專利名稱：用于酶促水解的改良的處理生物質(zhì)的方法
用于酶促水解的改良的處理生物質(zhì)的方法相關(guān)申請的交叉引用為美國專利實踐的目的，將2009年12月4日提交的美國臨時申請No. 61/266，618的內(nèi)容以無不一致的程度通過弓I用整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改良的在酶促水解之前使用，例如，包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液處理包含全纖維素的原料的方法。
背景技術(shù)：
纖維素到葡萄糖的酶促水解經(jīng)最近10年獲得了增加的興趣，及對經(jīng)濟上可持續(xù)的生物燃料的增長的需求指向?qū)υ谒鼈兊漠a(chǎn)生中減少成本的緊急需求。纖維素，被許多植·物制造的多糖，是地球上最豐富的有機化合物之一，由此代表用于生物燃料工業(yè)的潛在金礦。但是，當前纖維素的酶促降解面對阻止其用于產(chǎn)生，例如，經(jīng)濟上競爭性的生物燃料的廣泛利用的主要問題。該問題可包括，例如，低反應(yīng)和/或轉(zhuǎn)變速度。發(fā)明概述有利地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了實現(xiàn)上述的目標和更多的方法和組合物?？偠灾景l(fā)明中在一實施方式中涉及處理包含全纖維素的原料的方法。所述方法包括將原料與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液混合以形成混合物。然后使混合物經(jīng)歷足以減少全纖維素的結(jié)晶度的條件。隨后酶促水解可顯示相比不采用CBD處理過程的方法改善的速度和/或可發(fā)酵的糖產(chǎn)率。

圖I例證自瑞氏木霉(Trichoderma reesei )純化的cel7A和木瓜蛋白酶切割之后的cel7A催化性結(jié)構(gòu)域的SDS-PAGE凝膠。圖2例證CBD處理之后微晶纖維素的酶促水解。圖3例證各種CBD溫育時間的效應(yīng)。圖4顯示相比CBD溫育(13h)緩沖劑溫育對水解速度的效應(yīng)。圖5顯示緩沖劑溫育時間對水解速度的效應(yīng)。圖6顯示CBD濃度優(yōu)化實驗的結(jié)果。圖7顯示各種CBD處理時間的水解。圖8顯示各種⑶B濃度的效應(yīng)。圖9顯示連續(xù)添加和CBD去除的效應(yīng)。圖10顯示45°C處理的效應(yīng)。圖11顯示50°C處理的效應(yīng)。圖12顯示用CBD處理，用緩沖劑處理，無用同時添加CBD處理，及無處理(干樣品)之后使用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶自柳枝稷產(chǎn)生的還原端的量。
圖13顯示纖維素酶的木瓜蛋白酶切割之前及之后的SDS-PAGE。圖14顯示用CBDeem (自純化的Cel7A的纖維素_結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，CDm7a (催化性結(jié)構(gòu)域)或緩沖劑處理的微晶纖維素樣品的XRD譜。圖15a顯示用CBD的混合物于42°C預(yù)處理15h之后微晶纖維素的水解特征。圖15b顯示用CBD的混合物于42°C預(yù)處理15h之后纖維狀纖維素(FC)的水解特征。圖16顯示用CBDcem于42°C預(yù)處理15h之后微晶纖維素的水解特征。圖17顯示在預(yù)處理步驟(于42°C 15h)中各種CBD濃度對水解速度的效應(yīng)。圖18顯示用CBD的纖維素預(yù)處理期間攪棒對水解速度的效應(yīng)。
圖19顯示可在本發(fā)明中有用的各種CBD的氨基酸序列。發(fā)明詳述總而言之本發(fā)明中在一實施方式中涉及處理包含全纖維素的原料的方法。所述方法包括將原料與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液混合以形成混合物。然后使混合物經(jīng)歷足以減少全纖維素的結(jié)晶度的條件。隨后酶促水解可相比不在隨后水解之前采用CBD處理過程的方法顯示改善的速度和/或可發(fā)酵的糖產(chǎn)率。有利地，水解的組合物中的可發(fā)酵的糖和/或水解速度可為至少約10%，或至少約15%，或至少約20%，多于不采用纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可比較的方法。產(chǎn)生一種或更多可發(fā)酵的糖諸如葡萄糖的水解之后，可采用過程諸如發(fā)酵來產(chǎn)生，例如，生物乙醇。包含全纖維素的原料只要原料包含全纖維素，在本方法和組合物中采用的原料的性質(zhì)不是特別關(guān)鍵。如本文所用，"全纖維素"是指生物質(zhì)的至少部分水不溶性碳水化合物部分，即，不是木質(zhì)素，提取物或灰，而是，包括物質(zhì)諸如多糖的生物質(zhì)部分。全纖維素的精確的組合物可依賴于采用的特定原料而改變。但是，在本文有用的全纖維素一般包含各種量的纖維素諸如α-纖維素和半纖維素，且可含有各種戊聚糖或己聚糖聚合物。由此，實際上是可采用包含纖維素的任何木質(zhì)纖維素生物質(zhì)作為在本發(fā)明的方法和組合物中的原料。