油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其特點是以超臨界二氧化碳為介質(zhì)，使油溶性環(huán)氧化合物與膠原進行交聯(lián)反應，交聯(lián)結束后，加入活性物質(zhì)，封閉未反應的環(huán)氧基并將活性物質(zhì)接枝到膠原上，最后以超臨界二氧化碳為萃取劑，除去雜質(zhì)。該方法可應用于醫(yī)用生物材料與皮革工業(yè)中。
【專利說明】油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳介質(zhì)中交聯(lián)膠原的方法，可應用于生物醫(yī)用材料及皮革行業(yè)。
【背景技術】
[0002]膠原是組成結締組織的主要結構蛋白，在哺乳動物中約占總蛋白質(zhì)的I/ 3，廣泛存在于動物皮膚、骨、軟骨、肌腱、韌帶和血管壁等之中，以三維網(wǎng)絡的膠原纖維形式存在。膠原具有低的免疫原性、低刺激性、低細胞毒性、良好的生物相容性、良好的促進細胞生長的性能以及生物可降解性等諸多優(yōu)點，在生物醫(yī)學領域的應用日益廣泛。然而，未經(jīng)交聯(lián)的膠原在體內(nèi)降解過快，難以與目標組織的生長相匹配。通過物理、化學方法對膠原進行交聯(lián)，有利于降低抗原性，提高物理機械性能，降低生物降解性，有效提高其使用性能(但年華，但衛(wèi)華，曾睿，等.環(huán)氧化合物及其在膠原交聯(lián)中的應用[J].材料導報，2006，20(6):119-122)。膠原的交聯(lián)交聯(lián)一直是生物材料的研究熱點之一。
[0003]膠原的交聯(lián)方法包括物理交聯(lián)和化學交聯(lián)。物理交聯(lián)不引人外源性物質(zhì)，但交聯(lián)程度低，均勻性差。化學交聯(lián)相對交聯(lián)程度高，可以通過選擇交聯(lián)劑和交聯(lián)條件(用量、pH、溫度、時間等)，控制交聯(lián)程度，且交聯(lián)均勻。當需要較高交聯(lián)程度時，常采用化學交聯(lián)法。常用的化學交聯(lián)劑有:戊二醛、己二異氰酸酯、碳化二亞胺、環(huán)氧化合物、疊氮二苯基膦、京尼平等(公維菊，李國英.膠原交聯(lián)交聯(lián)的研究現(xiàn)狀[J].皮革化工，2007，24(5):21-30.)。戊二醛交聯(lián)劑由于細胞毒性強、交聯(lián)組織易鈣化，已不能滿足應用需要。碳化二亞胺、京尼平等，價格較為昂貴，限制了其規(guī)?；瘧?。環(huán)氧化合物具有結構簡單、易于合成、價格低廉、化學反應應性高、反應基團多、可設計性強、生物相容性好等諸多優(yōu)點，被認為是一種優(yōu)良的可接受的生物交聯(lián)材料(Woodroof E A.Use of glutaraldehyde and formaldehyde toprocess tissue heart valves.J Bioengj 1978,2:1 ；Speer D Pj Chvapil M，Eskelson C D，et al.Biological effects of residual glutaraldehyde in glutaraldehyde tannedcollagen biomaterials.J Biomed Mater Res， 1980， 14:753)。
[0004]環(huán)氧化合物的化學反應活性主要依賴環(huán)氧基，單個環(huán)氧化合物中的環(huán)氧基個數(shù)越多，可獲得的交聯(lián)程度越高。然而，環(huán)氧基越多，其水溶性越差，甚至不溶解于水(如乙二醇二縮水甘油醚、丁二醇縮水甘油醚、季戊四醇縮水甘油醚等)。當以水為介質(zhì)進行交聯(lián)時，油溶性的環(huán)氧化合物難于分散于水中，形成油水分離的非均相混合物，反應效率低，交聯(lián)速度慢，難以達到預期效果。而以有機溶劑(如丙酮)為溶劑時，雖然能夠形成均相溶液，反應速度快，交聯(lián)速度提高。但由于有機溶劑難以完全清除，可能會存在溶劑殘留，對交聯(lián)材料的生物相容性產(chǎn)生不利影響。可見，尋找一種綠色溶劑，在非水非有機溶劑介質(zhì)中，采用油溶性環(huán)氧化合物交聯(lián)膠原，是解決以上問題的關鍵。
