對Amy707t和Amy707tARS 均進行適當(dāng)?shù)南♂專瑥亩饕晕^移取180 ppm至含洗滌劑的獨立管中進 行測量。各突變酶與洗滌劑一起渦旋30秒，然后置于RotaMix (ATR RKVS 型)上10分鐘。用吸頭取IOO nl具有突變酶的洗滌劑并進行1:651稀釋。 利用封閉的對硝基苯麥芽七糖(P-Nitro-Phenyl-Maltoheptaose，封閉的 PBNPG7)底物在20XT型Konelab上測定突變體的初始活性。洗滌劑樣品 隨之在設(shè)置為37。C的恒溫溫箱中孵育。在l、 2、 4、 7和17天取樣，并測 定酶活。
7.11 a-淀粉酶活性測定 7.11.1 Phadebas測定
61a-淀粉酶活性通過采用Phadebas⑧片作為底物的方法來確定。 Phadebas片(Phadebas⑥淀粉酶試驗,由Pharmacia Diagnostic供應(yīng))含有 交聯(lián)的不溶性藍色淀粉聚合物，其已與牛血清白蛋白和緩沖物質(zhì)混合并壓 制成片。
對于每一單個的測量，將一片懸浮在含5 ml 50 mM Britton-Robinson 緩沖液(50 mM乙酸，50 mM磷酸，50 mM硼酸，0.1 mM CaCl2， pH用 NaOH調(diào)整至目的值)的管中。試驗在水浴中于目的溫度進行。待測的a-淀粉酶在x ml 50 mM Britton-Robinson緩沖液中稀釋。將1 ml此a-淀粉 酶溶液添加到上述5 ml 50 mM Britton-Robinson緩沖液中。淀粉4皮a-淀粉 酶水解產(chǎn)生可溶性藍色片段。所得藍色溶液的吸光度在620 nm通過分光 光度法測量，為a-淀粉酶活性的函數(shù)。
重要的是在10或15分鐘孵育(試驗時間)后所測量的620 nm吸光度處 于620 nm的0.2-2.0個吸光度單位的范圍。在此吸光度范圍內(nèi)，活性和吸 光度之間存在線性關(guān)系(Lambert-Beer定律)。因此必須調(diào)整酶的稀釋度以 符合此準則。在規(guī)定的一組條件(溫度、pH、反應(yīng)時間、緩沖條件)下，lmg 給定的a-淀粉膝會水解確定量的底物，并會生成藍顏色。顏色強度在620 nm測量。在給定的該組條件下，所測的吸光度與所討論a-淀粉酶的比活(活 性/mg純ot-淀粉酶蛋白)成正比。
7.11.2可選方法
a-淀粉酶活性可以通過采用PNP-G7底物的方法來確定。PNP-G7為對 硝基笨-a-D-麥芽七糖苷的縮寫，為封閉的寡糖，可被內(nèi)切淀粉酶切割。在 切割后，試劑盒中所包括的a-葡萄糖苷酶消化底物，釋方文游離的、帶黃顏 色的PNP分子，因此可在3i=405 nm (400-420 nm)處通過可見光分光光度 法來測量。含有PNP-G7底物和a-葡萄糖苷酶的試劑盒由 Boehringer-Mannheim (貨號1054635)生產(chǎn)。
為制備試劑溶液，按照生產(chǎn)商的建議，將10ml底物/緩沖溶液添加到 50 ml酶/緩沖溶液中。通過將20 nl樣品轉(zhuǎn)移到96孔孩t滴定板中并在25°C孵育，來進行測定。加入在25。C預(yù)平衡的200fU試劑溶液?；旌先芤?，預(yù) 孵育1分鐘，然后在ELISA讀板器中每30秒鐘測量OD 405 nm的吸光度 一次，為時4分4中。
在給定設(shè)置條件下，時間依賴性吸光度曲線的斜率與所討論cx-淀粉酶 的活性成正比。
7.12洗滌劑組合物中酶性能的確定 7.12.1美國條件
應(yīng)用Terg-o-to meter, United States Testing, Hoboken， N.J.-為模
擬美國洗涂條件下的洗滌試驗，使用標準洗滌劑，如不含熒光增白劑的液 體AATCC 2003和/或粉末AATCC 1993 (美國紡織品化學(xué)家和配色師協(xié)會， American Association of Textile Chemists and Colorists)，在20。C進行目的 突變酶的劑效曲線(DEC)。然后進行比較性a-淀粉酶的對應(yīng)DEC,以比較 本發(fā)明突變酶的污漬去除性能。在40。C重復(fù)此方法。 一般，將4個CS-28 稻淀粉污漬樣片(swatch)(荷蘭的CFT)置于Terg-o-tometer的鋼容器中， 其中裝有l(wèi)L去離子水和1.5g液體AATCC。當(dāng)使用粉末AATCC時，在 分才斤天平(PM4800型，Mettler Instrument Corp" Highstown， NJ. 08520)上 稱重1.5 g洗滌劑粉末，并添加到Terg-o-tometer中。同時進行兩份重復(fù)。 除非另有說明，試驗進行12分鐘，并漂洗3分鐘。洗滌后，樣片風(fēng)干，并 用Konica Minolta生產(chǎn)的CR-410型Chroma Meter來測量試驗樣片的反 射率。收集的數(shù)據(jù)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析進行處理。
7.12.2歐洲條件
應(yīng)用Atlas Company, Atlanta, Georgia生產(chǎn)的Launder-O調(diào)meter-
為;f莫擬歐洲洗滌條件下的洗滌試驗，^使用標準歐洲試驗洗滌劑，即IECA 以及IEC A帶漂白劑(TAED-四乙?；叶反姿猁})和過硼酸鈉，在40°C 進行目的突變酶的劑效曲線(DEC)。然后進行比較性突變酶的對應(yīng)DEC曲 線，以比較本發(fā)明突變酶的污潰去除性能。如果期望的話，在更高的洗滌溫度重復(fù)此方法。 一般，將4個EMPA 161玉米淀粉樣片(EMPA，瑞士) 置于裝有250 ml去離子水、含6.8 g/L IEC A洗滌劑或8.0 g/L帶漂白劑的 IECA的鋼容器中。同時進行兩份重復(fù)。除非另有說明，試驗進行45分鐘， 并漂洗5分鐘。洗滌后，樣片風(fēng)干，并用CR-410型Chroma Meter來測 量試驗樣片的反射率。收集的數(shù)據(jù)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析進行處理。
7.12.3評估洗滌劑組合物的微樣片法
存在眾多a-淀粉酶清潔測定法。檢測清潔的示例性描述包括如下。 "樣片"是其上施有污漬的一塊材料，諸如織物。該材料可以是例如由 棉、聚酯或天然和合成纖維的混合物制成的織物。樣片還可以是紙，例如 濾紙或硝化纖維素，或者是一塊硬材料，例如陶瓷、金屬或玻璃。對于淀 粉酶，污漬是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、 菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、色素、油或這些化合物的混合物。 "小樣片"是自樣片上用單孔穿孔裝置切下的部分，或者用定制的96 孔穿孔裝置(該多孔穿孔模式與標準96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者 是以其它方式自樣片上取下的部分。樣片可以是紡織品、紙、金屬或其他 適宜的材料。小樣片可以在放入24孔、48孔或96孔樣b'離定板孔之前或之 后被污物固著。"小樣片，，也可以通過向小塊材料施加污物而制成。例如， 小樣片可以是直徑為5/8"或0.25"的污染的織物片。設(shè)計定制的穿孔機， 從而同時將96個樣片遞送至96孔板的所有孔中。該裝置通過簡單地向同 一96孔板多次上樣，而允許向每孔遞送一個以上的樣片。可以想到將多孔 穿孔裝置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同時 遞送多個樣片。另一可想到的方法中，污染的測試平臺可以是由被污物載 污體所包覆的金屬、塑料、玻璃、陶瓷，或其他適宜材料形成的珠，用于 檢驗在紡織品以外的材料上使用的清潔組合物。然后將一個或多個污物包 覆的珠it^含有適宜緩沖液和酶的96孑L、 48孔或24孔板的孔中或更大格 式的板的孔中。這種情況下，可以通過直接吸光度測量或在二級生色反應(yīng) 后檢測上清液中釋放的污染物。也可以通過質(zhì)譜分析來進行釋放的污染物
64的分析。另 一微量篩選試驗可以將樣片(例如錠藍染色的粗斜棉布)遞送并 固定到多孔板的孔中，加入顆粒諸如沙或更大的顆粒(例如經(jīng)過篩濾以包括
6-8或9號(gauge)顆粒的石榴石)，并攪動多孔板以便由加入的顆粒造成樣 片磨損。這種測定可用于在石洗應(yīng)用中評估纖維素酶。可以通過釋放到反 應(yīng)緩沖液中的顏色(例如，釋放的散藍溶解到二甲基亞砜中并測量A鍋nm 的吸光度)或通過對磨損的樣片測量反射率來判斷酶的效力。
例如，當(dāng)在無漂白劑的洗滌劑中洗滌未處理的BMI (血'^/乳/墨)樣片 時，即使不借助于蛋白酶也釋放出大部分的墨。加入蛋白酶導(dǎo)致墨水釋放 的小量增加，這在大背景下可能難于量化。 一方面提供了允許人們控制污 漬固著程度的處理方法。結(jié)果是，可以產(chǎn)生例如當(dāng)在不存在被檢測的酶的 情況下進^f亍洗滌時能釋;^文出變化量的污漬的樣片。污漬固著的樣片的使用 導(dǎo)致在洗滌測定中信噪比的顯著提高。此外，通過改變固著程度，可以產(chǎn) 生在不同清潔條件下給出最佳結(jié)果的污潰。
在多種材料類型上具有已知"強度"的污漬的樣片是市售可得的 (EMPA， St. Gallen,瑞士； wfk—Testgewebe GmbH， Krefeld德國；或 Center for Test Materials, Vlaardingen，荷蘭)，和/或可以由從業(yè)者制得 (Morris和Prato， /ow""/ 52(4): 280 286 (1982))。其他試
驗樣片包括但不限于含棉織物上的血、^/乳/墨水(BMI)污漬、含棉織物上 的菠菜污漬、或含棉織物上的草、以及含棉織物上的巧克力/乳/煙灰。
可用0.0003。/。-0,3。/。的過氧化氫將BMI污漬固著在棉上。其他組合包 括用0.001%-1%戊二醛固著的草或菠菜、用0.001%-1%戊二醛固著的明 膠和考馬斯亮蘭污漬、或用0.001%-1%戊二醛固著的巧克力、乳和煙灰。
也可以在與酶和/或洗滌劑制劑孵育期間攪拌樣片。洗滌性能數(shù)據(jù)取決 于孔中，尤其是在96孔板中的樣片的取向(水平對垂直)。這表明在孵育期 間混合是不充分的。盡管存在許多方式來保證孵育期間充分的攪拌，但可 以構(gòu)建將微滴定板夾在兩個鋁板之間的板夾。這可以簡單地例如在孔上放 置粘性板密封物，然后用任何類型的適合的、市售可得的夾子將兩個鋁板 與96孔板加緊而實現(xiàn)。然后可以將它放到商品化的孵育搖床中。將搖床設(shè)定為約400rpm將產(chǎn)生非常有效的混合，而板夾有效地阻止了泄漏或交叉 污染。
可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)來量化洗液中的氨基基團濃度。這可以 用作從樣片中去除的蛋白質(zhì)量的量度(參見例如Cayot和Tainturier， 祝oc/^w. 249: 184-200 (1997))。然而，如果洗滌劑或酶樣品導(dǎo)致形成異乎 尋常小的肽片段(例如，因樣品中存在肽酶所致)，那么將會得到較大的 TNBS信號，即更多"噪音"。
另 一用于測量對血液/乳/墨水或其它污漬的洗滌性能的手段是基于墨 水的釋放。樣片上蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解導(dǎo)致墨水顆粒的釋放，這可以通過 測量洗液的吸光度而量化?？梢栽?50和800 nm之間的〗壬何波長測量吸 光度?？梢栽?10nm或620nm處測量波長。也可以檢查洗液以確定對于 含有草、菠菜、明膠或考馬斯亮蘭染料的污漬的洗潦性能。對于這些污漬， 示例性的波長包括針對菠菜或草的670 nm和針對明膠或考馬斯染料的620 nm。例如，取出等份的洗液(例如，通常來自96孔微板的100-150 pL)并 放到小杯或多孔賴L板中。然后放到分光光度計中并在適當(dāng)?shù)牟ㄩL讀取吸光 度。
也可以使用該體系，例如通過使用在諸如布、塑料或陶瓷的適宜載污 體上的血液/乳/墨水污漬，來測定用于餐具洗滌的增強的酶和/或洗滌劑組 合物。
一方面，通過在25。C將0.3%過氧化氫施加到BMI/棉樣片上30分鐘 或通過在60。C將0.03%過氧化氫施加到BMI/棉樣片上30分鐘，來固著 BMI污漬。從BMI/棉樣片上切下約0.25'，的小樣片并;^ 96孔孩"離定板 的孔中。向各孔中i文入已知的洗滌劑組合物和酶如變體蛋白質(zhì)的混合物。
向微滴定板頂部放置粘性板密封物后，將微滴定板與鋁板夾在一起，并在 定軌搖床上以約250 rpm攪拌約10-60分鐘。這個時間結(jié)束后，將上清液 轉(zhuǎn)移到新的微滴定板的孔中并測量620 nm的墨水吸光度。這可以類似地 用通過在25。C向菠菜/棉樣片或草/棉樣片施加0.01%戊二醛30分鐘而固著 在棉上的菠菜污漬或草污漬來進行檢測。這也可以用巧克力、乳和/或煙灰
66污漬完成。其他血液/乳/墨水測定和條件在美國專利No. 7，122，334 (Genencor International, Inc.)中提供。
7.13 LAS敏感性的確定