本發(fā)明可有利地在包含纖維素的結(jié)晶度需要減小的纖維素的組合物上采用。在一實施方式中特別可優(yōu)選的原料是植物生物質(zhì)。生物質(zhì)為許多不同類型，其可分組為少數(shù)主要類別木或林業(yè)殘留物，包括鋸木廠和造紙廠廢物，城市造紙廢漿，藻，農(nóng)業(yè)殘留物，包括玉米秸桿(秸桿和稻草)，及甘蔗蔗渣，及專用的能源作物，其通常由快生長的高的、木質(zhì)草諸如，例如，柳枝稷組成。上述的任何可在本發(fā)明中使用。特別可優(yōu)選的生物質(zhì)包含具有高纖維素含量的生物質(zhì)。依賴于原料的性質(zhì)，其可期望減小至少部分其尺寸以便暴露額外的處理用表面積。該減小可以任何方便的方式諸如通過研磨，插枝，切斷，等進行。期望的原料尺寸改變依賴于本發(fā)明的成分和其他特效物的類型。一般而言，更小尺寸原料可更快反應(yīng)，但花費更多來產(chǎn)生。一般而言，如果在CBD處理之前和/或水解之前原料減少是有利的。類似地，在一些情況中首先純化至少部分原料是常常有利的，或可甚至是必需的。純化意指部分清潔，以便去除可負面地影響下游過程的至少一些混雜物。此純化可輔助減少或消除下列步驟中任何不期望的反應(yīng)。純化類型會依賴于原料來源，以及，雜質(zhì)的量和性質(zhì)及會經(jīng)歷下列步驟。常常，木質(zhì)纖維素原料的簡單洗滌就足夠。該純化，如果進行，可在任何尺寸減小之前，伴隨，或之后實現(xiàn)。此外，如果需要或有利，可分離不包含全纖維素的至少部分或全部原料。但是，此對于組合物會可能經(jīng)歷的許多過程和條件不是必要的。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)本文采用的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般源于纖維素酶。纖維素酶是催化1，4- β -D-糖苷鍵的水解的不同結(jié)構(gòu)的糖基水解酶。多數(shù)纖維素酶包含3個結(jié)構(gòu)域(I)主要作為水解座位的催化性結(jié)構(gòu)域，(2)常常輔助將全酶錨定到纖維素表面和/或?qū)⒗w維素纖維定向到含有活性位點的隧道的纖維素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，及(3)連接2個其他結(jié)構(gòu)域和常常提供它們之間的足夠的空間分離的糖基化的柔性的接頭。接頭也可輔助允許持續(xù)運動和/或輔助能量存儲。如本文所用，術(shù)語〃纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域〃或〃CBD〃是包括上述的(2)的實質(zhì)性部分，但缺乏(I)的多數(shù)或全部實質(zhì)性部分的部分纖維素酶。該纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域在一些實施方式中包括全部或至少部分接頭(3)，而在其他實施方式中接頭(3)被修飾或自采用的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失。由此，用于本文使用的有用的CBD可常常通過以方便的方法諸如， 例如，蛋白水解切割來切割CBD及，如果需要，來自纖維素酶的接頭而從纖維素酶得到。依賴于切割方法，CBD可然后以方便的方式諸如，例如，過濾來回收。在一些實施方式中，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化性結(jié)構(gòu)域的比是大于1:1，或大于2:1，或大于3:1，或大于5:1，或大于10:1。采用的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)和類型不是特別關(guān)鍵的，只要它們以一些方式發(fā)揮減少纖維素的結(jié)晶度和/或輔助任何進一步處理諸如水解的功能。適合的CBS可源于由如下物種產(chǎn)生的適合的酶，如，例如，木霉屬(Trichoderma)物種諸如瑞氏木霉(T. reesei),綠色木霉(Τ· viride),以及，例如，黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens),灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea),解纖維支頂抱(Acremonium cellulolyticus),紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina), Penicilliumoccitanis,乳色祀菌(Irpex lacteus),棘抱青霉(Penicillium echinulatum),埃杜拉香裔KLentinula edodes)，斜臣卜青霉(Penicillium decumbens)。在一實施方式中，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域源于纖維二糖水解酶I (cel7A)，諸如由，例如，木霉屬(Trichoderma)物種如瑞氏木霉(Trichoderma reesei)產(chǎn)生的。