混合中性纖維素酶及其制備方法和在造紙打漿中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于造紙打漿的混合中性纖維素酶,屬于酶制劑領(lǐng)域。所述混合中性纖維素酶,重量份數(shù)組成如下:纖維素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果膠酶5-10份、甘露聚糖酶3-8份,中草藥粉劑2-8份。本發(fā)明制備的混合中性纖維素酶,有效的利用了中草藥粉劑的有效成分,并利用特殊方法克服了傳統(tǒng)的酸性木聚糖酶采用單一菌種發(fā)酵的缺陷;經(jīng)過(guò)混合中性纖維素酶處理的磨漿,叩解度相對(duì)于未處理漿增加了11.76%,短纖耐破指數(shù)提高了11.98%,環(huán)壓指數(shù)提高了13.99%;長(zhǎng)纖拉力指數(shù)提高了40.17%,,撕裂指數(shù)提高了58.91%,纖維表面變得光滑,酶纖維更為柔軟;成紙的撕裂指數(shù)、抗張指數(shù)、耐破指數(shù)分別提高了8.3%,10.6%,16.5%,紙漿白度提高2%-5%,污水質(zhì)量大大改善,降低了對(duì)環(huán)境的污染程度。
【專利說(shuō)明】混合中性纖維素酶及其制備方法和在造紙打漿中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001] 本發(fā)明屬于酶制劑領(lǐng)域,特別涉及紙漿造紙領(lǐng)域用酶。
【背景技術(shù)】:
[0002]制漿造紙工業(yè)是國(guó)民經(jīng)濟(jì)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一,但也是森林、能源、化學(xué)品等資源消耗和環(huán)境污染的大戶。全球的造紙工業(yè)每年要砍伐數(shù)億立方米的林木,而其中約半數(shù)變?yōu)閺U棄物又被排回至周圍的大氣和水流中,給人類生存的生態(tài)環(huán)境造成了巨大威脅和危害。減少能源和化學(xué)品消耗、提高紙漿得率、污水生物處理等都是克服上述困難的根本途徑。而生物技術(shù)恰恰在這些方面是可以大有作為的。
[0003]纖維素酶是由多種水解酶組成的一個(gè)復(fù)雜酶系,自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶。習(xí)慣上,將纖維素酶分成三類:Cl酶、Cx酶和β葡糖苷酶。Cl酶是對(duì)纖維素最初起作用的酶,破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。Cx酶是作用于經(jīng)Cl酶活化的纖維素、分解β-1,
4-糖苷鍵的纖維素酶。β葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖。
[0004]纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣,其最主要的區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系,且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。由于底物的水不溶性,纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES復(fù)合物過(guò)程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上,然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。
[0005]1950年,Reese等提出了 Cl-Cx假說(shuō),該假說(shuō)認(rèn)為必須以不同的酶協(xié)同作用,才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協(xié)同作用一般認(rèn)為是內(nèi)切葡聚糖酶(Cl酶)首先進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū),形成Cx所需的新的游離末端,然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位,最后由β_葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個(gè)葡萄糖。不過(guò),纖維素酶的協(xié)同作用順序不是絕對(duì)的,隨后的研究中發(fā)現(xiàn),Cl-Cx和β -葡聚糖苷酶必須同時(shí)存在才能水解天然纖維素。若先用Cl酶作用結(jié)晶纖維素,然后除掉Cl酶,再加入Cx酶,如此順序作用卻不能將結(jié)晶纖維素水解。
[0006]影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素很多,除菌種外,還有培養(yǎng)溫度、pH、水分、基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間等。這些因素不是孤立的,而是相互聯(lián)系的。張中良等(1997)采用均勻設(shè)計(jì)C112 (1210),以綠色木霉(T.ViriclePers.expr)為菌種,研究了影響產(chǎn)纖維素酶的五大因素對(duì)產(chǎn)酶量和活力的作用,認(rèn)為基質(zhì)粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31°C條件下培養(yǎng)45h可獲得最大產(chǎn)酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g.h。王成華等(1997)也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產(chǎn)酶條件,結(jié)果表明該菌種以7:3的秸桿粉和麥麩,另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養(yǎng)基,28-32°C為適宜培養(yǎng)溫度,30°C為最佳溫度,4%為最佳接種量,96h到達(dá)發(fā)酵高峰。張苓花等(1998)研究了以康氏木霉W-925為出發(fā)菌,經(jīng)誘變后得到的Wu-932纖維素酶高產(chǎn)菌的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明,以1:2的麥麩和稻草粉為培養(yǎng)基,5%的接種量,稻草粉碎平均長(zhǎng)度3-5mm,初始pH4-5,溫度在28-35°C,發(fā)酵時(shí)間72h為最佳發(fā)酵條件。[0007] 申請(qǐng)人:廣東溢多利生物科技股份有限公司提交的一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl及其基因和應(yīng)用專利,其申請(qǐng)?zhí)?201110362928.0。該發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,具體地,本發(fā)明涉及一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl,發(fā)明還提供了編碼上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl的基因,以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl在中性條件下酶活有很大的提高,并且,通過(guò)高拷貝外源基因菌株的篩選,得到能夠在反應(yīng)器中高效表達(dá)的生產(chǎn)菌株,進(jìn)一步滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求,因此,本發(fā)明的優(yōu)化改良的MEGl可在紡織、洗滌、造紙、飼料中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。
