一種醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，采用靜電紡絲技術(shù)制備殼聚糖納米纖維，再利用多巴胺和角蛋白對(duì)納米纖維進(jìn)行功能化修飾，以提高材料的生物相容性，促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖。制備過程包括：1)靜電紡絲獲得殼聚糖納米纖維；2)用多巴胺溶液浸泡上述納米纖維，提高材料表面的蛋白粘附性；3)用角蛋白溶液繼續(xù)浸泡紡絲材料，使其粘附于材料表面。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)修飾后的納米纖維生物相容性良好，能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。該方法也適用于其它醫(yī)用高分子材料納米纖維，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，在組織工程領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]殼聚糖是甲殼素的衍生物，具有良好的生物相容性、特殊的生物活性(廣譜抗菌性、止血、促進(jìn)傷口愈合、防止組織粘連、降脂、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等作用)和來源廣泛性。殼聚糖可以溶解在許多稀酸中，其實(shí)質(zhì)是糖殘基上的-NH2與H+形成陽離子-NH3+配合物，使殼聚糖成為帶正電荷的聚電解質(zhì)，破壞了殼聚糖分子內(nèi)與分子間的氫鍵，溶解性隨之增強(qiáng)。靜電紡絲技術(shù)是一種比較成熟的制備納米纖維的方法。利用靜電紡絲法生產(chǎn)的殼聚糖產(chǎn)品，其纖維直徑小，形成的非織造布在力學(xué)性能、導(dǎo)電性、吸附性等方面表現(xiàn)出優(yōu)良的性質(zhì)，再配合殼聚糖本身獨(dú)特的性能，使其在納米纖維材料的復(fù)合、過濾、生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和防護(hù)服等領(lǐng)域得到很好的利用。角蛋白屬于中間絲蛋白類，除了頭發(fā)纖維、角和指甲，角蛋白已被證明存在于幾乎所有已分化細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。角蛋白能增強(qiáng)細(xì)胞增殖和迀移，角蛋白本身及其降解產(chǎn)物能誘導(dǎo)細(xì)胞合成TGF等因子，如果能將角蛋白修飾到材料表面，能明顯提高其生物相容性。
[0003]高分子納米纖維材料越來越多的應(yīng)用于生物組織工程領(lǐng)域，納米材料的制備相對(duì)容易，但長(zhǎng)期以來，材料表面的生物功能化仍不理想，這就影響納米材料的生物相容性。
[0004]為了進(jìn)一步提高殼聚糖電紡納米纖維的生物相容性，就需要改變其表面特性，弓丨入上述角蛋白分子，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞粘附，增殖并增加細(xì)胞生存能力的目的。這種方法可同樣應(yīng)用于其它醫(yī)用高分子材料的表面改性以提高生物相容性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種工藝簡(jiǎn)單，能夠顯著提高納米纖維材料的生物相容性方法。
[0006]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，制備過程包括:
[0008]I)通過靜電紡絲方法制備殼聚糖納米纖維，采用的靜電紡絲溶液為殼聚糖/聚氧化乙烯溶液；
[0009]2)所述殼聚糖納米纖維進(jìn)行去酸后處理；
[0010]3)步驟2)所得的所述殼聚糖納米纖維的表面進(jìn)行功能化修飾:先后用多巴胺和角蛋白溶液浸泡，再經(jīng)孵育即得。
[0011]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述殼聚糖/聚氧化乙烯溶液中殼聚糖和聚氧化乙烯的質(zhì)量百分比為9:1。
[0012]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述殼聚糖/聚氧化乙烯溶液溶于90%乙酸溶液中，其中殼聚糖的質(zhì)量濃度為1.8%，聚氧化乙烯的質(zhì)量濃度為0.2%。
[0013]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，步驟I)的具體方法為:
[0014]1-1)所述靜電紡絲溶液注入注射器中，排出氣泡；
[0015]1-2)固定注射器在微量擠出栗上，注射器連接噴絲頭;噴絲頭連接有電源正極，電源負(fù)極連接接收裝置；
[0016]1-3)開啟微量擠出栗，調(diào)整擠出速率；
[0017]1-4)待溶液擠出后，打開電源，調(diào)節(jié)接收距離，收集樣品。
[0018]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述注射器的針頭為平口，內(nèi)徑為0.5毫米;步驟1-3)所述擠出速率為I毫升/小時(shí);步驟1-4)所述電源的電壓為20千伏，所述接收距離為20厘米。
[0019]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟2)的具體方法為:
[0020]2-1)干燥:所述殼聚糖納米纖維在40°C條件下真空干燥48h;
[0021 ] 2-2)浸泡:在w/v % 為0.5 % NaOH溶液中浸泡 10_20min ；
[0022]2-3)加熱:置于沸水中加熱10-20min;
[0023 ] 2-4) 二次干燥:置于烘箱中40 V干燥，即得。
[0024]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述多巴胺溶液是用pH8.5的1mMTris緩沖液配置成2mg/mL溶液，所述角蛋白溶液是將角蛋白粉末溶于HEPES緩沖液配置成2_5mg/mL溶液。