在另一實施方式中，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域源于纖維二糖水解酶II(cel6A)。在其他實施方式中，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域來源于，例如，下表5中的酶。在另一實施方式中，采用的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為上述的2種或更多的混合物。自瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的纖維素酶的纖維素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)(屬于家族I CBD)形成楔-樣折疊，其中平面提供與晶體纖維素強烈相互作用的關(guān)鍵(芳族)殘基?？刹捎萌缦吕心切┟枋龅脑摲椒ā４送?，本公開的益處，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用其他物質(zhì)的常規(guī)測試來鑒定有用的物質(zhì)。替代性地或額外地，可對CBD進行蛋白加工。可然后開發(fā)CBD上的特定殘基的突變(諸如在與纖維素結(jié)合或相互作用中涉及的那些和/或可實現(xiàn)更快的水解速度的任何)，以開發(fā)剪裁為，例如，特定原料和/或處理條件的CBD。原料與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液的混合包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液可以任何方便的方式制造及與原料混合。包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液的濃度依賴于特定原料，溶液的其他成分諸如緩沖劑，及待采用的條件而改變。一般而言，其應(yīng)具有至少足以在處理條件減少纖維素的結(jié)晶度，但不高到干擾任何隨后期望的處理步驟諸如水解的濃度。一般而言，至少約5，或至少約10，或至少約15達至多約100，或至多約75，或至多約55，或至多約45，或至多約35 μ g/ml的濃度可有效。也可在溶液中采用適合的緩沖劑，如果需要。采用與CBD協(xié)同作用至甚至還輔助減小纖維素的結(jié)晶度的緩沖劑可為有利。適合的緩沖劑常常包括低級烷基的酸諸如乙酸的鹽或酯，和一般具有約4. 5 約5. 5的pH。在一實施方式中，溶液包含約25 約75mM的濃度的乙酸鈉緩沖劑。CBD處理條件一旦制造包含一種或更多原料與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液的混合物，然后使混合物經(jīng)歷足以減少全纖維素的結(jié)晶度和/或輔助隨后水解的條件。這些條件可改變廣泛依賴于原料的性質(zhì)和類型和包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液中成分的類型和量。一般而言，使混合物經(jīng)歷增加的溫度經(jīng)足以減少全纖維素的結(jié)晶度的時間。該溫度改變，但可為至少約30°C，或至少約35°C達至多約60°C，或至多約50°C，或至多約45°C。一般而言，采用的溫度越高，混合物必需加熱的時間越短，且反之亦然。在之前描述的溫度，使混合物經(jīng)歷增加的溫度的適合的時間是至少約8小時，或至少約10小時，或至少約12小時，或至少約14小時，達至多約48小時，或至多約24小時，或至多約16小時。使用本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用常規(guī)實驗來測定用于特定原料和組合物的適當?shù)臅r間和溫度。不限制于任何特定理論，認為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和類似蛋白減少結(jié)晶度程度，由此致使纖維素欠反抗酶攻擊。本發(fā)明的上述的過程可單獨或與其他技術(shù)組合使用，以降低結(jié)晶度到期望的水平。該技術(shù)可在本發(fā)明的方法之前，期間或之后使用，且包括，例如，(熱)化學(xué)和/或機械技術(shù)(例如用磷酸，離子液體或有機溶劑，AFEX和球磨機研磨處理)。在一些實例中，純化在水解步驟(例如用離子液體)之前可有益。在一些實例中，使混合物經(jīng)歷足夠的攪拌使得基本上全部固體懸浮可為有利。例如，在一些實例中，使混合物經(jīng)歷在瓶中用攪棒，優(yōu)選劇烈攪拌。在一些實施方式中，攪棒具有瓶內(nèi)徑的至少約45%，優(yōu)選至少約50%，優(yōu)選至少約55%的直徑。在另一實施方式中，本發(fā)明屬于在例如，纖維素水解過程中的預(yù)處理步驟中使用包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液或組合物。包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液或組合物如以上及以下描述。