[0008]混合中性纖維素酶是由許多具有高協(xié)同作用的水解酶組成的,含有纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等生物活性成分。纖維素酶又含有:(I)外切型葡聚糖酶(Cl酶);(2)內(nèi)切型葡聚糖酶(Cx酶);(3) β -葡萄糖苷酶(也稱纖維二糖酶,CBH酶)三種組分。
[0009]混合中性纖維素酶主要是通過(guò)對(duì)纖維素內(nèi)部進(jìn)行分解,促進(jìn)(打)磨漿過(guò)程中纖維的分絲和帚化,使打漿變得更容易,節(jié)省打漿能耗。通過(guò)對(duì)纖維表面進(jìn)行改性,對(duì)纖維末端進(jìn)行分化,促進(jìn)纖維的潤(rùn)脹,同時(shí)使纖維表面和末端的羥基和羧基增多,從而增強(qiáng)纖維之間的結(jié)合力,達(dá)到增強(qiáng)成紙性能、提高成紙品質(zhì)的效果。
[0010]通過(guò)生物酶對(duì)纖維素的改性,纖維形態(tài)起明顯有益變化,無(wú)論是磨前或者磨后,其纖維表面均有更為明顯的分絲帚化,因此漿料的叩解度更易提高,同時(shí)表面細(xì)纖化有助于提高成紙物理性能和改善留著率,紙張成形時(shí)纖維間結(jié)合力更強(qiáng)。
[0011]由于纖維得到充分的吸水潤(rùn)漲,使纖維變得柔軟增粗。從而使成紙的松厚度有所增加,柔軟性提高。同時(shí)具有使細(xì)小纖維重新組合的作用,有利于濕紙頁(yè)的濾水,減少白水中細(xì)小纖維的含量,使白水循環(huán)率有所提高,從而降低噸紙?jiān)瓭{消耗及清水用量。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0012]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有制漿造紙技術(shù)中廢棄物排放量大的缺陷,利用一種混合中性纖維素酶過(guò)對(duì)纖維素內(nèi)部進(jìn)行分解,促進(jìn)磨漿過(guò)程中纖維的分絲和帚化,使打漿變得更容易,從而節(jié)省打漿能耗,,使白水循環(huán)率有所提高,從而降低噸紙?jiān)瓭{消耗及清水用量,改善了污水的質(zhì)量。
[0013]為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0014]一種混合中性纖維素酶,用于造紙打漿酶;
[0015]所述混合中性纖維素酶,重量份數(shù)組成如下:
[0016]纖維素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果膠酶5_10份、甘露聚糖酶3_8份,中草藥粉劑2-8份。 [0017]所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當(dāng)歸20-30份;黨參10-18份;柴胡10_15份;黃芩10-15份;分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下,然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水,控制溫度80°C—95°C保持2—4h,添加混合物料2_3倍重量乙醇和丙醇的混合物,控制溫度至55°C—65°C保持3 — 4h,過(guò)濾;濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0018]所述混合混合中性纖維素酶的制備方法如下:將纖維素酶、酸性木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和中草藥粉劑按照重量份數(shù)混合而成;[0019]所述酸性木聚糖酶采用以下技術(shù)方案制備:
[0020]一種酸性木聚糖酶制備方法包括如下步驟:
[0021](I)黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化
[0022]將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,28_35°C培養(yǎng)36_48h進(jìn)行菌種活化,如此活化2-4次;
[0023]將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,34_35°C培養(yǎng)24_36h進(jìn)行菌種活化,如此活化2-3次;
[0024]所述黑曲霉斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯煮汁200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,中草藥劑粉 5-20g,蒸餾水 1000mL, pH 值 5.8,121°C 滅菌 20min ;
[0025]所述枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g,氯化鈉5g,蛋白胨10g,瓊脂15g,蒸餾水 1000mL,pH 值 6.8,121°C 滅菌 20min ;
[0026](2)黑曲霉液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
`[0027]所述黑曲霉一級(jí)種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml ;
[0028]枯草芽孢桿菌液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0029]一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L,培養(yǎng)溫度32-36°C,攪拌速度200-400rpm,通風(fēng)量(V/V) 1:1-2,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間 10-20h ;
[0030](3)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級(jí)種子罐液體種子混合
[0031]將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合;所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5-1 ;
[0032]所述混合液體種子菌體濃度為:7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml ;
[0033](4) 二級(jí)種子罐互生
[0034]將步驟(3)中均勻混合的一級(jí)種子罐液體種子以10%接種量接入總?cè)莘e為300L的二級(jí)種子罐,互生培養(yǎng)基裝量240L,二級(jí)種子罐發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-35 °C,攪拌速度200-700r/m,通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間 15_24h ;