變體與不同濃度的LAS (線性烷基笨璜酸鹽；Nansa 1169/P)在40。C孵 育10分鐘。
殘留活性利用Phadebas⑧測定法或采用PNP-G7底物的可選方法來確定。
LAS在pH 7.5的0.1 M磷酸鹽緩沖液中稀釋。
使用如下濃度500 ppm、 250 ppm、 100 ppm、 50 ppm、 25 ppm和 10ppm,或無LAS。
變體在總體積10 ml中于不同LAS緩沖液中稀釋至0.01-5 mg/1的濃 度，并在溫度控制的水浴中孵育IO分鐘。通過將小份試樣轉(zhuǎn)移到冷測定緩 沖液中終止孵育。為了不影響活性測量，重要的是在活性測量期間，LAS 濃度低于1 ppm。
然后利用上述Phadebas⑧測定或可選方法一式兩份來確定殘留活性。 扣除空白后來度量活性。無LAS的活性為100%。
8.生物膜去除組合物及用途
組合物可以包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體作為主要的酶 組分，例如單組分組合物，用于去除生物膜?；蛘?，組合物可以包括多種 酶活性，例如多種淀粉酶，或包括如下任意組合的酶混合物氨肽酶、淀 粉酶(p-或a-或葡糖-淀粉酶)、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾 丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖 苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、卣代 過氧化物酶(hal叩eroxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化 酶、果膠裂解(pectinolytic)酶、肽基谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過 氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶，或其任意組合，用于去除生物膜。這些其他酶可通過屬 于曲霉屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬(例如特異腐質(zhì)霉)及鐮孢霉屬的微生物生產(chǎn)。 示例性曲霉屬成員包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉。示例性鐮
孢霉屬成員包括桿孢狀鐮孢、F. cweato、 F. C7^ A:M^//e"se、大刀鐮孢、禾 本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅 鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、F.麵/仍畫、擬絲孢鐮孢和
包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的組合物可以按照本領(lǐng)域 已知的方法制備，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，含芽孢桿菌 屬物種707 a-淀粉酶或其變體的組合物可以是顆?；蛭㈩w粒的形式。包括 在組合物中的多肽可以按照本領(lǐng)域已知的方法穩(wěn)定化。
下文給出了多肽組合物用途的實例。含芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶 或其變體的組合物的用量及組合物使用的其他條件可以基于本領(lǐng)域已知的 方法來確定。
還考慮芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體與2，6-p-D-果聚糖水解
酶或其變體一起用在組合物中。
另一方面考慮瓦解和/或去除生物膜的組合物。如本文所用的術(shù)語"瓦 解"應(yīng)理解為水解生物膜基質(zhì)中將生物膜中的個體微生物細胞連接并結(jié)合 在一起的多糖，從而所述微生物細胞能夠從生物膜中釋放并去除。生物膜 一般存在于表面，故生物膜的瓦解通過使表面接觸(例如通過浸沒、覆蓋或 噴灑表面)含有芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體或一種或多種其他 負責(zé)降解生物膜的酶(例如但不限于2，6-P-D-果聚糖水解酶)的水性介質(zhì)而 實現(xiàn)。組合物可用于水解例如紙漿業(yè)和紙業(yè)白水中的腐漿(slime)。
芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的存在量可以是0.0001-10000 mg/L; 0.001-1000 mg/L; 0.01-100 mg/L或0.1-10 mg/L。其他酶及酶變體 可以以相似或更〗氐的量存在。
該方法可以適宜地在室溫至約70。C的溫度進行。示例性的溫度范圍包 括約30'C至約6(TC，例如約40。C至約50'C。
68用于水解生物膜的適宜pH處在約3.5至約8.5的范圍。示例性的范圍 包括pH約5.5至約8，例如約6.5至約7.5。用于酶有效去除生物膜的接 觸時間或反應(yīng)時間可以變化相當(dāng)大，這取決于生物膜的特性以及用酶單獨 或組合其他生物膜降解酶如2，6-p-D-果聚糖水解酶處理表面的頻率。示例 性反應(yīng)時間可包括約0.25至約25小時，例如約1至約10小時，例如約2 小時。
可與芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體和2，6-(5-D-果聚糖水解酶 組合的其他生物膜降解酶包括但不限于纖維素酶，半纖維素酶，木聚糖 酶，其他淀粉酶，包括其他a-淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和/或果膠酶。
芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體還可以與抗微生物劑組合，例 如酶或非酶的生物殺滅劑。酶生物殺滅劑可以是例如包括氧化還原酶(例如 漆酶)或過氧化物酶(尤其是卣代過氧化物酶)和任選的增強劑(例如丁香酸 烷基酯)的組合物，例如國際PCT申請WO 97/42825和DK 97/1273中所 描述的那樣。
可以將生物膜自上去除和/或清除的表面例如是硬表面，其定義涉M 本上微生物不能透過的任何表面。表面的實例是由金屬例如不銹鋼合金、 塑料/合成聚合物、橡膠、板材、玻璃、木材、紙、紡織品、混凝土、巖石、 大理石、石膏及陶資材料制成的表面，其任選地以例如油漆、琺瑯、聚合 物等包覆。從而，表面可以是容納、運輸、處理或接觸水性溶液的系統(tǒng)(如 供水系統(tǒng)、食品處理系統(tǒng)、冷卻系統(tǒng)、化學(xué)品處理系統(tǒng)或藥物處理系統(tǒng)) 的構(gòu)件。提供了組合物和使用該組合物在木材加工業(yè)如紙漿和/或紙業(yè)去除 生物膜的方法。因此，酶變體和含有酶變體的組合物可用于常規(guī)的就地清 洗(C-I-P)系統(tǒng)。表面可以是系統(tǒng)單元(如管道、罐、泵、膜、濾器、熱交換 器、離心機、蒸發(fā)器、混合器、噴霧塔、閥門和反應(yīng)器)的一部分。表面也 可以是醫(yī)學(xué)科學(xué)和工業(yè)所用的器具(如污染的內(nèi)窺鏡、假體裝置或醫(yī)學(xué)內(nèi)植 物)或其部分。
用于生物膜去除的組合物也可以考慮用于防止當(dāng)金屬表面例如管道受 微生物生物膜攻擊時發(fā)生的所謂生物腐蝕，即通過瓦解生物膜，由此防止生物膜中的微生物細胞建立起腐蝕其所附著的金屬表面的生物膜環(huán)境。
抗生物膜組合物的另一應(yīng)用是口腔護理。不過，表面還可以是生物來
源的，如粘膜、皮膚、牙齒、毛發(fā)、指曱等。
具有牙菌斑的牙齒(例如通過將酶變體摻入牙骨中)以及污染的隱形眼
鏡包括在表面內(nèi)。因此，芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體可用在組 合物和方法中用于制備瓦解人或動物牙齒上的菌斑的藥物。另一用途是自 粘膜上瓦解生物膜，例如患有嚢性纖維化的患者肺中的生物膜。
因此，又另一方面涉及口腔護理組合物，包括重組酶，例如純化的基 本上不含任何活性污染物的酶。口腔護理組合物可以適宜地包括一定量的 重組酶。
用于口腔護理組合物的其他生物膜降解酶包括但不限于口腔護理組合 物中的2，6-P-D-果聚糖水解酶活性。所考慮的酶活性包括選自如下的酶的 活性葡聚糖酶；齒斑葡聚糖酶(mutanase);氧化酶，例如葡糖氧化酶， L-氨基酸氧化酶，過氧化物酶，例如WO 95/10602中所述的鬼傘屬物種 (Coprinus sp.)過氧化物酶，或乳過氧化物酶，卣代過氧化物酶，特別是可 以來源于彎孢霉屬(CWT"/flWas/7.)、特別是糙壁彎孢(C. vmm""/osfl)和不等 彎孢(C./m^《M"他)的卣代過氧化物酶；漆酶；蛋白酶例如木瓜蛋白酶，酸 性蛋白酶(例如WO 95/02044中所述的酸性蛋白酶)，內(nèi)切糖苷酶，脂肪酶， 淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，如AMG (來自Novo Nordisk A/S);抗微生 物酶，以及它們的混合物。
口腔護理組合物可以具有任何適宜的物理形式(即，粉末、糊劑、凝膠 劑、液體、膏劑、片劑等)。"口腔護理組合物"包括可用于維持或改善人和 動物口中口腔衛(wèi)生的組合物，預(yù)防齲齒、預(yù)防牙菌斑和牙垢形成、去除牙
菌斑和牙垢、預(yù)防和/或治療牙科疾病等。至少在該情況下，口腔護理組合 物的確也包括用于清潔假牙、人工牙齒等的產(chǎn)品。此類口腔護理組合物的 實例包括牙膏、牙霜、凝膠或牙粉、漱牙漱口水、刷牙前后的嗽洗制劑、 口香糖、錠劑和糖果。牙膏和牙凝膠一般包括磨擦拋光材料、發(fā)泡劑、矯 味劑、保濕劑、粘合劑、增稠劑、甜味劑、增白劑/漂白劑/去漬劑、水和
70任選地其它酶及酶組合。
嗽口水，包括菌斑去除液體， 一般包括7]C/醇溶液、香料、保濕劑、增 甜劑、發(fā)泡劑、著色劑和任選地其它酶或酶組合。
磨擦拋光材料也可以摻入到口腔護理組合物如牙粉(骨)中。
從而，磨擦拋光材料可以包括鋁及其水合物，例如三7JC合a-氧化鋁 (alpha alumina trihydrate);三硅酸鎂；碳酸鎂；高嶺土；鋁硅酸鹽，例如 煅燒硅酸鋁和硅酸鋁；碳酸鋦；硅酸鋯；還有粉狀塑料，例如聚氯乙烯； 聚酰胺；聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯；苯酚甲醛樹脂；蜜胺甲醛樹脂； 脲甲醛樹脂；環(huán)氧樹脂；粉狀聚乙烯；氧化硅干凝膠；水凝膠和氣凝膠等。 同樣適合作為磨料的有焦磷酸鉀；水不溶性堿性偏磷酸鹽；磷酸二鈣和/ 或其二水合物，正磷酸二釣；磷酸三鉤；羥基磷灰石顆粒等。還可以采用 這些物質(zhì)的混合物。
根據(jù)口腔護理組合物的不同，磨擦產(chǎn)品可以以重量計約0%至約70%， 或約1%至約70%存在。對于牙膏，磨料含量一般處于以最終牙骨重量計 10%-70%的范圍內(nèi)。
可以采用保濕劑以防止例如牙膏的水分流失。適合用于口腔護理組合
物的保濕劑包括如下化合物及其混合物甘油；多元醇；山梨糖醇；聚乙 二醇(PEG);丙二醇；1，3-丙二醇；1，4-丁二醇；氫化的部分水解多糖等。 保濕劑一般以重量計0%至約80%,或約5%至約70%存在于牙骨中。
二氧化硅、淀粉、黃芪膠、黃原膠、愛爾蘭苔(Irishmoss)提取物、藻 酸鹽、果膠、纖維素衍生物如羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基纖 維素鈉；聚丙烯酸及其鹽、聚乙烯吡咯烷酮，可提及作為適宜增稠劑和粘 合劑的實例，它們有助于穩(wěn)定牙粉(骨)產(chǎn)品。增稠劑在牙骨乳劑和凝膠中 的存在量可以是以終產(chǎn)品重量計約0.1%至約20%，而粘合劑達到約0.01 至約10%的程度。
可以使用陰離子、陽離子、非離子、兼性和/或兩性離子表面活性劑作 為發(fā)泡劑皂。這些可以以終產(chǎn)品重量計0%至約15%、約0.1至約13%或 約0.25%至約10%的水平存在。表面活性劑僅在其不對芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體施加失 活效應(yīng)的程度上是適宜的。表面活性劑包括脂肪醇硫酸鹽，磺化甘油單酯 或具10-20個碳原子的脂肪酸的鹽，脂肪酸-白蛋白縮合產(chǎn)物，脂肪酸酰胺 和?；撬岬柠}和/或脂肪酸羥乙基磺酸酯的鹽。
適宜的增甜劑包括制劑用糖精。
香料例如留蘭香通常以低含量存在，例如以重量計約0.01%至約5%， 尤其是約0.1%至約5%。增白劑/漂白劑包括11202，且可以以終產(chǎn)品重量 計低于約5%,或約0.25%至約4%的量添加。增白劑/漂白劑可以是酶， 例如氧化還原酶。適宜的牙齒漂白酶的實例為例如WO 97/06775中描述的 那些。
水通常以賦予例如牙膏可流動形式的量添加。
也可以包括其它水溶性抗菌劑，例如二葡萄糖酸氯己定，氨己嘧啶 (hexetidine)，雙胍咬(alexidine)，三氯生(Triclosan⑧)，季銨抗菌化合物， 以及水溶性的某些金屬離子源，例如鋅、銅、銀和錫源(例如，氯化鋅、氯 化銅和氯化亞錫，以及硝酸銀)。
