專利名稱：一種靜電紡絲制備抗菌納米纖維復合膜的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于納米材料制備技術和生物材料領域，具體涉及一種靜電紡絲制備抗菌 EGCG_Cu(II)/PVA納米纖維復合膜的方法及其應用。
背景技術：
兒茶素是茶葉中富含多烴基的酚性物質-茶多酚的主要成分，EGCG (表沒食子兒 茶素沒食子酸酯)是茶葉中含量最多的兒茶素，具有抗菌抑菌作用。EGCG由于具有多個酚 羥基的特殊結構且具有較強的酸堿緩沖能力，使其在與金屬離子相遇時，極易與金屬離子 發(fā)生吸附和絡合作用，形成絡合物。日本學者Kimura等人發(fā)現在銅離子存在下茶多酚的殺 菌效果明顯增加。靜電紡絲是一種具有廣闊應用前景的納米材料制備技術，其設備價格低廉、制備 工藝簡單，能夠制備具有極大體積比表面積的納米纖維絲，因此受到廣泛的關注。已經有報 道利用靜電紡絲技術將聚合物與金屬顆粒、蛋白質和一些無機材料混紡，到目前為止有關 聚合物與茶葉中組分的混紡制備納米纖維膜未見報道。上述研究未對茶多酚中的有效成分及絡合反應進行深入研究，同時兒茶素與銅離 子形成的絡合物在溶液中不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化還原反應，從而影響其在生物醫(yī)學領域的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種靜電紡絲制備抗菌EGCG_Cu(II)/PVA納米纖維復合膜 的方法及其應用。本發(fā)明提出的靜電紡絲制備抗菌EGCG_Cu(II)/PVA納米纖維復合膜的方法，具體 步驟如下
(1)分別稱取硫酸銅和EGCG，用蒸餾水溶解，在充分攪拌條件下，將硫酸銅溶液滴加到 EGCG溶液中，控制EGCG與Cu2的摩爾比為1 1_1 4，在22_30°C溫度下，用堿性溶液調節(jié)溶 液的PH值為5. 0-8. 0 ；
(2)稱取PVA(聚乙烯醇)溶于蒸餾水中，加入步驟⑴所得溶液，控制PVA濃度 為 5-12% (w/v, g/ml), EGCG 的濃度為 0. 05X 1(T3_4X 1(T3 mol/1, CuSO4 溶液的濃度為 0. IX ICT3-IO ΧΙΟ—3 mol/1 ；室溫下磁力攪拌l_4h，得到紡絲溶液；
(3)將步驟(2)所得紡絲溶液吸入20ml注射器，裝上直徑0.6_1. 2mm針頭，調整針頭 到接收器的距離為5-20cm，調節(jié)電壓在10-20kv，紡絲溶液流速控制在0. 5_6ml/h，紡絲2h， 78-82°C下真空干燥2-8h，即得到所需產品。本發(fā)明中，所述堿性溶液為10% Na2CO3或ImM NaOH。本發(fā)明提出的靜電紡絲制備抗菌EGCG_Cu(II)/PVA納米纖維復合膜作為殺菌抑 菌材料的應用，具體方法為
(1)菌體培養(yǎng)、離心和收集菌體細胞，用磷酸鹽緩沖液重懸細胞，再將納米纖維復合膜放入反應液中，28-37°C，搖床轉速100-250 r/min，反應2_8h ； (2)離心收集菌體，觀察。具體的，本發(fā)明中所用大腸桿菌Esehedchia coli為DH5 α。具體的，所述方法如下
(1)斜面培養(yǎng)取常規(guī)適用于五coli的斜面培養(yǎng)基，接種，37°C斜面培養(yǎng)6-12h，作為 斜面。(2)菌體培養(yǎng)取常規(guī)適用于五COli的液體培養(yǎng)基，從斜面接種到液體培養(yǎng)基 中，37°C搖床轉速100-250 r/min，培養(yǎng)4-12h，收集菌體。本發(fā)明優(yōu)點在于
本發(fā)明對EGCG與Cu2+的絡合反應條件進行了優(yōu)化。本發(fā)明采用聚合物與EGCG_Cu(II)復合物共紡技術制備納米纖維膜，為靜電紡絲 技術的一項新的應用。本發(fā)明采用的聚合物具有高水溶性，低毒和生物相容性好等優(yōu)點，所加藥物是天 然提取物，該復合膜最終能夠降解，對環(huán)境污染小，是一種環(huán)保的工藝。本發(fā)明的工藝簡單，條件溫和，操作簡便，成本低廉，產品可重復利用，適合于大規(guī) 模工業(yè)生產。本發(fā)明制備的納米纖維復合膜具有較好的韌性和生物相容性，在生物材料領域有 較為廣闊的應用前景。