[0035]所述互生培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g,玉米粉50_60g,豆粉15_25g,麩皮10-15g,海藻糖10-30g,酵母粉4-8g,玉米漿l_5g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀 l_2g,純凈水 1000mL, pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ;
[0036](5)菌種混合發(fā)酵
[0037]將步驟(4)中二級(jí)種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-30°C,攪拌速度 200-700r/m,通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間 10_15h;然后以 1-2 °C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5 °C,此時(shí),將步驟(4)中二級(jí)種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐,恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C,恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以
1-20C /h升溫速率緩慢升溫至30-35°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;
[0038]溶解氧控制:通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量,控制溶解氧15-30% ;
[0039]PH控制:通過(guò)補(bǔ)氨水或稀磷酸,控制發(fā)酵過(guò)程中pH值保持在5-7 ;
[0040]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時(shí),開(kāi)始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基,補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ;
[0041 ] 放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80%菌體衰老自溶,酶活力增長(zhǎng)緩慢。
[0042]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g,玉米粉50_60g,豆粉15_25g,麩皮10-15g,海藻糖30-40g,酵母粉4-8g,玉米漿l_5g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀 l_2g,純凈水 1000mL, pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ;
[0043]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%,玉米粉10-20%,豆粉15_25%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5-7,121-123°C滅菌30_40min。
[0044](6)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
[0045]有益效果:
[0046]本發(fā)明制備的混合中性纖維素酶,有效的利用了中草藥粉劑的有效成分,并利用特殊方法克服了傳統(tǒng)的酸性木聚糖酶采用單一菌種發(fā)酵的缺陷,將產(chǎn)高活力酸性木聚糖酶的菌種黑曲霉與產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性酸性木聚糖酶的菌種枯草芽孢桿菌科學(xué)結(jié)合、互生穩(wěn)定,致使混合菌種的產(chǎn)酶能力最大限度地顯現(xiàn),也使本發(fā)明所產(chǎn)酸性木聚糖酶類型全、活力高、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強(qiáng)、適于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明發(fā)酵液酸性木聚糖酶比活力為5300-6800U/mg,比單一菌種黑曲霉發(fā)酵液酸性木聚糖酶酶活力平均提高了 2_3倍,熱穩(wěn)定性強(qiáng),適用反應(yīng)溫度范圍為30-78°C ;并且經(jīng)過(guò)混合中性纖維素酶處理的磨漿,叩解度相對(duì)于未處理漿增加了 11.76%,短纖耐破指數(shù)提高了 11.98%,環(huán)壓指數(shù)提高了 13.99% ;長(zhǎng)纖拉力指數(shù)提高了 40.17%,,撕裂指數(shù)提高了 58.91%,纖維表面變得光滑,酶纖維更為柔軟;成紙的撕裂指數(shù)、抗張指數(shù)、耐破指數(shù)分別提高了 8.3%,10.6%,16.5%,減少了盤(pán)末磨漿時(shí)間,降低電耗10 — 20%,紙漿白度提高2%-5%,白水循環(huán)系統(tǒng)變得干凈,污水質(zhì)量大大改善,降低了對(duì)環(huán)境的污染程度。
【具體實(shí)施方式】
`[0047]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明,本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外,實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的,而非限制本發(fā)明的范圍,本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下,對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0048]實(shí)施例1
[0049]本發(fā)明提供的黑曲霉菌株保藏號(hào)為CICC2475,購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。所述黑曲霉斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯煮汁200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL, pH 值 5.8,121°C 滅菌 20min ;
[0050]枯草芽孢桿菌CICC10158購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。所述枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g,氯化鈉5g,蛋白胨10g,瓊脂15g,蒸餾水lOOOmL,pH值
6.8,121°C 滅菌 20min ;
[0051]所述黑曲霉一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯煮汁200g,葡萄糖20g,海藻糖 10-30g,蒸餾水 lOOOmL, pH 值 5.5,121°C 滅菌 20min ;
[0052]所述黑曲霉一級(jí)種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50_60g,豆粉15_25g,麩皮10_15g,海藻糖10-30g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀l_2g,純凈水lOOOmL,pH值5-7,121°C 滅菌 20min ;
[0053]所述枯草芽孢桿菌一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0054]酵母粉0.3-0.5%,葡萄糖1-1.5%,蛋白胨0.3-0.5%,牛肉膏0.5-0.8%,磷酸氫二鉀