也可以考慮添加能夠用作為氟化物源的化合物、色素/著色劑、防腐劑、 維生素、pH調(diào)節(jié)劑、防齲劑、脫敏劑等。
當(dāng)生物膜降解酶用于清潔口腔時可提供若干益處。蛋白酶降解唾液蛋 白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)吸附在牙齒表面并形成薄膜(pdlide)，即所致菌斑的第 一層。蛋白酶連同脂肪酶一起通過裂解構(gòu)成細菌細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)組分的 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)而^f皮壞細菌。
葡聚糖酶及其他糖酶如2，6-P-D-果聚糖水解酶可以降解細菌所產(chǎn)生 的、形成細菌粘附基質(zhì)的有機骨架結(jié)構(gòu)。蛋白酶和淀粉酶不僅防止牙菌斑 形成，而且還可以通過降解結(jié)合4丐的糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物防止礦化，從而阻止
牙垢發(fā)展。
牙骨一般可以包括如下成分(以最終牙骨組合物的重量百分比計)磨 料至約70%;保濕劑0%至約80%;增稠劑約0.1%至約20%;粘合 劑約0,01%至約10%;增甜劑約0.1%至約5%;發(fā)泡劑0%至約15%;增白劑0%至約5%;和酶約0.0001%至約20%。
在一個具體實施方案中，牙骨具有在約6.0至約8.0范圍內(nèi)的pH，且 包括a)約10%至約70%的磨料；b) 0%至約80%的保濕劑；c)0.1。/o至約 20%的增稠劑；d)0.01。/o至約10%的粘合劑；e)約0.1%至約5%的增甜劑； f) 0%至約15%的發(fā)泡劑；g) 0%至約5%的增白劑；i)約0.0001%至約20% 的酶。
i)中所M的酶包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體，單獨或組 合其他生物降解酶如2，6-(3-D-果聚糖水解酶，和任選的已知用于牙骨中的 上述其他類型的酶等。
漱口劑 一般可以包括如下成分(以最終漱口劑組合物的重量百分比 計)0%至約20%的保濕劑；0%至約2%的表面活性劑；0%至約5%的 酶；0%至約20%的乙醇；0%至約2%的其他成分(例如香料，增甜劑活性 成分，如氟化物)。組合物還可以含有約0%至約70%的水。
漱口劑組合物可以用適當(dāng)?shù)木彌_劑進行緩沖，例如pH約6.0至約7.5 的檸檬酸鈉或磷酸鈉。漱口劑可以是非稀釋的形式(即，用前必須稀釋)。
口腔護理組合物可以利用任何口腔護理領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來生產(chǎn)。
9.淀粉加工組合物及用途
另一方面，可利用具有所公開的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變 體的組合物進行淀粉液化或糖化。
一方面考慮由淀粉生產(chǎn)增甜劑的組合物及組合物的用途。將淀粉轉(zhuǎn)換 為果糖糖漿的"傳統(tǒng)，，方法通常包括三個連續(xù)的酶促步驟，即，液化步驟， 接著是糖化步驟，以及異構(gòu)化步驟。在液化步驟中，在約5.5至約6,2的 pH值、約95。C至約160。C的溫度，通過為期約2個小時的芽孢桿菌屬物 種707 a-淀粉酶或其變體的作用，使淀粉降解為糊精。為確保這些條件下 的最佳酶穩(wěn)定性，可以添加1 mM的鈣(40 ppm游離鈣離子)。淀粉加工可 用于生產(chǎn)醇(例如，谷物液化用于燃料和飲用酒、酒類釀造)、淀粉液化用 于增甜劑生產(chǎn)、蔗糖加工及其他食品相關(guān)的淀粉加工目的。對于不同的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體，可應(yīng)用其他條件。
液化步驟后，可以通過添加葡糖淀粉酶(例如AMGT^)和脫支酶(如異 淀粉酶或普魯蘭酶(例如Promozyme⑧))，將糊精轉(zhuǎn)換為葡萄糖。在此步驟 之前，將pH降至低于約4.5的值，維持高溫(高于95。C)，并變性液化芽孢 桿菌屬物種707a-淀粉酶或其變體的的活性。使溫度降至60。C，可以加入 葡糖淀粉酶和脫支酶。糖化過程通常進行約24至約72小時。
糖化步驟之后，將pH升至處于約6.0至約8.0范圍的值(例如pH 7.5)， 并通過離子交換除去鉀。然后利用例如固定化的葡萄糖異構(gòu)酶(如 Sweetzyme⑧)將葡萄糖漿轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿。
此過程可以進行至少一種降&改進降低液化芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的的鈣依賴性。為了確保芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或 其變體的足夠高的穩(wěn)定性，需要添加游離的鈣，但是游離的鈣強烈抑制葡 萄糖異構(gòu)酶的活性，故而需要通過昂貴的單元操作去除，達到游離鈣的水 平降至低于3-5ppm的程度。如果能夠避免這樣的操作，且液化過程無需 添加游離釣離子即能進^f亍，則可以獲得費用的節(jié)約。
例如，可在組合物和操作中利用鈣依賴性較小的酶，其在低濃度游離 鉤(<40 ppm)時穩(wěn)定且具有高活性。這樣的芽孢桿菌屬物種7(V7 a-淀粉酶或 其變體應(yīng)當(dāng)具有位于pH范圍約4.5至約6,5或者約4.5至約5.5中的最適 pH。
可利用芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體在實驗室及工業(yè)設(shè)置中 水解淀粉或任何含麥芽糖糊精的化合物以用于多種目的。這些芽孢桿菌屬 物種707 a-淀粉酶或其變體可以單獨使用以提供特異性水解，或者可以與 其他淀粉酶組合以提供具有廣譜活性的"混合物"。示例用途包括從生物學(xué)、 食品、動物飼料、藥學(xué)或工業(yè)樣品中去除或部分或完全水解淀粉或任何含 麥芽糖糊精的化合物。
另一方面考慮組合物和在發(fā)酵方法中使用該組合物的方法，在該發(fā)酵 方法中淀粉底物在芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的存在下被液化 和/或糖化以產(chǎn)生葡萄糖和/或麥芽糖，其適于由發(fā)酵生物如酵母轉(zhuǎn)換為發(fā)酵產(chǎn)品。此類發(fā)酵方法包括用于生產(chǎn)燃料乙醇或飲用乙醇(飲用酒)的方法， 生產(chǎn)飲料的方法，生產(chǎn)期望有機化合物(例如檸檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖 酸、葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鉤、葡萄糖酸鉀、葡萄糖酸8內(nèi)酯或異抗壞血 酸鈉)、酮、氨基酸(例如谷氨酸、單谷氨酸鈉)、以及更為復(fù)雜的化合物(例
如抗生素，如青霉素、四環(huán)素)、酶、維生素(例如核黃素、維生素B12、 p-胡羅卜素)和激素(它們難于合成生產(chǎn))的方法。
待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉質(zhì)量，例如至少卯％、至少 95%、至少97%或至少99.5%純?；蛘?，淀粉可以是較為粗制的含淀粉材 料，包括經(jīng)碾磨的整個谷粒(包括非淀粉級分如胚殘留物和纖維)。碾磨原 料如整個谷粒的目的是打開其結(jié)構(gòu)，從而允許進一步加工?？梢允褂脙煞N 碾磨方法濕磨法和干磨法。此外，可以^使用玉米渣例如碾磨過的玉米渣。
千磨的谷粒除淀粉外還將包含顯著量的非淀粉糖類化合物。當(dāng)通過噴 射蒸煮加工這樣的異質(zhì)原料時，往往僅能實現(xiàn)淀粉的部分糊化。由于芽孢
桿菌屬物種707 (x-淀粉酶或其變體對未糊化的淀粉具有高活性，故該酶可 以有利地應(yīng)用在包括液化和/或糖化噴射蒸煮干磨淀粉的方法中。
此外，由于芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體優(yōu)越的水解活性， 極大地降低了糖化步驟期間對葡糖淀粉酶的需求。這允許糖化作用在極低 水平葡糖淀粉酶活性下進行，葡糖淀粉酶活性或者不存在，或者如果存在 的話，其存在量僅僅是或者甚至低于0.5 AGU/g DS;或者僅僅是或者甚至 低于0.4 AGU/g DS;或者僅僅是或者甚至低于約0.3 AGU/g DS;或者低 于0.1 AGU，例如僅僅是或者甚至低于約0.05 AGU/g DS的淀粉底物。"DS" 是每克干固形物底物加入的酶單位。以mg酶蛋白質(zhì)表達，具有葡糖淀粉 酶活性的酶或者不存在，或者其存在量僅僅是或者甚至低于約0.5 mg EP/g DS;或者僅僅是或者甚至低于約0.4mgEP/gDS;或者僅僅是或者甚至低 于約0.3mgEP/gDS;或者僅僅是或者甚至低于約0.1 mg EP/g DS，例如 僅僅是或者甚至低于約0.05 mg EP/g DS,或者僅僅是或者甚至低于0.02 mg EP/g DS的淀粉底物。葡糖淀粉酶可以源自曲霉屬、籃狀菌屬 (7Vi/"ay 附j(luò)^^ sp.)、尸"c/^^^wpow sp.或栓菌屬(rmwetes sp.)的菌林，其中
75示例性的實例為黑曲霉、埃默森籃狀菌(rfl/"fw^c^e/wefww//)、瓣環(huán)栓菌
該方法可以包括a)使淀粉底物與包含具a-淀粉酶活性的催化模塊和碳 水化合物結(jié)合模塊的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體(例如第一方 面的多肽)接觸；b)使所述淀粉底物與所述酶在足以實現(xiàn)至少90%或至少 92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 至少99.5% w/w所述淀粉底物轉(zhuǎn)換為可發(fā)酵糖的溫度和一段時間內(nèi) 一起孵 育；c)發(fā)酵以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品；和d)任選地回M酵產(chǎn)品。在方法步驟b)和 /或c)期間，具有葡糖淀粉酶活性的酶不存在，或者其存在量為0.001-2.0 AGU/gDS、 0.01-1.5 AGU/gDS、 0.05-1.0 AGU/g DS、 0.01-0.5 AGU/g DS。 具有葡糖淀粉酶活性的酶可以不存在，或者其存在量僅僅是或者甚至低于 0.5 AGU/g DS;或者僅僅是或者甚至低于0.4 AGU/g DS;或者僅僅是或者 甚至低于0.3 AGU/g DS;或者僅僅是或者甚至低于0.1 AGU/g DS，例如 僅僅是或者甚至低于0.05 AGU/gDS淀粉底物。以mg酶蛋白質(zhì)表達，具 有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者其存在量僅僅是或者甚至低于0.5 mgEP/gDS;或者僅僅是或者甚至低于0.4 mg EP/g DS;或者僅僅是或者 甚至低于0.3 mg EP/g DS;或者僅僅是或者甚至低于0.1 mg EP/g DS，例 如僅僅是或者甚至低于0.05 mg EP/g DS，或者僅僅是或者甚至低于0.02 mgEP/gDS淀粉底物。方法步驟a)、 b)、 c)和/或d)可以分開或同時進行。
另一方面，方法可以包括a)使淀粉底物與經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達包含具a-淀 粉酶活性的催化模塊和碳水化合物結(jié)合模塊的芽孢桿菌屬物種707 (x-淀粉 酶或其變體的酵母細胞接觸；b)使所述淀粉底物與所述酵母在足以實現(xiàn)至 少90% w/w所述淀粉底物轉(zhuǎn)換為可發(fā)酵糖的溫度和一段時間內(nèi)一起孵育； c)發(fā)酵以生產(chǎn)乙醇；和d)任選地回收乙醇。步驟a)、 b)和c)可以分開或同 時進行。
再另一方面，方法包括水解糊化的淀粉或顆粒淀粉的漿液，特別是在 物。除了與包含具a-淀粉酶活性的催化模塊和碳水化合物結(jié)合模塊的多肽接觸，淀粉還可以與如下之任一種或多種接觸真菌a-淀粉酶(EC 3,2.1.1) 以及一種或多種如下酶p-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。 再一方面，可向芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體中添加其他淀粉水 解酶或脫支酶，例如異淀粉酶(EC 3.2.1.68)或普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)。
