專(zhuān)利名稱(chēng)：銀杏葉提取物及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及銀杏葉的提取物及其制劑。具體講是銀杏內(nèi)酯提取物與銀杏黃酮提取物的組合物及其藥物制劑。本發(fā)明還涉及銀杏葉提取物及其制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
銀杏藥用至今已有600多年的歷史，對(duì)其進(jìn)行藥理及其他應(yīng)用研究始于70年代，近十年來(lái)發(fā)展很快，目前，集中在銀杏葉中提取的銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮的開(kāi)發(fā)和利用上。根據(jù)以往報(bào)道，銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)于治療心血管疾病和腦血管疾病有較好的治療效果。關(guān)于銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮的提取方法已經(jīng)有很多報(bào)道，例如CN1281856A公開(kāi)了微波提取銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)的方法。銀杏內(nèi)酯是從中草藥銀杏葉當(dāng)中提取獲得的有效物質(zhì)，該物質(zhì)從結(jié)構(gòu)上還可以進(jìn)一步細(xì)分為銀杏內(nèi)酯A、B、C、K(銀杏內(nèi)酯K是發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)銀杏內(nèi)酯單體，已另案申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)柺?2128965.4)等，對(duì)于銀杏內(nèi)酯提取方法的報(bào)道，還可以參見(jiàn)以下文獻(xiàn)李新崗等人介紹了銀杏內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)室提取方法(參見(jiàn)李新崗等，銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)室提取方法研究，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志1998年第1期)，中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1195665A介紹了銀杏內(nèi)酯的提取方法和含有銀杏內(nèi)酯的制劑，該方法是將銀杏葉用水煮沸提取，用吸附劑對(duì)提取濾液吸附，再用乙醇脫附，回收乙醇，將析出的結(jié)晶溶解，重結(jié)晶，干燥制得銀杏內(nèi)酯。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1313287A公開(kāi)了一種銀杏內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝。從銀杏內(nèi)酯的總提取物當(dāng)中分離銀杏內(nèi)酯單體的方法，也有很多相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，例如，游松等人介紹了銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的分離與結(jié)構(gòu)測(cè)定方法(參見(jiàn)游松等，銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的分離與結(jié)構(gòu)測(cè)定，中國(guó)藥物化學(xué)雜志1995年第4期)。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1287121A公開(kāi)了由銀杏葉或銀杏葉浸膏制備藥物銀杏內(nèi)酯A、B的方法。銀杏內(nèi)酯作為一個(gè)有效的活性物質(zhì)，可以將其制備成不同的臨床藥物劑型。用銀杏內(nèi)酯制備注射劑的方法已經(jīng)在中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1315175A當(dāng)中公開(kāi)。劉潔等使用銀杏葉注射劑治療急性腦梗塞取得了一定療效[參見(jiàn)劉潔等，銀杏葉注射液對(duì)急性腦梗塞后肢體運(yùn)動(dòng)功能及TXB_2、6-Keto-PGF_(1a)的影響]。關(guān)于銀杏內(nèi)酯的藥理作用，已經(jīng)有較為詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道(參見(jiàn)陳維軍等，銀杏內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理作用研究進(jìn)展，中國(guó)藥學(xué)雜志1998年第9期)。盡管現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)中對(duì)于銀杏內(nèi)酯及其制劑的研究已經(jīng)有很多的報(bào)道，但是，對(duì)于銀杏內(nèi)酯的研究一直沒(méi)有停止，特別是對(duì)于銀杏內(nèi)酯單體的分離及其衍生物的研究，不斷有文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明人在發(fā)現(xiàn)了銀杏內(nèi)酯K的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)銀杏內(nèi)酯進(jìn)一步精制和控制質(zhì)量，特別是對(duì)銀杏黃酮進(jìn)一步進(jìn)行了精制，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，找到了銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的特定配比進(jìn)行組合，將其制備成藥劑，完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種藥物組合物以及由該組合物制備的藥物制劑。
本發(fā)明還提供了藥物組合物及其制劑的制備方法。
本發(fā)明藥物組合物為銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物的組合物，其中銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮提取物可以通過(guò)對(duì)市售或自制的銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮粗品進(jìn)行精制而獲得，銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮粗品可以按照常規(guī)的已知方法制備。
銀杏內(nèi)酯的精制方法及其鑒別和含量測(cè)定方法如下1、銀杏內(nèi)酯精制方法取銀杏內(nèi)酯粗品，加8倍量乙醇，50～60℃水浴，攪拌溶解，過(guò)濾，濾液濃縮至總量的八分之一至四分之一，靜置，冷卻，析晶，過(guò)濾，重復(fù)上述操作，直至經(jīng)檢驗(yàn)本品中銀杏內(nèi)酯各成分符合要求，取晶體減壓低溫干燥，即得2、含量測(cè)定方法照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000版一部附錄VI D)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以異丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，理論塔板數(shù)按銀杏內(nèi)酯B計(jì)應(yīng)不低于7000，各相鄰峰之間的分離度及拖尾因子應(yīng)符合要求。
銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)還可以是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇-水-四氫呋喃＝70∶25∶10；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù)漂移管溫度105攝氏度，載氣為氮?dú)?，載氣流速3.10升/min；理論踏板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰計(jì)，應(yīng)不低于3500。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的銀杏內(nèi)酯A、B、K、白果內(nèi)酯適量，分別加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的本品20mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
結(jié)果銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于90.0％，銀杏內(nèi)酯原料中各成分的含量要求如下銀杏內(nèi)酯A30％～40％銀杏內(nèi)酯B50％～60％銀杏內(nèi)酯k≥0.5％白果內(nèi)酯≥0.5％3、銀杏內(nèi)酯的鑒別方法(1)高效液相色譜法按照上述含量測(cè)定方法當(dāng)中的高效液相色譜條件試驗(yàn)，供試品中銀杏內(nèi)酯B的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品一致。
(2)薄層色譜法取銀杏內(nèi)酯1mg加50％丙酮1ml溶解，另取銀杏內(nèi)酯A、B、C、K和白果內(nèi)酯對(duì)照品各1mg分別加50％丙酮1ml溶解，照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)，用微量點(diǎn)樣器分別取上述供試品和對(duì)照品溶液各10μL點(diǎn)樣于同一塊含4％醋酸鈉的0.5％CMC-Na溶液制成的硅膠GF254薄板上，以石油醚-丙酮-甲醇(10∶2.5∶0.3)為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)后，取出，吹干，于160℃加熱30分鐘，置紫外燈365nm下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)。
4、銀杏酸檢查照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000版一部附錄VI D)檢查，供試品溶液峰面積不得大于對(duì)照品溶液峰面積。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸(83∶17∶0.5)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)243nm。理論塔板數(shù)按銀杏酸計(jì)應(yīng)不低于7000，銀杏酸與其它成分的分離度應(yīng)符合要求。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取銀杏酸對(duì)照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，精密量取該溶液5.0ml，定量轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，混勻，作為對(duì)照溶液，濃度為25μg/ml。
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小時(shí)，回收溶媒，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?mL，該溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。
測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。銀杏酸含量不得高于0.0005％，最好不得高于0.0002％。
銀杏黃酮的精制及含量測(cè)定方法和鑒別方法如下1、銀杏黃酮的精制方法取銀杏黃酮提取物，加95％乙醇在60攝氏度水浴中溶解，先通過(guò)沙芯漏斗過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)10000分子量以下超濾膜超濾，收集濾液，60攝氏度減壓濃縮，40～50攝氏度真空干燥，即得。
2、銀杏黃酮的含量測(cè)定方法用高效液相色譜法測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm；理論塔板數(shù)以斛皮素峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg異鼠李素對(duì)照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得儲(chǔ)備液。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液用甲醇或流動(dòng)相稀釋配成濃度分別為斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，異鼠李素1μg/ml，的對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取銀杏黃酮提取物50mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5ml于錐形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％鹽酸緩慢加熱至回流，回流1小時(shí)，冷卻。溶液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。