圖1為EGCG與Cu(II)摩爾比為1:1時的吸收光譜圖。圖2為EGCG與Cu(II)摩爾比為1:2時的吸收光譜圖。圖3為EGCG與Cu(II)摩爾比為1:3時的吸收光譜圖。圖4為溶液的pH為7. 4時吸收光譜圖。圖5為產品EGCG_Cu(II)納米復合膜圖。圖6為8%PVA+0. 5mM EGCG_Cu(II)納米復合膜掃描電鏡圖。圖7為8%PVA+0. 05mM EGCG_Cu(II)納米復合膜掃描電鏡圖。圖8和圖9為采用1 mM EGCG的EGCG_Cu(II)納米復合膜透射電鏡圖。圖10為采用0. 5 mM EGCG的EGCG_Cu(II)納米復合膜和EGCG抑菌效果圖。圖11為EGCG_Cu(II)納米復合膜處理前空白對照圖。圖12為EGCG_Cu(II)納米復合膜處理后菌懸液涂布圖。
具體實施例方式下面通過實施例進一步描述本發(fā)明。實施例1
(1)取3ml的5X10—3 mol/1 EGCG溶液于比色杯中，再用微量移液槍加入5 μ 1 0.01 mol/1 0^04溶液，用UV-Visible全波段分光光度計全波段檢測，結果如圖1所示。(2)稱取PVA (聚乙烯醇)溶于蒸餾水中，加熱到95°C使其充分溶解，再加入步驟 (1)中的溶液，PVA終濃度為8% (w/v, g/ml )，室溫下磁力攪拌2h備用。將紡絲溶液吸入20ml注射器，裝上直徑0. 6mm針頭，調整針頭到接收器的距離為6cm，調節(jié)電壓在12kv，紡絲 溶液流速控制在2ml/h，紡絲2h，80°C下真空干燥6h，得到EGCG_Cu(II)納米復合膜。實施例2:
(1)取3ml 5X IO"3 mol/1 EGCG溶液于比色杯中，再用微量移液槍加入10 μ 1 0.01 mol/1 CuSO4溶液，用UV-Visible全波段分光光度計全波段檢測，結果如圖2所示。(2)稱取PVA (聚乙烯醇)溶于蒸餾水中，加熱到95°C使其充分溶解，再加入步驟 (1)中的溶液，PVA終濃度為8% (w/v, g/ml )，室溫下磁力攪拌2h備用。將紡絲溶液吸入 20ml注射器，裝上直徑0. 6mm針頭，調整針頭到接收器的距離為6cm，調節(jié)電壓在12kv，紡絲 溶液流速控制在2ml/h，紡絲2h，80°C下真空干燥6h，得到EGCG_Cu(II)納米復合膜。實施例3
(1)取3ml 5X IO"3 mol/1 EGCG溶液于比色杯中，再用微量移液槍加入15 μ 1 0.01 mol/1 CuSO4溶液，用UV-Visible全波段分光光度計全波段檢測，結果如圖3所示。(2具體如下稱取PVA (聚乙烯醇)溶于蒸餾水中，加熱到95°C使其充分溶解，再 加入步驟(1)中的溶液，PVA終濃度為8% (w/v, g/ml),室溫下磁力攪拌2h備用。將紡絲 溶液吸入20ml注射器，裝上直徑0. 6mm針頭，調整針頭到接收器的距離為6cm，調節(jié)電壓在 12kv，紡絲溶液流速控制在2ml/h，紡絲2h，80°C下真空干燥6h，得到EGCG_Cu(II)納米復 合膜。實施例4
用微量移液槍取0. 15ml 1X10—3 mol/1 EGCG溶液于比色杯中，加蒸餾水至3ml，滴加 0.05 mol/1 NaOH溶液，充分攪拌，調pH至7. 4，用UV-Visible全波段分光光度計全波段檢 測，結果如圖4所示。(2)稱取PVA (聚乙烯醇)溶于蒸餾水中，加熱到95°C使其充分溶解，再加入步驟 (1)中的溶液，PVA終濃度為8% (w/v, g/ml),室溫下磁力攪拌2h備用。將紡絲溶液吸入 20ml注射器，裝上直徑0. 6mm針頭，調整針頭到接收器的距離為6cm，調節(jié)電壓在12kv，紡絲 溶液流速控制在2ml/h，紡絲2h，80°C下真空干燥6h，得到EGCG_Cu (II)納米復合膜。實施例5
按照實施例2和實施例4中的方法制備EGCG_Cu(II)絡合物溶液。稱取0. 8 g PVA (聚乙烯醇)溶于10 ml蒸餾水中，PVA濃度為8% (w/v, g/ml), 室溫下磁力攪拌2h備用。將紡絲溶液吸入20ml注射器，裝上直徑0. 6mm針頭，調整針頭到 接收器的距離為6cm，調節(jié)電壓在12kv，紡絲溶液流速控制在2ml/h，紡絲2h，80°C下真空 干燥6h，得到EGCG_Cu(II)納米復合膜，直徑在100-500nm(見圖5-9)。其中圖6_7為掃描 電鏡圖，圖8-9為透射電鏡圖。實施例6