[0025]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，步驟3)具體方法為:先用所述多巴胺溶液浸泡lh，超純水清洗;再用所述角蛋白溶液浸泡材料，在37°C培養(yǎng)箱孵育Ih后，超純水清洗，氮?dú)獯蹈伞?br>[0026]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，將所述多巴胺和角蛋白溶液預(yù)先用0.22μπι的濾膜進(jìn)行過濾。
[0027]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，將步驟3)所得到的殼聚糖紡絲纖維進(jìn)行生物相容性驗(yàn)證，包括接種BMSC細(xì)胞和H9c2細(xì)胞;所述BMSC細(xì)胞接種后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性;所述H9c2細(xì)胞接種后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，研究材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
[0028]有益效果:本發(fā)明提供的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，采用靜電紡絲技術(shù)制備殼聚糖納米纖維，再利用多巴胺和角蛋白對(duì)納米纖維進(jìn)行功能化修飾，以提高材料的生物相容性，促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖。
[0029]優(yōu)點(diǎn)在于通過簡(jiǎn)便的方法在醫(yī)用高分子材料殼聚糖的表面引入活性官能團(tuán)，進(jìn)而通過該官能團(tuán)修飾上角蛋白分子，從而顯著改善原材料的生物相容性。該方法操作方便、可重復(fù)性好，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方法制得的納米纖維相容性良好，能顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。該方法也適用于其它醫(yī)用高分子材料納米纖維，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，在組織工程領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030]圖1為殼聚糖靜電紡絲材料SEM表征圖；
[0031 ]圖2為兩種濃度角蛋白修飾前后殼聚糖納米纖維材料BMSC細(xì)胞活性比較；
[0032]圖3為角蛋白修飾前后殼聚糖納米纖維材料接種H9c2細(xì)胞增殖比較。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0034]以下實(shí)施例所用主要原材料:
[0035]殼聚糖(CS):脫乙酰度85.60%，分子量25萬；聚氧乙烯(PEO);多巴胺:西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；角蛋白。
[0036]實(shí)施例1
[0037]—種醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，制備過程包括:I)將殼聚糖粉末溶解于乙酸溶液中；2)添加聚氧化乙烯(PEO)，完全溶解后進(jìn)行靜電紡絲獲得納米纖維;3)用多巴胺溶液浸泡上述納米纖維，提高材料表面的蛋白粘附性;4)用角蛋白溶液繼續(xù)浸泡紡絲材料，使其粘附于材料表面。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)修飾后的納米纖維生物相容性良好，能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。具體的操作方法如下:
[0038]首先，靜電紡絲制得殼聚糖納米纖維:選取醫(yī)用高分子材料殼聚糖，溶解在90%乙酸溶液中，通過靜電紡絲方法制備納米纖維，再添加聚氧乙烯(PEO)提高紡絲效果。優(yōu)選的，按殼聚糖:聚氧乙烯PEO = 9:1 (質(zhì)量比)的最佳比例溶于90 %乙酸中，其中殼聚糖的質(zhì)量濃度為1.8%，聚氧化乙烯的質(zhì)量濃度為0.2%。
[0039]殼聚糖靜電紡絲方法為:取適量配制好的殼聚糖/PEO溶液注入注射器中，排出氣泡，注射器針頭為平口，內(nèi)徑為0.5毫米;固定注射器在微量擠出栗上；以導(dǎo)管連接注射器和噴絲頭;將高壓電源正極夾在噴絲頭上，負(fù)極接在接收裝置上；打開微量擠出栗，選擇合適的擠出速率。待溶液被緩慢擠出后，打開高壓電源，選擇合適的電壓值。適當(dāng)調(diào)節(jié)接收距離，收集裝置處得到的樣品。
[0040]優(yōu)選的，微量擠出栗的推進(jìn)速度為I毫升/小時(shí)，高壓直流電源正極接注射器針頭，負(fù)極連在接收裝置上，電壓為20千伏，收集距離為20厘米，3小時(shí)后將得到殼聚糖納米纖維薄膜。圖1所示為利用本發(fā)明提供的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化方法獲得的殼聚糖電紡納米纖維SEM表征圖，獲得了出絲連續(xù)的納米纖維材料，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供支架。
[0041]其次，對(duì)上述步驟得到的紡絲纖維進(jìn)行去酸處理，以去除酸性環(huán)境對(duì)細(xì)胞的不良影響。從錫箔紙上剪下蓋玻片，用殼聚糖納米纖維將其裹好，在40°C真空干燥箱中干燥48h后，將納米纖維材料浸在0.5% (w/v% )NaOH溶液中10-20分鐘，處理所用溶劑:0.5% (w/V % )NaOH溶液，將所配溶液倒入培養(yǎng)皿中，沒過纖維即可;然后用純水洗三次，再將纖維置于沸水中約5min兩次，后用純水沖洗兩次，置于烘箱中40°C干燥，放入干燥器中備用。