本提取物中含黃酮甙的總量不低于25％。其中各黃酮甙的含量范圍是斛皮素12～18％，山柰酚7～13％，異鼠李素1～4％。
本發(fā)明銀杏黃酮提取物的鑒別方法取銀杏黃酮提取物溶于5ml甲醇，取1滴滴于濾紙上吹干后噴灑10％三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置365nm紫外燈下觀(guān)察，呈黃色熒光。
銀杏酸含量檢查照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000版一部附錄VI D)檢查。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸(83∶17∶0.5)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)243nm。理論塔板數(shù)按銀杏酸計(jì)應(yīng)不低于7000，銀杏酸與其它成分的分離度應(yīng)符合要求。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取銀杏酸對(duì)照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，精密量取該溶液5.0ml，定量轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，混勻，作為對(duì)照溶液，濃度為25μg/ml。
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小時(shí)，回收溶媒，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?mL，該溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。
測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。總銀杏酸含量不得高于0.0005％。
本發(fā)明藥物提取物由銀杏內(nèi)酯提取物與銀杏黃酮提取物組成，二者的比例是(19-4)∶(1-3)。
本發(fā)明所述銀杏內(nèi)酯提取物與銀杏黃酮提取物的優(yōu)選比例是(15-5)∶(1-2)，更優(yōu)選的比例是(10-8)∶(1-2)，其中進(jìn)一步的優(yōu)選比例為銀杏內(nèi)酯提取物∶銀杏黃酮提取物＝19∶1，本發(fā)明將這種原料組合物稱(chēng)為組合物G1；銀杏內(nèi)酯提取物∶銀杏黃酮提取物＝8∶1，本發(fā)明將這種原料組合物稱(chēng)為組合物G2；銀杏內(nèi)酯提取物∶銀杏黃酮提取物＝5∶2，本發(fā)明將這種原料組合物稱(chēng)為組合物G3；銀杏內(nèi)酯提取物∶銀杏黃酮提取物＝4∶3，本發(fā)明將這種原料組合物稱(chēng)為組合物G4；其中銀杏內(nèi)酯提取物與銀杏黃酮提取物的特別優(yōu)選比例為8∶1。
上述不同比例的藥物組合物充分混勻，作為本發(fā)明藥物制劑的活性成分原料，按照常規(guī)工藝，可以制備成不同的臨床藥物劑型，例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸、口服液體制劑、注射劑等。
本發(fā)明藥物口服制劑的制備工藝如下分別取上述幾種混合物100g，加入淀粉、糊精50～200g，充分混勻，用乙醇制粒，干燥。制成硬膠囊、片劑；或取PEG400276.0g置適宜容器內(nèi)，加入PEG60006.0g，水浴加熱至PEG6000溶解，攪勻，加入甘油18.0g，加入銀杏提取物100.0g，用膠體磨研磨成均勻的膏體，轉(zhuǎn)移至軟膠囊機(jī)的貯料桶，用約0.3ml的模具壓制成軟膠囊或制成其他口服制劑等，硬膠囊、軟膠囊或片劑每?；蛎科y杏提取物0.1g，服用方法是每次1～2粒或片，每日三次。
為了保證所制備藥物制劑的穩(wěn)定性，本發(fā)明還研制了上述不同比例組合物口服制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和含量測(cè)定方法及鑒別方法。
上述制劑的含量測(cè)定方法如下1.銀杏內(nèi)酯的含量測(cè)定照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000版一部附錄VI D)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以異丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，理論塔板數(shù)按銀杏內(nèi)酯B計(jì)應(yīng)不低于7000，各相鄰峰之間的分離度及拖尾因子應(yīng)符合要求。
銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)還可以是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇-水-四氫呋喃＝70∶25∶10；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù)漂移管溫度105攝氏度，載氣為氮?dú)?，載氣流速3.10升/min；理論踏板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰計(jì)，應(yīng)不低于3500。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的銀杏內(nèi)酯A、B、K、白果內(nèi)酯適量，分別加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品100mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。
測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
按照上述方法測(cè)定本發(fā)明所述藥物組合物當(dāng)中銀杏內(nèi)酯的含量，應(yīng)當(dāng)符合下述要求組合物G1制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于85.0％；組合物G2制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于80.0％；組合物G3制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于64.0％；組合物G4制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于51.0％。
2、銀杏黃酮的含量測(cè)定用高效液相色譜法測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm；理論塔板數(shù)以斛皮素峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg異鼠李素對(duì)照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得儲(chǔ)備液。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液用甲醇或流動(dòng)相稀釋配成濃度分別為斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，異鼠李素1μg/ml，的對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品100mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，精密吸取5ml于錐形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％鹽酸緩慢加熱至回流，回流1小時(shí)，冷卻。溶液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。
按照上述方法測(cè)定本發(fā)明所述藥物組合物口服制劑當(dāng)中銀杏黃酮的含量，應(yīng)當(dāng)符合下述要求組合物G1中含黃酮甙的總量不低于1.25％；組合物G2中含黃酮甙的總量不低于2.8％；組合物G3中含黃酮甙的總量不低于7.0％；組合物G4中含黃酮甙的總量不低于10.5％本發(fā)明所述藥物組合物口服制劑的鑒別方法如下1.取本發(fā)明所述藥物組合物或其制劑1g，溶于10ml甲醇，取1滴滴于濾紙上吹干后噴灑10％三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置365nm紫外燈下觀(guān)察，呈黃色熒光。
2.薄層色譜法取本發(fā)明所述藥物組合物或其制劑適量，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內(nèi)酯A、B、C、K和白果內(nèi)酯對(duì)照品各1mg分別加甲醇1ml溶解，照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)，用微量點(diǎn)樣器分別取上述供試品和對(duì)照品溶液各10μL點(diǎn)樣于同一塊含4％醋酸鈉的0.5％CMC-Na溶液制成的硅膠GF254薄板上，以石油醚-丙酮-甲醇(10∶2.5∶0.3)為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)后，取出，吹干，于160℃加熱30分鐘，置紫外燈365nm下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)。
本發(fā)明所述藥物組合物口服制劑當(dāng)中所含銀杏酸的檢查方法照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000版一部附錄VI D)檢查，供試品溶液峰面積不得大于對(duì)照品溶液峰面積。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸(83∶17∶0.5)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)243nm。理論塔板數(shù)按銀杏酸計(jì)應(yīng)不低于7000，銀杏酸與其它成分的分離度應(yīng)符合要求。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取銀杏酸對(duì)照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，精密量取該溶液5.0ml，定量轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，混勻，作為對(duì)照溶液，濃度為25μg/ml.
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小時(shí)，回收溶媒，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?mL，該溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。
測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
本發(fā)明所述藥物組合物口服制劑當(dāng)中所含銀杏酸含量不得高于0.0004％。
本發(fā)明藥物組合物注射劑的制備工藝是制備工藝1取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高壓滅菌30min，取出后于10000級(jí)配料室加熱至80℃，加入研細(xì)過(guò)80目篩的本發(fā)明藥物組合物5.0～6.0g，加熱至溶解，冷卻至室溫后用10％的檸檬酸水溶液調(diào)pH至8.0，溶解后加注射用NaCl 8.0g，加注射用水調(diào)至總量1000ml，于100級(jí)無(wú)菌車(chē)間用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，熔封，質(zhì)檢，印字，包裝?；蛘呒尤肫咸烟恰⒏事洞?、氯化鈉等其中之一作為支架劑，支架劑的量相當(dāng)于藥物組合的1～4倍，分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑，質(zhì)檢，印字，包裝。
制備工藝2取本發(fā)明所述藥物組合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml、pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液350ml，充分混勻，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量1000ml，于100級(jí)無(wú)菌車(chē)間用無(wú)菌濾板下襯0.22 m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，熔封，質(zhì)檢，印字，包裝。或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化鈉等其中之一作為支架劑，支架劑的量相當(dāng)于藥物組合的1～4倍，溶解后一起分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；制備工藝3取本發(fā)明所述藥物組合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量1000ml，于100級(jí)無(wú)菌車(chē)間用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，熔封，質(zhì)檢，印字，包裝。或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化鈉等其中之一作為支架劑，支架劑的量相當(dāng)于藥物組合的1～4倍，溶解后一起分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；制備工藝4取本發(fā)明所述組合物，加入2％～10％乙醇溶液溶解，加2％~10％乙醇溶液調(diào)至總量，微孔濾膜過(guò)濾，分裝，即得。優(yōu)選方案是取本發(fā)明所述組合物5.0～6.0g，加入用注射用水配制的3.5％乙醇溶液溶解，加3.5％乙醇溶液調(diào)至總量1000ml，用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝10ml安瓿，即得。