0.8-1.5%,海藻糖1_3%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121_123°C滅菌30_40min。
[0055]所述枯草芽孢桿菌種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0056]麥芽糊精5-15%,酵母粉0.4-0.8%,海藻糖1_3%,蛋白胨0.1-0.5%,玉米漿
0.1-0.5%,磷酸氫二鉀0.8-1.5%,硫酸鎂0.05-0.1%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121-123? 滅菌 30-40min。
[0057]所述互生培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g,玉米粉50_60g,豆粉15_25g,麩皮10-15g,海藻糖10-30g,酵母粉4-8g,玉米漿l_5g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀 l_2g,純凈水 1000mL, pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ;
[0058]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g,玉米粉50_60g,豆粉15_25g,麩皮10-15g,海藻糖30-40g, 酵母粉4-8g,玉米漿l_5g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀 l_2g,純凈水 1000mL, pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ;
[0059]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%,玉米粉10-20%,豆粉15_25%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5-7,121-123°C滅菌30_40min。
[0060]實(shí)施例2
[0061]混合中性纖維素酶的重量份數(shù)組成如下:纖維素酶30份、木聚糖酶酶25份、果膠酶8份、甘露聚糖酶5份,中草藥粉劑5份。
[0062]中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當(dāng)歸24份;黨參14份;柴胡13份;黃芩14份;分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下,然后于容器中均勻混合并添加4倍重量的水,控制溫度90°C保持4h,添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物,控制溫度至60°C保持4h,過(guò)濾;濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0063]所述酸性木聚糖酶采用以下技術(shù)方案制備:
[0064](I)黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化
[0065]將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,30°C培養(yǎng)40h進(jìn)行菌種活化,如此活化3次;
[0066]將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,35°C培養(yǎng)30h進(jìn)行菌種活化,如此活化2次;
[0067]所述黑曲霉斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯煮汁200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL, pH 值 5.8,121°C滅菌 20min ;
[0068]所述枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g,氯化鈉5g,蛋白胨10g,瓊脂15g,蒸餾水 1000mL,pH 值 6.8,121°C 滅菌 20min ;
[0069](2)黑曲霉液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0070]①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的黑曲霉斜面菌種以無(wú)菌水洗下孢子,接入500毫升搖瓶中,液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升,30°C、80rpm搖床培養(yǎng)40h ;
[0071]②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中,培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同;
[0072]③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以8%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中,液體培養(yǎng)基裝量1000毫升,30°C、80rpm搖床培養(yǎng)40h ;
[0073]④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L,控制pH值為5,培養(yǎng)溫度28°C,攪拌速度200rpm,通風(fēng)量(V/V) 1: 0.8,培養(yǎng)時(shí)間36h,溶解氧10%;
[0074]所述黑曲霉一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g,葡萄糖20g,海藻糖 IOg,蒸懼水 lOOOmL, pH 值 5.5,121°C滅菌 20min ;
[0075]所述黑曲霉一級(jí)種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50g,豆粉15g,麩皮10g,海藻糖10g,硫酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,磷酸二氫鉀lg,純凈水10001^,?!1值5,1211:滅菌20min ;
[0076]所述黑曲霉一級(jí)種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個(gè)/ml ;
[0077](3)枯草芽孢桿菌液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0078]①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中,培養(yǎng)基裝量100毫升,旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)溫度35°C,培養(yǎng)時(shí)間IOh ;
[0079]②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中,培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同;
[0080]③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中,培養(yǎng)基裝量1000毫升,旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)溫度35°C,培養(yǎng)時(shí)間IOh ;