在一實施方案中，所述方法在低于初始糊化溫度的溫度實施。此類方 法時常在至少30。C、至少31。C、至少32。C、至少33。C、至少34。C、至少 35。C、至少36。C、至少37。C、至少38°C、至少39°C、至少40°C、至少41。C、 至少42。C、至少43。C、至少44。C、至少45。C、至少46。C、至少47。C、至 少48。C、至少49。C、至少50。C、至少51。C、至少52。C、至少53""C、至少 54°C、至少55°C、至少56°C、至少57°C、至少58°C、至少59。C或至少60°C 實施。實施所述方法的pH可以處于約3.0至約7.0、或約3.5至約6.0、或 約4.0至約5.0的范圍。 一方面考慮包括發(fā)酵的方法，例如，在32。C左右(例 如30-35。C)的溫度，例如利用酵母生產(chǎn)乙醇。
另一方面，所述方法包括同時進行的糖化和發(fā)酵，例如，在30-35。C(例 如32。C左右)的溫度，例如利用酵母生產(chǎn)乙醇或者利用其他適宜的發(fā)酵生 物生產(chǎn)期望的有機化合物。
在上述發(fā)酵方法中，乙醇含量達到至少約7%、至少約8%、至少約 9%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、 至少約15%，例如至少約16。/。乙醇。
在上述任何方面中使用的淀粉漿可以具有約20%至約55%的干固形 物顆粒淀粉，或約25%至約40%的干固形物顆粒淀粉，或約30%至約35% 的千固形物顆粒淀粉。在與芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體接觸之 后，酶將顆粒淀粉中的可溶性淀粉以至少85%、至少86%、至少87%、 至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的量轉(zhuǎn) 化成可溶性淀粉水解物。
在另一實施方案中，在用于液化、糖化糊化的淀粉(例如但不限于通過 噴射蒸煮進行的糊化)的方法中使用包含具a-淀粉酶活性的催化模塊和碳水化合物結(jié)合模塊的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體(例如第一方 面的多肽)。所述方法可以包括發(fā)酵以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇。通過發(fā)酵由 含淀粉原料生產(chǎn)乙醇的此類方法包括(i)用包含具cx-淀粉酶活性的催化模 塊和碳水化合物結(jié)合模塊的多肽(例如第一方面的多肽)來液化所述含淀粉 原料；(ii)糖化所得的液化醪；和(iii)在發(fā)酵生物的存在下發(fā)酵步驟(ii)所得 的物質(zhì)。任選所述方法還包括回收乙醇。所述糖化和發(fā)酵的方法可以以同 時糖化和發(fā)酵法(SSF法)實施。發(fā)酵期間，乙醇含量達到至少約7%、至少 約8%、至少約9%、至少約10%，例如至少約11%、至少約12%、至少 約13%、至少約14%、至少15%,例如至少16%乙醇。
在上述方面的方法中待加工的淀粉可以特別地來自塊莖、根、莖、豆 類、谷物或整個谷粒。更具體地，顆粒淀粉可以獲自玉米、玉米芯、小麥、 大麥、黑麥、買羅高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香 蕉或馬鈴薯。也考慮蠟質(zhì)及非蠟質(zhì)類型的玉米和大麥。
上文所述的組合物可用于液化和/或糖化糊化的或顆粒淀粉以及部分 糊化的淀粉。部分糊化的淀粉是在某種程度上糊化的淀粉，即，其中部分 淀粉已經(jīng)不可逆地溶脹和糊化，而部分淀粉仍以顆粒狀態(tài)存在。
上文所述的組合物可以包括以0.01-10.0 AFAU/g DS、或0.1-5.0 AFAU/g DS、或0.5-3.0 AFAU/AGU或0.3-2.0 AFAU/g DS的量存在的酸 性a-淀粉酶變體。所述組合物可以應(yīng)用于任^可上文所述的淀粉加工方法 中。
如本文所用，名詞或動詞形式的術(shù)語"液化"表示將淀粉轉(zhuǎn)化為鏈長較 短且粘性較小的糊精的過程。通常，此過程包括淀粉的糊化，同時或之后 添加芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體。也可以添加其他液化誘導(dǎo)酶。
如本文所用，術(shù)語"初次液化(primary liquefaction)"是指漿液溫度升至 或接近其糊化溫度時的液化步驟。繼溫度升高之后，4吏漿液傳送通過熱交 換器或噴射蒸煮器達到溫度200-300下，例如220-235下。繼應(yīng)用熱交換器 或噴射器溫度之后，使?jié){液在該溫度保持為期3-10分鐘。這種保持漿液處 于200-300下的步驟為初次液化。
78如本文所用，術(shù)語"二次液化，，是指繼初次液化(加熱至200-300下)之 后，當(dāng)漿液被允許冷卻至室溫時的液化步驟。此冷卻步驟可以是30分鐘至 180分鐘(3小時)，例如90分鐘至120分鐘(2小時)。
如本文所用，術(shù)語"二次液化的分鐘數(shù)"是指自二次液化開始時起所過 去的時間，即測量DE的時間。
另一方面考慮在包含芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的組合物 中額外應(yīng)用P-淀粉酶，p-淀粉酶(EC3.2.1.2)是外切產(chǎn)麥芽糖淀粉酶，其催 化直鏈淀粉、支鏈淀粉以及相關(guān)的葡萄糖聚合物中的1，4-a-糖苷鍵水解， 由此釋放麥芽糖。
已經(jīng)從多種植物和微生物中分離到p-淀粉酶(W. M. Fogarty和C. T. Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 15巻，112-115 頁，1979)。這些p-淀粉酶的特征在于具有處于40。C至65。C范圍內(nèi)的最適溫 度，以及處于約4.5至約7.0范圍內(nèi)的最適pH?？紤]的p-淀粉酶包括但不 限于來自大麥的p-淀粉酶Spezyme BBA 1500、 Spezyme DBA, Optimalt ME、 Optimalt BBA (Genencor International, Inc.); 以及 NovozymTM WBA (Novozymes AJS)。
考慮應(yīng)用在組合物中的另一種酶是葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。葡糖淀粉 酶來源于孩i生物或植物。示例性葡糖淀粉酶為真菌或細菌來源。示例性細 菌葡糖淀粉酶有曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶 (Bod等人，EMBO J. 3(5): 1097-1102 (1984))或其變體，例如WO 92/00381 和WO 00/04136中所^&開的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921);米曲 霉葡糖淀粉酶(Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949 (1991))或其變體或片段。
其他考慮的曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括增強熱穩(wěn)定性的變體GIVA 和G139A (Chen等人(1996)， TV".9: 499-505); D257E和D293E/Q (Chen等人(1995)， 8: 575-582); N182 (Chen等人(1994)，
J /oc/ie附./. 301 : 275-281); 二硫鍵A246C (Fierobe等人(1996)， B"d^鵬'^j， 35: 8698-8704);以及在A435和S436位置中引入Pro殘基(Li 等人(1997) Pn te/"10: 1199-1204)。其他考慮的葡糖淀粉酶包括籃狀
79菌屬葡糖淀粉酶，特別是來源于埃默森籃狀菌(WO 99/28448)、 ra/fliw^c^ /^cert"w"s (美國專利No. RE 32,153)、杜邦籃狀菌(7Wflfw^ces ^i/w/iri)、 嗜熱籃狀菌(r"/" 附F^幼w附o/7/^7/a)(美國專利No. 4,587,215)?？紤]的 細菌葡糖淀粉酶包括來自梭菌屬(C7oWnVZ/"柳)，特別是C. 狄er附oa附y(tǒng)/o(v,/cw附 (EP 135138)和 C 狄e簡o/^/msw^ii".cw附 (WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。示例性葡糖淀粉酶包括來源于米曲霉的葡糖淀粉 酶。還考慮商業(yè)葡糖淀粉酶，例如AMG 200L; AMG 300 L; SAN1^ SUPER 和AMGTM E (來自Novozymes); OPTIDEX 300 (來自Genencor International, Inc.); AMIGASE⑧和AMIGASE PLUS (來自DSM); G-ZYME G900 (來自Enzyme Bio-Systems); G-ZYME G990 ZR (黑曲 霉葡糖淀粉酶且低蛋白酶含量)。
可按0.02-2.0 AGU/gDS，或者0.1-1.0 AGU/g DS，例如0，2AGU/gDS
的量添加葡糖淀粉酶。
也可以考慮在組合物中包括其他酶和酶變體。除了芽孢桿菌屬物種 707 a-淀粉酶或其變體外，還可以使用一種或多種a-淀粉酶，或者還可以 包括本文中討論的其它酶。
可以任選加入的另一種酶是脫支酶，例如異淀粉酶(EC 3.2丄68)或普 魯蘭酶(EC 3.2.1.41)。異淀粉酶水解支鏈淀粉和P-極限糊精中的a-l，6-D-糖苷分支鍵，并且通過異淀粉酶不能攻擊普魯蘭及其對a-極限糊精的有限 作用而能夠與普魯蘭酶區(qū)別開來。可以按本領(lǐng)域4支術(shù)人員熟知的有效量加 入脫支酶。
所述方法的產(chǎn)物的確切組成取決于所應(yīng)用的酶組合以及所加工的顆粒 淀粉的類型。例如，可溶水解產(chǎn)物可以是純度為至少約85%、至少約90%、 至少約95.0% 、至少約95,5% 、至少約96.0% 、至少約96.5% 、至少約97.0% 、 至少約97.5%、至少約98.0%、至少約98.5、至少約99.0%或至少約99.5% 的麥芽糖?；蛘?，可溶淀粉水解產(chǎn)物可以是葡萄糖，或者淀粉水解物具有 至少94.5%、至少95.0%、至少95.5%、至少96.0%、至少96.5%、至少 97.0%、至少97.5%、至少98.0%、至少98.5、至少99.0%或至少99.5%
80的DX (葡萄糖占總?cè)芙獾母晒绦挝锏陌俜直?。該方法可以包括為特制糖 漿的產(chǎn)物，例如含有葡萄糖、麥芽糖、DP3和DPn的混合物的、用于生產(chǎn) 冰激凌、蛋糕、糖果、罐頭水果的特制糖漿。
兩種碾磨方法是濕磨法和干磨法。在干磨法中，碾磨和使用整個谷 粒。濕磨法提供胚芽和粗磨粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))的良好分離，且除少數(shù) 例外情況， 一般應(yīng)用在淀粉水解產(chǎn)物用于生產(chǎn)糖漿的場所。干磨法和濕磨 法均為淀粉加工領(lǐng)域公知，且同等地考慮與所公開的組合物和方法一起使 用。所述方法可在超濾體系中進行，其中保留物在酶、生淀粉和水的存在 下保持再循環(huán)，且其中透過物為可溶淀粉水解產(chǎn)物。同等考慮的是在具有 超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中進行的方法，其中保留物在酶、生淀粉和水的存 在下保持再循環(huán)，且其中透過物為可溶淀粉水解產(chǎn)物。同樣考慮的是在具 有微過濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中進行的方法，其中保留物在酶、生淀粉和水 的存在下保持再循環(huán)，且其中透過物為可溶淀粉水解產(chǎn)物。
一方面，將該方法的可溶淀粉水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為基于淀粉的高果糖糖漿 (HFSS)，例如高果糖玉米糖漿(HFCS)。這種轉(zhuǎn)化可利用葡萄糖異構(gòu)酶(例 如固定在固相支持物上的葡萄糖異構(gòu)酶)實現(xiàn)。所考慮的異構(gòu)酶包括商品 Sweetzyme , IT (Novozymes AJS); G-zyme IMGI和G-zyme G993 ， KetomaxTM， G-zyme G993 (Rhodia)， G-zyme G993液體和GenSweet IGI (Genencor International, Inc,)。
另 一方面，通過這些方法所生產(chǎn)的可溶淀粉水解產(chǎn)物可以用于生產(chǎn)燃 料或飲用乙醇。在第三方面的方法中，發(fā)酵可以與顆粒淀粉漿的水解同時 或分開/相繼進行。當(dāng)發(fā)酵與水解同時進行時，溫度可以是30°C-35°C，或 31°C-34°C。該方法可以在超濾體系中進行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵 母、酵母營養(yǎng)物和水的存在下保持再循環(huán)，且其中透過物為含乙醇的液體。