上述四種制備工藝經(jīng)穩(wěn)定性考察，均符合制劑要求。該注射劑的含量測(cè)定方法及鑒別方法如下1、薄層鑒別供試品的制備取本發(fā)明所述藥物組合物粉針劑，加蒸餾水溶解，取1ml或直接取注射液1ml以6mol/L鹽酸溶液0.2ml酸化，待結(jié)晶析出，放置30分鐘，離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，棄去上清液，沉淀以少量水洗至中性后加1ml丙酮溶解即得。
對(duì)照品溶液的制備取銀杏內(nèi)酯A、B、C、K對(duì)照品適量，加丙酮溶解，制成每1mL分別含1mg、1mg、1mg、0.01mg，即得。
測(cè)定法照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)，用微量點(diǎn)樣器分別取上述供試品和對(duì)照品溶液各10μL點(diǎn)樣于同一塊含4％醋酸鈉，用0.5％CMC-Na溶液制成的硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)-丙酮-甲醇(10∶2.5∶0.3)為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)，取出，吹干，于160℃加熱30分鐘，置紫外燈365nm下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)。
2、取本發(fā)明所述藥物組合物制備的溶液1滴滴于濾紙上吹干后噴灑10％三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置365nm紫外燈下觀(guān)察，呈黃色熒光。
本發(fā)明注射劑當(dāng)中銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮的含量測(cè)定方法如下1、銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以異丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。理論塔板數(shù)按銀杏內(nèi)酯B計(jì)應(yīng)不低于7000，各峰之間的分離度應(yīng)符合藥典要求。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的銀杏內(nèi)酯A、B、K對(duì)照品適量，分別以50％丙酮溶解，制成每1mL含0.5mg、0.5mg、0.1mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備精密量取本品5ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的鹽酸溶液1ml，室溫放置3.5小時(shí)，以丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘，經(jīng)微孔濾膜(孔徑0.45μm)濾過(guò)，即得。該供試溶液應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)測(cè)定。
測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照溶液各20μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
銀杏內(nèi)酯的含量測(cè)定還可以按下法進(jìn)行測(cè)定銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)還可以是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇-水-四氫呋喃＝70∶25∶10；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù)漂移管溫度105攝氏度，載氣為氮?dú)?，載氣流速3.10升/min；理論踏板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰計(jì)，應(yīng)不低于3500。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的銀杏內(nèi)酯A、B、K、白果內(nèi)酯適量，分別加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備精密量去本品0.5ml于5ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，即得。
測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照溶液各20μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
經(jīng)上述方法測(cè)定的注射劑當(dāng)中銀杏內(nèi)酯含量應(yīng)當(dāng)復(fù)合下述要求組合物G1制劑的中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于4.3mg/ml；組合物G2制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于4.0mg/ml；組合物G3制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于3.2mg/ml；組合物G4制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于2.6mg/ml。
2、銀杏黃酮的含量測(cè)定用高效液相色譜法測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm；理論塔板數(shù)以斛皮素峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg異鼠李素對(duì)照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得儲(chǔ)備液。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液用甲醇或流動(dòng)相稀釋配成濃度分別為斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，異鼠李素1μg/ml，的對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備精密吸取本品5ml于錐形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％鹽酸緩慢加熱至回流，回流1小時(shí)，冷卻。溶液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。
按照上述方法測(cè)定的注射劑當(dāng)中銀杏黃酮的含量應(yīng)當(dāng)復(fù)合以下要求組合物G1制劑中含黃酮甙的總量不低于0.0625mg/ml；組合物G2制劑中含黃酮甙的總量不低于0.14mg/ml；組合物G3制劑中含黃酮甙的總量不低于0.35mg/ml；組合物G4制劑中含黃酮甙的總量不低于0.53mg/ml。
實(shí)驗(yàn)例1銀杏葉提取物口服藥效學(xué)研究1本發(fā)明銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮組合物(以下稱(chēng)銀杏葉提取物)口服對(duì)小鼠耐缺氧能力的影響取小鼠60只，體重為18-22g，隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。分別為銀杏葉提取物的組合物G1、G2、G3、G4、35.0mg/kg；尼莫地平組(2.0mg/kg)及模型對(duì)照組(給以等量的0.5％CMC-Na)。于實(shí)驗(yàn)前六天，每天灌胃給藥一次，以不同濃度等容積給藥0.2ml/10g體重。第七天最后一次給藥后一小時(shí)，將小鼠置于裝有25g鈉石灰的150ml密閉廣口瓶中，以秒表觀(guān)察記錄小鼠的呼吸停止時(shí)間。
表1結(jié)果表明銀杏葉提取物ig可顯著延長(zhǎng)小鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間(P＞0.01)，與尼莫地平相比無(wú)顯著性差異。
表1銀杏葉提取物ig對(duì)小鼠耐缺氧能力的影響(n＝10，x±s)

**p＜0.05，***p＜0.012.銀杏葉提取物ig對(duì)小鼠急性不完全性腦缺血的保護(hù)作用取小鼠70只，體重為18-22g，隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。分別為銀杏葉提取物組合物G1、G2、G3、G4 35mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照尼莫地平組2mg/kg，假手術(shù)組及缺血模型對(duì)照組(均給以等量CMC-Na)。于實(shí)驗(yàn)前六天，每天給藥一次，以不同濃度等容積給藥(0.2ml/10g體重)。第七天最后一次給藥后，小鼠用乙醚麻醉，切開(kāi)頸部正中皮膚，鈍性分離肌層，暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，用眼科鑷把頸總動(dòng)脈和動(dòng)脈鞘內(nèi)的其他組織分開(kāi)。給藥后1小時(shí)后，在分離出的兩側(cè)頸總動(dòng)脈下穿線(xiàn)并結(jié)扎(合并迷走神經(jīng)結(jié)扎)。觀(guān)察結(jié)扎后1小時(shí)內(nèi)小鼠的存活數(shù)。
結(jié)果如表2所示，銀杏葉提取物ig能夠劑量依賴(lài)性的增加急性不完全性腦缺血小鼠的存活數(shù)。與模型對(duì)照組相比，銀杏葉提取物ig 35.0有明顯的差異(P＜0.05和P＜0.01＝。與尼莫地平組相比無(wú)顯著性。
表2銀杏葉提取物對(duì)抗小鼠急性不完全性腦缺血的作用(n＝10)

**p＜0.05，***p＜0.01試驗(yàn)表明，上述四種銀杏葉提取物均具有提高小鼠抗缺氧能力。抗小鼠急性不完全性腦缺血的作用，提高其成活率。揭示四種銀杏葉提取物可用于缺血性中風(fēng)的治療。
實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明藥物組合物制備的注射劑(本發(fā)明稱(chēng)為銀杏葉提取物注射劑)的藥效學(xué)研究。
根據(jù)中藥新藥研究指南，研究銀杏葉提取物注射劑治療缺血性腦損傷的藥效學(xué)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
一、受試藥物1.名稱(chēng)銀杏葉提取物注射劑(由本發(fā)明藥物組合物制備)規(guī)格50mg/10ml/支(5mg/ml)。G1中銀杏內(nèi)酯含量為4.39mg/ml，含黃酮甙的總量0.064mg/ml；G2中銀杏內(nèi)酯含量為4.11mg/ml，含黃酮甙的總量0.146mg/ml；G3中銀杏內(nèi)酯含量為3.31mg/ml，含黃酮甙的總量為0.359mg/ml；G4中銀杏內(nèi)酯含量為2.64mg/ml，含黃酮甙的總量為0.538mg/ml。
配制方法靜脈注射將該藥用提供的溶媒稀釋到所需濃度，大鼠實(shí)驗(yàn)的藥物濃度為0.25％，靜脈給藥0.6ml/100g。
2.名稱(chēng)銀杏葉提取物注射劑溶媒批號(hào)000409規(guī)格10ml/支
3名稱(chēng)尼膜同注射液(尼莫地平注射液)，德國(guó)拜爾出品，批號(hào)CATEZ1規(guī)格50ml10mg4.名稱(chēng)金納多注射液，德國(guó)舒培大藥廠(chǎng)出品，批號(hào)6580199，規(guī)格17.5mg銀杏提取物/5ml/支二、動(dòng)物SD大白鼠，體重為300-400g，雌雄各半。由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)室提供，合格證號(hào)蘇動(dòng)質(zhì)97004三、試驗(yàn)方法和結(jié)果(一)銀杏葉提取物注射劑iv對(duì)動(dòng)物腦缺血的保護(hù)作用1、銀杏葉提取物注射劑iv對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性局灶性腦缺血的保護(hù)作用1.1銀杏葉提取物注射劑iv對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦功能、梗塞率和腦含水量的影響取雄性SD大鼠90只，體重300-400g，按體重隨機(jī)分為9組，分別為銀杏葉提取物注射劑G1、G2、G3、G4 15.0mg/kg，，溶媒對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照尼膜同注射液組0.2mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照金納多注射液組1.0ml/kg，假手術(shù)組及缺血模型對(duì)照組(均給以等量生理鹽水0.6ml/100g)。于實(shí)驗(yàn)前四天，每天尾靜脈注射給藥一次，第四天最后一次于缺血前30分鐘給藥。參考Longa等人的方法，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。大鼠用10％水合三氯乙醛(300mg/kg)ip麻醉，仰臥恒溫手術(shù)臺(tái)上頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，向外牽引二腹肌及胸鎖乳突肌，由頸總動(dòng)脈分叉處向頭端依次游離，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈的分支枕骨下動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，切斷頸外動(dòng)脈使其主干游離備用，然后分離頸內(nèi)動(dòng)脈，用絲線(xiàn)在頸外動(dòng)脈根部打一松扣，夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。將尼龍線(xiàn)(長(zhǎng)4cm，直徑0.26mm)經(jīng)頸外動(dòng)脈主干切口，緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)20mm左右時(shí)感到阻力，即達(dá)到了較細(xì)的大腦前動(dòng)脈內(nèi)，阻斷了MCA的所有血供來(lái)源，扎緊頸外動(dòng)脈根部松扣。一小時(shí)后，拔出尼龍線(xiàn)，扎緊動(dòng)脈殘端?？p合皮膚，完成MCAO導(dǎo)致局灶性腦缺血-再灌模型。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉，不閉塞MCA。