[0081]④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L,培養(yǎng)溫度32°C,攪拌速度200rpm,通風(fēng)量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間IOh ;
[0082]所述枯草芽孢桿菌一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0083]酵母粉0.3%,葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,牛肉膏0.5%,磷酸氫二鉀0.8%,海藻糖1%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121°C滅菌30min。
[0084]所述枯草芽孢桿菌種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0085]麥芽糊精5%,酵母粉0.4%,海藻糖1%,蛋白胨0.1%,玉米漿0.1%,磷酸氫二鉀
0.8%,硫酸鎂0.05%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121°C滅菌30min。
[0086]所述枯草芽孢桿菌種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個(gè)/ml ;
[0087](4)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級(jí)種子罐液體種子混合
[0088]將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(3)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合;
[0089]所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5 ;
[0090]所述混合液體種子菌體濃度為:7.0xlO8個(gè)/ml ;
[0091](5) 二級(jí)種子罐互生
[0092]將步驟(4)中均勻混合的一級(jí)種子罐液體種子以10%接種量接入總?cè)莘e為300L的二級(jí)種子罐,互生培養(yǎng)基裝量240L,二級(jí)種子罐發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-35 °C,攪拌速度200-700r/m,通風(fēng)量(V/V) 1:1,培養(yǎng)時(shí)間 15h ;
[0093]所述互生培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g,玉米粉50g,豆粉15g,麩皮10g,海藻糖10g,酵母粉4g,玉米漿lg,硫酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,磷酸二氫鉀lg,純凈水lOOOmL,pH值5,121°C 滅菌 20min ;
[0094](6)菌種混合發(fā)酵[0095]將步驟(5)中二級(jí)種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28°C,攪拌速度200r/m,通風(fēng)量(V/V) 1:1,培養(yǎng)時(shí)間IOh ;然后以TC /h降溫速率緩慢降溫至10°C,恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C,此時(shí),將步驟(5)中二級(jí)種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐,恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C,恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C,恒溫培養(yǎng)15h ;
[0096]溶解氧控制:通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量,控制溶解氧15% ;
[0097]PH控制:通過(guò)補(bǔ)氨水或稀磷酸,控制發(fā)酵過(guò)程中pH值保持在5 ;
[0098]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時(shí),開(kāi)始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基,補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ;
[0099]放罐標(biāo)準(zhǔn):60%菌體衰老自溶,酶活力增長(zhǎng)緩慢。
[0100]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g,玉米粉50g,豆粉15g,麩皮10g,海藻糖30g,酵母粉4g,玉米漿lg,硫酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,磷酸二氫鉀lg,純凈水1000mL,pH值5,121°C 滅菌 20min ;
[0101]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%,玉米粉10%,豆粉15%,中草藥劑粉5%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5,121°C滅菌30min。[0102](7)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
[0103]所述調(diào)配過(guò)程不添加任何防腐劑。
[0104]經(jīng)上述制備方法得到的發(fā)酵液酸性木聚糖酶酶活力為5300U/mg。
[0105]實(shí)施例3
[0106]所述混合中性纖維素酶的用法及用量:
[0107]根據(jù)紙漿原料和工藝、設(shè)備的不同選用合適產(chǎn)品,生物酶的添加方法也有所差異,可主要分為以下兩類:
[0108](I)紙廠自己制漿、直接供漿的生產(chǎn)線添加地點(diǎn):最后一道洗漿機(jī)出漿口和叩前池進(jìn)漿口之間可能的位置;洗漿后漿料獲得適宜的溫度和PH值,叩前池可使生物酶獲得足夠的停留時(shí)間。
[0109]添加方法:根據(jù)送漿方式和流量,把生物酶配制成易于準(zhǔn)確操作的溶液,然后用計(jì)量泵同步加入漿料中。
[0110](2)采用廢紙和外來(lái)漿板的生產(chǎn)線添加地點(diǎn):一般情況下碎漿機(jī)溫度和pH值均可適合生物酶使用,利于生物酶得到充分的攪拌和反應(yīng)時(shí)間。
[0111]添加方法:根據(jù)碎漿方式的不同分兩種情況:一種為連續(xù)碎漿:根據(jù)碎漿產(chǎn)量,把生物酶配制成易于準(zhǔn)確操作的溶液,然后用計(jì)量泵同步加入碎漿機(jī)中;第二種為間歇碎漿:根據(jù)每次碎漿量稱取足量的生物酶,直接投入碎漿機(jī)中。
[0112]添加量:50-200g(ml) /t 絕干漿;
[0113]所述混合中性纖維素酶原封裝在陰涼、干燥環(huán)境下,保質(zhì)期為12個(gè)月,在5°C -15°C低溫、干燥環(huán)境下,保質(zhì)期為24個(gè)月。
【權(quán)利要求】