[0005]超臨界流體是指其溫度和壓力分別在臨界溫度和臨界壓力以上的一種特殊狀態(tài)的流體，其特點是具有類似氣體和液體的性質(zhì)。自1869年安德魯斯發(fā)現(xiàn)臨界點至今已有100多年的歷史，但對超臨界流體的廣泛研究只是近幾十年的事(俞琢捷，馬宏佳，周志華.超臨界流體技術的應用研究進展[J].化學世界，2007 (2):118-120，124)。超臨界CO2是一種常用的超臨界流體，具有以下優(yōu)點:①提高化學反應的反應速度；②降低高溫化學反應的反應溫度可將多相反應變?yōu)榫喾磻虎芙档痛呋瘎┑氖Щ钏俾侍岣叻磻倪x擇性；⑥反應速率、產(chǎn)率、選擇性等可通過壓力或少量共溶劑的添加來調(diào)節(jié)；⑦大大改善多相反應的傳質(zhì)速率；⑧用環(huán)境友好的溶劑取代有害溶劑；⑨將化學反應與分離過程結合為一體(張淵明.化學化工研究與應用新進展概論[M].廣州:華南.理工大學出版社，2000)。
[0006]利用超臨界CO2作為反應介質(zhì)，有望實現(xiàn)在非水非有機溶劑介質(zhì)中油溶性環(huán)氧化合物交聯(lián)膠原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其特征是稱取100重量份的膠原，浸泡于100-1000重量份的pH7.0至PH12.0的緩沖溶液中，攪拌或振搖5_30min，冷凍干燥；將上述膠原與0.5-20重量份的油溶性環(huán)氧化合物加入到超臨界二氧化碳反應器，封閉反應器，調(diào)整反應器溫度為35°C _45°C，設定反應壓強為8-15MPa，使反應器內(nèi)部攪拌或轉(zhuǎn)動，保持此條件反應12-72 h ;關閉反應器，排出反應器內(nèi)二氧化碳氣體；向反應器內(nèi)加入1-20重量份的活性物質(zhì)，調(diào)整反應器溫度為35°C _45°C，增加壓強至8_15MPa，攪拌或轉(zhuǎn)動，保持此條件反應12-72 h ;關閉反應器,排出反應器內(nèi)二氧化碳氣體；通入二氧化碳氣體，再次將反應器 溫度調(diào)節(jié)為35°C -45°C，壓強為8-15MPa，攪拌或轉(zhuǎn)動，保持此條件l-48h,回收二氧化碳氣體；關閉反應器,取出交聯(lián)膠原。
[0008]根據(jù)權利要求1所述的油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其中所述的緩沖液是指硼酸-硼砂緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、氫氧化鈉-碳酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液。
[0009]根據(jù)權利要求1所述的油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其中所述的油溶性環(huán)氧化合物是指乙二醇二縮水甘油醚、丁二醇二縮水甘油醚、丙三醇三縮水甘油醚、季戊四醇四縮水甘油醚、山梨醇四縮水甘油醚。
[0010]根據(jù)權利要求1所述的油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其中所述的活性物質(zhì)是指氨基酸、RGD肽、RPM1-1640干粉培養(yǎng)基。
[0011]權利要求1所述油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其特征在于該交聯(lián)方法可用于皮革行業(yè)中豬、牛、羊動物皮的加工或含膠原的生物醫(yī)學材料的制備中。
[0012]本發(fā)明具有以下的優(yōu)點:
(1)解決溶劑問題
超臨界二氧化碳流體具有很強的溶解能力，它能夠溶解水難溶的多環(huán)氧化合物，從而實現(xiàn)非水、非有機溶劑條件下的交聯(lián)反應。同時二氧化碳可以回收，反復使用；
(2)無溶劑殘留
二氧化碳無毒，常溫下是氣體，反應結束后，二氧化碳會自動揮發(fā)出來，從而避免了有機溶劑(如丙酮)的殘留。這一點，對膠原用作醫(yī)用生物材料來說，顯得十分重要、有益；
(3)提高反應速度超臨界二氧化碳流體具有良好的流動性和傳遞性，并且比液體具有更大的動能，能象氣體一樣進入到多孔的膠原纖維之中，這就加強了油溶性環(huán)氧化合物與膠原接觸的速度，提高了傳質(zhì)過程，增加了活性基團之間碰撞的幾率，從而可以提高反應速度，提高交聯(lián)的均一 I"生；
(4)改變化學平衡