術(shù)后24h按Bederson的方法對(duì)動(dòng)物的行為缺陷進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)未觀(guān)察到神經(jīng)癥狀；1級(jí)提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的手術(shù)對(duì)側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，肘外展，緊貼胸壁；2級(jí)將動(dòng)物置于光滑平面上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)，阻力降低；3級(jí)動(dòng)物自由行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)環(huán)轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈；4級(jí)；軟癱，肢體無(wú)自發(fā)活動(dòng)。
MCAO 24h后，斷頭處死大鼠，取出全腦，左右腦分別切開(kāi)，稱(chēng)重。在右腦視交叉及其前后各2mm處，做冠狀切，腦切片于1％TTC溶液中避光37℃孵育25分鐘，用眼科鑷分離蒼白區(qū)(梗塞區(qū))和非蒼白區(qū)(正常區(qū))，計(jì)算梗塞百分比如下梗塞百分比(％)＝蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)×100％將染色后的腦組織置于110℃烘箱烘干，對(duì)照大腦濕重求出腦含水量如下腦組織含水量(％)＝(1-腦組織干重/腦組織濕重)×100％由表3可知，銀杏葉提取物注射劑15.0mg/kg iv能使MCAO大鼠的腦卒中評(píng)分降低(P＜0.01)，MCAO梗塞范圍縮小(P＜0.01)，腦組織含水量減少(P＜0.01)，其高、中劑量作用強(qiáng)度與金納多比較無(wú)明顯差異。
表3銀杏葉提取物注射劑iv對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為、腦梗塞率和腦含水量的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg) 神經(jīng)行為評(píng)分腦梗塞率(％) 腦含水量(％)假手術(shù)組 -0.2±0.4077.7±0.6模型對(duì)照 -3.2±0.821.0±2.381.0±1.7溶媒對(duì)照 -3.0±0.8*△△△◇◇◇20.7±2.0*△△△◇◇◇81.1±1.4*△△◇◇◇G1 2.2±0.8**△◇◇17.1±2.5***△◇◇◇79.9±1.6**△◇◇◇G215.0 2.1±0.7**△◇◇16.4±2.4***△◇◇◇79.2±1.2**△◇◇◇G3 2.3±0.5**△◇◇17.4±2.3**△◇◇◇80.1±1.1**△◇◇◇G4 2.2±0.8**△◇◇17.2±2.3***△◇◇◇80.2±1.8**△◇◇◇金納多組 1.0ml/kg 1.9±0.7**◇◇◇15.6±3.0***◇◇◇78.0±2.1**◇尼膜同組 0.2 1.9±0.7**◇◇◇16.9±1.9***◇◇◇78.4±1.3**◇
*p＞0.05， **p＜0.05， ***p＜0.01vs模型對(duì)照△p＞0.05，△△p＜0.05，△△△p＜0.01 vs金納多組◇p＞0.05，◇◇p＜0.05，◇◇◇p＜0.01 vs假手術(shù)組上述實(shí)驗(yàn)表明G1，G2，G3，G4均具有改善大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)行為、腦梗塞率和腦含水量的作用，其中以G2效果較佳。
實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明藥物組合物G2制備的注射液(本發(fā)明稱(chēng)為銀杏酮酯腦心康)對(duì)犬腦循環(huán)及后肢循環(huán)的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 觀(guān)察銀杏酮酯(腦心康)注射液靜脈注射給藥后，對(duì)麻醉家犬腦血流量、腦血管阻力、平均動(dòng)脈壓、心率、后肢血流量等的影響。
實(shí)驗(yàn)材料1 銀杏酮酯(腦心康)注射液銀杏酮酯5mg/ml，10ml/支，批號(hào)990728，中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院提供；2 家犬家養(yǎng)雜種，健康，體重7～12kg，♀♂兼有(雌性未孕)，本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；3 RM-6000型多道生理記錄儀日本光電公司產(chǎn)品；4 MFV-3200型電磁血流量計(jì)日本光電公司產(chǎn)品；5 0.9％氯化鈉注射液100ml/瓶，批號(hào)990212，南京小營(yíng)制藥廠(chǎng)生產(chǎn)；6 葛根素注射液規(guī)格100mg/2ml，批號(hào)981204，浙江康恩貝集團(tuán)制藥有限公司生產(chǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法將動(dòng)物隨機(jī)分為四組，每組6只，♀♂兼有，各組的平均體重為空白對(duì)照組8.1+1.7kg；陽(yáng)性藥組8.4+1.4kg；大劑量組9.0+1.0kg；小劑量組8.7+1.1kg。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將生理記錄儀、電磁血流量計(jì)及合適的探頭、放大器等連接好，開(kāi)機(jī)預(yù)熱，調(diào)平衡；實(shí)驗(yàn)室溫度控制在25～28℃，相對(duì)濕度40-60％。
家犬稱(chēng)重后，以3.5％的戊巴比妥鈉1ml/kg靜脈注射麻醉后，將動(dòng)物仰臥位固定于犬手術(shù)臺(tái)上。頸部、腹股溝處剪毛，以碘酊和75％酒精消毒剪毛區(qū)。分離出下肢左側(cè)股動(dòng)、靜脈，股動(dòng)脈插管并以肝素生理鹽水液導(dǎo)與TP-400T型壓力換能器習(xí)；目連，由RM-6000型多導(dǎo)生理記錄儀記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)；股靜脈插管以生理鹽水(NS)靜脈滴注，滴速約30d/min。頸部正中線(xiàn)切口，分離出氣管，進(jìn)行氣管插管，并連接動(dòng)物人工呼吸機(jī)，維持通氣。分離出頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈，沿頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端分離出頸外動(dòng)脈并結(jié)扎。分別在頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈上固定適宜口徑的電磁血流量計(jì)探頭，由MFV-3200型電磁血流量計(jì)記錄頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈的血流量。以止血鉗關(guān)閉手術(shù)區(qū)皮膚，并以沾滿(mǎn)NS的濕紗布蓋住傷口。在動(dòng)物四肢皮下插入針狀電極，描記標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖，記錄心率。分離出右側(cè)股動(dòng)脈并固定合適口徑的電磁血流量計(jì)探頭，測(cè)定股動(dòng)脈的血流量。
動(dòng)物手術(shù)后穩(wěn)定約20min，待頸內(nèi)動(dòng)脈、椎動(dòng)脈及股動(dòng)脈血流量、血壓、心率等指標(biāo)穩(wěn)定后，記錄上述指標(biāo)，5min后復(fù)測(cè)一次，取平均值作為給藥前的對(duì)照值。然后由左側(cè)股靜脈按組分別給藥，空白對(duì)照組靜脈滴注0.9％氯化鈉注射液100ml/只，10min左右滴完。陽(yáng)性對(duì)照藥用葛根素注射液，劑量為10mg/kg；銀杏酮酯(腦心康)注射液大劑量組的劑量為重mg/kg，小劑量組的劑量為0.5mg/kg。陽(yáng)性藥及銀杏酮酯(腦心康)注射液均將藥液混入100ml的0.9％氯化鈉注射液中由股靜脈快速靜脈滴注給藥，10min左右滴完。給藥后5、10、20、30、60、120min復(fù)測(cè)上述各指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，取全腦稱(chēng)重，其1/2作為一側(cè)腦重。依下列公式計(jì)算腦血流量和腦血管阻力腦血流量(ml/100g·min)＝(頸內(nèi)動(dòng)脈血流量+椎動(dòng)脈血流量)(ml/min)×100(g)/-側(cè)腦重(g)腦血管阻力(kPa·100g·min/ml)＝血壓(kPa)/腦血流量(ml/100g·min)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行給藥前后配對(duì)t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表4，表5)表4可見(jiàn)，麻醉犬靜脈注射0.9％NaCl注射液后，腦血流量呈下降趨勢(shì)，腦血管阻力有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＞0.05)。靜脈注射銀杏酮酯(腦心康)注射液后，腦血流量明顯地增加(P＜0.05～0.001)，腦血管阻力明顯下降(P＜0.05～0.001)，藥效作用維持1h以上，給藥2h后基本恢復(fù)到正常水平(P＞0.05)。陽(yáng)性藥(葛根素注射液)也有同樣的作用，但維持1h后基本恢復(fù)到正常水平。各組動(dòng)物的血壓和心率則未見(jiàn)顯著性改變。表明銀杏酮酯(腦心康)注射液可以明顯增加麻醉犬腦部的供血，減少腦血管阻力。
由表5可見(jiàn)，銀杏酮酯(腦心康)注射液靜脈注射給藥后，麻醉犬的股動(dòng)脈血流量有短時(shí)間的明顯升高，其中大、小劑量組給藥后5～30min均有明顯的增加(P＜0.05～0.001)，60min時(shí)也有增加趨勢(shì)(但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05)，其后恢復(fù)接近正常。而葛根素注射液給藥后，犬的股動(dòng)脈血流量在5～30min內(nèi)呈增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，60min后，有下降的趨勢(shì)?？瞻讓?duì)照組犬的股動(dòng)脈誘因流量未見(jiàn)明顯的改變(P＞0.05)。
表4 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)麻醉犬腦循環(huán)的影響(x±s，n＝6)組別 時(shí)間 腦血流量 腦血管阻力(×10-2) 血壓心率(min)(ml/100g·min)(kPa 100g·min/ml)(kPa) (beats/min)給藥前 334.0±103.2 5.16±1.3716.12±2.20 187.2±24.2空 5346.2±106.0 4.99±1.3816.12±2.28 191.0±24.0白 10 332.5±99.2 5.07±1.4915.93±2.28 92.2±24.2對(duì) 20 318.0±105.4 5.44±1.5516.02±2.44 193.5±24.0照 30 307.2±117.7 5.70±1.8315.93±2.41 192.2±23.2組 60 301.1±121.4 5.68±1.7915.43±2.38 192.8±25.6120 288.4±121.8 5.95±1.8815.56±2.66 192.8±25.6給藥前 329.4±91.6 5.29±1.6716.25±1.34 167.0±27.0陽(yáng) 5517.0±182.2**3.45±1.16** 16.27±1.18 164.5±25.7性 10 505.3±165.6**3.54±1.14** 16.45±1.22 164.8±26.9對(duì) 20 442.0±110.9*** 3.93±0.93** 16.55±1.27 164.7±25.5照 30 420.8±85.1***4.03±0.88* 16.236±1.22163.5±25.1組 60 369.0±75.6* 4.62±1.1416.35±1.25 159.7±26.2120 302.8±86.6 5.87±2.0016.42±1.54 159.5±31.0大 給藥前 311.3±118.6 5.17±1.3714.95±3.07 183.5±21.2劑 5446.9±210.8* 3.83±1.24* 15.07±2.97 181.5±21.0量 10 443.4±188.0* 3.76±1.15** 15.08±3.01 182.3±16.0