同等考慮的是在具有超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中進行的方法，其中保留物在 酶、粗淀粉、酵母、酵母營養(yǎng)物和水的存在下保持再循環(huán)，且其中透過物 為含乙醇的液體。
所述方法的可溶淀粉水解產(chǎn)物也可以用于發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)，包括將所處理的淀粉發(fā)酵成發(fā)酵產(chǎn)品，例如檸檬酸、谷氨酸單鈉、葡糖酸、葡萄糖 酸鈉、葡萄糖酸鉀、葡萄糖酸鉀、葡萄糖酸S內(nèi)酯或異抗壞血酸鈉。
芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的淀粉水解活性可以利用馬鈴 薯淀粉作為底物來測定。此方法基于該酶對改性馬鈴薯淀粉的降解，且反 應(yīng)后接著將淀粉/酶溶液樣品與碘溶液混合。最初形成黑藍色，但是在淀粉 降解期間，藍色變?nèi)酰饾u變成紅棕色，將其與有色玻璃標準進行比較。
10.用于紡織品退漿的組合物及方法
還考慮使用一種或多種芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體處理織 物(例如，使紡織品退漿)的組合物和方法。該酶可以用于本領(lǐng)域眾所周知 的任何織物處理方法中，參見例如美國專利No. 6,077,316。例如， 一方面， 可以通過包括將織物與芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體溶液接觸的 方法，改善該織物的觸感和外觀。 一方面，該織物可以用該溶液在壓力下 處理。
一方面，可以在紡織品紡織期間或之后、或在退漿階段或者一個或多 個其他織物加工步驟的過程中施加酶。在紡織品紡織期間，紡線暴露于相 當(dāng)大的機械張力。在機械織機上紡織之前，徑紗通常涂上淀粉或淀粉衍生 物漿料，以增加其抗張強度并防止斷裂。可以施加酶以除去這些淀粉或淀 粉衍生物漿料。在紡織品織成之后，織物可以ii^退漿階段。這之后可接 著一個或多個其他織物加工步驟。退漿是從紡織品中除去漿料的行為。紡 織后必須除去漿料涂層，之后再進一步加工織物，以確保均一和耐洗效果。 本文還提供了包括通過芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體的作用來酶 促水解上漿料的退漿方法。
該酶可以單獨或與其他退漿化學(xué)試劑和/或退漿酶一起用作為洗滌劑 添加劑，在例如水性組合物中，使織物(包括含棉織物)退漿。芽孢桿菌屬 物種707 a-淀粉酶或其變體也可用于在龍藍染色的粗斜棉布織物和衣服上 產(chǎn)生石洗外觀的組合物和方法中。為生產(chǎn)衣服，織物可以剪裁并縫紉成衣 服或衣物，之后進行整理(finish)。特別是，為生產(chǎn)粗斜棉布牛仔服，已研發(fā)了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退漿步驟， 在此期間淀粉分解酶作用于衣服，以使織物柔軟，并使該棉布更易于接受 隨后的酶促整理步驟。本發(fā)明酶可用于整理粗斜棉布衣服(例如"生物打磨
法"(bio-stoning))、酶促退漿及為織物提供柔軟度，和/或整理的方法中。 淀粉酶的劑量根據(jù)方法類型而有所變動。較小的劑量將比相同酶的較大劑 量需要更多的時間。然而，除了受限于溶液的物理約束之外，對退漿淀粉 酶的存在量并無上限要求。因此，酶的極限值可以是能夠在溶液中溶解的 量。 一般，退漿酶如a-淀粉酶按織物重量計以約0.00001。/。至約2。/。酶蛋白 質(zhì)的量摻入處理組合物之中；或按織物重量計約0.0001%至約1%酶蛋白 質(zhì)；或按織物重量計約0.001%至約0.5%酶蛋白質(zhì)；而在另一實例中，是 按織物重量計約0.01%至約0.2%酶蛋白質(zhì)。
11.用于烘焙和食品制備的組合物及方法
對于面粉在烘焙和食品生產(chǎn)中的商用和家用而言，重要的是維持面粉 中適當(dāng)水平的a-淀粉酶活性。太高的活性水平可能產(chǎn)生粘性和/或面團似的 滯銷產(chǎn)品；但是a-淀粉酶活性不足的面粉可能不含足夠的糖用于正常酵母 功能，導(dǎo)致不甜的易碎的面包。為增加面粉中的內(nèi)源a-淀粉酶活性，可向 面粉中添加芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體形式的a-淀粉酶。因此， 確定面粉樣品中內(nèi)源(天然)和真菌a-淀粉酶或其他a-淀粉酶活性水平的能 力，將會有益于食品生產(chǎn)過程，并促進在食品生產(chǎn)中更有效地應(yīng)用面粉。
除了在烘焙中應(yīng)用谷物及其他植物產(chǎn)品外，諸如大麥、燕麥、小麥等 谷物以及諸如玉米、嘩酒花和稻等植物成分還應(yīng)用于工業(yè)釀造以及家庭釀 造。酉Hit中所用的成分可以是未制芽或是制芽的，這意味著部分發(fā)芽，從 而導(dǎo)致包括a-淀粉酶在內(nèi)的酶水平增加。為成功酉l^，充足水平的a-淀粉 酶酶活是必要的，以確保有適當(dāng)水平的糖進行發(fā)酵。
如本文所用，術(shù)語"面粉，，指研磨或磨碎的糧谷。術(shù)語"面粉"還可以表 示已經(jīng)磨碎或搗碎的西米或塊莖產(chǎn)品。在一些實施方案中，面粉還可以含 有除研磨或搗碎的谷類或植物材料之外的成分。其他成分的一個實例^
83松劑，不過并非旨在限制。#包括小麥、燕麥、黑麥和大麥。塊莖產(chǎn) 品可包括木薯淀粉(tapioca flour)、 木薯粉(cassava flour)和eustard powder。術(shù)語"面粉，，還fe括磨碎的玉米粉、玉米面、米粉(rice flour)、粗 面粉、自發(fā)粉(self-rising flour)、木薯淀粉(tapioca flour)、木薯粉(cassava flour)、 米粉(ground rice)、 強化面粉和custard powder。
如本文所用，術(shù)語"原材料"表示粉碎或破碎的谷類和植物成分。例如， 啤酒生產(chǎn)中所用的大麥是已經(jīng)被粗磨或粉碎的谷類，以便提供適于產(chǎn)生發(fā) 酵醪的粘稠度。如本文所用，術(shù)語"原材料"包括任何前迷類型的粉碎或粗 磨形式的植物和谷類。本文所述的方法可用于確定面粉以及原材料(其包括 已經(jīng)粉碎的前述類型的谷類、塊莖及其他植物產(chǎn)品)中的a-淀粉酶活性水 平。
還公開了測量面粉、谷類或塊莖產(chǎn)品及原材料中a-淀粉酶活性的方 法，如本文所用，術(shù)語"a-淀粉酶，，指內(nèi)源a-淀粉酶(存在于面粉或原材料之 中)或已經(jīng)加入到面粉或原材料之中的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其 變體。
可單獨地或與其他淀粉酶組合添加芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其 變體以防止陳化。所用的抗陳化淀粉酶可以是任何有效延遲烘焙產(chǎn)品變陳 (面色瓤變硬)的淀粉酶。
在淀粉的存在下，淀粉酶可具有處于范圍例如30-卯。C、 50-80°C、 55-75。C、 60-70。C中的最適溫度。最適溫度可在pH 5.5的1%可溶淀粉溶 液中測量。
可與芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶組合使用的其他抗陳化淀粉酶包括 內(nèi)切淀粉酶，例如來自芽孢桿菌屬的細菌內(nèi)切淀粉酶。例如，其他淀粉酶 可以是產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如來自芽孢桿菌屬。Novamyl 是來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌林NCIB 11837的產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶，并描述 在C. Christophersen等人，1997 ^"/rA 50(1): 39-45中。
抗陳化內(nèi)切淀粉酶的其他實例可包括其他細菌a-淀粉酶，源自例如芽 孢桿菌屬，例如地衣芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌。
84抗陳化淀粉酶可以是外切淀粉酶，例如p-淀粉酶，例如來自植物(例如 大豆)，或來自微生物來源(例如芽孢桿菌屬)。
芽孢桿菌屬物種707的a-淀粉酶可單獨地或與其他淀粉酶一起以有效 延遲烘焙產(chǎn)品變陳(抓變硬)的量添加?？龟惢矸勖傅牧恳话闾幱?.01-10 mg酶蛋白質(zhì)/kg面粉的范圍，例如l-10mg/kg。
包括芽孢桿菌屬物種707的a-淀粉酶的烘焙組合物還可以包括磷脂 酶。磷脂酶可具有Al或A2活性，以從磷脂中移去脂肪酸并形成溶血磷脂。 其可以具有或可以不具有脂肪酶活性，即對甘油三酸酯的活性。磷脂酶可 具有范圍30-卯。C(例如30-WC)的最適溫度。所添加的磷脂酶可以是動物 來源的，例如來自胰腺(例如?；蜇i胰腺)、蛇毒液或蜂毒液?；蛘?，磷脂 酶可以是^:生物來源的，例如來自絲狀真菌、酵母或細菌，例如來自如下 屬或種曲霉屬，黑曲霉；網(wǎng)柄菌屬(2)^0^對^//"柳)，盤基網(wǎng)柄菌(Z). ^foco/flfe畫)；毛霉屬，爪哇毛霉(My"vfl"/c"s),大毛霉(M.歸m/力，細孢 毛霉(M. sw6ft7/M/附ws);脈孢霉屬(7Vewnw/wm)，粗糙脈孢霉(7V; cT"ssfl);根 毛霉屬，微小根毛霉(兄/ ww7/船)；根霉屬(及/i/zopws)，少根根霉(凡rwr/^"s)， 日；^艮霉(及.y'flp謂/c附)，旬枝根霉(i . sto/ow'y^r);核盤菌屬(Sc/erW/"/")， 大豆核盤菌(51. /幼eW/ami);發(fā)癬菌屬(7Wc/io/7/^to")，紅色發(fā)癬菌(r. m6m附)；維氏核盤菌屬(^7^^"/mVi), 『 sc/efC/orw附；芽孢桿菌屬，巨 大芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌；檸檬酸細菌屬(OM""w)，弗氏檸檬酸細菌 (C./"wi<///);腸桿菌屬(五"te/^M"er)，產(chǎn)氣腸桿菌(E "en gewes)，陰溝腸 桿菌(五.c/卯c"e);愛德華氏菌屬(￡^/>^^/ >//")，遲鈍愛德華氏菌(E ^y/"); 歐文氏菌屬(￡>w/"/ ),草生歐文氏菌(E /^^Vo/fl);埃希氏菌屬 (^sd^WcA/fl)，大腸桿菌(E 克雷伯氏菌屬(/^6 >//"),肺炎克雷伯
氏菌(凡變形桿菌屬(尸rofews)，普通變形桿菌(尸.vw/gfln's); 普羅威登斯菌屬(/Vov/^w"fl)，斯氏普羅威登斯菌(戶.W""Wi7);沙門氏菌屬 (^"/附0"《//")，鼠傷寒沙門氏菌(51. (K/7/^附"r/"/m);沙雷氏菌屬(Sermft'"),液 化沙雷氏菌(51. //^^/iwc/e"s),粘質(zhì)沙雷氏菌0S.附flrc"ce附)；志賀氏菌屬 0S7i/ge/to)，弗氏志賀氏菌(S./Ze;c"^/);鏈霉菌屬C^^to附j(luò);c")，紫紅鏈霉菌OS. v/o/e"w"6w);耶爾森氏菌屬(Jers/mVi)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(K 鐮孢霉屬，尖鐮孢(例如菌抹DSM2672)。
磷脂酶在烘焙后的初始階段，特別是頭24個小時，以改進面包柔軟度 的量添加。磷脂酶的量一般處于0.01-10 mg酶蛋白質(zhì)/kg面粉(例如，0.1-5 mg/kg)或200-5000 LEU/kg面粉(例如，500-2000 LEU/kg)的范圍。具有脂 肪酶活性的磷脂酶通常以相當(dāng)于20-1000 LU/kg面粉脂肪酶活性的量添 加，特別是50-500 LU/kg。 一LU(脂肪酶單位)定義為在30.0。C、 pH7.0、 以阿拉伯樹膠作為乳化劑、以三丁酸甘油酯作為底物時，每分鐘釋放1 Hmol丁酸所需的酶量。
面團組成通常包括小麥面或小麥粉和/或其他類型的面、粉或淀粉，如 玉米粉、玉米淀粉、黑麥面、黑麥粉、燕麥粉、燕麥面、大豆粉、高粱面、 高粱粉、馬鈴薯面、馬鈴薯粉或馬鈴薯淀粉。面團可以是新鮮的、冷凍的 或是部分烘焙的。
面團通常是已膨發(fā)的面團或是待進行膨發(fā)的面團。面團可以以多種方 式進行膨發(fā)，例如通過添加化學(xué)膨;^劑(例如小蘇打)或通過添加膨發(fā)面團 (發(fā)酵面團)。例如，面團可通過添加適宜的酵母培養(yǎng)物(例如釀酒酵母(面包 酵母)培養(yǎng)物，例如商購可得的釀酒酵母菌林)來膨發(fā)。
面團也可以包括其他常規(guī)的面團成分，例如蛋白質(zhì)，如奶粉、面筋和 大豆；蛋(或為全蛋、蛋黃、或為蛋清)；氧化劑如抗壞血酸、溴酸鉀、碘 酸鉀、偶氮雙甲酰胺(ADA)或過硫酸銨；氨基酸如L-半胱氨酸；糖；鹽如 氯化鈉、乙酸鉤、硫酸鈉或硫酸鉀。
面團可以包括脂肪(甘油三酸酯)如顆粒狀脂肪或起酥油。