超臨界可影響反應的化學平衡。目前有兩種解釋，一是認為在超臨界條件下反應平衡常數(shù)發(fā)生了幾個數(shù)量級的變化；二是由于突破了熱力學平衡條件的限制。通過優(yōu)化反應參數(shù)，有望使油溶性環(huán)氧化合物與膠原的反應更加完全、高效，獲得更高的交聯(lián)度；
(5)提高反應溫度
膠原在水中的變性溫 度比較低；而在無水的條件下，變性溫度會明顯升高。以超臨界二氧化碳流體為介質(zhì)，是在無水條件下進行的交聯(lián)反應，因此，反應可以在較高的溫度下進行，有利于加速分子熱運動，有利于克服反應能壘，從而提高反應速率；
(6)終止反應與殘留環(huán)氧基的功能化除去
由于空間位阻、纖維間隙過大、反應不完全等原因，交聯(lián)劑中的多個環(huán)氧基難以全部反應完全，可能會在反應結束后，存在部分環(huán)氧基殘留(如季戊四醇縮水甘油醚中，可能有三個環(huán)氧基發(fā)生的交聯(lián)，但有一個環(huán)氧基未能反應，因而殘留一個環(huán)氧基)。這些殘留化學活性基團可能會對材料的生物相容性產(chǎn)生不利影響。為了有效除去這些殘留交聯(lián)基團，在超臨界二氧化碳介質(zhì)中，加入能夠與殘留環(huán)氧基發(fā)生反應的生物活性物質(zhì)(如氨基酸、RGD、細胞培養(yǎng)基粉劑等)，封閉這些活性基團。一方面除去了這些活性基團，同時引入生物活性物質(zhì)，提高交聯(lián)材料的其它性能。在實現(xiàn)基團封閉的同時，達到了功能化的目的；
(7)除去非膠原成分
超臨界CO2因其良好的溶解性用于作為萃取介質(zhì)，利用該特性，在交聯(lián)反應完成后，通入一定量的超臨界CO2流體(不加入其它物質(zhì))，就可以達到純化膠原的目的。它不僅可以萃取除去膠原中的非膠原成分(如膠原中可能殘留的油脂、雜蛋白等)，同時，可以萃取除去未反應的交聯(lián)劑或其它產(chǎn)物；
(8)保持結構與形態(tài)
超臨界CO2作為反應介質(zhì)，交聯(lián)結束后，降低溫度和壓力，CO2成為氣體而除去。整個反應過程可以不引人水溶液或有機溶劑，膠原樣品可以基本保持原來的形貌(如外形、孔隙等)，同時保持干燥狀態(tài)，避免了二次凍干；
綜上所述，采用超臨CO2流體為介質(zhì)，不僅克服了有機溶劑可能產(chǎn)生的毒副作用，而且能夠促進傳質(zhì)過程，提高反應速度，改善化學平衡，促進交聯(lián)。采用功能化處理的方法，除去殘留的化學活性基團，并接枝活性物質(zhì)，提高生物相容性；最后，采用超臨CCV流體進行萃取，可以除去膠原中的非膠原成分以及反應殘留物。本方法將交聯(lián)、功能化和純化熔為一體，具有明顯的創(chuàng)新性。
【具體實施方式】
[0013]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，而不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。[0014]實施例1
(1)稱取脫細胞豬真皮基質(zhì)10克(干重);
(2)將其置于100mLρΗΙΟ.4氫氧化鈉-碳酸鈉緩沖溶液中，浸泡30min,冷凍干燥備
用；
(3)稱取0.8克季戊四醇四縮水甘油醚，加入超臨界二氧化碳反應器，再將經(jīng)過上述處理的脫細胞豬真皮基質(zhì)放入反應器中，封閉反應器；
(4)打開溫控開關，將反應器溫度調(diào)整為40°C；
(5)打開加壓開關,加入二氧化碳,加壓至9.5Mpa,關閉加壓開關；
(6)開啟攪拌裝置，在前述溫度和壓力下，反應48h；
(7)關閉加熱開關，打開二氧化碳回收閥，回收CO2氣體；
(8)打開反應器，加入0.2克RPM1-1640干粉培養(yǎng)基，開啟攪拌裝置，調(diào)整溫度為40°C，壓強為9.5Mpa，反應12 h ；
(9)關閉反應器，排出CO2氣體；
(10)向反應器中通入CO2氣體，開啟攪拌裝置，調(diào)節(jié)溫度為40°C，壓強為9.5MPa，萃取
8h ；
(11)關閉加熱開關，打開二氧化碳回收閥，回收CO2氣體，打開反應器，取出交聯(lián)脫細胞豬真皮基質(zhì)。
[0015]實施例2
(1)稱取膠原海綿100克，將其放入超臨界二氧化碳反應器中；
(2)稱取4克乙二醇二縮水甘油醚加入反應器中，封閉反應器；
(3)開啟攪拌裝置，將反應器溫度調(diào)整為37°C，通入二氧化碳氣體使壓強為8.0Mpa，反應 12 h ;
