專利名稱：葡聚糖內(nèi)切酶以及含有該酶的纖維素酶制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡聚糖內(nèi)切酶以及含有該酶的纖維素酶制劑，以及利用該制劑去除含纖維素纖維細(xì)毛、減量加工和斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工。
為了使含纖維素纖維具有所期望的特性，要用纖維素酶對這樣的纖維進(jìn)行處理。例如，在紡織界中為了改善含纖維素纖維與皮膚的觸感和其外觀，以及為了賦予染色斜紋粗棉布中含纖維素纖維具有磨石水洗(スト-ンウオッシュ)的外觀，就利用纖維素酶對這樣的纖維進(jìn)行處理。
另外，近年來，作為來自木材紙漿的纖維素用有機(jī)溶劑溶解、紡線而制成的再生纖維素系纖維的Tencel由于它的高的強(qiáng)度、吸水度等性質(zhì)，同時其制造方法又不容易引起環(huán)境污染，所以一直受到人們的注目。然而由于Tencel在制造過程中產(chǎn)生細(xì)毛，所以直接作為纖維的商品價值低。因此，利用纖維素酶除去制造過程中產(chǎn)生的細(xì)毛的方法的提案不斷提出。
現(xiàn)在，處理含纖維素纖維使用的纖維素酶主要來自木材不朽菌木霉菌Trichoderma或霉質(zhì)菌Humicola。然而，為了使纖維達(dá)到所期望的效果，目前的狀況是必須使用很多的這類纖維素酶。
如果能夠通過使用比以前用量少的高活性的纖維素酶改善含纖維素纖維的觸感和外觀，賦予染色斜紋粗棉布中含纖維素纖維具有磨石水洗的外觀，并除去Tencel的細(xì)毛的話，就能夠進(jìn)一步降低這些處理中的成本。
來自Humicola菌的纖維素酶在WO91/17243號公報(特表平5-509223號公報)中已有報道，43kD的葡聚糖內(nèi)切酶基因已從Humicolainsolens DSM1800菌株中分離出來，并確定了其堿基序列。
本發(fā)明人從Humicola insolens菌中分離出了對各種含有纖維素的纖維的處理非常有用的新的高活性的纖維素酶及其基因。本發(fā)明是基于上述認(rèn)識的產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明的目的在于提供新的高活性的纖維素酶及其基因。
另外，提供利用新的纖維素酶除去含纖維素纖維細(xì)毛的方法，減量加工方法以及斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工方法也是本發(fā)明的目的。
而本發(fā)明的新的纖維素酶是序列1記載的氨基酸序列的一部分或含有1～284號序列的蛋白質(zhì)和其變化的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的含纖維素纖維細(xì)毛的除去方法，減量加工方法以及斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工方法中包括使上述蛋白質(zhì)或其變化蛋白質(zhì)與染色的斜紋粗棉布中含纖維素纖維接觸的工序。
微生物的保藏用含有本發(fā)明的的纖維素酶基因質(zhì)粒pNCE4Sal(參見實(shí)施例A5)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所(日本國茨城縣筑波市東1-1-3)，保藏號為FERM BP-5976(原保藏號FERM P-15732，原保藏日1996年7月12日)。
纖維素酶及其基因本發(fā)明的纖維素酶是具有序列1記載的氨基酸序列的一部分或含有1～284號序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中所謂序列1記載的氨基酸序列的一部分是指可用作探針程度的序列長度，而且即使是其中的一部分序列也仍然具有纖維素酶的活性，尤其是指維持葡聚糖內(nèi)切酶活性的那部分序列。
本發(fā)明中，也包含在上述蛋白質(zhì)的N末端還含有序列1的-22～-1的氨基酸序列的一部分或全部的蛋白質(zhì)。由于序列1的-22～-1的氨基酸序列被認(rèn)為是信號肽，所以所謂的其中一部分序列也意味著是加在保持信號肽活性的那部分序列上的，留在N末端的序列，其結(jié)果是因表達(dá)宿主的種類不同而在加工的位置上產(chǎn)生了差別。
另外，本發(fā)明包括上述蛋白質(zhì)的變化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中所謂的變化蛋白質(zhì)是指在上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，附加、插入、剔除、缺失或置換一～數(shù)個氨基酸后而產(chǎn)生了變化的蛋白質(zhì)，但仍然保持纖維素酶活性，尤其是保持葡聚糖內(nèi)切酶活性的蛋白質(zhì)。
以下序列表1記載的氨基酸序列中1～284的序列稱之纖維素酶NCE4，而該酶基因有時稱之纖維素酶NCE4基因。
本發(fā)明的纖維素酶活性高，只需少量就可以在各種用途中獲得所期望的效果。例如，如果按照本發(fā)明的優(yōu)選狀態(tài)，將NCE4與從Humicola insolens菌的培養(yǎng)液制備的未純化的纖維素酶比較，前者的用量大約為后者的百分之一就可看到同等纖維素系纖維的細(xì)毛去除效果，若是二十五分之一的用量就可看到同等的染色斜紋粗棉布中含有的含纖維素纖維的脫色效果，若是五分之一用量就可看到同等纖維素系纖維的減量效果。因此，本發(fā)明纖維素酶可以在要效率更高而且經(jīng)濟(jì)的纖維素系纖維的處理中使用。
按照本發(fā)明的其它實(shí)施方案，可以提供編碼上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的DNA序列。該DNA序列的典型序列應(yīng)當(dāng)是含有序列2記載的堿基序列的一部分或全部序列。
序列2記載的堿基序列含有開始于118～120的ATG，終止于1089～1091的TAA的開放讀框。而171～173的堿基序列對應(yīng)于由284個殘基組成的上述成熟蛋白質(zhì)。另外在序列2的堿基序列中確認(rèn)存在著內(nèi)含子(參照實(shí)施例A7)。
如果給出蛋白質(zhì)的氨基酸序列，很容易確定編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，可以選擇編碼序列1記載的氨基酸序列的全部或部分序列的各種堿基序列。因此，所謂編碼本發(fā)明序列1記載的氨基酸序列的一部分或全部序列的DNA序列，除序列2記載的一部分或全部的堿基序列上的序列外，也是指編碼同一氨基酸序列的但以存在簡并關(guān)系的密碼為堿基序列的序列。
本發(fā)明的DNA既可以是來自天然的DNA，也可以全是合成的。而即使是利用一部分來自天然的序列進(jìn)行合成的也可以。作為獲得DNA的典型方法有來自Humicola insolens菌的染色體文庫或cDNA文庫的在基因工程領(lǐng)域中慣用的方法，有利用例如以部分氨基酸序列信息為基礎(chǔ)作成適當(dāng)DNA探針進(jìn)行篩選的方法等。另外，從上述保藏的菌株獲得DNA也是可能的。
表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化微生物另外，根據(jù)本發(fā)明，使上述的本發(fā)明的DNA序列在宿主微生物中復(fù)制是可能的，而且可以提供含有能夠表達(dá)該DNA編碼的蛋白質(zhì)的載體。同時，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供通過該載體轉(zhuǎn)化的微生物。該宿主-載體系統(tǒng)并沒有特別限定，例如可以使用大腸桿菌、放線菌、酵母、霉菌等系統(tǒng)，以及使用與其它蛋白質(zhì)融合的融合蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明的載體的構(gòu)建過程和方法可以使用基因工程領(lǐng)域中常用的方法。
為了使本發(fā)明的載體實(shí)際上導(dǎo)入宿主微生物中，表達(dá)出所期望的蛋白質(zhì)，該載體除了含有上述的本發(fā)明的DNA以外，最好還含有控制目的DNA表達(dá)的DNA序列以及選擇微生物的標(biāo)記基因等。由于序列2的堿基序列已含有這些控制序列，所以直接利用該堿基序列有時隨場合不同也是有利的。該表達(dá)載體即使含有重復(fù)的編碼纖維素酶的DNA序列(串聯(lián)的)也可以。含有這些DNA序列的表達(dá)載體可以按照常規(guī)方法構(gòu)建。而通過該表達(dá)載體對微生物的轉(zhuǎn)化也可以按照該領(lǐng)域中常用的方法實(shí)施。