面團可以還包括乳化劑，例如甘油單酸酯或甘油二酸酯、甘油單酸酯 或甘油二酸酯的雙乙酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖脂、脂肪酸的聚甘油酯、 甘油單酸酯的乳酸酯、甘油單酸酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯 (polyoxyetliylene stearates)或溶血卵磷脂，但不添加乳化劑(除任選的鱗脂 外)而制備的面團也是適用的。
任選地，可與抗陳化淀粉酶和磷脂酶一起使用其他酶。其他酶可以是第二淀粉酶，如淀粉葡萄糖苷酶、p-淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶；或者 其他酶可以是肽酶，特別是外肽酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、脂肪酶、纖維素酶、 半纖維素酶，特別是戊聚糖酶如木聚糖酶，蛋白酶，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶， 例如WO 95/00636中所公開的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，糖基轉(zhuǎn)移酶，分支酶 (1 ，4-cx-葡聚糖分支酶)，4奮葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(糊精糖基轉(zhuǎn)移酶)或氧化還原酶， 例如過氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂加氧酶、L-氨 基酸氧化酶或糖氧化酶。
其他酶可以是任何來源的，包括哺乳動物和植物來源，以及樣吏生物(細 菌、酵母或真菌)來源，并可通過本領(lǐng)域常規(guī)使用的技術(shù)獲得。
木聚糖酶可為^:生物來源，例如源自細菌或真菌，例如曲霉屬菌林， 特別是棘孢曲霉、黑曲霉(參見WO 91/19782)、泡盛曲霉(W0 91/18977)或 塔賓曲霉(WO 92/01793);源自木霉屬菌林，例如里氏木霉，或源自腐質(zhì)霉 屬菌林，例如特異腐質(zhì)霉(WO 92/17573)。 Pentopan⑧和Novozym 384@為 商購可得的由里氏木霉生產(chǎn)的木聚糖酶制品。
淀粉葡萄糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶(如AMG⑥)。其他有用 的淀粉酶產(chǎn)品包括Grindamyl A 1000或A 5000 (購自Grindsted Products,丹麥)及Amylase H或Amylase P (購自DSM Gist Brocades, 荷蘭)。
葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特別是黑曲霉葡萄糖氧化酶 Gluzyme )。示例'l"生蛋白酶有Neutrase (Novozymes)和Protex OxG (Genencor International, Inc.)。
示例性脂肪酶可來源于嗜熱絲孢菌屬(腐質(zhì)霉屬)、^^艮毛霉屬、假絲酵 母菌屬(Cflm/iW")、曲霉屬、根霉屬(/^/z印附)或假單胞菌屬的菌林，特別 是來自疏棉狀嗜熱絲孢菌(疏毛腐質(zhì)霉)、米黑根毛霉、南極洲假絲酵母 (Om^V/" "","r"/c")、黑曲霉、德氏根霉(及A/w/;附fife/e附"。或少根根霉 (/ /i/zo/^s tffr/r&"s)或洋蔥假單胞菌CPs^/^wwwf"s ce/7ac/")。在具體實施方 案中，脂肪酶可以是如WO 88/02775中所述來自南極洲假絲酵母的脂肪酶 A或脂肪酶B，或者脂肪酶可以如EP 238,023中所述源自米黑根毛霉，或
87如EP 305,216中所述源自疏毛腐質(zhì)霉，或如EP 214,761和WO 89/01032 中所述源自洋蔥假單胞菌。
該方法可用于任何類型由面團制備的烘焙產(chǎn)品，無論是軟的或是脆的， 無論是白面包型、酵母發(fā)酵的白面包型或是黑面包類型的。實例有面包(特 別是白面包、全麥面包或黑麥面包)， 一般為塊或巻的形式，法式長棍型面 包、比塔餅、玉米粉圓餅、蛋糕、薄煎餅、餅干、曲奇餅、餡餅皮、酥面 包、饅頭、比薩等等。
另一方面考慮在包括面粉連同抗陳化淀粉酶、磷脂酶和磷脂的預(yù)混物 中應(yīng)用芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體。預(yù)混物可以含有其他改進 面團和/或改進面包的添加劑，例如4壬何添加劑，包括上文所述的酶。
另一方面提供了酶制品，包括抗陳化淀粉酶和磷脂酶，用作為烘焙添 加劑。酶制品可為顆?；驁F聚的粉末的形式。其可具有窄的粒徑分布，95% (以重量計)以上的顆粒處于25-500 nm的范圍。
顆粒和團聚的粉末可通過常規(guī)方法制備，例如在流化床制粒機中通過 向載體上噴淀粉酶。載體可包括具有適宜粒徑的粒核。載體可以是可溶或 不可溶的，例如鹽(如NaCl或硫酸鈉)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨糖 醇)、淀粉、稻、玉米渣或大豆。
另一方面考慮包封芽孢桿菌屬物種707 (x-淀粉酶。為制備包封的a-淀 粉酶顆粒，使酶與下文進一步詳述的食品級脂質(zhì)以足以懸浮所有(X-淀粉酶 顆粒的量接觸。
如本文所使用，食品級脂質(zhì)可以是任何天然的不溶于7JC但溶于非極性 有機溶劑如烴或乙醚的有機化合物。所用的食品級脂質(zhì)可包括但不限于飽 和或不飽和的脂肪或油形式的甘油三酸酯。構(gòu)成所用的飽和甘油三酸酯的 脂肪酸及其組合的實例包括但不限于丁酸(來源于乳脂肪)、棕櫚酸(來源 于動物及植物脂肪)和/或硬脂酸(來源于動物及植物脂肪)。構(gòu)成所用的不飽 和甘油三酸酯的脂肪酸及其組合的實例包括但不限于棕櫚油酸(來源于動 物及植物脂肪)、油酸(來源于動物及植物脂肪)、亞油酸(來源于植物油)和/ 或亞麻酸 來源于亞麻子油)。其他考慮且落在本范圍的食品級脂質(zhì)包括但不限于衍生自上文所討論的甘油三酸酯的甘油單酯和甘油二酯，磷脂及 糖酯。
將液體形式的食品級脂質(zhì)與粉末形式的a-淀粉酶顆粒以這樣的方式 接觸，從而脂質(zhì)物質(zhì)覆蓋至少大多數(shù)(例如100%) a-淀粉酶顆粒的至少一 部分表面。因此，各a-淀粉酶顆粒獨立地包封在脂質(zhì)中。例如，全部或基 本上全部的a-淀粉酶顆粒均被提供有薄層連續(xù)的包封脂膜。這可通過首先 向容器中傾入一定量的脂質(zhì)，然后將a-淀粉酶調(diào)成漿液，從而使脂質(zhì)徹底 潤濕各a-淀粉酶顆粒的表面而實現(xiàn)。在短期攪拌之后，回收其表面攜帶實 質(zhì)量脂質(zhì)的包封的a-淀粉酶顆粒?？赏ㄟ^選擇所用脂質(zhì)的類型，來控制向 a-淀粉酶顆粒如此施加的包衣的厚度，并在期望時通過重復(fù)操作以建造較 厚的膜。
包載的遞送載體的儲存、處理和摻入可通過包裝混合物實現(xiàn)。包裝混 合物可包括包封的a-淀粉酶。不過，包裝混合物可以還含有生產(chǎn)商或面點 師所需的其他成分。在包封的ot-淀粉酶摻入到面團之中后，面點師繼續(xù)進 行產(chǎn)品的常規(guī)生產(chǎn)方法。
包封a-淀粉酶的優(yōu)勢有兩重。其一，對于熱不穩(wěn)定性酶而言，食品級 脂質(zhì)在烘焙過程中保護酶免受熱變性。結(jié)果，雖說a-淀粉酶在醒發(fā)和烘焙 階段被穩(wěn)定化和受保護，其在最終的烘焙產(chǎn)品中從保護性包膜中釋放出來， 在這里水解多聚葡聚糖中的糖苷鍵。包栽的遞送載體也確保向烘焙品持續(xù) 釋放活性酶。也就是說，繼烘焙過程之后，活性a-淀粉酶從保護性包膜中 持續(xù)釋放，其釋放速率抵消并因此減小陳化機制的速率。
一般而言，向a-淀粉酶顆粒施用的脂質(zhì)的量可從a-淀粉酶總重的幾個 百分點到該重量的許多倍進行變動，這取決于脂質(zhì)的性質(zhì)、向a-淀粉酶顆 粒施用脂質(zhì)的方式、待處理面團混合物的組成、以及所涉及的面團混合操 作的強度。
以有效延長烘焙商品保存限期的量向用于制備烘焙商品的成分中添加 包載的遞送載體(即，脂質(zhì)包封的酶)。面點師可以計算為實現(xiàn)期望抗陳化 效果所需的如上文那樣制備的包封a-淀粉酶的量。所需的包封a-淀粉酶的
89量基于被包封的酶的濃度以及a-淀粉酶與指定面粉的比例來計算。雖然已 發(fā)現(xiàn)廣范圍的濃度有效，但是正如已經(jīng)討論過的那樣，抗陳化方面的可見 改進與a-淀粉酶濃度并不線性相關(guān)，而是超過一定的最低水平后，a-淀粉 酶濃度的大幅增加僅產(chǎn)生很小的額外改進。在特定烘焙生產(chǎn)中實際應(yīng)用的 a-淀粉酶濃度可能比最低需要量高得多，以便向面點師提供一定的保障以 對抗因其無意低估引起的錯誤。酶濃度的下限由面點師希望達到的最低抗 陳化效果決定。
根據(jù)該方法，制備烘焙品的一個典型方法包括a)制備脂質(zhì)包被的a-淀粉酶顆粒，其中基本上100%的a-淀粉酶顆粒被包覆；b)混合含面粉的 面團；c)在完成混合之前向面團中添加脂質(zhì)包被的a-淀粉酶，在脂質(zhì)包衣 從a-淀粉酶上去掉之前終止混合；d)醒發(fā)面團；和e)烘焙面團以提供烘 焙品，其中a-淀粉酶在混合、醒發(fā)和烘焙階段無活性，而在烘焙品中有活 性。
因此，可在接近混合周期結(jié)束的時候向面團中添加包封的a-淀粉酶。 該方法的一個特征在于包封的a-淀粉酶在混合階段中于允許包封的a-淀 粉酶充分地遍及整個面團分布的時間點添加，不過，混合階段在保護性包 膜從a-淀粉酶顆粒剝落之前終止。根據(jù)面團的類型和體積、以及混合器的 作用方式和速度不同，可能需要1-6分鐘或更長的任何時間將包封的a-淀 粉酶混入面團中，但平均為2-4分鐘。因此，存在可以決定該精確程序的 幾種變量。首先，包封的a-淀粉酶的量必須具有足以允許包封的a-淀粉酶 分布于整個面團混合物的總體積。如果包封的a-淀粉酶制品為高度濃縮 的，可能需要在向面團添加包封的a-淀粉酶之前先向預(yù)混物中添加額外的 油。食鐠和生產(chǎn)方法可能需要特定的改變。不過，當(dāng)將面包面團配方中指 定的25%的油從面團中扣除，而用作為濃縮的包封a-淀粉酶的載體在接近 混合周期結(jié)束的時候加入時， 一般能夠達成良好的結(jié)果。在食語具有極低 脂肪含量的面包或其他烘焙品(如法式面包)中，已發(fā)現(xiàn)干面粉重量約1%的 包封a-淀粉酶混合物足以使包封的a-淀粉酶與面團徹底地混合，但可以生 效的百分比范圍非常寬泛，并取決于配方、成品以及個體面點師的生產(chǎn)方法需求，而非任何已知的限制。其次，必須在混合周期中余下足夠時間以
向混合物中添加包封的a-淀粉酶懸液，以便完全的混合入面團中，但是不
要太早以致于過度的機械作用使保護性脂質(zhì)包膜從大比例的包封(X-淀粉
酶顆粒上剝落下來。
在另一實施方案中，向脂質(zhì)包被的酶顆粒中添加細菌a-淀粉酶(BAA)。 已知BAA可以使面包縮小成為粘團，這是由于其在充分烘焙的面包塊中 具有過度的熱穩(wěn)定性和保留活性。然而，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)在受保護的酶產(chǎn)品中摻 入BAA時，可以獲得相當(dāng)大的附加抗陳化保護作用，即便以非常低的BAA 劑量水平也是如此。例如，已發(fā)現(xiàn)150 RAU (參考淀粉酶單位)/100磅面 粉的BAA劑量是有效的。 一方面，向脂質(zhì)包纟皮的酶產(chǎn)品添加約50-2000 RAU的BAA。此低BAA劑量水平，組合保護性包衣能夠在充分烘焙的面 包塊中阻止酶與淀粉自由接觸的能力(除水蒸氣隨機地將酶自其包衣中釋 放出來的情況之外)，有助于達成非常高水平的抗陳化活性，而沒有BAA 的反面副作用。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對本文所述的以及下文實施 例中進一步舉例的組合物和方法進行多種改動和變動而不偏離目的用途的 精神或范圍。
實施例