按照實施例2和實施例4中的方法制備EGCG_Cu(II)絡合物溶液。按照實施例5中的方法制備EGCG_Cu (II)納米復合膜。從37°C培養(yǎng)16 20h的五coli平板中取一環(huán)，轉接到一個裝有50ml LB培養(yǎng)基 的 250ml 三角瓶中，于 37°C 200 r/min 培養(yǎng)至 0D600=0. 4 0. 5 ；4°C 4000 r/min 離心 10 min，收集菌體；用無菌水制成菌體濃度為106~7的菌懸液。將融化并冷卻到50°C左右的培養(yǎng)基傾入滴有0. 5ml菌懸液的培養(yǎng)皿中約15ml，迅速搖勻制成含菌平板；或將融化的培養(yǎng)基傾入滅菌培養(yǎng)皿中待凝固后滴入0. 5ml菌懸液， 用滅菌涂布棒將菌懸液涂布均勻即成含菌平板。所得的EGCG_Cu (II)納米復合膜剪成直徑為9mm的圓片，放置在紫外燈下滅菌2h， 貼于上述含菌平板上，倒置培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈(見圖10 )。實施例7
按照實施例2和實施例4中的方法制備EGCG_Cu(II)絡合物溶液。按照實施例5中的方法制備EGCG_Cu (II)納米復合膜。37°C下五C^i平板培養(yǎng)16 20h，轉接到一個裝有2ml LB培養(yǎng)基的試管中，于37°C 200 r/min培養(yǎng)至0D600=1. 0，4°C 4000 r/min離心10 min，收集菌體，用pbs重懸，再將實 施例2所得的EGCG_Cu(II)納米復合膜加入上述重懸液中，EGCG_Cu(II)終濃度為0. 5mM 的EGCG_Cu (II)納米復合膜，370C 200 r/min培養(yǎng)24h，用十倍稀釋法涂平板，平板計數法 數菌落，檢測抑菌效果(見圖11-12)，抑菌率高達99%。
權利要求
一種靜電紡絲制備抗菌納米纖維復合膜的方法，其特征在于具體步驟如下 (1)分別稱取硫酸銅和EGCG，用蒸餾水溶解，在充分攪拌條件下，將硫酸銅溶液滴加到EGCG溶液中，控制EGCG與Cu2的摩爾比為1:1 1:4，在22 30℃溫度下，用堿性溶液調節(jié)溶液的pH值為5.0 8.0；(2)稱取聚乙烯醇溶于蒸餾水中，加入步驟(1)所得溶液，控制聚乙烯醇濃度為5 12%，EGCG的濃度為0.05×10 3 4×10 3 mol/l，CuSO4溶液的濃度為0.1×10 3 10×10 3 mol/l；室溫下磁力攪拌1 4h，得到紡絲溶液；(3)將步驟(2)所得紡絲溶液吸入20ml注射器，裝上直徑0.6 1.2mm針頭，調整針頭到接收器的距離為5 20cm，調節(jié)電壓在10 20kv，紡絲溶液流速控制在0.5 6ml/h，紡絲2h，78 82℃下真空干燥2 8h，即得到所需產品。
2.根據權利要求1所述的靜電紡絲制備抗菌納米纖維復合膜的方法，其特征在于所述 堿性溶液為10% Na2CO3或ImM NaOH。
3.—種如權利要求1所述的靜電紡絲制備抗菌納米纖維復合膜作為殺菌抑菌材料的 應用，具體方法為(1)菌體培養(yǎng)、離心和收集菌體細胞，用磷酸鹽緩沖液重懸細胞，再將納米纖維復合膜 放入反應液中，28-37°C，搖床轉速100-250 r/min，反應2_8h ；(2)離心收集菌體，觀察。
4.根據權利要求3所述的靜電紡絲制備抗菌納米纖維復合膜的應用，其特征在于該抗 菌納米纖維復合膜用于大腸桿菌cWi;具體方法如下(1)斜面培養(yǎng)取常規(guī)適用于五coli的斜面培養(yǎng)基，接種，37°C斜面培養(yǎng)6-12h，作為 斜面；(2)菌體培養(yǎng)取常規(guī)適用于五coli的液體培養(yǎng)基，從斜面接種到液體培養(yǎng)基中， 37°C搖床轉速100-250 r/min，培養(yǎng)4-12h，收集菌體。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米材料制備技術和生物材料領域，具體涉及一種靜電紡絲制備抗菌EGCG_Cu(II)/PVA納米纖維復合膜的方法及其應用。按比例稱取硫酸銅和EGCG，蒸餾水溶解后，通過調節(jié)pH得到EGCG_Cu(II)絡合物；將EGCG_Cu(II)絡合物與PVA按比例混合，利用靜電紡絲技術生成EGCG_Cu(II)/PVA納米纖維復合膜，本發(fā)明對大腸桿菌的殺菌率高達99%。該納米復合膜具有較好的韌性和生物相容性，在生物材料領域有較為廣闊的應用前景。
文檔編號D01F6/50GK101962812SQ20101028631
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權日2010年9月19日
發(fā)明者孫立明, 李平 申請人:同濟大學