1.一種混合中性纖維素酶,重量份數(shù)組成如下: 纖維素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果膠酶5-10份、甘露聚糖酶3_8份,中草藥粉劑2-8份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合中性纖維素酶,其特征在于,所述酸性木聚糖酶采用以下技術(shù)方案制備: (1)黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化 將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,28-35°C培養(yǎng)36-48h進(jìn)行菌種活化,如此活化2-4次; 將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,34-35°C培養(yǎng)24-36h進(jìn)行菌種活化,如此活化2-3次; (2)黑曲霉液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) 所述黑曲霉一級(jí)種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml ; 枯草芽孢桿菌液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) 一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L,培養(yǎng)溫度32-36 °C,攪拌速度200-400rpm,通風(fēng)量(V/V) 1:1-2,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間 10-20h ; (3)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級(jí)種子罐液體種子混合 將步驟(2)得到的黑曲霉種 子罐液體種子與步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合;所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5-1 ; 所述混合液體種子菌體濃度為:7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml ; (4)二級(jí)種子罐互生 將步驟(3)中均勻混合的一級(jí)種子罐液體種子以10%接種量接入總?cè)莘e為300L的二級(jí)種子罐,互生培養(yǎng)基裝量240L,二級(jí)種子罐發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-35°C,攪拌速度200_700r/m,通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間15-24h ; (5)菌種混合發(fā)酵 將步驟(4)中二級(jí)種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-30°C,攪拌速度200-700r/m,通風(fēng)量(V/V)l:l-3,培養(yǎng)時(shí)間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C,此時(shí),將步驟(4)中二級(jí)種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐,恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1-20C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-35°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ; (6)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混合中性纖維素酶,其特征在于,所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當(dāng)歸20-30份;黨參10-18份;柴胡10-15份;黃芩10-15份;分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下,然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水,控制溫度80°C—95°C保持2—4h,添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物,控制溫度至55°C—65°C保持3 — 4h,過(guò)濾;濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種混合中性纖維素酶,其特征在于,所述黑曲霉一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯煮汁200g,葡萄糖20g,海藻糖10-30g,蒸餾水1000mL,pH 值 5.5,121°C 滅菌 20min ; 所述黑曲霉一級(jí)種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50-60g,豆粉15-25g,麩皮10-15g,海藻糖10_30g,硫酸銨l_3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀l_2g,純凈水lOOOmL,pH值5-7,.121°C 滅菌 20min ; 所述枯草芽孢桿菌一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為: 酵母粉0.3-0.5%,葡萄糖1-1.5%,蛋白胨0.3-0.5%,牛肉膏0.5-0.8%,磷酸氫二鉀.0.8-1.5%,海藻糖1_3%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121_123°C滅菌30_40min ; 所述枯草芽孢桿菌種子罐培養(yǎng)基重量組成為: 麥芽糊精5-15%,酵母粉0.4-0.8%,海藻糖1-3%,蛋白胨0.1-0.5%,玉米漿0.1-0.5%,磷酸氫二鉀0.8-1.5%,硫酸鎂0.05-0.1%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121_123°C滅菌.30-40min ; 所述互生培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g,玉米粉50-60g,豆粉15-25g,麩皮10_15g,海藻糖10_30g,酵母粉4-8g,玉米漿l-5g,硫酸銨l-3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀.l_2g,純凈水 1000mL, pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ; 所述發(fā)酵培 養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g,玉米粉50-60g,豆粉15-25g,麩皮10_15g,海藻糖30-40g,酵母粉4-8g,玉米漿l-5g,硫酸銨l-3g,磷酸氫二鉀l_2g,磷酸二氫鉀.l_2g,純凈水 1000mL, pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ; 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%,玉米粉10-20%,豆粉15-25%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH 值 5-7,121-123°C滅菌 