實施例l芽孢桿菌屬物種707ot-淀粉酶的密碼子優(yōu)化 從GeneArt (德國)訂購合成的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶基因 preLAT-Amy707 。編碼芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶的該基因(A. Tsukamoto等人，1988必/oc/ie附.Co附附ww. 151(1): 25-31)，凈皮 克隆到整合載體pICatH (見圖4)中，得到命名為pICatH-Amy707(oril)的 產(chǎn)物(見圖5)。 pICatH包含如下特征(l)溫度敏感型復(fù)制起點(ori pE194， 用于在芽孢桿菌中復(fù)制)，(2) ori pBR322 (用于在大腸桿菌中擴增)，(3)用 于選擇的新霉素抗性基因，和(4)用于選擇、染色體整合及盒擴增的天然地 衣芽孢桿菌氯霉素抗性基因(car)。在許可溫度(37°C)，將pICatH-Amy707(oril)轉(zhuǎn)化到宿主菌林BML780 (BRA7 f汴生物，cat-， amyL-， spo-， aprL-， endoGluC-)中。選擇一新霉素抗性(neoR)和一氯霉素抗 性(capR)轉(zhuǎn)化林，并命名為BML780(pICatH-Amy707(ori1))。通過在非許 可溫度(即 50。C)在具有氯霉素的TSB (胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)基中生長 菌林，使BML780中的質(zhì)粒(pICatH-707(ori))整合到地衣芽孢桿菌基因組 的區(qū)域。選擇一個氯霉素抗性克隆，并命名為 BML780-pICatH-Amy707(oril)。所選的菌林再次在許可溫度生長幾代， 不加抗生素，以環(huán)出載體序列，然后選擇一個新霉素敏感(neoS和capR) 克隆。在此克隆中，切除了染色體上的pICatH載體序列，包括新霉素抗 性基因，僅留下Amy707-cat盒。注意所使用的caf基因為天然地衣芽孢桿 菌基因，而Amy707基因為引入到宿主中的唯一異源DNA片段。
接下來，通過在具有漸增濃度氯霉素(即，5、 25、 50和75 ng/mL氯 霉素)的TSB培養(yǎng)基中生長菌林來擴增染色體上的Amy707-cat盒。在多輪 擴增之后，選擇兩個克隆(抗75 ng/mL氯霉素，并且當(dāng)在含可溶淀粉的心 浸液瓊脂板上生長時在碘染色后產(chǎn)生最大的暈圏) BML780-Amy707-CAP75克隆1和克隆2。兩個菌林均在淀粉瓊脂板上產(chǎn) 生大暈圏。
實施例2芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶的純化 轉(zhuǎn)化了 BML780-Amy707-CAP75的細胞利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)發(fā)酵。 從發(fā)酵肉湯中分離細胞，并利用Millipore prep scale TFF-6 10K分子量截 斷(MWCO)超濾膜柱(Millipore Corp., Bedford, MA;貨號CDUF 006 TG) 濃縮肉湯以獲得UFC。含有1-2 g/L a-淀粉酶的超濾濃縮物(UFC)在10 K 透析(SpecraPor Cat. No, 132119)管中用20 L溶于pH 5.0的25 mM乙酸鈉 緩沖液的2 mM氯化鉀透析過夜。透析物過濾，并將一半的物質(zhì)上樣到陽 離子交換柱(POROS HS 20 83 mL; Applied Biosystems, California)上；該 陽離子交換柱事先已經(jīng)以溶于pH 5.0的25 mM乙酸鈉緩沖液的1 mM氯 化鈣平衡。柱用相同的緩沖液徹底洗滌，直至A280 nm的吸光度(A)小于
920.1個OD單位，且酶活性用溶于相同緩沖液中的0-100 mM氯化鈉梯度進 行洗脫，a-淀粉酶活性在90 mM氯化鈉處洗脫?；诶肕egazyme a-淀粉酶試劑盒(貨號K-CERA; Megazyme)測量的酶促活性而合并具有活性 的級分。其余的樣品類似處理，并與第一份樣品合并。向1/3的此合并物 中添加硫酸銨至750 mM，并上樣到96 mL苯基Sepharose柱(貨號 17-0973-10; GE Healthcare)上，該柱事先已經(jīng)用調(diào)整至pH 6.8的50 mM MES緩沖液(4-嗎啉乙磺酸緩沖液)中所含的750 mM硫酸銨、2 mM氯化 4丐平衡。在用相同的溶劑洗滌之后，a-淀粉酶蛋白質(zhì)以750 mM至OmM 硫酸銨梯度洗脫。酶活性在此梯度終點洗脫。合并具有酶活性的級分。類 似地純化其余的離子交換合并級分。組合所有的苯基Sepharose合并物， 并在具有10 K纖維素膜(Millipore)的攪拌的Amicon cell (Millipore)中濃 縮。濃縮物利用10 K透析管以50 mM hydrogen maleate緩沖液(pH 6.8) 中所含的5 mM氯化鈣透析16小時。向此透析樣品補加10%山梨糖醇以 助酶溶解。在除菌過濾后，通過凝膠光密度分析法來定量含芽孢桿菌屬物 種707a-淀粉酶的樣品，顯示2.8mg/mL的量。
實施例3性能表征
在稻淀粉污染的織物樣片上用與淀粉結(jié)合的指示染料進行性能試驗 (Test Fabrics貨號CS-28; TestFabrics Inc.)。洗滌性能通過指示染料向溶 液相的釋，放來判斷。在測定前，染色的試驗織物用蒸餾水預(yù)洗l小時，然 后風(fēng)干。試驗織物的預(yù)洗在測定前除去了任何差結(jié)合的指示染料。
從預(yù)洗織物上切下1/4英寸的圓盤，并置于96孔板中。向各孔中加入 190 nL洗滌劑(IEC-A頭堿洗滌劑；貨號88010-1; WFK Testgewebe GmBH， 德國)。帶有樣片和洗滌劑的板在40。C預(yù)孵育15分鐘。向各孔添加10nL 體積的、來自實施例2的0-3 ppm芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或?qū)φ?-3 ppm a-淀粉酶(OxAm (Purastar ) Genencor International, Inc.),以起始反 應(yīng)。板隨之在大約40。C以750 rpm (Eppendorf Thermomix)孵育10分鐘。 孵育后，將150 ftL上清液轉(zhuǎn)移到新板中，并在A488 nm測量上清液(其含有釋放的指示染料)的吸光度。
為進行比較，利用Stainzyme (Novozymes)和OxAm (Purastar⑧； Genencor International, Inc.)(地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的一種衍生物 (Genencor產(chǎn)品))進行類似的測定。測定中應(yīng)用(K5.2 ppm (mg/L)，條件同 上文所述。
pH 8.0 (洗衣條件)時IEC "A"標準洗滌劑的數(shù)據(jù)示于圖1。將吸光度作 為a-淀粉酶濃度的函數(shù)進行了繪圖。此試驗顯示，在這些條件下，芽孢桿 菌屬物種707 a-淀粉酶的性能比OxAm (Purastar⑧)顯著更佳，且與 Stainzyme⑧相當(dāng)。
利用相同的測定法、相同量的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶以及(相同) 量的Stainzyme⑧和OxAm (Purastar ),將pH調(diào)整至10.1重復(fù)該測定。 這些條件(即，增加pH)使人聯(lián)想到自動餐具洗滌中的條件。在pH 10.1時， 芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶的性能再一次地比OxAm (Purastar )更佳， 且令人驚訝地比Stainzyme⑧更佳。見圖2。
實施例4利用Terg-o-tometer的洗滌劑測定 #辨和才法 使用的樣片
CFT可可在棉上，STC CFT CS-2 (TestFabrks)
CFT全卵帶顏料在棉上，STC CFT CS-37 (TestFabrics)
CFT著色的稻淀粉在棉上，STC CFT CS-28 (TestFabrics)
每輪試驗2x白色漂白的棉
利用額外的壓栽物(ballast)以造成40 g/L常規(guī)載量 在1L Terg-o-tometer中
5 mM HEPES pH 8.0,1.5 g/L AATCC HDL WOB (2003) 1.8 g/L Tide,帶漂白替代物(滅活的)
6 gpg水硬度，溫度在74°F或23.3 °C 處理
941). AATCC; 2). AATCC + 0.1 ppm 707 a-淀粉酶；3). AATCC + 0.1 ppm Stainzyme ; 4). Tide; 5),滅活Tide; 6).滅活Tide + 0.1 ppm 707 a-淀粉酶；7).滅活Tide + 0.1 ppm Stainzyme ; 8).滅活Tide + 0.1 ppm 707 a一定粉酶+ 0.5 ppm Purafect Prime;滅活Tide + 0.1 ppm Stainzyme + 0.5 ppm Purafect Prime (Genencor)。 AATCC存在量為1.5 g/L，而滅活 Tide存在量為l,8g/L。
潛采。對于可可和卵污漬而言，在對照和酶處理之間未觀察到清潔性 能的差異，這提示兩種污漬的清潔飽和，如圖6所示。活性Tide產(chǎn)生的結(jié) 果與使用0.1 ppm 707 a-淀粉酶時滅活Tide的相當(dāng)。707 a-淀粉酶的性能 比Stainzyme⑧^f氐。添力口 Purafect Prime并不改變Stainzyme 或707 a-淀粉酶的清潔性能(圖6)。
實施例5利用Launder-o-meter試驗a-淀粉酶
使用的樣片
CFT可可在棉上，STCCFTCS-2
CFT全卵帶顏料在棉上，STCCFTCS-37
著色的淀粉在棉上，EMPA161
CFT著色的玉米淀粉在棉上，STCCFTCS-26
CCFT著色的稻淀粉在棉上，STC CFT CS-28 向缸(Pot)中添加
向各缸中加入2x白色漂白棉布。向各缸中加入額外的壓載物以造成 42 g/200 mL常規(guī)載量(漂白的棉毛布(cotton interlock))。水具有12 gpg的 7jC5更度。測定在40。C進行40分鐘。 處理
8 g/L IEC八*帶漂白劑。這些洗滌劑組合物或者在僅有洗滌劑時、或 者在洗滌劑加0.2 ppm 707 a-淀粉酶(4 mg/mL)的存在下、或者是在洗滌劑 加0.2 ppm Stainzyme 的存在下進行試驗。在洗滌之前和之后均利用
95Minolta反射計以50 mm孔徑來度量清潔程度。
潛果。測定表明在清潔可可和全卵樣片方面，對照和酶處理之間沒有 顯著的性能差異(圖7)。帶漂白劑的IEC AA對照顯示出芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶比Stainzyme⑧表現(xiàn)更佳。
實施例6餐具洗滌劑
^^^々才法。芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶與Stainzyme⑧和OxAm (Purastar⑧)一起在自動洗碟機中針對米乳污漬進行了試驗。如圖8所示， 洗滌劑為WfK C (含標準ADD的磷酸鹽)和漂白劑(WFK Testgewebe GmBH，德國)；所用的漂白劑為過硼酸鹽。Stainzyme⑧以25 mg/g的等價 活性酶的濃度應(yīng)用。芽孢桿菌屬物種707以4 mg/g的濃度應(yīng)用。OxAm (Purastar⑧)具有其中3,2 mg = 0.6 % Ww劑量的濃度。瓷盤用來自IKW 的混合淀粉和米乳(Genencor International, Inc.)污染。Genencor乳-米污 漬在140。C在瓷盤上烘烤。污染的餐具在Miele洗碟機中于50。C以21°GH 的7jO更度洗滌。米乳測定結(jié)果示于圖8。混合淀粉測定結(jié)果示于圖9。洗滌 劑組合物中還加入了 0.8%的properase 4000D。 a-淀粉酶在該自動餐具洗 滌條件下以0.4、 0.8、 1.6和3.2mg總活性酶的酶劑量加入。
潛采。芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶在全等級(full-scale)自動洗碟機 (ADW)試驗中達到了 Stainzyme⑧的性能，并且至少具有處于實驗誤差范 圍內(nèi)的Stainzyme⑧活性。芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶在自動餐具洗滌條 件下比OxAm (Purastar⑧)具有更高的性能。
實施例7芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶及變體 如上文實施例1-2所述的密碼子優(yōu)化的變體可進一步重組修飾以包括 如下文獻中所教導(dǎo)的任何變異美國專利No. 6,093,562; 6,187,576; 6,197,565; 6，204，232; 6,297,038; 6，309，871; 6,486,113; 6，528，298; 6,623,948; 6,673,589; 6，867，031和6,887,986; ^>開的美國申請No. 20040096952; 20040253676; 20050059131; 20050084937; 20050196853; 2005025664和20060035323;歐洲申請No, EP 1423513和EP 1538155;國際PCT申請 No. WO 01/64852; WO 0166712; WO 01/88107; WO 01/96537', WO 02/092797和WO 02/10355 ;以及日本申請No. JP2001520006 ; JP2001521739; JP2002530072和JP2004505606.