用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，從該培養(yǎng)物中可以分離到上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明還提供上述本發(fā)明的新蛋白質(zhì)的制造方法。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和培養(yǎng)條件只要是與使用的微生物所采用的在本質(zhì)上一樣的條件就可以。而從培養(yǎng)液中回收、純化本發(fā)明的新蛋白質(zhì)也可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。
纖維素酶的用途/纖維素酶制劑本發(fā)明的上述纖維素酶可以直接或作成纖維素酶制劑用于各種用途。尤其是為了賦予纖維素系纖維所期望的特性而使用纖維素酶。具體講，纖維素酶被用于含纖維素纖維細(xì)毛的去除、減量加工、以及染色的斜紋粗棉布中含纖維素纖維的脫色加工。
纖維素酶制劑是將本發(fā)明的纖維素酶與通常纖維素酶制劑含有的成分，例如和賦形劑(如乳糖、氯化鈉、山梨糖)、表面活性劑、防腐劑等混合在一起制備的。
利用本發(fā)明的纖維素酶或纖維素酶制劑去除含纖維素纖維細(xì)毛、減量加工以及斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工可以通過使纖維素酶與含纖維素纖維接觸來實(shí)施。
接觸溫度、纖維素酶的用量等條件可以在考慮了其它各種條件之后適當(dāng)?shù)卮_定，例如在去除含纖維素纖維細(xì)毛時，可以于50～60℃溫度下通過使用蛋白質(zhì)濃度為5～50mg/l的纖維素酶進(jìn)行處理。而在進(jìn)行減量加工時，可以于50～60℃溫度下通過使用蛋白質(zhì)濃度為100～300mg/l的纖維素酶進(jìn)行處理。如果進(jìn)行斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工時，可以于50～60℃溫度下通過使用蛋白質(zhì)濃度為2～10mg/l的纖維素酶進(jìn)行處理。
以下通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些例子。
實(shí)施例A1從Humicola insolens分離純化具有使Tencel細(xì)毛除去的活性成分將Humicola insolens MN 200-1于37℃下在(N)培養(yǎng)基(5.0％微晶纖維素(Avicel)、2.0％酵母提取物、0.1％蛋白胨、0.03％氯化鈣、0.03％硫酸鎂、pH6.8)中培養(yǎng)。培養(yǎng)七天后，將得到的培養(yǎng)液用7000rpm離心20分鐘，除去菌體，培養(yǎng)液的上清液就作為粗纖維素酶液。
將粗纖維素酶液進(jìn)行疏水層析(Phenyl-Sepharose High Performance 16/100，Phamacia Biotech公司制)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗脫，分級。其中，由于在濃度梯度為1-0 M硫酸銨洗脫時得到的級分表現(xiàn)出很強(qiáng)的去除Tencel細(xì)毛的活性，所以再將收集的該級分進(jìn)行疏水層析(Phenyl-Sepharose High Performance 16/100)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗脫，收集活性成分。
將收集的活性級分進(jìn)行反相層析(Source15 ISO,Phamacia Biotech公司制)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗脫，分級。其中，由于在0M硫酸銨的50mM磷酸緩沖液洗脫時得到的級分表現(xiàn)出很強(qiáng)的去除Tencel細(xì)毛的活性，所以將該級分進(jìn)行反相層析(Source15 PHE，Phamacia Biotech公司制)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗脫，將分離出的表現(xiàn)出很強(qiáng)的去除Tencel細(xì)毛的活性的級分作為純化酶NCE4。該NCE4在SDS-PAGE中顯示出分子量為43kDa的單一條帶。
實(shí)施例A2纖維素酶NCE4的部分氨基酸序列(1)N末端氨基酸殘基的確定為了確定實(shí)施例1中純化的蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列，使用FPLC系統(tǒng)(Phamacia Biotech公司制)進(jìn)行柱層析(柱子RESOURCE(商品名)RPC3ml、含有0.1％的TFA的5％～60％乙腈梯度)，分別收集主要的峰。
將收集的成分冷凍干燥后，溶解于少量的水中，使用小型電泳裝置(TEFCO公司制造)，進(jìn)行膠濃度為8％的SDS-PAGE電泳。電泳后，利用MultiphorII電泳裝置(Phamacia Biotech公司制)將膠中的蛋白質(zhì)經(jīng)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore公司)上，然后用考馬斯亮藍(lán)R-250(Nakalai-texque公司)染色后，再脫色，經(jīng)水洗干凈，最后風(fēng)干。從PVDF膜上將分子量為43kDa的蛋白質(zhì)斑剪下來供蛋白質(zhì)序列儀Model492(Perkin Elmer公司)進(jìn)行序列分析。確定了N末端一側(cè)15個氨基酸殘基序列。得到的氨基酸序列如下所示。N末端氨基酸序列Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser(15個殘基)(2)肽譜峰將通過上述(1)中FPLC純化的蛋白質(zhì)冷凍干燥后，溶解于100mM的碳酸氫銨緩沖液中(pH8.0)。然后添加大約相對于蛋白質(zhì)摩爾量的1/20的胰蛋白酶(Promega公司制造)，于37℃反應(yīng)48小時。用Model172μ制備量HPLC系統(tǒng)(Perkin Elmer公司)進(jìn)行柱層析(柱子C8220×2.1mm,0.1％TFA、0％乙腈～-0.085％TFA、35％乙腈梯度)，分別獲得3種肽。然后通過上述的蛋白質(zhì)序列儀確定得到的肽段的氨基酸序列。其結(jié)果如下所示。TP-1:Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser(6個殘基)TP-2:Phe-Pro-Asp-Ala-Leu-Lys(6個殘基)TP-3:Phe-Asp-Trp-Phe-Lys-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Phe-Ser-Phe-Arg* * * * * * *(15個殘基)這些N末端氨基酸序列和通過肽段峰得到的氨基酸序列由于與WO91/17243號公報記載的由Humicola insolens DSM1800得到的43kDa葡聚糖內(nèi)切酶的氨基酸序列具有同源性，所以明顯地暗示出該蛋白質(zhì)是纖維素酶的一種。
另外，將上述序列與Protein Identification Resource(PIR) R44.0,March,1995，或者SWISS-PROT R31.0,March 1995登錄的序列比較，雖然具有表現(xiàn)出同源性的序列，但并不是同一種蛋白質(zhì)，而是一種新的蛋白質(zhì)已經(jīng)很清楚了。
實(shí)施例A3基因組DNA文庫的制作基因組DNA的分離按照Horiuchi等人的方法(Horiyuki Horiuchi等，《細(xì)菌學(xué)雜志》J.Bacteriol.,170:272-278,1988)進(jìn)行。
首先將Humicola insolens MN 200-1于37℃下，在上述(N)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，通過離心分離(3500rpm、10分鐘)收集菌體。將得到的菌體進(jìn)行苯酚處理、蛋白酶K和核糖核酸酶A處理、再通過聚乙二醇(PEG)沉淀，得到基因組DNA。
接下來，用Sau3AⅠ消化Humicola insolens基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)在9～23kbp的范圍有部分分解帶，然后利用乙醇沉淀回收該電泳帶。使用T4連接酶(東洋紡織社制造)將該DNA片段連接在噬菌體載體、EMBL3克隆試劑盒(Stratagene公司制造)中的BamHⅠ臂上。用乙醇沉淀后，溶解于TE(10mM Tris鹽酸(pH8.0)、1mMEDTA)緩沖液中。
使用就象Hohn,B.方法(Hohn,B.《酶學(xué)方法》Methods Enzymol.,68:299-309,1979)記載的那樣冷凍干燥的包裝成分和Giga-PackⅡ包裝試劑盒(Stratagene公司制造)，將上述連接后的混合物都包裝在λ噬菌體頭部，然后用得到的噬菌體感染大腸桿菌LE392菌株。使用通過這種方法得到的5×104個噬菌體文庫進(jìn)行目的基因的克隆。