類似地，預(yù)處理步驟如所述，即，首先將全纖維素原料與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液或組合物混合以形成混合物，然后使混合物經(jīng)歷足以減少全纖維素的結(jié)晶度的條件。特定成分，條件，等可如在本文別處描述。實施例I 8用于微晶纖維素的CBD處理的一般過程纖維二糖水解酶I (cel7A)是作為自還原端側(cè)攻擊纖維素鏈的外切葡聚糖酶的纖維素酶混合物的組分。下列發(fā)明的例采用自此酶，及更特別自瑞氏木霉(Trichodermareesei)(例如，生物乙醇產(chǎn)生中通常使用的生物)的cel7A的纖維素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。研究CBD對纖維素的效應(yīng)，即在包含CBD的溶液中纖維素溫育，即，處理，對結(jié)晶度程度，及隨后對用CBD-處理的纖維素進行的反應(yīng)的酶促水解速度的結(jié)果。Cel7A是由3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成纖維素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，催化性結(jié)構(gòu)域(⑶)、和接合CBD和CD的高度糖基化的接頭。實施例涉及
(I)經(jīng)使用木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)的片段(加接頭)自CD的蛋白水解切割由cel7A產(chǎn)生CBD ；(2)經(jīng)過濾通過30kDa膜回收CBD (CBD+接頭 61個殘基；理論尺寸 6kDa;自實驗估計的尺寸 14kDa,由于接頭的O-糖基化丨⑶的估計的尺寸 50kDa,由于N-糖基化)；(3)用包含CBD的溶液溫育，即，處理，纖維素(微晶纖維素)；以及
(4)添加纖維素酶混劑(自瑞氏木霉(Trichoderma reesei))及監(jiān)控水解速度(經(jīng)葡萄糖含量)。用于CBD產(chǎn)生的一般過程在對自在例如，P.Tomme et al, Eur. J. Biochem.，1988，170，575-581 中使用的核心蛋白的CBD切割過程之后，在下列條件下采用木瓜蛋白酶來進行蛋白水解消化I.在50mM NH4OAc緩沖劑pH6. O中于30°C活化木瓜蛋白酶30min ；2.將木瓜蛋白酶于30°C添加到ce17A溶液(在50mM NaOAc緩沖劑中，ρΗ5· 0)，木瓜蛋白酶/cel7A 比是 1:5 (w/w, v/v)；3.于30°C攪拌2h;以及4.通過30kDa膜過濾反應(yīng)混合物(以4000rpm, 15min),以在濾出液中收集纖維素
結(jié)合結(jié)構(gòu)域(附接于接頭)。切割反應(yīng)發(fā)現(xiàn)在2h之后完成，且無法通過SDS-PAGE可檢測殘留cel7A ( 64kDa)，如顯示于圖I。反應(yīng)導(dǎo)致形成單強條帶，其具有 50kDa的分子量。木瓜蛋白酶成功地自核心蛋白(⑶)切割下CBD+接頭；但是，未通過SDS-PAGE檢測到此小蛋白片段( 14kDa)(序列顯示可用通常使用的考馬斯染料-染色反應(yīng)的非常少殘留物)。但是，經(jīng)微BCA蛋白測定(雙金雞寧酸)在濾出液中檢測到CBD (<30kDa)(表1，100%回收)。表I.木瓜蛋白酶切割之后的Cel7A片段回收
蛋白片段總質(zhì)量(mg)~
Cel7A (+木瓜蛋白酶)反應(yīng)之前4. 6mg
過濾通過膜之后的CD(+木瓜蛋白酶)濃縮物>30kDa3. 8mg
過濾通過膜之后的⑶D濾出液〈30kDaO. 6mg
預(yù)期的 CBD (自 64kDa 的 ~10 14kDa)O. 6 O. 9mg實施例IA:用包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的溶液處理微晶纖維素和經(jīng)X-射線衍射測量結(jié)晶度不束縛于任何特定理論，認為CBD的活性涉及纖維素的非-水解性分裂及纖維素中氫-鍵合網(wǎng)絡(luò)的減弱及分裂。下列調(diào)查確定是否活性對于減小纖維素結(jié)晶度足夠強。用CBD溶液(如上述獲得的)處理微晶纖維素，及隨后經(jīng)X-射線衍射使用我們最近開發(fā)的在例如，Bansal et al. , Multivariate statistical analysis of X-ray datafrom cellulose:A new method to determine degree of crystallinity and predicthydrolysis rates. Bioresource Technol, 101，4461-4471 中描述的分析方法測定回收的
纖維素的結(jié)晶度的程度。如下進行纖維素處理步驟將CBD溶液(50mM NaOAc緩沖劑，pH5)中的微晶纖維素(20mg/ml)于37°C攪拌2天。將混合物以4000rpm離心15min,并將回收的纖維素冷凍干燥。通過以上所述的X-射線衍射方法分析粉。微晶纖維素是具有約60%的平均結(jié)晶度的微晶纖維素。用CBD溶液處理之后，觀察到微晶纖維素結(jié)晶度的顯著減小，如顯示于下表2。用對應(yīng)于自在7ml緩沖劑中3.3mgcel7A的切割獲得的4. 7ml的濾出液的樣品4獲得最高13%的減小。表2.與纖維素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)或催化性結(jié)構(gòu)域(⑶)溫育(2天)之后微晶纖維素的結(jié)晶度(CrI)程度