30_40min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混合中性纖維素酶,其特征在于,所述混合中性纖維素酶的重量份數(shù)組成如下:纖維素酶30份、木聚糖酶酶25份、果膠酶8份、甘露聚糖酶5份,中草藥粉劑5份; 中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當(dāng)歸24份;黨參14份;柴胡13份;黃芩14份;分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下,然后于容器中均勻混合并添加4倍重量的水,控制溫度90°C保持4h,添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物,控制溫度至60°C保持4h,過(guò)濾;濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑; 所述酸性木聚糖酶采用以下技術(shù)方案制備: (O黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化 將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,30°C培養(yǎng)40h進(jìn)行菌種活化,如此活化3次; 將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,35°C培養(yǎng)30h進(jìn)行菌種活化,如此活化2次; 所述黑曲霉斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯煮汁200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸餾水.1000mL, pH 值 5.8,121°C 滅菌 20min ; 所述枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g,氯化鈉5g,蛋白胨10g,瓊脂15g,蒸餾水 1000mL, pH 值 6.8,121°C 滅菌 20min ; (2)黑曲霉液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) ①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的黑曲霉斜面菌種以無(wú)菌水洗下孢子,接入500毫升搖瓶中,液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升,30°C、80rpm搖床培養(yǎng)40h ;②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中,培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同; ③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以8%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中,液體培養(yǎng)基裝量1000毫升,30°C、80rpm搖床培養(yǎng)40h ; ④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L,控制pH值為5,培養(yǎng)溫度28°C,攪拌速度200rpm,通風(fēng)量(V/V)l: 0.8,培養(yǎng)時(shí)間36h,溶解氧10% ; 所述黑曲霉一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g,葡萄糖20g,海藻糖 IOg,蒸餾水 1000mL, pH 值 5.5,121°C 滅菌 20min ; 所述黑曲霉一級(jí)種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50g,豆粉15g,麩皮10g,海藻糖IOgjt酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,磷酸二氫鉀lg,純凈水10001^,?!1值5,1211:滅菌20min ; 所述黑曲霉一級(jí)種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個(gè)/ml ; (3)枯草芽孢桿菌液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) ①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中,培養(yǎng)基裝量100毫升,旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)溫度35°C,培養(yǎng)時(shí)間IOh ; ②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中,培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同; ③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中,培養(yǎng)基裝量1000毫升,旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)溫度35°C,培養(yǎng)時(shí)間IOh ; ④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L,培養(yǎng)溫度32°C,攪拌速度200rpm,通風(fēng)量(V/V)l:l,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間IOh ; 所述枯草芽孢桿菌一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為: 酵母粉0.3%,葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,牛肉膏0.5%,磷酸氫二鉀0.8%,海藻糖1%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121。。滅菌30min ; 所述枯草芽孢桿菌種子罐培養(yǎng)基重量組成為: 麥芽糊精5%,酵母粉0.4%,海藻糖1%,蛋白胨0.1%,玉米漿0.1%,磷酸氫二鉀0.8%,硫酸鎂0.05%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值6.8,121°C滅菌30min ; 所述枯草芽孢桿菌種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個(gè)/ml ; (4)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級(jí)種子罐液體種子混合 將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(3)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合; 所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5 ; 所述混合液體種子菌體濃度為:7.0xlO8個(gè)/ml ; (5)二級(jí)種子罐互生 將步驟(4)中均勻混合的一級(jí)種子罐液體種子以10%接種量接入總?cè)莘e為300L的二級(jí)種子罐,互生培養(yǎng)基裝量240L,二級(jí)種子罐發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-35°C,攪拌速度200_700r/m,通風(fēng)量(V/V) 