組 20 417.1±159.5**3.86±1.14** 14.91±3.01185.0±18.930 409.2±145.1**4.02±1.32***15.14±2.64186.2±22.860 370.2±112.2 4.33±1.36* 15.01±3.07183.2±19.5120 299.1±99.7 5.36±1.37 15.13±2.87191.8±21.8給藥前 300.3±94.3 5.75±1.51 16.17±1.53196.8±29.5小 5 488.2±102.8**3.39±1.00** 15.84±1.84188.7±28.6劑 10 481.0±126.5**3.56±1.29** 15.96±1.73190.8±30.7量 20 437.1±124.5**3.97±1.63** 15.92±1.82190.8±31.7組 30 405.3±117.4**4.18±1.69* 15.56±1.73190.3±31.360 384.2±102.9* 4.35±1.29* 15.72±1.39189.3±33.1120 310.8±92.6 5.64±2.26 15.93±1.14183.5±25.7注與給藥前的凈增減值比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表5 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)股動(dòng)脈血流量的影響(x±s ml/min，n＝6)時(shí)間空白對(duì)照組陽(yáng)性藥組 大劑量組小劑量組(min)給藥前 36.3±9.9 37.3±19.045.2±14.3 34.0±13.55 37.0±9.8 62.3±44.569.8±20.3* 66.7±23.0**10 36.0±11.360.8±41.868.0±15.5**60.0±16.920 33.5±11.750.3±29.363.3±10.9* 54.7±13.8***30 32.5±11.747.2±29.561.8±10.9* 52.0±17.3**60 32.3±12.236.8±20.056.7±14.8 47.3±23.6120 35.0±13.527.8±13.850.3±21.8 39.2±22.3注與給藥前的凈增減值比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
實(shí)驗(yàn)例4血小板聚集性及血液流變性試驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^(guān)察銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)血瘀模型家兔的血小板聚集性和血液流變性的影響。
實(shí)驗(yàn)材料1動(dòng)物新西蘭白兔，♀♂各半，體重2.2～2.5kg，購(gòu)于省農(nóng)科院種畜場(chǎng)，合格證號(hào)蘇動(dòng)(質(zhì))9812002銀杏酮酯(腦心康)注射液含銀杏酮酯5mg/ml，中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院提供，批號(hào)990715；3葛根素注射液含葛根素0.1g/2ml，批號(hào)981204，浙江康恩貝集團(tuán)制藥有限公司生產(chǎn)4高分子右旋糖酐平均分子量236000，上海長(zhǎng)征制藥廠(chǎng)，以注射用生理鹽水加熱配成10％。
5血小板聚集儀，LBY-NJ2型，北京普利生公司產(chǎn)6旋轉(zhuǎn)式錐板粘度儀，LBY-N6A+型，北京普利生公司產(chǎn)。
7血小板活化因子(PAF)1mg/支，批號(hào)99H7001，美國(guó)SIGMA公司生產(chǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果家兔36只，隨機(jī)分為6組，每組6只，♀♂各半，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組及銀杏酮酯(腦心康)注射液大、中、小劑量組。各組動(dòng)物先耳緣靜脈注射(iv)給藥。空白及模型對(duì)照組注射生理鹽水(NS)1ml/ks，陽(yáng)性藥組iV葛根素注射液30mg/kg(以NS配成30mg/ml)，銀杏酮酯(腦心康)注射液大、中、小劑量組分別注射含銀杏內(nèi)酯1、0.5、0.25mg/ml的藥液(以NS配成)，給藥量2ml/kg，連續(xù)給藥兩周(14天)，于給藥的第12、13天，除空白對(duì)照組外，各兔分別注射10％高分子右旋糖酐5ml/Kg，每日兩次，造成“血瘀”模型。末次給藥1h后，再次注射10％高分子右旋糖酐5ml/Kg，15min后，心臟采取空腹血6ml，2ml置于含109mmol/L枸櫞酸鈉(9∶1)的試管供測(cè)定血小板聚集率(用LBY-NJ2型血小板聚集儀，采用比濁法，以900umol/L的PAF作誘導(dǎo)劑)，4ml置肝素抗凝管供測(cè)定全血粘度(用LBY-N6A+旋轉(zhuǎn)式錐板粘度儀，切變率為8、10、20、40、60、80、100、120s-1)、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積、血沉、纖維蛋白原等指標(biāo)，并計(jì)算出全血還原粘度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞聚間t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果如下(見(jiàn)表6～11)。
表6 銀杏酮酯(腦心康)對(duì)家兔血小板聚集和纖維蛋白原的影響(x±s，n＝6)組別 劑量 體重 血小板聚集率 纖維蛋白原(mg/kg)(kg) (％) (g/L)空白組/ 2.32±0.15 15.56±2.48**2.53±1.16模型組/ 2.47±0.08 39.27±15.07 2.73±1.42陽(yáng)性藥組 30 2.37±0.12 12.74±3.47**3.12±1.932 2.42±0.12 12.97±3.29**2.86±2.15腦心康組 1 2.42±0.13 13.28±3.16**2.40±1.870.52.33±0.15 13.86±2.38**2.60±0.94注與模型組比較**P＜0.01。
表7 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)家兔全血粘度的影響(mPa.s，x±s，n＝6)組別 劑量 切變率(l/s)mg/kg8 102040空白組/5.45±1.02** 5.09±0.86** 4.17±0.63** 3.54±0.47**模型組/14.05±4.83 12.42±4.21 8.84±3.066.95±2.42陽(yáng)性藥組 30 7.61±1.53* 7.14±1.59* 5.54±0.89* 4.33±0.32*27.28±2.22* 6.84±2.03* 5.41±1.47* 4.42±1.07*腦心康組 110.27±4.94 9.33±4.447.80±4.515.54±1.870.5 8.21±2.42* 7.63±2.186.26±1.754.68±1.17注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表8 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)家兔全血粘度的影響(mpa.s，x±s，n＝6)組別 劑量 切變率(l/s)mg/kg6080 100 120空白組/3.30±0.43** 3.23±0.45* 3.00±0.32* 2.83±0.31*模型組/5.93±1.875.38±1.79 5.11±1.69 4.92±1.72陽(yáng)性藥組 30 3.89±0.27* 3.62±0.28* 3.46±0.26* 3.28±0.25*24.01±0.92* 3.78±0.83 3.62±0.80 3.45±0.79腦心康組 14.85±1.274.46±1.06 4.22±0.93 3.97±0.850.5 4.24±1.003.95±0.90 3.77±0.86 3.57±0.84
注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表9 銀杏酮酯(腦心康)對(duì)家兔血漿粘度、紅細(xì)胞壓積及血沉等的影響(x±s，n＝6)組別 劑量血漿粘度 紅細(xì)胞壓積血沉 血沉方程K值mg/kg mPa.s ％mm/h空白組/ 1.12±0.08*** 44.47±3.93 3.22±3.12*** 12.39±12.00***模型組/ 1.61±0.16 44.42±8.36 31.92±8.69126.55±35.78陽(yáng)性藥組 30 1.51±0.26 42.00±11.69 33.72±16.16 110.97±30.722 1.81±0.46 43.17±6.98 24.03±6.9791.86±40.64腦心康組 1 1.53±0.26 44.00±5.42 25.25±12.69 103.58±65.430.5 1.61±0.16 41.38±6.19 22.10±15.89 65.21±40.48*表10 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)家兔全血還原粘度的影響(x±s，n＝6)組別 劑量低切 中切 高切mg/kg 切變率8s-1切變率40s-1切變率120s-1空白組/ 9.67±1.54** 5.43±0.63* 3.83±0.41*模型組/ 28.16±11.67 12.00±5.52 7.23±2.84陽(yáng)性藥組 30 15.37±5.51* 6.77±1.25* 4.31±0.992 12.81±4.52* 6.08±2.20* 3.79±1.77*腦心康組 1 19.47±9.199.02±3.505.61±2.110.5 16.08±5.617.55±2.664.81±1.79表11 銀杏酮酯(腦心康)對(duì)家兔紅細(xì)胞聚集性的影響(x±s，n＝6)劑量組別 聚集指數(shù) 剛性指數(shù)變形指數(shù)電泳指數(shù)mg/kg空白組 / 1.92±0.22** 3.44±0.42 0.70±0.05 4.33±0.46*模型組 / 2.90±0.70 4.62±2.15 0.78±0.16 6.76±2.14陽(yáng)性藥組 302.34±0.55 2.95±0.88 0.65±0.15 5.96±2.2422 2.08±0.22*2.28±1.25* 0.53±0.20* 4.94±0.9611 2.50±0.83 3.79±1.62 0.72±0.19 5.62±1.270.5 0.5 2.28±0.21 2.94±0.81 0.66±0.12 5.57±0.60
結(jié)果表明銀杏酮酯(腦心康)注射液能明顯改善血瘀模型家兔的血液流變性，以大、中、小三個(gè)劑量組血小板聚集性下降最為明顯(P＜0.01)。大劑量組的全血粘度(切變率8、10、20、40、60s-1)和全血還原粘度(高、中、低切)明顯下降(P＜0.05)，小劑量組的全血粘度在切變率8、10s-1時(shí)亦明顯下降(P＜0.05)，全血還原粘度(低切)和血沉方程K值也明顯下降(P＜0.05)。大劑量組的紅細(xì)胞聚集、剛性、變形指數(shù)等也明顯下降。
實(shí)驗(yàn)例5銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)大白鼠離體心臟灌流的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 觀(guān)察銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)大白鼠離體心臟灌流的作用。
實(shí)驗(yàn)材料1銀杏酮酯(腦心康)注射液2ml/支，含銀杏酮酯5mg/ml，批號(hào)9907028，中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院提供。
2銀杏酮酯(腦心康)注射液溶媒含丙二醇45％。聚乙二醇40020％.pH6.83 0.05mol/L 35％，中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院提供；3葛根素注射液2ml100mg，批號(hào)981204，康恩貝集團(tuán)制藥有限公司制造；4垂體后葉素注射液1ml10u，批號(hào)981221，上海第一生化藥業(yè)公司上海生物化學(xué)制藥廠(chǎng)生產(chǎn)；5改良K-H液等所用試劑均為市售AR級(jí)；6儀器改良的Langendorff離體心臟灌流裝置；DC-001型離體器官測(cè)定儀，南京分析儀器廠(chǎng)；501型超級(jí)恒溫水浴，中國(guó)重慶儀器設(shè)備廠(chǎng)；7動(dòng)物SD種健康大白鼠，兼有，體重250-350g，購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)蘇動(dòng)(質(zhì))第97028號(hào)。
實(shí)驗(yàn)方法1對(duì)正常大白鼠離體心臟灌流的影響將大白鼠隨機(jī)分為六組，每組8只，♀♂兼有，即(1)空白對(duì)照組(NS0.1ml)；(2)葛根素對(duì)照組(5mg)；(3)銀杏酮酯(腦心康)注射液大劑量組(0.6mg)；(4)銀杏酮酯(腦心康)注射液中劑量組(0.3mg)；(5)銀杏酮酯(腦心康)注射液小劑量組(0.15mg)；(6)銀杏酮酯(腦心康)注射液溶媒對(duì)照組(0.1ml)。采用改良的Langendorff大白鼠心臟灌流裝置進(jìn)行離體心臟灌流試驗(yàn)。離體心臟固定在灌流裝置上后，即用37℃的K-H液灌流20～30分鐘，記錄心率(HR)、冠脈流量(CBF)及收縮幅度(AC)等指標(biāo)，作為給藥前對(duì)照，用微量注射器在灌流管下端緩慢注射藥液0.1ml，空白組注入NS 0.1ml，1分鐘內(nèi)給完，記錄給藥后的3、6、9、12、15、18、30min的上述各項(xiàng)指標(biāo)。