權(quán)利要求
1.處理包含全纖維素的原料的方法，其中所述方法包括 Ca)將原料與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液混合以形成混合物；以及 (b)使混合物經(jīng)歷足以減少全纖維素的結(jié)晶度的條件。
2.權(quán)利要求I的方法，其中纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域源于纖維二糖水解酶I(cel7A)或纖維二糖水解酶II (cel6A)。
3.權(quán)利要求I的方法,其中纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域源于由瑞氏木霉(Trichodermareesei)產(chǎn)生的纖維二糖水解酶I (cel7A)。
4.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中使混合物經(jīng)歷大于30°C的溫度經(jīng)足以減少全纖維素的結(jié)晶度的時間。
5.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中使混合物經(jīng)歷增加的溫度至少8小時。
6.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中使混合物經(jīng)歷攪拌使得基本上全部固體懸浮。
7.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液具有5 55 μ g/ml的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域濃度。
8.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液還包含適合的緩沖劑及其中溶液具有4. 5 5. 5的pH。
9.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其還包括水解權(quán)利要求I中步驟(b)的產(chǎn)物，以產(chǎn)生包含至少一種可發(fā)酵的糖的組合物，且相比不采用纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可比較的方法，其中所述組合物中的所述至少一種可發(fā)酵的糖是至少10%更多。
10.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化性結(jié)構(gòu)域的比是大于 I: I ο
11.適合于減少纖維素的結(jié)晶度的組合物，其包含 纖維素， 適合的濃度的包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液，及 適合的緩沖劑。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域源于由瑞氏木霉(Trichodermareesei)產(chǎn)生的纖維二糖水解酶I (cel7A)。
13.權(quán)利要求11 12之任一項的組合物， 其中包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液具有5 55 μ g/ml的濃度， 其中緩沖劑包含25 75mM乙酸鈉緩沖劑，且 其中溶液具有5的pH。
14.權(quán)利要求11 12之任一項的組合物，其中包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液具有大于1:1的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化性結(jié)構(gòu)域的比。
15.權(quán)利要求11 12之任一項的組合物，其中包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液具有大于5:1的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化性結(jié)構(gòu)域的比。
全文摘要
本發(fā)明是處理包含全纖維素的原料的方法。所述方法包括將原料與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液混合以形成混合物。然后使混合物經(jīng)歷足以減少全纖維素的結(jié)晶度的條件。隨后酶促水解可相比不采用所述過程的方法顯示改善的速度和/或可發(fā)酵的糖產(chǎn)率。
文檔編號D21C1/00GK102918200SQ201080061814
公開日2013年2月6日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者P·班薩爾, A·S·博馬留斯, M·霍爾, J·H·李 申請人:佐治亞技術(shù)研究公司