實(shí)施例A4利用PCR方法制作長鏈探針作為DNA探針是通過以Humicola insolens全長DNA作模板利用PCR方法制作的擴(kuò)增的長鏈探針。
各個引物是對應(yīng)于N末端和多肽TP-3中用*表示的氨基酸合成的DNA。制作的合成寡核糖核酸序列如下所示。
NCE4N1:5′-GCXGA(CT)GGXAA(AG)TC(AGCT)AC-3′(17mer)NCE4N2:5′GCXGA(CT)GGXAA(AG)AG(CT)AC-3′(17mer)NCE4C:5′-CXGC(AG)TT(CT)TT(AG)AACCA(AG)TC-3′(19mer)(X次黃嘌呤核苷)PCR反應(yīng)的條件如下。首先對于1μg Humicola insolens基因組DNA，一組的試管中加入引物NCE4N1、NCE4C各1μM，另一組試管中加入NCE4N2、NCE4C各1μM，在dNTP存在下，于95℃進(jìn)行5分鐘熱變性，然后加入Taq聚合酶(重組Taq，寶酒造公司制造)，通過25輪反復(fù)反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，每次的反應(yīng)條件都是94℃1分鐘，45℃2分鐘，72℃3分鐘。擴(kuò)增的結(jié)果是，只使用引物NCE4N1、NCE4C時，擴(kuò)增得到大約750bp的DNA。這些DNA用作以下的篩選探針。
實(shí)施例A5纖維素酶成分NCE4基因的克隆(1)利用噬斑原位雜交進(jìn)行篩選首先利用ECL Director DNA/RNA標(biāo)記檢測系統(tǒng)(Amersham公司制造)對通過PCR擴(kuò)增的大約750bp的DNA片段100ng預(yù)先進(jìn)行標(biāo)記。
將按照實(shí)施例2記載的方法制作的噬菌體噬斑轉(zhuǎn)移到High-Bond N+尼龍轉(zhuǎn)移膜(Amersham公司制造)上，用0.4N的氫氧化鈉變性后，用5倍濃度的SSC(15mM檸檬酸三鈉鹽，150mM氯化鈉)洗凈，干燥，使DNA固定。按照試劑盒的方法，進(jìn)行1小時的預(yù)雜交(42℃)后，加入先前標(biāo)記的探針，進(jìn)行4小時(42℃)的雜交。按照上述試劑盒的方法洗凈標(biāo)記物。首先用加有0.4％SDS、6M尿素的0.5倍濃度的SSC于42℃反復(fù)洗2次，每次20分鐘，然后再用2倍濃度的SSC于室溫反復(fù)洗2次，每次5分鐘。
洗過探針的尼龍膜浸入到檢測液中1分鐘，然后使Hyper-Film-ECL(Amersham公司制造)感光，得到4個陽性克隆。(2)噬菌體DNA的制備使噬菌體感染E.coli LE392,8小時后收集噬菌體顆粒，按照Grossberger的方法(Grossberger，《核酸研究》D.,Nucleic Acids.Res.15 6737,1987)用蛋白激酶K和苯酚處理后，通過乙醇沉淀，分離出噬菌體DNA。
(3)目的基因的亞克隆4種噬菌體DNA用SalⅠ切，然后走瓊脂糖電泳。
按照Southern的方法(Southern,E.M.，《分子生物學(xué)雜志》J.Mol.Biol.98:503-517,1975)將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，在與上述(1)的噬斑雜交相同的條件下，用大約750bp的探針進(jìn)行雜交，檢測出含有5.2kbp的目的基因的DNA片段。其結(jié)果4種噬菌體DNA都有同樣大小的SalⅠ片段。
用Sephaglass Band Prep試劑盒(Phamacia Biotech公司制造)分離5.2kbp DNA片段，使用E.coli JM109在質(zhì)粒pUC119的SalⅠ部位進(jìn)行亞克隆。得到的質(zhì)粒定為pNCE4Sal。
實(shí)施例A6堿基序列的確定(1)基因組DNA堿基序列的解析堿基序列的確定按以下方式實(shí)施。
堿基序列解析設(shè)備使用的是A.L.F.DNA序列儀Ⅱ(Phamacia Biotech公司制造)。作為測序膠使用的是ReadyMix膠(Phamacia Biotech公司制造)，或者使用可能作為Hydrolink Long Ranger(FMC公司制造)得到的丙烯酰胺載體。作膠用的各種試劑(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、尿素、過硫銨)可以使用A.L.F級試劑(Phamacia Biotech公司制造)。解讀堿基序列反應(yīng)使用的是自動解讀測序試劑盒Autoread Sequencing Kit(Phamacia Biotech公司制造)。凝膠制作條件、反應(yīng)條件和電泳條件等參照各個說明書設(shè)定。
將作為模板DNA的pNCE4Sal用10μg的2M氫氧化鈉進(jìn)行堿變性后，與自動解讀測序試劑盒附帶的Universal引物退火，進(jìn)行延長反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用測序儀解讀，判斷有546bp堿基序列。從這一結(jié)果可以制作MNEG01的FITC標(biāo)記的測序引物，與pNCE4Sal反應(yīng)，可進(jìn)一步進(jìn)行解讀。由得到的結(jié)果又可制作下一個引物，繼續(xù)解讀。其結(jié)果就可解讀出整個的NCE4。制作的FITC標(biāo)記測序引物如下所示。
MNEG-01:5′-GTGATGAGGGCTGGCGACAGGCC-3′(23mer)MNEG-02:5′-CTGCCACCTCTATTGCCGGCAGC-3′(23mer)MNEG-03:5′-CCCGACGCCCTCAAGCCCGGCTG-3′(23mer)MNEG-04:5′-GGCTGGAGCGGCTGCACCACCTG-3′(23mer)(2)堿基序列的確定以上述(1)的結(jié)果為基礎(chǔ)，合成MNEG-05～MNEG-08的FITC標(biāo)記測序引物，制作的FITC標(biāo)記測序引物如下所示。
MNEG-05:5′-GACCTGACGGAAGCTGAAGCTCG-3′(23mer)MNEG-06:5′-AGCAGTGCAGCCGCTGGGAGTCG-3′(23mer)MNEG-07:5′-TGGCAGATGAGGACGTGGTGTTG-3′(23mer)MNEG-08:5′-CGCAGCCGGACTTGGCGTCGAAG-3′(23mer)使這些引物與pNCE4Sal通過自動解讀測序試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。首先，對10μg的質(zhì)粒進(jìn)行堿變性，然后與各個引物進(jìn)行退火，用T7聚合酶使其反應(yīng)。其結(jié)果可以確定SalⅠ片段內(nèi)的1257bp堿基序列。該序列如序列3所示。
實(shí)施例A7內(nèi)含子的確定為了確定內(nèi)含子，首先從Humicola insolens MN200-1制備mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，將它與基因組的堿基序列比較，判斷它們的相同區(qū)域。
(1)總RNA的制備將Humicola insolensMN200-1于纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，優(yōu)選于上述(N)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，通過離心分離(3500rpm、10分鐘)，收集菌體。取出其中的2g菌體用滅菌水洗凈，于液氮冷凍狀態(tài)下用攪拌機(jī)(日本精機(jī)公司制造的勻漿機(jī)AM-3)粉碎。然后懸浮于含有4M胍基硫氰酸鹽的變性溶液10ml中(4M胍基硫氰酸鹽、25mM檸檬酸三鈉鹽、0.5％N-十二烷基肌氨酸鈉、0.1M巰基乙醇)。于室溫攪拌數(shù)分鐘后，用1ml的2M醋酸鈉(pH4.5)中和，加入10ml的TE飽和的苯酚，繼續(xù)攪拌。然后加入2ml的氯仿-異戊醇(24∶1)，充分?jǐn)嚢韬?，通過離心分離(3500rpm、10分鐘)，除去苯酚變性了的菌體成分。吸取上層液(水相)，用10ml的異丙醇將核酸沉淀。通過離心分離(3500rpm、10分鐘)從該沉淀中回收核酸，用70％乙醇通過再離心分離洗沉淀。
將該沉淀溶解于3.5ml的TE后，向溶液中加入880μl的10M氯化鋰溶液，于5℃冷藏2小時后，經(jīng)離心分離(12000rpm、10分鐘)，回收沉淀。用70％乙醇洗該沉淀，得到沉淀即為總RNA級分?；厥誖NA的量為2.7mg，收率是0.14％。
(2)PolyA尾巴+RNA(=mRNA)的制備mRNA的制備是利用mRNA純化試劑盒(Phamacia Biotech公司制造)進(jìn)行的。
首先，從(1)中制備的總RNA中取出1mg溶解于1ml的洗脫緩沖液中，于65℃進(jìn)行10分鐘的熱變性處理。然后于冰中驟冷后，加入0.2ml的樣品緩沖液。將該總RNA溶液加到寡聚物(dT)纖維素柱上，用高鹽緩沖液洗柱3次，再用低鹽緩沖液洗柱3次，然后用于65℃加溫的洗脫緩沖液洗脫。上述對柱子的操作反復(fù)進(jìn)行2次。得到mRNA級分。得到的mRNA量為19.2μg，收率為2％。