(4)停止攪拌，關閉溫控開關，打開回收閥，回收CO2氣體；
(5)打開反應器，稱取0.5克RGD加入到反應器中，將反應器溫度為調(diào)整37°C，通入CO2氣體，加壓至8.0Mpa,反應12 h ；
(6)開啟攪拌裝置，調(diào)節(jié)溫度為40°C，加入二氧化碳，增壓至9.5MPa，萃取8h ；
(7)關閉加熱開關，打開二氧化碳回收閥，回收CO2氣體，打開反應器，取出交聯(lián)膠原海綿。
[0016]實施例3
(1)稱取I克膠原基微納纖維，置于超臨界二氧化碳反應器中；
(2)加入0.1克丙三醇三縮水甘油醚至反應器，封閉反應器；
(3)開啟攪拌裝置，將反應器溫度調(diào)整為35°C，通入二氧化碳氣體使壓強為8.5MPa，反應 24 h ;
(4)停止攪拌，排出CO2氣體；
(5)打開反應器，加入0.3克賴氨酸，調(diào)整溫度為37°C，壓強為8.5Mpa，反應12h ；
(6)向反應器中通入CO2氣體，調(diào)節(jié)溫度為37°C，壓強為8.5MPa，保持8h后排出氣體；
(7)停止攪拌，關閉溫控儀，回收二氧化碳，打開反應器，取出交聯(lián)膠原基纖維。
[0017]實施例4
(I)稱取1000克軟化后的黃牛裸皮，置于PH10.0的氫氧化鈉-碳酸鈉緩沖液中，常溫下轉(zhuǎn)動30min ；
(2)用擠水機擠去多余水分；
(3)稱取80克季戊四醇四縮水甘油醚放于反應器，將擠水后的裸皮加入反應器中，封閉反應器；
(4)開啟轉(zhuǎn)動裝置，將反應器溫度調(diào)整為35°C，通入二氧化碳氣體使壓強為lOMPa，反應 24 h ;
(5)停止攪 拌，關閉溫控儀，回收二氧化碳，打開反應器，取出鞣制的黃牛皮。
【權利要求】
1.油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其特征是稱取100重量份的膠原，浸泡于100-1000重量份的PH7.0至PH12.0的緩沖溶液中，攪拌或振搖5_30min，冷凍干燥；將上述膠原與0.5-20重量份的油溶性環(huán)氧化合物加入到超臨界二氧化碳反應器，封閉反應器，調(diào)整反應器溫度為35°C _45°C，設定反應壓強為8-15MPa，使反應器內(nèi)部攪拌或轉(zhuǎn)動，保持此條件反應12-72 h ;關閉反應器，排出反應器內(nèi)二氧化碳氣體；向反應器內(nèi)加入1-20重量份的活性物質(zhì)，調(diào)整反應器溫度為35°C _45°C，增加壓強至8_15MPa，攪拌或轉(zhuǎn)動，保持此條件反應12-72 h ;關閉反應器,排出反應器內(nèi)二氧化碳氣體；通入二氧化碳氣體，再次將反應器溫度調(diào)節(jié)為35°C -45°C，壓強為8-15MPa，攪拌或轉(zhuǎn)動，保持此條件l-48h,回收二氧化碳氣體；關閉反應器,取出交聯(lián)膠原。
2.根據(jù)權利要求1所述的油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其中所述的緩沖液是指硼酸-硼砂緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、氫氧化鈉-碳酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權利要求1所述的油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其中所述的油溶性環(huán)氧化合物是指乙二醇二縮水甘油醚、丁二醇二縮水甘油醚、丙三醇三縮水甘油醚、季戊四醇四縮水甘油醚、山梨醇四縮水甘油醚。
4.根據(jù)權利要求1所述的油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其中所述的活性物質(zhì)是指氨基酸、RGD肽、RPM1-1640干粉培養(yǎng)基。
5.權利要求1所述油溶性環(huán)氧化合物在超臨界二氧化碳中交聯(lián)膠原的方法，其特征在于該交聯(lián)方法可用于皮革行業(yè)中豬、牛、羊動物皮的加工或含膠原的生物醫(yī)學材料的制備中。
【文檔編號】C14C3/08GK103980507SQ201410223524
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權日:2014年5月26日
【發(fā)明者】但年華, 但衛(wèi)華, 陳一寧 申請人:四川大學