結(jié)果顯示①銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)正常大白鼠離體心臟心率(HR)的作用給藥后銀杏酮酯(腦心康)注射液各組與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大劑量組給藥后3min與給藥前自身比較有降低(P＜0.05)陽(yáng)性藥葛根素組心率給藥后與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與給藥前比較略有增加；溶媒組與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表12)。②對(duì)冠脈流量(CBF)的作用銀杏酮酯(腦心康)注射液各組與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與給藥前比較大劑量組及小劑量組18、30min明顯下降(P＜0.05～0.001)；葛根素組與空白組比較藥后冠脈流量有所增加但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，給藥后9、18min與給藥前自身比較明顯增高(P＜0.05)；溶媒組與空白組組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與給藥前比較15、30min時(shí)明顯下降(P＜0.05)(表13)o③對(duì)收縮幅度(AC)的作用給藥后銀杏酮酯(腦心康)注射液各組與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，大劑量組3min與給藥前比較明顯增大(P＜0.05)；葛根素組、溶媒組給藥后與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，給藥前后自身比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表14)。
2對(duì)垂體后葉素所致大白鼠心肌缺血模型離體心臟的影響將大白鼠隨機(jī)分為六組，每組8只，♀♂兼有，即(1)空白對(duì)照組(NS0.1ml)(2)垂體后葉素(0.1ml)造模組；(3)葛根素+垂體后葉素組(5mg/0.1ml)；(4)銀杏酮酯(腦心康)注射液大劑量+垂體后葉素組(0.6mg/0.1ml)；(5)銀杏酮酯(腦心康)注射液中劑量+垂體后葉素組(0.3mg/0.1ml)；(6)銀杏酮酯(腦心康)注射液小劑量+垂體后葉素組(0.15mg/0.1ml)。方法同前。改良K-H液灌流20分鐘，待各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定后用微量注射器向灌流液中注入藥液，同時(shí)注入垂體后葉素(1個(gè)單位)，1分鐘內(nèi)給完，造成心肌缺血模型，記錄給藥后3、6、9、12、15、18、30min各項(xiàng)指標(biāo)。模型組以NS 0.1ml代替藥液。
結(jié)果顯示垂體后葉素可使離體心臟的心率減慢，3min明顯降低(P＜0.01)，同時(shí)自身前后比較3、6min時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)改變(P＜0.05～0.01)；冠脈流量明顯減少，組間比較與自身前后比較均有下降(P＜0.05～0.001)；心收縮幅度略有增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。①對(duì)心肌缺血模型心率的作用銀杏酮酯(腦心康)注射液+垂體后葉素各組給藥后心率均有增加，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，大、中、小三個(gè)劑量組3min與給藥前自身比較明顯減慢(P＜0.05～0.001)；葛根素+垂體后葉素組給藥后與模型組比較心率增加，6min、9min時(shí)明顯增加(P＜0.05)，與給藥前自身比較3、6、9、12、15min明顯增加(P＜0.05～0.01)(表15)。②對(duì)心肌缺血模型冠脈流量的作用銀杏酮酯(腦心康)注射液+垂體后葉素各組的冠脈流量均有增加，其中大劑量+垂體后葉素組6、9、12、15、18min，中劑量+垂體后葉素組6min及小劑量組+垂體后葉素組6、12min與模型組比較有顯著差異(P＜0.05～0.01)，大劑量+垂體后葉素組3min，中劑量+垂體后葉素組3、6min及小劑量+垂體后葉素組3、6、30min與給藥前自身比較明顯減少(P＜0.05～0.001)；葛根素+垂體后葉素組給藥后與模型組比較可明顯增加冠脈流量(P＜0.05)，與給藥前自身比較3min明顯減少(P＜0.05)。③對(duì)心肌缺血模型心肌收縮幅度的作用銀杏酮酯(腦心康)注射液+垂體后葉素各組給藥后與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，大劑量+垂體后葉素3min。中劑量+垂體后葉素組3、12、15、18min，小劑量+垂體后葉素組3、6、18min與給藥前自身比較明顯增加(P＜0.05～0.01)，而中劑量+垂體后葉素給12、15、18min與給藥前自身比較明顯下降p＜0.05。
表12銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)大白鼠離體心臟心率的影響(x±s，n＝8)組別 藥前 藥后(凈增減值)bpm3 6 9 12 15 18 30空白組223.5±41.0 2.1±24.7-5.5±13.6 -5.0±17.6 -20.3±35.9 -7.5±14.2 -7.3±16.4 -9.6±16.5葛根素組 231.9±22.1 6.6±17.4-2.9±16.9 6.1±12.1 3.0±9.9 6.5±9.83.1±21.7 0.6±19.4大劑量組 211.8±26.8 -20.0#±21.1 -7.3±15.5 -5.8±11.6 -5.8±12.9 -8.8±13.4 -8.8±13.3 -10.8±17.8中劑量組 211.5±29.8 -6.8±20.4-7.5±24.2 -0.9±17.2 -0.5±18.5 -3.9±30.1 -4.0±32.1 -4.0±35.5小劑量組 224.6±34.2 -21.6±32.0 -5.9±19.3 1.9±25.1 1.4±25.00.9±18.0 -8.1±17.7 -9.6±23.8溶媒組205.4±24.0 -13.6±40.71.7±18.1 1.8±16.8 7.3±20.70.3±15.6 -0.7±21.1 -10.2±35.5
注與給藥前自身比較#P＜0.05表13 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)大白鼠離體心臟冠脈流量的影響(x±s，n＝8)組別 藥前 藥后(凈增減值)bpm3 6 9 12 15 18 30空白組 19.9±2.6 -0.3±1.2 0.5±1.1 -0.2±1.6 -0.2±3.9 0.4±4.30.6±3.4 0.4±3.8葛根素組 18.3±3.6 1.9±1.9 1.7±2.2 1.8#±1.8 0.8±1.5 1.4±1.81.6#±1.71.4±2.2大劑量組 17.6±3.2 -1.5±1.9 0±0.9 0±1.5-0.5±1.2 -0.9±1.6 -0.9#±0.9 -1.4#±1.3中劑量組 18.3±4.6 -1.2±5.3 0.6±2.3 0.4±2.3 0±2.2-0.2±2.86.0±2.6 0.4±3.3小劑量組 16.8±3.1 -2.3±4.1 -1.0±2.3 -1.0±1.3 -1.8±6.5 -1.3±4.2 -1.8##±1.3 -2.4###±0.9溶媒組 18.1±3.9 -0.7±2.7 -0.7±1.7 0±1.3-0.1±1.1 -0.8#±0.9 -0.6±1.5-1.1#±1.2注與給藥前自笛比較，#P＜0.05；##P＜0.01；###P＜0.001表14 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)大白鼠離體心臟心肌收縮心率的影響(x±s，n＝8)組別 藥前 藥 后 凈增減值mm3 6 9 12 15 18 30空白組16.8±4.0 1.1±2.90.3±2.10.8±2.5 0.8±2.9 1.6±2.1 1.9±2.6 1.9±2.4葛根素組 17.6±4.1-0.7±3.4 -1.6±10.0 -1.1±4.9 -0.8±6.1 0.1±5.1 -0.2±2.7 -0.3±3.1大劑量組 14.9±5.5 2.1#±2.2 1.1±2.20.6±1.6 1.5±3.3 1.3±2.9 1.9±3.9 2.4±4.6中劑量組 18.3±9.1 0.6±1.5 -0.6±2.70±2.6-0.8±2.5 -0.4±3.6 -0.8±3.3 -1.6±4.6小劑量組 14.0±8.3 3.3±5.10.8±2.0 -0.8±4.8 -1.0±4.7 -0.3±4.3 3.4±3.9 -0.9±3.3溶媒組19.5±5.5-2.2±3.6 -0.8±2.4 -0.2±3.4 -0.4±4.2 -1.0±2.9 1.2±3.5 1.7±4.8注與給藥前自身比較#p＜0.05表15 銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)缺血大白鼠離體心臟心率的影響(x±s，n＝8)組別 藥前 垂體后葉素+藥物 凈增減值 bmp3 69 12 15 18 30空白組 223.5±41.0 2.1？**±24.7 -5.5±13.6 -5.0±17.6 -20.3±35.9 -7.5±14.2 -7.3±16.4 -9.6±16.5垂體后葉素組 226.8±28.8 -53.6##±35.4 -22.6#±23.5 -13.4±26.7-0.1±17.5 -0.9±32.4 -8.4±14.6 -32.9±23.9葛根素+垂體后葉素 214.0±20.6 -36.54##±29.1 6.0±#*25.3 17.5#*±16.4 17.0#±16.3 9.8#±10.9 3.3±14.0 5.5±11.5大劑量組+垂體后葉素組 198.9±21.8 -75.4###±16.6 -7.6±22.12.1±118.42.6±17.10.6±17.3 1.9±16.6 2.6±10.3中劑量組+垂體后葉素組 217.5±31.6 -50.25#±49.7 -12.0±18.7 -1.3±12.0 7.0±17.08.5±19.9 10.8±18.9 6.8±13.9小劑量組+垂體后葉素組 225.1±27.2 -84.4##±48.4 -28.4±37.6 -0.6±33.3 4.6±33.30.9±37.1 1.4±33.8 -6.1±34.2
注與給藥前自身比較#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；與模型組比較，*p＜0.05；**p＜0.01小結(jié)1銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)正常大白鼠離體心臟的作用銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)正常大白鼠離體心臟的心率、冠脈流量、心肌收縮幅度與空白組比較無(wú)明顯作用。但大劑量組給藥后3min心率比藥前減慢(P＜0.05)，6min后心率恢復(fù)正常；大、小劑量組藥后18～30min冠脈流量比給藥前減少(P＜0.05～0.001)；大劑量組藥后3min心肌收縮幅度比藥前增加(P＜0.05)。
2銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)垂體后葉素造成心肌缺血模型的作用銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)垂體后葉素造成心肌缺血模型具有增加心率，增加冠脈流量等作用。銀杏酮酯(腦心康)注射液+垂體后葉素各劑組給藥6min后心率略有增加，與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；大、中、小三個(gè)劑量組給藥后3min與造模前比較心率減慢(P＜0.05～0.00 1)。銀杏酮酯(腦心康)注射液+垂體后葉素各劑組給藥后冠脈流明顯增加，與模型組比較大劑量組6、9、12、15、18min，中劑量組6min，小劑量組6、12min均有顯著差異(P＜0.05-0.001)；與造模前比較大劑量組3min、中劑量組3、6min、小劑量組3、6、30min冠脈流量明顯減少(P＜0.05～0.001)。銀杏酮酯(腦心康)注射液+垂體后葉素各劑組給藥后與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與造模前比較大劑量組3min、中劑量組3min、小劑量組3、6、18min心肌收縮幅度明顯增加(P＜0.05-0.01)，而十劑量組12、15、1groin則減少(P＜0.05)。
實(shí)驗(yàn)例6銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)小白鼠耳廓微循環(huán)的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 觀(guān)察銀杏酮酯(腦心康)注射液對(duì)小白鼠耳廓微循環(huán)的作用。
實(shí)驗(yàn)材料銀杏酮酯(腦心康)注射液2ml/支，含銀杏酮酯5mg/ml，批號(hào)9907028，中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院提供；丹參注射液2ml3g，批號(hào)980703，上海中西藥業(yè)股分有限公司；動(dòng)物昆明種小白鼠，體重22±2g，♀♂兼有，健康，購(gòu)于南京藥械廠(chǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)蘇動(dòng)(質(zhì))97012；
儀器Olympus-BH顯微電視錄象系統(tǒng)，日本(組裝)。