(3)cDNA的合成使用Timesaver cDNA合成試劑盒(Phamacia Biotech公司制造)進(jìn)行cDNA合成。
首先將5μg的mRNA溶解于20μl的樣品緩沖液。于65℃進(jìn)行10分鐘的熱變性處理后，與二硫蘇糖醇溶液以及寡聚物(dT)引物一起加到第一條鏈合成混合物中，于37℃反應(yīng)1小時。然后再都加到第二條鏈合成混合物中，于12℃反應(yīng)30分鐘，再于22℃反應(yīng)1小時，得到cDNA。
(4)通過PCR方法擴(kuò)增纖維素酶NCE4cDNA從合成的cDNA取出1μg作為模板，通過PCR方法只擴(kuò)增目的cDNA。制作的N末端和C末端引物的寡核苷酸序列如下所示。
NCE4-CN:5′-ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3′(30mer)NCE4-CC:5′-TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3′(30mer)PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行。首先對于1μg Humicola insolens的cDNA，各加入1μM引物，在dNTP存在下，于94℃進(jìn)行10分鐘熱變性，然后加入Taq聚合酶(重組Taq，寶酒造公司制造)，通過30輪反復(fù)反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，每次的反應(yīng)條件都是94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘。擴(kuò)增的片段經(jīng)瓊脂糖電泳確定為0.9bp大小的片段。通過乙醇沉淀濃縮該片段，利用pT7 blue-T vector試劑盒(Novagen公司制造)進(jìn)行克隆。該質(zhì)粒定為pCNCE4。
(5)cDNA堿基序列的解析使用與上述一樣的自動解讀測序試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)。
質(zhì)粒pCNCE4用2M的氫氧化鈉進(jìn)行堿變性后，用乙醇進(jìn)行沉淀。該一條鏈質(zhì)粒作為模板，用T7聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)。利用前面合成的引物MNEG-01、MNEG-02、MNEG-03、MNEG-04、MNEG-05、MNEG-06、MNEG-07、MNEG-08以及試劑盒附帶的Universal引物、Reverse引物進(jìn)行反應(yīng)，解讀序列。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在著一個56bp的內(nèi)含子。在序列3的序列中，非翻譯開始序列以及終止序列、內(nèi)含子內(nèi)部的調(diào)控序列如下所示(數(shù)字為序列3中的序列位置號)。
內(nèi)含子453～458、506～508、491～497
實(shí)施例A8:NCE4去除含纖維素纖維細(xì)毛活性的評價使用大型洗衣機(jī)，加有表面活性劑和橡皮球，使預(yù)先染色的Tencel(Courtauls公司制造)布料生出細(xì)毛。將通過處理生出細(xì)毛的Tencel按照下面的條件用纖維素酶處理除去細(xì)毛，計算為了使細(xì)毛完全除去所需要的纖維素酶的蛋白質(zhì)濃度。
試驗(yàn)機(jī)械20kg洗衣機(jī)(SANYO公司制造全自動洗衣機(jī)SCW5101)浴比1∶20加熱55℃時間60分鐘pH:7(10mM磷酸緩沖液)橡皮球與纖維素酶液一起加入到處理液中，總重量大約是布的2倍。
表1除去Tencel細(xì)毛所需要的蛋白質(zhì)量*NCE4 5mg/L粗制纖維素酶液500mg/L*蛋白質(zhì)量是使用蛋白質(zhì)分析試劑盒(Biorad公司)、以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)來定量的。
結(jié)果表明，NCE4的用量為粗制纖維素酶液的百分之一就可以使同等程度的Tencel細(xì)毛除去。
實(shí)施例A9NCE4對斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色活性的評價對已下水脫漿的12-Ounce的藍(lán)色牛仔褲按照下面的條件進(jìn)行脫色處理。
試驗(yàn)機(jī)械20kg洗衣機(jī)(SANYO公司制造全自動洗衣機(jī)SCW5101)
浴比1∶50加熱55℃時間60分鐘pH:7(10mM磷酸緩沖液)橡皮球與纖維素酶液一起加入到處理液中，總重量大約是布的2倍。
脫色度用色差系COLOR ANSLYZER TOPSCAN MODELTC-1800MK2(東京電色株式會社制造)測定，Lab表示系列的L值(明度)。通過L值相對于對照的增加值(白色度的增加)=ΔL來評價脫色，就評價脫色的各個試驗(yàn)區(qū)測定了5個點(diǎn)的ΔL值(n=5)，去掉最大值和最小值，采用剩下的3點(diǎn)的平均值。可以算出為了使脫色達(dá)到ΔL值=7所需要的纖維素酶的蛋白質(zhì)濃度。
表2藍(lán)色牛仔褲脫色所需要的蛋白質(zhì)量NCE4 1.8mg/L粗制纖維素酶液 45.0mg/L試驗(yàn)結(jié)果表明NCE4的用量為粗制纖維素酶液的二十五分之一就可以使同等程度的藍(lán)色牛仔褲脫色。
實(shí)施例A10NCE4對含纖維素纖維的減量活性的評價按照下面條件對作為預(yù)先測定了絕對干重的再生纖維素系纖維的庫普拉(銅銨短纖維，旭化成工業(yè)株式會社制長15cm×寬10cm)進(jìn)行酶處理。
試驗(yàn)機(jī)械洗滌牢固度試驗(yàn)機(jī)型號L-12(株式會社大榮科學(xué)精密儀器制作所制造)浴比1∶50加熱55℃
時間60分鐘pH:7(40mM磷酸緩沖液)不銹鋼球與纖維素酶液一起加入到處理液中。酶處理后，使其干燥，測定庫普利的絕對干重，測定相對于酶處理前的重量減少率。計算出為了達(dá)到8％的重量減少率所需要的纖維素酶的蛋白質(zhì)濃度。
表3為使庫普拉重量減少8％所需要的蛋白質(zhì)量NCE4 100mg/L粗制纖維素酶液 500mg/L試驗(yàn)結(jié)果表明NCE4的用量為粗制纖維素酶液的五分之一就可以實(shí)現(xiàn)同等程度的減量加工。
實(shí)施例B1質(zhì)粒pMKD01的制備(1)質(zhì)粒pUC118BN的制備用BamHⅠ切1μg pUC118 DNA，利用苯酚使限制性內(nèi)切酶失活。然后進(jìn)行乙醇沉淀，將沉淀溶解于少量的TE(10mM Tris鹽酸(pH8.0)、1mM EDTA)緩沖液中。使用DNA Branching kit(寶酒造社制)使上述DNA的末端補(bǔ)平。再利用DNA連接試劑盒使平滑化的DNA連接，使其自身環(huán)化。用得到的連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109(寶酒造社制)。轉(zhuǎn)化菌可以在含有100μg/ml的氨芐青霉素、1mM IPTG、0.004％X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％瓊脂)上繁殖，選擇白色的菌斑在含有100μg/ml的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)上于37℃培養(yǎng)過夜。從得到的培養(yǎng)基中通過堿-SDS方法回收質(zhì)粒DNA。將該質(zhì)粒DNA用BamHⅠ切，走0.8％瓊脂糖凝膠電泳，選擇pUC118DNA被BamHⅠ切斷的質(zhì)粒DNA。該質(zhì)粒DNA被定為pUC118BN。
(2)質(zhì)粒pUC118BSN的制備用SphⅠ切1μg pUC118BN DNA，利用與上述同樣的方法獲得pUC118BN DNA的SphⅠ部位被破壞的質(zhì)粒DNA。該質(zhì)粒DNA被定為pUC118BSN。
(3)質(zhì)粒pM21的制備(A)纖維素酶NCE2基因的分離將按照特開平8-126492號公報記載的方法從Humicola insolens得到的含有作為纖維素酶NCE2基因、以及含有作為該基因啟動子和終止區(qū)的上游1.4kb、下游0.5kb的DNA序列的全長3.4kb的PstⅠ-Xba的酶切片段連接到先前的pUC118BSN PstⅠ～XbaⅠ位點(diǎn)上，得到的質(zhì)粒DNA被定為pUC118BSN-PX。