1:1,培養(yǎng)時(shí)間15h ; 所述互生培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g,玉米粉50g,豆粉15g,麩皮10g,海藻糖10g,酵母粉4g,玉米漿lg,硫酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,磷酸二氫鉀lg,純凈水1000mL,pH值5,121 °C滅菌20min ; (6)菌種混合發(fā)酵 將步驟(5)中二級(jí)種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28°C,攪拌速度200r/m,通風(fēng)量(V/V)l:l,培養(yǎng)時(shí)間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C,恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以TC /h降溫速率緩慢降溫至2°C,此時(shí),將步驟(5)中二級(jí)種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐,恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至.10°C,恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C,恒溫培養(yǎng)15h ; 溶解氧控制:通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量,控制溶解氧15% ; PH控制:通過(guò)補(bǔ)氨水或稀磷酸,控制發(fā)酵過(guò)程中pH值保持在5 ; 補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時(shí),開(kāi)始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基,補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ; 放罐標(biāo)準(zhǔn):60%菌體衰老自溶,酶活力增長(zhǎng)緩慢; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g,玉米粉50g,豆粉15g,麩皮10g,海藻糖30g,酵母粉4g,玉米漿lg,硫酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,磷酸二氫鉀lg,純凈水1000mL,pH值5,121 °C滅菌20min ; 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%,玉米粉10%,豆粉15%,中草藥劑粉5%,不足部分純凈水補(bǔ)足,pH值5,121°C滅菌30min ; (7)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶; 所述調(diào)配過(guò)程不添加任何防腐劑; 經(jīng)上述制備方法得到的發(fā)酵液酸性木聚糖酶酶活力為5300U/mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述混合中性纖維素酶的制備方法,包括如下步驟:所述混合混合中性纖維素酶的制備方法如下:將纖維素酶、酸性木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和中草藥粉劑按照重量份數(shù)混合而成; (O黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化 將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,28-35°C培養(yǎng)36-48h進(jìn)行菌種活化,如此活化2-4次; 將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基,34-35°C培養(yǎng)24-36h進(jìn)行菌種活化,如此活化2-3次; (2)黑曲霉液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) 所述黑曲霉一級(jí)種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml ; 枯草芽孢桿菌液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) 一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L,培養(yǎng)溫度32-36 °C,攪拌速度200-400rpm,通風(fēng)量(V/V) 1:1-2,罐壓.0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間 10-20h ; (3)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級(jí)種子罐液體種子混合 將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合;所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5-1 ; 所述混合液體種子菌體濃度為:7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml ;(4)二級(jí)種子罐互生 將步驟(3)中均勻混合的一級(jí)種子罐液體種子以10%接種量接入總?cè)莘e為300L的二級(jí)種子罐,互生培養(yǎng)基裝量240L,二級(jí)種子罐發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-35°C,攪拌速度200_700r/m,通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間15-24h ; (5)菌種混合發(fā)酵 將步驟(4)中二級(jí)種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐,培養(yǎng)溫度28-30°C,攪拌速度200-700r/m,通風(fēng)量(V/V)l:l-3,培養(yǎng)時(shí)間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C,此時(shí),將步驟(4)中二級(jí)種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐,恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1-20C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C,恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-35°C,恒溫培 養(yǎng)15-20h ; (6)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
【文檔編號(hào)】D21C5/00GK103642774SQ201310573648
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】趙迎春, 王剛, 謝合群 申請(qǐng)人:寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司