實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果實(shí)驗(yàn)用小白鼠40只，♀♂兼有，隨機(jī)分為五組，即(1)空白對(duì)照組(NS0.1ml)；(2)陽(yáng)性藥(丹參注射液)對(duì)照組(7.5g/kg)；(3)銀杏酮酯(腦心康)注射液大劑量組(15.0mg/kg)(4)銀杏酮酯(腦心康)注射液中劑量組(7.5mg/kg)；(5)銀杏酮酯(腦心康)注射液小劑量組(3.75mg/kg)。藥物以NS稀釋至0.1ml并溫?zé)嶂?7℃后，尾靜脈注射給藥。
小白鼠以25％烏拉坦0.1ml/10g腹腔麻醉，分別記錄給藥前及給藥后5、10、20、30min時(shí)耳廓部的微動(dòng)、靜脈管徑及血色、流態(tài)等微循環(huán)指標(biāo)。
結(jié)果顯示銀杏酮酯(腦心康)注射液大、中、小劑量組在藥后5～30min微動(dòng)脈管徑有顯著擴(kuò)張(P＜0.05～0.01)；微靜脈管徑大劑量組20、30min，中劑量組5、10、20rain都有顯著擴(kuò)張(P＜0.05～0.01)。(詳見(jiàn)表16)。小白鼠耳廓微血管血色及流態(tài)無(wú)明顯改變。
表16 對(duì)小白鼠耳廓微動(dòng)靜管徑的影響(x±s，n＝8)組別 劑量 藥后(凈增減值)(g/kg) 5min 10min 20min 30min空白組等積NSA -0.1±0.14-0.13±0.18-0.15±0.28-0.13±0.25V -0.01±0.060.01±0.06-0.01±0.06-0.04±0.07陽(yáng)性藥組 7.5 A0.06±0.180.18±0.29*0.06±0.12 0.11±0.15*V0±0.18 0.08±0.19-0.01±0.29 0.05±0.17大劑量組 0.015 A0.29±0.34*0.21±0.29*0.33±0.32**0.25±0.23**V0.1±0.18 0.16±0.26 0.23±0.23*0.23±0.23*中劑量組 0.0075A0.1±0.13*0.18±0.21**0.18±0.23*0.14±0.23*V0.24±0.29*0.31±0.3*0.27±0.21**0.2±0.32小劑量組 0.0033A0.14±0.21*0.16±0.20**0.21±0.20*0.16±0.16*V0.05±0.090.14±0.24 0.08±0.21 -0.01±0.22注與空白組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
小結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明奶杏酮酯(腦心康)注射液具有擴(kuò)張小白鼠耳廓微動(dòng)、靜脈管徑，改善微循環(huán)，從而增加局部血流量的作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以19∶1的比例取銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物，并將其混合，取上述混合物100g，加入淀粉50g、糊精50g，充分混勻，用乙醇制粒，壓片。制成片劑。
實(shí)施例2以8∶1的比例取銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物，并將其混合，取上述混合物100g備用；取PEG400276.0g置適宜容器內(nèi)，加入PEG60006.0g，水浴加熱至PEG6000溶解，攪勻，加入甘油18.0g，加入上述混合物100g，用膠體磨研磨成均勻的膏體，轉(zhuǎn)移至軟膠囊機(jī)的貯料桶，用約0.3ml的模具壓制成軟膠囊。
實(shí)施例3以8∶1的比例取銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物，并將其混合，取上述混合物5.0g備用；取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高壓滅菌30min，取出后于10000級(jí)配料室加熱至80℃，加入研細(xì)過(guò)80目篩的本發(fā)明上述混合物5.0g，加熱至溶解，冷卻至室溫后用10％的檸檬酸水溶液調(diào)pH至8.0，加入注射用NaCl8.0g，加注射用水調(diào)至總量1000ml，于100級(jí)無(wú)菌車(chē)間用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，熔封，質(zhì)檢，印字，包裝。
實(shí)施例4以8∶1的比例取銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物，并將其混合，取上述混合物5.0g備用；取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高壓滅菌30min，取出后于10000級(jí)配料室加熱至80℃，加入研細(xì)過(guò)80目篩的本發(fā)明上述混合物5.0g，加熱至溶解，冷卻至室溫后用10％的檸檬酸水溶液調(diào)pH至8.0，加入注射用NaCl 8.0g，加入20g甘露醇作為支架劑，溶解后加注射用水調(diào)至總量1000ml，于100級(jí)無(wú)菌車(chē)間用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑。
實(shí)施例5以5∶2的比例取銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物，并將其混合，取上述混合物6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml、pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液350ml，充分混勻，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量1000ml，于100級(jí)無(wú)菌車(chē)間用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑。
實(shí)施例6以4∶3的比例取銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物，并將其混合，取上述混合物6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量1000ml，于100級(jí)無(wú)菌車(chē)間用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑，質(zhì)檢，印字，包裝。
實(shí)施例7以4∶3的比例取銀杏內(nèi)酯提取物和銀杏黃酮提取物，并將其混合，取上述混合物8.0g，加入用注射用水配制的3.5％乙醇溶液溶解，加3.5％乙醇溶液調(diào)至總量10000ml，用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝100ml輸液，即得。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于包括下述重量比的組份銀杏內(nèi)酯∶銀杏黃酮＝(19-4)∶(1-3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的比例是(15-5)∶(1-2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的比例是(10-8)∶(1-2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的比例是下述一組配比中的任何一種19∶1；8∶1；5∶2；4∶3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述的銀杏內(nèi)酯是按照下述方法精制獲得取銀杏內(nèi)酯粗品，加8倍量乙醇，50～60℃水浴，攪拌溶解，過(guò)濾，濾液濃縮至總量的八分之一至四分之一，靜置，冷卻，析晶，過(guò)濾，重復(fù)上述操作，直至經(jīng)檢驗(yàn)本品中銀杏內(nèi)酯各成分符合要求，取晶體減壓低溫干燥，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于所述銀杏內(nèi)酯當(dāng)中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于90.0％。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于所述銀杏內(nèi)酯當(dāng)中各成分的含量如下銀杏內(nèi)酯A30％～40％銀杏內(nèi)酯B50％～60％銀杏內(nèi)酯k不低于0.5％白果內(nèi)酯不低于0.5％。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于所制備的銀杏內(nèi)酯當(dāng)中銀杏酸含量不得高于0.0005％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述的銀杏黃酮是按照下述方法精制獲得取銀杏黃酮粗提取物，加95％乙醇在60攝氏度水浴中溶解，先通過(guò)沙芯漏斗過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)10000分子量以下超濾膜超濾，收集濾液，60攝氏度減壓濃縮，40～50攝氏度真空干燥，即得。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于所說(shuō)的銀杏黃酮提取物當(dāng)中黃酮甙的總量不低于25％。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于所說(shuō)銀杏黃酮當(dāng)中各黃酮甙的含量范圍是斛皮素12～18％，山柰酚7～13％，異鼠李素1～4％。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于所說(shuō)的銀杏黃酮提取物當(dāng)中銀杏酸的含量不得高于0.0005％。
13.權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于還含有藥物賦形劑，其劑型是口服制劑或者注射劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述藥物組合物制劑，其特征在于當(dāng)組合物中銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的比例是19∶1時(shí)，組合物制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于85.0％，含黃酮甙的總量不低于1.25％。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述藥物組合物制劑，其特征在于當(dāng)組合物中銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的比例是8∶1時(shí)，組合物制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于80.0％，含黃酮甙的總量不低于2.8％。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述藥物組合物制劑，其特征在于當(dāng)組合物中銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的比例是5∶2時(shí)，組合物制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于64.0％，含黃酮甙的總量不低于7.0％。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述藥物組合物制劑，其特征在于當(dāng)組合物中銀杏內(nèi)酯與銀杏黃酮的比例是4∶3時(shí)，組合物制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、K和白果內(nèi)酯含量之和應(yīng)高于51.0％，含黃酮甙的總量不低于10.5％。
18.權(quán)利要求13口服藥物制劑的制備方法，其特征在于取權(quán)利要求1-12所述的任何一種組合物，加入淀粉、糊精，充分混勻，用乙醇制粒，干燥，制成硬膠囊、片劑、顆粒劑；或取PEG400置適宜容器內(nèi)，加入，水浴加熱至溶解，攪勻，加入甘油，加入權(quán)利要求1-6所述的任何一種組合物，用膠體磨研磨成均勻的膏體，轉(zhuǎn)移至軟膠囊機(jī)的貯料桶，用模具壓制成軟膠囊或制成其他口服制劑。
19.權(quán)利要求18所述的口服藥物制劑的制備方法，其特征在于取權(quán)利要求1-12所述的任何一種組合物100g，加入淀粉、糊精50～200g，充分混勻，用乙醇制粒，干燥，制成硬膠囊或片劑；或者取PEG400276.0g置適宜容器內(nèi)，加入PEG60006.0g，水浴加熱至PEG6000溶解，攪勻，加入甘油18.0g，加入權(quán)利要求1-6所述的任何一種組合物100g，用膠體磨研磨成均勻的膏體，轉(zhuǎn)移至軟膠囊機(jī)的貯料桶，用約0.3ml的模具壓制成軟膠囊或制成其他口服制劑。