(B)pUC118BSN-PX的指定部位的變異處理在緊靠NCE2基因的N末端的下游以及終止密碼的下游象以下那樣通過指定部位變異導(dǎo)入BamHⅠ位點(diǎn)。通過質(zhì)粒pUC118BSN-PX轉(zhuǎn)化E.coli JM109菌株，使輔助噬菌體M13K07感染后，在含有氨芐青霉素和卡那霉素各150μg/ml、70μg/ml的30ml的2×YT液體培養(yǎng)基(1.6％細(xì)菌胰蛋白酶、0.8％酵母提取物、0.5％NaCl)上于37℃培養(yǎng)16-20小時。從培養(yǎng)上清中回收M13的單鏈DNA(ssDNA)。利用該ssDNA和兩種合成的寡核苷酸，使用雕紋體外誘變系統(tǒng)(Sculpture In Vitro Mutagenesis System(Amersham公司制造))進(jìn)行特定部位的變異處理。制備的合成寡核苷酸引物如下所示。
MNC-02 5′-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3′(36mer)MNC-03 5′-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3′(35mer)將經(jīng)指定部位變異處理的DNA混合液導(dǎo)入E.coli TGl，得到的轉(zhuǎn)化菌株在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)中培養(yǎng)，回收質(zhì)粒DNA。該質(zhì)粒DNA用BamHⅠ切，走0.8％瓊脂糖凝膠電泳，選擇在pUC118BSN-PX中導(dǎo)入兩個BamHⅠ位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA被定為pM21。
(4)纖維素酶NCE3基因的分離以來自眾所周知的灰腐質(zhì)霉Humicola grisea纖維二糖水解酶基因(de Oliviera Alzevedo,M.等，《普通分子生物學(xué)雜志》J.GeneralMcrobiol.,136:2569-2576,1990)的序列為基礎(chǔ)利用PCR方法分離來自Humicola insolens纖維二糖水解酶基因(NCE3)。
(A)基因組DNA的分離利用上述實(shí)施例A3的方法得到Humicola insolens MN200-1的基因組。
(B)利用PCR方法擴(kuò)增纖維素酶NCE3基因以來自Humicola grisea的纖維二糖水解酶基因的序列為基礎(chǔ)利用PCR方法分離Humicola insolens的NCE3基因。為了能夠使含有該NCE3的PCR產(chǎn)物連接在質(zhì)粒pM21的BamHⅠ位點(diǎn)上，預(yù)先在各引物中設(shè)計了含有BamHⅠ位點(diǎn)，作為引物合成了如下的寡核苷酸序列。
MKA-05:5′-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3′(36mer)MKA-06:5′-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3′(36mer)PCR反應(yīng)根據(jù)LA PCR Kit Ver.2(寶酒造社制)，按照以下方法進(jìn)行。首先對通過上述方法得到的1μg Humicola insolens基因組DNA，各加入1μM引物、400μM dNTP、LA Taq聚合酶2.5U，通過30輪重復(fù)反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，每次的反應(yīng)條件都是94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃3分鐘。擴(kuò)增的片段經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)1.6Kb DNA的擴(kuò)增。該1.6Kb DNA的片段用Sephaglass Band Prep試劑盒(Phamacia Bi otech.公司制造)回收，并與pT7 Blue-T-vector kit(Novagen公司制造)連接。該質(zhì)粒DNA定為pK21。
(5)質(zhì)粒pKM04的制備質(zhì)粒pK21DNA用BamHⅠ消化，回收1.6Kbp片段。然后質(zhì)粒pM21DNA用BamHⅠ消化，再于70℃處理10分鐘，使限制性內(nèi)切酶失活。再通過小牛堿性磷酸酶脫磷酸后，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，回收5.2Kbp DNA片段。最后將來自pK21的1.6Kbp片段與來自pM21的5.2Kbp DNA片段連接，就得到質(zhì)粒pKM04。
(6)質(zhì)粒pMKD01的制備首先，使用通過眾所周知的方法得到的來自構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans的trp C基因的啟動子和終止子(Mullaney,E.J.等，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》Mol.Gen.Genet.199:37-45,1985)，將特開昭59-175889號公報記載的越霉素抗性基因制備成在Humicola insoleHs中能夠表達(dá)的基因。將該基因?qū)胭|(zhì)粒pMKD04的XbaⅠ位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pMKD01。
實(shí)施例B2利用質(zhì)粒pMKD01轉(zhuǎn)化Humicola insolens(1)質(zhì)粒pMKD01高濃度純化樣品的制備為了使質(zhì)粒pMKD01導(dǎo)入Humicola insolens，首先要制備純化的高濃度質(zhì)粒pMKD01。將pMKD01導(dǎo)入E.coli JM109，在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜。得到的培養(yǎng)液用Flexiprep kit(Phamacia Biotech公司制造)純化，得到1μg/μl的pMKD01質(zhì)粒DNA。
(2)轉(zhuǎn)化Humicola insolens將Humicola insolensMN200-1在(S)培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24小時后，通過3000rpm、離心分離10分鐘，收集菌體。其中(S)培養(yǎng)基的組成是上述(N)培養(yǎng)基中加了葡萄糖(3.0％)，并去掉了Avicel后的培養(yǎng)基。得到的菌體用0.5M蔗糖洗凈，懸浮于經(jīng)0.45μm濾器過濾的10ml的原生質(zhì)體化酶液中(5mg/ml Novozyme 234(NLⅠ公司制造)、5mg/ml Cellulase 0nozuka R-10(Yacult公司制造)、0.5M蔗糖)。于30℃振蕩60～90分鐘，使菌原生質(zhì)體化。將該懸濁液過濾后，經(jīng)2500rpm、10分鐘離心分離，回收原生質(zhì)體，用SUTC緩沖液(0.5M蔗糖、10mM氯化鈣、10m MTRis鹽酸(pH7.5))洗凈。
將以上制備的原生質(zhì)體懸浮于1ml的SUTC緩沖液中，向100μl該懸浮液中加入10μg的DNA(TE)溶液(10μl)，靜置于冰中5分鐘。然后加入400μl的PEG溶液(60％PEG4000、10mM氯化鈣、10mM TRis鹽酸(pH7.5))，靜置于冰中20分鐘后，加入10ml的SUTC緩沖液，經(jīng)2500rpm、10分鐘離心分離，收集原生質(zhì)體。將該原生質(zhì)體懸浮于1ml的SUTC緩沖液后，經(jīng)4000rpm、5分鐘離心分離，將原生質(zhì)體最終懸浮于100μl的SUTC緩沖液中。
將經(jīng)以上處理的原生質(zhì)體與YMG軟瓊脂一起鋪在含有200μg/ml潮霉素B的YMG培養(yǎng)基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取液、0.2％麥芽提取液、1％瓊脂(pH6.8))上，于37℃培養(yǎng)5天后，形成的菌落就是轉(zhuǎn)化體。
(3)pMKD01轉(zhuǎn)化的菌株的培養(yǎng)以及經(jīng)SDS-PAGE的評價象前述那樣將質(zhì)粒pMKD01導(dǎo)入Humicola insolens MN200-1，挑選50個潮霉素抗性菌株。將這些菌株在(N)培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)5天。獲得的培養(yǎng)液上清通過SDS-PAGE解析，pMKD01轉(zhuǎn)化的菌株中的5個菌落推斷為NCE3的蛋白質(zhì)帶比親本菌株增加了3～4倍。