實施例8 M202L a-淀粉酶變體 M202L變體利用標準方法通過用亮氨酸取代a-淀粉酶序列202位上的 甲硫氨酸而創(chuàng)建。其他變體可包括M208及M261位的不同M酸取代， 以及這3個位點上一個或多個取代的組合。任何變體的純化可如上所述進 行。
實施例9 Amv707變體的清潔能力 ^"^N^才法。如上文所討論的CS-28稻淀粉污染的樣片于20。C在所示 a-淀粉酶的存在下在有或沒有漂白劑的情況下孵育。該測定應(yīng)用IEC "A" 標準條件。變體通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法制備，并且未從培養(yǎng) 物上清中純化即應(yīng)用。變體的濃度通過SDS PAGE凝膠光密度分析法來確 定。用于此實驗的洗滌劑為以8 g/L應(yīng)用的IEC "A"。當(dāng)存在漂白劑時， 其由漂白活化體系過硼酸鈉(sodium perporate)(13.7 mM)和TAED (1.85 mM)提供。
潛果。與不含漂白劑的溶液相比，在漂白劑的存在下芽孢桿菌屬物種 707 M202L變體具有更高的活性。與野生型芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶 獲得的結(jié)果相比，M202L變體在漂白劑的存在下具有增加的活性。見圖 10。不存在漂白劑時，M202L變體的活性不及包含野生型形式的組合物。
所有上文引述的參考文獻以其整體作為參考并入本文用于所有目的。
權(quán)利要求
1.手工或自動餐具洗滌組合物，其包括芽孢桿菌屬物種707α-淀粉酶或其變體，和表面活性劑、洗滌劑助劑、絡(luò)合劑、聚合物、漂白劑、CaCl2、漂白體系、穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺細菌劑、助水溶物、晦暗抑制劑和香料中的一種或多種。
2. 清潔餐具的方法，包括施用權(quán)利要求l的手工或自動餐具洗滌組合物。
3. 洗衣洗滌劑添加劑，其包括芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體。
4. 洗衣洗涂劑，包括權(quán)利要求3的洗衣添加劑，并且還包括以下之一 種或多種，和表面活性劑、洗滌劑助劑、#劑、聚合物、漂白體系、漂 白劑、CaCl2、穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、抗污垢再 沉積劑、染料、殺細菌劑、助水溶物、熒光增白劑、織物調(diào)理劑和香料中 的一種或多種。
5，權(quán)利要求4的洗衣洗滌劑，其中CaCl2在洗滌劑中以約0.1 mM至 約20 mM的量存在。
6. 分離的編碼芽孢桿菌屬物種707a-淀粉酶或其變體的核酸，其中所 述變體具有選自SEQIDNO: 3的M202、 M208、 S255、 R172和/或M261 的取代的殘基取代或缺失。
7. 權(quán)利要求5的分離的核酸，其中M202變體是選自M202L、M202V、 M202S、 M202T、 M202I、 M202Q和M202W的取代變體；其中S255取 代是S255N;且其中R172取代是R172Q。
8. 包含SEQ ID NO: 3的a-淀粉酶或其變體，其中所述變體包含SEQ ID NO: 3殘基M202、 M208和/或M261位的殘基取代或缺失。
9. 權(quán)利要求8的a-淀粉酶，其中所述變體是(a)選自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202變體；(b) S255變體S255N;和/或(c) R172變體R172Q。
10. 栽體，含有權(quán)利要求6的核酸。
11. 分離的宿主細胞，含有權(quán)利要求6的核酸。
12. 分離的宿主細胞，含有權(quán)利要求10的載體。
13. 權(quán)利要求11或12中任一項的分離的宿主細胞，其中細胞為微生物。
14. 權(quán)利要求13的分離的宿主細胞，其中微生物是細菌或真菌。
15. 權(quán)利要求14的分離的宿主細胞，其中細菌是選自枯草芽孢桿菌 (5鏡W"s s"Mfo)、 地衣芽孢桿菌CB.扁簡/or附/s)、 遲緩芽孢桿菌(及 /e",附)、短芽孢桿菌(5. 6rev&)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(及Sfefl/^/^f7m /7A//ws)、 嗜堿芽孢桿菌(及"汰"/o/ /^7"力、解淀粉芽孢桿菌(必.tf/^/o/z^we/ac/ews),凝 結(jié)芽孢桿菌CB. co嘆"/"附)、環(huán)狀芽孢桿菌(及"Vr"/朋s)、燦爛芽孢桿菌(及/fl"似S)、蘇云金芽孢桿菌(及,ZlW7"g/e"wX)、變鉛青鏈霉菌(S^印to/^C^//v,V/a附)或鼠灰鏈霉菌(S.附w/""s)的革蘭氏陽性菌；或是革蘭氏陰性菌， 其中所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌CE^/^Wc/hVi 或假單胞菌屬
16. 權(quán)利要求8的多肽在衣物洗滌和/或餐具洗滌中的用途。
17. 權(quán)利要求8的a-淀粉酶或其變體在衣物洗滌和/或餐具洗滌中的用途。
18. 洗滌劑添加劑，包括權(quán)利要求8的a-淀粉酶或其變體，任選地為 無粉塵顆粒、微粒、穩(wěn)定的液體或受保護的酶的形式。
19. 權(quán)利要求18的洗滌劑添加劑，其中所述洗滌劑添加劑還包括選自 下組的酶纖維素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化 氫酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、 a-半乳糖苦酶、(5-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、 鹵代過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂 解酶、肽基谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、角叉茱聚
20. 權(quán)利要求19的洗滌劑添加劑，其中淀粉酶為另外的a-淀粉酶、(5-淀粉酶、異淀粉酶或葡糖淀粉酶。
21. 洗滌劑組合物，包括權(quán)利要求8的a-淀粉酶或其變體。
22. 洗滌劑組合物，包括權(quán)利要求18的洗滌劑添加劑。
23. 權(quán)利要求21的洗滌劑組合物，還包括選自下組的酶纖維素酶、 蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì) 酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳 糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、(5-葡萄糖苷酶、卣代過氧化物酶、 轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂解酶、肽基谷氨酰 胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、角叉菜聚糖酶或其任意組 合。
24. 手工或自動餐具洗滌洗滌劑組合物，包括權(quán)利要求8的a-淀粉酶 或其變體多肽。
25. 權(quán)利要求24的手工或自動餐具洗滌洗滌劑組合物，還包括選自下 組的酶纖維素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫 酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖普酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、 鹵代過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂 解酶、肽基谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、 核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、角叉菜聚 糖酶或其任意組合。
26. 權(quán)利要求24或22中任一項的手工或自動餐具洗滌洗滌劑組合物， 還包括表面活性劑、洗滌劑助劑、M劑、聚合物、漂白劑、CaCl2、漂 白體系、穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、抗污垢再沉積劑、 染料、殺細菌劑、助水溶物、晦暗抑制劑和香料中的一種或多種。
27. 權(quán)利要求26的手工或自動餐具洗滌洗涂劑組合物，其中CaCl2在 洗滌劑中以約0.1 mM至約20 mM的量存在。
28. 洗滌劑添加劑，包括權(quán)利要求8的a-淀粉酶或其變體。
29. 手工或自動衣物洗滌組合物，包括權(quán)利要求28的洗滌劑添加劑。
30. 權(quán)利要求29的手工或自動衣物洗滌組合物，還包括選自下組的酶 纖維素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、幾丁 質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷 酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖普酶、p-葡萄糖苷酶、由代過 氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂解酶、 肽基谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖 核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、角叉菜聚糖酶 或其任意組合。
31. 斥又利要求29或30中4壬一項的手工或自動衣物洗滌組合物，還包 括如下之一種或多種，和表面活性劑、洗滌劑助劑、*劑、聚合物、漂 白體系、漂白劑、CaCl2、穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、 抗污垢再沉積劑、染料、殺細菌劑、助水溶物、熒光增白劑、織物調(diào)理劑和香料中的一種或多種。
32. 權(quán)利要求31的手工或自動衣物洗滌組合物，其中CaCl2在所述組 合物中以約0.1 mM至約20 mM的量存在。
33. 手工或自動衣物洗滌組合物，包括權(quán)利要求8的a-淀粉酶或其變體。
34. 權(quán)利要求33的手工或自動衣物洗滌組合物，還包括選自下組的酶 纖維素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、幾丁 質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷 酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、P-葡萄糖苷酶、卣代過 氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂解酶、 肽基谷氨酖胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖 核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、角叉菜聚糖酶或其任意組合。
35. 權(quán)利要求33和34中任一項的手工或自動衣物洗滌組合物，還包 括如下之一種或多種和表面活性劑、洗滌劑助劑、絡(luò)合劑、聚合物、漂白 體系、漂白劑、CaCl2、穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、 抗污垢再沉積劑、染料、殺細菌劑、助水溶物、熒光增白劑、織物調(diào)理劑 和香料中的一種或多種。
36. 權(quán)利要求8的a-淀粉酶或其變體在紡織品退漿中的用途。
37. 紡織品退漿組合物，包括在水性溶液中的權(quán)利要求8的芽孢桿菌 屬物種707 a-淀粉酶或其變體，且任選地包括酶。
38. 權(quán)利要求37的紡織品退漿組合物，其中所述變體是(a) 選自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202變體；(b) S255變體S255N;和/或(c) R172變體R172Q。
39. 使紡織品退漿的方法，包括施用權(quán)利要求37或38中任一項的退 漿組合物足以使所述紡織品退漿的一段時間。
40. 淀粉加工組合物，包括在水性溶液中的權(quán)利要求8的芽孢桿菌屬 物種707 a-淀粉酶或其變體。
41. 權(quán)利要求40的淀粉加工組合物，其中所述變體是(a) 選自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202變體；(b) S255變體S255N;和/或(c) R172變體R172Q。
42. 權(quán)利要求40的淀粉加工組合物，還包括葡糖淀粉酶、異淀粉酶、 普魯蘭酶、植酸酶或其組合。
43. 加工淀粉的方法，包括施用權(quán)利要求40-42中任一項的組合物足 以加工所述淀粉的 一段時間。
44. 生物膜水解組合物，包括在溶液或凝膠中的權(quán)利要求8的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體，且任選地還包括.纖維素酶、半纖維素酶、 木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果膠酶、抗孩i生物劑或其任意組合。
45. 權(quán)利要求44的生物膜水解組合物，其中所述變體是(a) 選自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202變體；(b) S255變體S255N;和/或(c) R172變體R172Q。
46. 水解生物膜的方法，包括施用權(quán)利要求44或45中任一項的組合 物足以加工所述生物膜的一段時間。
47. 用于糖化淀粉的組合物，包括在溶液中的權(quán)利要求8的芽孢桿菌 屬物種707 (x-淀粉酶或其變體。
48. 權(quán)利要求47的組合物，其中所述變體是(a) 選自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202變體；(b) S255變體S255N;和/或(c) R172變體R172Q。
49. 糖化淀粉的方法，包括施用權(quán)利要求47或48中任一項的組合物 足以糖化所述淀粉的一段時間。
50. 用于液化淀粉的組合物，包括在溶液中的權(quán)利要求8的芽孢桿菌 屬物種707 a-淀粉酶或其變體。
51. 權(quán)利要求50的組合物，其中所迷變體是(a) 選自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202變體；(b) S255變體S255N;和/或(c) R172變體R172Q。
52. 液化淀粉的方法，包括施用權(quán)利要求50或51中任一項的組合物 足以液化所述淀粉的一段時間。
53. 烘焙組合物，包括在溶液或凝膠中的權(quán)利要求8的芽孢桿菌屬物種707 a-淀粉酶或其變體。
54. 權(quán)利要求53的烘焙組合物，其中所述變體是(a) 選自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202變體；(b) S255變體S255N;和/或(c) R172變體R172Q。
55. 烘焙方法，包括施用權(quán)利要求53或54中任一項的烘焙組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于芽孢桿菌屬物種707的α-淀粉酶的變體，包括所述變體的組合物，以及使用所述變體的方法。使用方法包括清潔表面、洗滌紡織品、退漿、從多種基質(zhì)上水解生物膜、以及處理淀粉(例如液化和糖化)的方法。
文檔編號D06M16/00GK101679987SQ200880015125
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者B·E·瓊斯, C·常, C·弗勒門, C·納比, H·德諾貝爾, M·科爾克曼, W·韋勒 申請人:丹尼斯科美國公司