[0042]最后，將殼聚糖納米纖維進(jìn)行表面生物功能化修飾，方法為:將多巴胺溶解在濃度為2mg/ml的1mM Tris緩沖液(pH = 8.5)中；同時(shí)角蛋白溶解在2?5mg/ml HEPES溶液中，之后在超凈臺(tái)操作，用0.22μπι的濾膜將多巴胺和角蛋白溶液過濾。先用多巴胺將要處理的材料浸泡約I小時(shí)，用超純水清洗I遍，然后用角蛋白溶液浸泡所述修飾氨基后的殼聚糖納米纖維材料，在37 °C培養(yǎng)箱孵育I小時(shí)，后用超純水清洗I次，氮?dú)獯蹈杀４嬗?度冰箱待用。
[0043]通過修飾多巴胺，在殼聚糖紡絲纖維上引入氨基，通過表面氨基進(jìn)行后續(xù)反應(yīng);然后再在多巴胺處理的殼聚糖納米纖維材料表面修飾上角蛋白分子，增加表面細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞粘附和細(xì)胞增殖，改善殼聚糖納米纖維材料的生物相容性。
[0044]實(shí)施例2
[0045]對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法所獲得的殼聚糖紡絲纖維進(jìn)行生物相容性驗(yàn)證。
[0046]培養(yǎng)液清洗步驟3)所得材料后，置于48孔板中，接種BMSC細(xì)胞，接種濃度為3*104個(gè)/mL，每孔lOOyL。培養(yǎng)3天后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在角蛋白處理的殼聚糖納米纖維材料比未處理材料上活力均要大，5mg/ml角蛋白處理的殼聚糖材料上BMSC細(xì)胞活性最好，如圖2所示。
[0047]用同樣的方法接種H9c2細(xì)胞，在1、3、5天進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，研究材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響。驗(yàn)證得該材料能促進(jìn)細(xì)胞增殖，角蛋白的加入大大改善了殼聚糖納米纖維的生物相容性如圖3所示。
[0048]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，制備過程包括: 1)通過靜電紡絲方法制備殼聚糖納米纖維，采用的靜電紡絲溶液為殼聚糖/聚氧化乙烯溶液； 2)所述殼聚糖納米纖維進(jìn)行去酸后處理； 3)步驟2)所得的所述殼聚糖納米纖維的表面進(jìn)行功能化修飾:先后用多巴胺和角蛋白溶液浸泡，再經(jīng)孵育即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述殼聚糖/聚氧化乙烯溶液中殼聚糖和聚氧化乙烯的質(zhì)量百分比為9:1。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述殼聚糖/聚氧化乙烯溶液溶于90%乙酸溶液中，其中殼聚糖的質(zhì)量濃度為1.8%，聚氧化乙烯的質(zhì)量濃度為0.2%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，步驟I)的具體方法為: 1-1)所述靜電紡絲溶液注入注射器中，排出氣泡； 1-2)固定注射器在微量擠出栗上，注射器連接噴絲頭；噴絲頭連接有電源正極，電源負(fù)極連接接收裝置； 1-3)開啟微量擠出栗，調(diào)整擠出速率； 1-4)待溶液擠出后，打開電源，調(diào)節(jié)接收距離，收集樣品。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述注射器的針頭為平口，內(nèi)徑為0.5毫米;步驟1-3)所述擠出速率為I毫升/小時(shí);步驟1-4)所述電源的電壓為20千伏，所述接收距離為20厘米。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述步驟2)的具體方法為: 2-1)干燥:所述殼聚糖納米纖維在40°(:條件下真空干燥48h; 2-2)浸泡:在w/v %為0.5 % NaOH溶液中浸泡10_20min; 2-3)加熱:置于沸水中加熱10-20min; 2-4) 二次干燥:置于烘箱中40 V干燥，即得。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，所述多巴胺溶液是用PH8.5的1mM 1^8緩沖液配置成21^/1^溶液，所述角蛋白溶液是將角蛋白粉末溶于HEPES緩沖液配置成2-5mg/mL溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，步驟3)具體方法為:先用所述多巴胺溶液浸泡lh，超純水清洗;再用所述角蛋白溶液浸泡材料，在37 °C培養(yǎng)箱孵育Ih后，超純水清洗，氮?dú)獯蹈伞?.根據(jù)權(quán)利要求8所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，將所述多巴胺和角蛋白溶液預(yù)先用0.22μπι的濾膜進(jìn)行過濾。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的醫(yī)用高分子材料納米纖維的表面生物功能化的方法，其特征在于，將步驟3)所得到的殼聚糖紡絲纖維進(jìn)行生物相容性驗(yàn)證，包括接種BMSC細(xì)胞和H9c2細(xì)胞;所述BMSC細(xì)胞接種后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性;所述H9c2細(xì)胞接種后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，研究材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
【文檔編號(hào)】D01F8/18GK105839407SQ201610243288
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月19日
【發(fā)明人】黃寧平, 張寧, 張峰
【申請(qǐng)人】東南大學(xué)