(4)重組NCE3的N末端氨基酸殘基的鑒定為了進(jìn)一步確認(rèn)SDS-PAGE結(jié)果給出的大量表達(dá)的蛋白質(zhì)帶是來自NCE3基因的，所以要確定該蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列。首先，就從親本菌株和NCE3高表達(dá)菌株得到的培養(yǎng)上清按照前述實(shí)施例A2的方法進(jìn)行FPLC柱層析，比較它們的主要的峰。收集NCE3高表達(dá)菌株中特別增加的峰，并冷凍干燥。冷凍干燥的樣品溶解于少量的水中，進(jìn)行膠濃度為8％的微型SDS-PAGE(Difco公司制造)。然后按照前述實(shí)施例A2的方法，將膠中蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，進(jìn)行脫色，用水洗凈。從膜中剪下印記為分子量66KD的蛋白質(zhì)部分，將該印記蛋白質(zhì)按照Podell,D.N等人的方法(Podell,D.N.等，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》Biochem.Biophys.Res.Commun.,81:176,l978)，除去修飾N末端殘基。首先，剪下目的蛋白質(zhì)，在少量的0.5％聚乙烯吡咯烷酮(分子量40,000 Sigma公司制造)/100mM醋酸溶液中于37℃保溫30分鐘后，用水充分洗凈。然后利用Pfu焦谷氨酸氨肽酶(寶酒造公司制造)除去修飾的N末端殘基，用水洗凈、風(fēng)干。利用蛋白質(zhì)測序儀Model492，確定了N末端的15個氨基酸殘基序列。得到的序列如下所示。
N末端氨基酸序列Asn-Cys-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Glu-Arg-His-Pro-Ser-Leu-Ser-Trp(15個氨基酸殘基)該N末端氨基酸序列與由質(zhì)粒pMKD01的堿基序列推測的纖維素酶NCE2、NCE3融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列一致。
(5)pMKD01轉(zhuǎn)化的菌株的FPLC評價為了進(jìn)一步定量象上述那樣用SDS-PAGE確認(rèn)NCE3大量表達(dá)的5個菌落的培養(yǎng)上清，利用FPLC柱進(jìn)行柱層析。層析條件與上述(4)的一樣。分別收集NCE3的峰，并冷凍干燥，測定重量，比較高表達(dá)菌株與親本菌株的產(chǎn)率。比較結(jié)果如下表所示。
表4NCE3產(chǎn)量*Humicola insolens MN200-1(親本菌株)0.46gHumicola insolens pMKD011.8g*產(chǎn)量是每一升培養(yǎng)液的產(chǎn)量。
實(shí)施例B3；質(zhì)粒pEGD01的制備質(zhì)粒pMKD01經(jīng)BamHⅠ消化，然后通過70℃的熱處理使限制性內(nèi)切酶失活，經(jīng)脫磷酸處理，回收8.2Kbp的DNA片段。
然后，以在上述實(shí)施例A1～7得到的來自Humicola insolens的NCE4基因的序列為基礎(chǔ)，通過PCR方法擴(kuò)增NCE4基因。按照在各個引物中預(yù)先含有BamHⅠ位點(diǎn)的形式設(shè)計該NCE4的PCR產(chǎn)物，使之能夠符合讀碼框架，連接于上述質(zhì)粒pMKD01的8.2Kbp的BamHⅠ片段。
作為引物合成具有以下序列的寡核苷酸。
NCE4-N:5′-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3′(30mer)NCE4-C:5′-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3′(30mer)PCR反應(yīng)如下。對于1μg Humicola insolens基因組DNA，各加入1μM引物、400μM dNTP、Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司制造)2.5U，通過25輪重復(fù)反應(yīng)擴(kuò)增0.8Kbp的DNA片段，每次的反應(yīng)條件都是94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃3分鐘?；厥赵?.8Kbp的DNA片段，將該片段連接到上述pMKD01的8.2KbpBamHⅠ片段。該質(zhì)粒DNA定為pEGD01。
實(shí)施例B4質(zhì)粒pEGD01的表達(dá)(1)質(zhì)粒pEGD01對Humicola insolens的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pEGD01對Humicola insolensMN200-1的轉(zhuǎn)化按照實(shí)施例B2的方法進(jìn)行。首先制備純化的高濃度的質(zhì)粒pEGD01，得到1μg/μlpEGD01質(zhì)粒DNA。使用10μl該pEGD01溶液，轉(zhuǎn)化Humicola insolens MN200-1，挑選50個潮霉素抗性菌株。將這些菌株在(N)培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)5天。獲得的培養(yǎng)液上清通過SDS-PAGE解析，pMKD0l轉(zhuǎn)化的菌株中的10個菌落中推斷為NCE4蛋白質(zhì)帶比親本菌株增加了10～16倍。
(2)重組NCE4的N末端氨基酸殘基的鑒定為了進(jìn)一步確認(rèn)SDS-PAGE結(jié)果給出的確認(rèn)大量表達(dá)的蛋白質(zhì)帶是來自NCE4基因的，所以要確定該蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列。首先，就從親本菌株和NCE4高表達(dá)菌株得到的培養(yǎng)上清進(jìn)行FPLC柱層析，比較它們的主要的峰。條件與上述實(shí)施例B2一樣。收集NCE3高表達(dá)菌株中特別增加的峰，并冷凍干燥。冷凍干燥的樣品溶解于少量的水中。按照實(shí)施例B2的方法除去修飾N末端殘基后，通過上述蛋白質(zhì)測序儀確定N末端的氨基酸序列。結(jié)果得到比例大約為7∶3的如下所示的兩種N末端氨基酸序列。而如果不除去修飾N末端殘基，通過上述蛋白質(zhì)測序儀確定N末端氨基酸序列，結(jié)果只得到如下所示的氨基酸序列1。
N末端氨基酸序列1:Val-Val-Glu-Glu-Arg-Gln-Asn-Cys-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp(20個殘基)N末端氨基酸序列2:Asn-(Cys)-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys)(20個殘基)
這些N末端氨基酸序列與由質(zhì)粒pMKD01的堿基序列推測的纖維素酶NCE2和NCE4融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列一致。因?yàn)榈玫降氖莾煞NN末端氨基酸序列，很清楚，當(dāng)切斷該融合蛋白質(zhì)的信號序列時，會在多個位置進(jìn)行切斷。
(3)pEGD01轉(zhuǎn)化的菌株的FPLC評價為了進(jìn)一步定量象上述那樣用SDS-PAGE確認(rèn)NCE4大量表達(dá)的5個菌落的培養(yǎng)上清，利用FPLC柱進(jìn)行柱層析。分別收集NCE4的峰，并冷凍干燥，測定重量，比較高表達(dá)菌株與親本菌株的產(chǎn)率。比較結(jié)果如下表所示。
表5NCE4產(chǎn)量*Humicola insolens MN200-1(親本菌株)0.28gHumicola insolens pMKEG14.5g*產(chǎn)量是每一升培養(yǎng)液的產(chǎn)量。
實(shí)施例B5；質(zhì)粒pIED02的制備(1)質(zhì)粒pID01的制備pEGD01經(jīng)HindⅢ～BamHⅠ消化，回收7.2Kbp的DNA片段。
然后，以用特開平8-5663號公報中記載的方法得到的來自Humicola insolens的NCE1基因的序列為基礎(chǔ)，通過PCR方法擴(kuò)增NCE1基因的啟動子和編碼信號序列部分的DNA。含有該NCE1啟動子和信號序列的PCR產(chǎn)物按照在各個引物中預(yù)先含有HindⅢ位點(diǎn)、BamHⅠ位點(diǎn)的形式設(shè)計，使之能夠符合讀碼框架，連接于上述質(zhì)粒pEGD01的7.2Kbp的HindⅢ～BamHⅠ片段。作為引物制備了如下的合成寡核苷酸。
PNCE1-N:5′-GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3′(32mer)PNCE1-C:5′-GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3′(32mer)PCR反應(yīng)與實(shí)施例3一樣。對于1μg Humicola insolens基因組DNA，各加入1μM引物、400μM dNTP、Pfu DNA聚合酶2.5U，通過23輪重復(fù)反應(yīng)擴(kuò)增1.5Kbp的DNA片段，每輪的反應(yīng)條件都是94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃4分鐘。該P(yáng)CR產(chǎn)物用HindⅢ和BamHⅠ消化，回收1.5Kbp的DNA片段，將該片段連接到上述pEGD01的7.2Kbp HindⅢ～BamHⅠ片段。該質(zhì)粒DNA定為pIED01。
(2)質(zhì)粒pIED02的制備質(zhì)粒pID01經(jīng)BamHⅠ消化，然后通過70℃的熱處理使限制性酶失活，經(jīng)脫磷酸處理，回收8.6Kbp的DNA片段。然后質(zhì)粒pEGD01經(jīng)BamHⅠ消化后，回收含有NCE4基因的0.8Kbp的DNA片段，將兩個片段連接起來，得到質(zhì)粒pIED02。
實(shí)施例B6質(zhì)粒pIED02的表達(dá)(1)質(zhì)粒pIED02對Humicola insolens的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pIED02對Humicola insolens MN200-1的轉(zhuǎn)化按照實(shí)施例B2的方法進(jìn)行。首先制備純化的高濃度的質(zhì)粒pIED02，得到1μg/μlpIED02質(zhì)粒DNA。使用10μl該pIED02溶液，轉(zhuǎn)化Humicola insolens MN200-1，挑選50個潮霉素抗性菌株。將這些菌株在(N)培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)5天。獲得的培養(yǎng)液上清通過SDS-PAGE解析，pIED02轉(zhuǎn)化的菌株中的5個菌落中推斷為NCE4蛋白質(zhì)帶，比親本菌株增加了5～10倍。
(2)重組NCE4的N末端氨基酸殘基的鑒定為了確認(rèn)SDS-PAGE的結(jié)果給出的大量表達(dá)的蛋白質(zhì)帶是來自NCE4基因的，所以要確定該蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列。首先，按照與實(shí)施例B2一樣的方法，就從親本菌株和NCE4高表達(dá)菌株得到的培養(yǎng)上清進(jìn)行FPLC柱層析，收集NCE3高表達(dá)菌株中特別增加的峰，并冷凍干燥。冷凍干燥的樣品溶解于少量的水中。按照實(shí)施例B2的方法除去修飾N末端殘基后，通過上述蛋白質(zhì)測序儀確定N末端的15個氨基酸殘基序列。得到的序列如下所示。
N末端氨基酸序列Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)(15個殘基)該N末端氨基酸序列與由質(zhì)粒pIED02的堿基序列推測的纖維素酶NCE1、NCE4融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列一致。
(3)pEGD02轉(zhuǎn)化的菌株的FPLC評價為了進(jìn)一步定量象上述那樣用SDS-PAGE確認(rèn)的NCE4大量表達(dá)的5個克隆的培養(yǎng)上清，利用FPLC柱進(jìn)行柱層析。分別收集NCE4的峰，并冷凍干燥，測定重量，比較高表達(dá)菌株與親本菌株的產(chǎn)率。比較結(jié)果如下表所示。
表6NCE4產(chǎn)量*Humicola insolens MN200-1(親本菌株) 0.28gHumicola insolens pIED022.9g*產(chǎn)量是每一升培養(yǎng)液的產(chǎn)量。
序列表序列號1序列的長度305拓?fù)湫椭辨溞涡蛄蟹N類蛋白質(zhì)序列Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro-20 -15 -10Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys-51 5 10Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro15 20 25Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala30 35 40Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln45 50 55Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr60 65 70 75Ser Ile Ala Gly Ser Ash Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu80 85 90Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln95 100 105Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn110 115 120Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe125 130 135Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu140 145 150 155Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe160 165 170Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val175 180 185Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp190 195 200Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser205 210 215Pro Val Gly Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr220 225 230235Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu240 245 250Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Sar Gly Cys Thr Thr Cys255 260 265Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys270 275 280Leu序列號2序列的長度1257序列類型核酸鏈數(shù)二條鏈拓?fù)湫椭辨溞涡蛄蟹N類基因組DNA起源生物名humicola insolens序列特征表示特征的記號intron存在位置453..509決定特征的方法E序列AATGACGGGG CAACCTCCCG CCCGGGCCCA ACTCTTGGGT TTGGTTTGAC AGGCCGTCTG60TCTCTTGCGT CCTCTTACTA CGCCTGCCTG GACCCTACGT CTCAACTCCG ATTCAAG 117ATG CGT TCC TCC CCT CTC CTC CGC TCC GCC GTT GTG GCC GCC CTG CCG 165Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro-20 -15 -10GTG TTG GCC CTT GCC GCT GAT GGC AAG TCC ACC CGC TAC TGG GAC TGC 213Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys-51 5 10TGC AAG CCT TCG TGC GGC TGG GCC AAG AAG GCr CCC GTG AAC CAG CCT 261Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro15 20 25GTC TTC TCC TGC AAC GCC AAC TTC CAG CGT CTC ACT GAC TTC GAC GCC 309Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala30 35 40AAG TCC GGC TGC GAG CCG GGC GGT GTC GCC TAC TCG TGC GCC GAC CAG 357Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln45 50 55ACC CCA TGG GCT GTG AAC GAC GAC TTC GCG TTC GGT TTT GCT GCC ACC 405Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr60 65 70 75TCT ATT GCC GGC AGC AAT GAG GCG GGC TGG TGC TGC GCC TGC TAC GA 452Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Gl80 85 90GTAAGCTTTG GTCGCGTGTG TAACACTGTG CAGGCATAGC ACTAACCACC TCCCAG G 509uCTC ACC TTC ACA TCC GGT CCT GTT GCT GGC AAG AAG ATG GTC GTC CAG 557Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln95 100 105TCC ACC AGC ACT GGC GGT GAT CTT GGC AGC AAC CAC TTC GAT CTC AAC 605Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn110 115 120ATC CCC GGC GGC GGC GTC GGC ATC TTC GAC GGA TGC ACT CCC CAG TTC 653Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe125 130 135GGC GGT CTG CCC GGC CAG CGC TAC GGC GGC ATC TCG TCC CGC AAC GAG 701Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu140 145 150TGC GAT CGG TTC CCC GAC GCC CTC AAG CCC GCC TGC TAC TGG CGC TTC 749Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe160 165 170GAC TGG TTC AAG AAC GCC GAC AAC CCG AGC TTC AGC TTC CGT CAG GTC 797Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val175 180 185CAA TGC CCA GCC GAG CTC GTC GCT CGC ACC GGA TGC CGC CGC AAC GAC 845Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp190 195 200GAC GGC AAC TTC CCT GCC GTC CAG ATC CCC TCC AGC AGC ACC AGC TCT 893Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser205 210 215CCG GTC GGC CAG CCT ACC AGT ACC AGC ACC ACC TCC ACC TCC ACC ACC 941Pro Val Gly Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr220 225 230 235TCG AGC CCG CCC GTC CAG CCT ACG ACT CCC AGC GGC TGC ACT GCT GAG 989Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu240 245 250AGG TGG GCT CAG TGC GGC GGC AAT GGC TGG AGC GGC TGC ACC ACC TGC1037Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly ASn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys255 260 265GTC GCT GGC AGC ACC TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC CAT CAG TGC1085Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys270 275 280CTG TAA ACGCAGGGCA GCCTGAGAAC CTTACTGGTT GCGCAACGAA ATGACACTCC 1141LeuCAATCACTGT ATTAGTTCTT GTACATAATT TCGTCATCCC TCCAGGGATT GTCACATATA 1201TGCAATGATG AATACTGAAC ACAAACCTGG CCGCTTGAAC TGGCCGAAGG AATGCC 125權(quán)利要求
1．含有序列1記載的氨基酸序列的一部分或含有1～284號的序列的蛋白質(zhì)和其變化的蛋白質(zhì)。
2．權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)和其變化的蛋白質(zhì)，其特征是在N末端一側(cè)還具有序列1記載的-21～-1號氨基酸序列的一部分或全部序列。
3．權(quán)利要求1和2記載的蛋白質(zhì)和其變化的蛋白質(zhì)，其特征是具有葡聚糖內(nèi)切酶活性。
4．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的編碼蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)的DNA序列。
5．權(quán)利要求4記載的的DNA序列，其特征是含有序列2記載的堿基序列的一部分或全部序列。
6．權(quán)利要求5記載的的DNA序列，其特征是含有序列2記載的堿基序列的118～1088號的堿基序列。
7．含有權(quán)利要求4～6中任一項(xiàng)記載的DNA序列的載體。
8．利用權(quán)利要求7記載的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)的制備方法，其特征包括培養(yǎng)權(quán)利要求8記載的宿主細(xì)胞，從其培養(yǎng)物中提取權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)和其變化的蛋白質(zhì)的提取工序。
10．含有權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)的纖維素酶制劑。
11．含纖維素纖維細(xì)毛的去除方法，其特征包括使權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7記載的纖維素酶制劑與含纖維素纖維接觸的工序。
12．斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工方法，其特征包括使權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7記載的纖維素酶制劑與斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維接觸的工序。
13．含纖維素纖維的減量加工方法，其特征包括使權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7記載的纖維素酶制劑與含纖維素纖維接觸的工序。
14．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7記載的纖維素酶制劑在去除含纖維素纖維細(xì)毛中的應(yīng)使用。
15．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)和其變化的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7記載的纖維素酶制劑在斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工中的應(yīng)用。
16．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其變化的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7記載的纖維素酶制劑含纖維素纖維的減量加工中的應(yīng)用。
全文摘要
公開了理想的可用于含纖維素纖維細(xì)毛的去除、減量加工和斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工的高活性纖維素酶及其基因。從Humicola insolens分離的新的纖維素酶NCE4是高活性的纖維素酶,該酶可以用于各種含纖維素纖維的處理。
文檔編號D06P5/13GK1230988SQ97198010
公開日1999年10月6日 申請日期1997年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月24日
發(fā)明者村島弘一郎, 浜谷徹, 古賀仁一郎, 河野敏明, 守屋達(dá)樹, 隅田奈緒美, 青柳薰, 村上健 申請人:明治制果株式會社