20.權(quán)利要求18或19所制備口服制劑的鑒別方法，其特征在于該方法包括(1)、鑒別取口服制劑1g，溶于10ml甲醇，取1滴滴于濾紙上吹干后噴灑10％三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置365nm紫外燈下觀(guān)察，呈黃色熒光；取口服制劑，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作為供試品溶液，另取銀杏內(nèi)酯A、B、C、K和白果內(nèi)酯對(duì)照品各1mg分別加甲醇1ml溶解，按照薄層色譜法，用微量點(diǎn)樣器分別取上述供試品和對(duì)照品溶液各10μL點(diǎn)樣于同一塊含4％醋酸鈉的0.5％CMC-Na溶液制成的硅膠GF254薄板上，以石油醚∶丙酮∶甲醇10∶2.5∶0.3為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)后，取出，吹干，于160℃加熱30分鐘，置紫外燈365nm下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)；(2)、含量測(cè)定a.銀杏內(nèi)酯的含量測(cè)定照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000版一部附錄VI D)測(cè)定，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以異丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，理論塔板數(shù)按銀杏內(nèi)酯B計(jì)應(yīng)不低于7000，各相鄰峰之間的分離度及拖尾因子應(yīng)符合要求；銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)還可以是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇-水-四氫呋喃＝70∶25∶10；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù)漂移管溫度105攝氏度，載氣為氮?dú)猓d氣流速3.10升/min；理論踏板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰計(jì)，應(yīng)不低于3500；對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的銀杏內(nèi)酯A、B、K、白果內(nèi)酯適量，分別加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得；供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品100mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得；測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得；b、銀杏黃酮的含量測(cè)定用高效液相色譜法測(cè)定，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm；理論塔板數(shù)以斛皮素峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000；對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg異鼠李素對(duì)照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得儲(chǔ)備液。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液用甲醇或流動(dòng)相稀釋配成濃度分別為斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，異鼠李素1μg/ml，的對(duì)照品溶液；供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品100mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，精密吸取5ml于錐形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％鹽酸緩慢加熱至回流，回流1小時(shí)，冷卻。溶液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得；測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。
21.權(quán)利要求13所述注射劑的制備方法，其特征在于該方法選自下述方法當(dāng)中的一種取葡甲胺，加注射用水溶解，高壓滅菌，取出后加熱至80℃，加入權(quán)利要求1-6的任何一種組合物，加熱至溶解，冷卻至室溫后用10％的檸檬酸水溶液調(diào)pH至8.0，溶解后加注射用NaCl，加注射用水調(diào)至總量，微孔濾膜過(guò)濾，分裝，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化鈉等其中之一作為支架劑，分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；或者取權(quán)利要求1-6的任何一種藥物組合物，加入丙二醇、PEG400、pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液，充分混勻，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量，微孔濾膜過(guò)濾，分裝，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化鈉等其中之一作為支架劑，溶解后一起分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；或者取權(quán)利要求1-6的任何一種藥物組合物，加入丙二醇、PEG400及4％Na2HPO4·12H2O溶液，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量，微孔濾膜過(guò)濾，分裝，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化鈉等其中之一作為支架劑，溶解后分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；或者取權(quán)利要求1-6的任何一種藥物組合物，加入2％～10％乙醇溶液溶解，加2％～10％乙醇溶液調(diào)至總量，微孔濾膜過(guò)濾，分裝，即得。
22.權(quán)利要求21所述注射劑的制備方法，其特征在于該方法選自下述方法當(dāng)中的一種取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高壓滅菌30min，取出后于10000級(jí)配料室加熱至80℃，加入研細(xì)過(guò)80目篩的權(quán)利要求1-6的任何一種組合物5.0～6.0g，加熱至溶解，冷卻至室溫后用10％的檸檬酸水溶液調(diào)pH至8.0，加入注射用NaCl 8.0g，加注射用水調(diào)至總量1000ml，用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化鈉等其中之一作為支架劑，支架劑的量相當(dāng)于藥物組合的1～4倍，溶解后分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；或者取權(quán)利要求1-6的任何一種組合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml、pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液350ml，充分混勻，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量1000ml，用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，即得，或者分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；或者取權(quán)利要求1-6的任何一種組合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量1000ml，用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，即得，或者分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；或者取權(quán)利要求1-6的任何一種組合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加熱攪拌至溶解，加注射用水調(diào)至總量1000ml，用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝于10ml安瓿，即得，或者分裝于西林瓶中冷凍干燥，封口制成粉針劑；或者取權(quán)利要求1-6的任何一種組合物6.0～8.0g，加入用注射用水配制的3.5％乙醇溶液溶解，加3.5％乙醇溶液調(diào)至總量10000ml，用無(wú)菌濾板下襯0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝100ml輸液，即得。
23.權(quán)利要求21或22所制備注射劑的鑒別方法，其特征在于該鑒別方法選自如下兩種方法當(dāng)中的一種方法一，薄層鑒別供試品的制備取所述藥物組合物粉針劑，加蒸餾水溶解，取1ml或直接取注射液1ml以6mol/L鹽酸溶液0.2ml酸化，待結(jié)晶析出，放置30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，沉淀以少量水洗至中性后加1ml丙酮溶解即得；對(duì)照品溶液的制備取銀杏內(nèi)酯A、B、C、K對(duì)照品適量，加丙酮溶解，制成每1mL分別含1mg、1mg、1mg、0.01mg，即得；測(cè)定法按照薄層色譜法，用微量點(diǎn)樣器分別取上述供試品和對(duì)照品溶液各10μL點(diǎn)樣于同一塊含4％醋酸鈉，用0.5％CMC-Na溶液制成的硅膠GF254薄層板上，以石油醚∶丙酮∶甲醇＝10∶2.5∶0.3為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)，取出，吹干，于160℃加熱30分鐘，置紫外燈365nm下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)；方法二，取所述藥物組合物粉針劑制備的溶液1滴滴于濾紙上吹干后噴灑10％三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置365nm紫外燈下觀(guān)察，呈黃色熒光。
24.權(quán)利要求1或13中所述銀杏內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，其特征在于按照高效液相色譜法測(cè)定；色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以異丙醇∶甲醇∶水＝8∶24∶80為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，理論塔板數(shù)按銀杏內(nèi)酯B計(jì)應(yīng)不低于7000；銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)還可以是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇∶水∶四氫呋喃＝70∶25∶10；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù)漂移管溫度105攝氏度，載氣為氮?dú)?，載氣流速3.10升/min；理論踏板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰計(jì)，應(yīng)不低于3500；對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的銀杏內(nèi)酯A、B、K、白果內(nèi)酯，分別加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得；供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品100mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得；測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的測(cè)定方法，其特征在于所說(shuō)的銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇∶水∶四氫呋喃＝70∶25∶10；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù)為漂移管溫度105攝氏度，載氣為氮?dú)?，載氣流速3.10升/min；理論踏板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰計(jì)，應(yīng)不低于3500。
26.權(quán)利要求1或13中所述銀杏內(nèi)酯的鑒別方法，其特征在于按照權(quán)利要求12所述高效液相色譜法及條件試驗(yàn)，測(cè)定供試品中銀杏內(nèi)酯B的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品一致。
27.權(quán)利要求1或13中所述銀杏內(nèi)酯的鑒別方法，其特征在于按照薄層色譜法取銀杏內(nèi)酯1mg加50％丙酮1ml溶解，另取銀杏內(nèi)酯A、B、C、K和白果內(nèi)酯對(duì)照品各1mg分別加50％丙酮1ml溶解，照薄層色譜法，用微量點(diǎn)樣器分別取上述供試品和對(duì)照品溶液各10μL點(diǎn)樣于同一塊含4％醋酸鈉的0.5％CMC-Na溶液制成的硅膠GF254薄板上，以石油醚∶丙酮∶甲醇＝10∶2.5∶0.3為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)后，取出，吹干，于160℃加熱30分鐘，置紫外燈365nm下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)在對(duì)應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)。
28.權(quán)利要求1或13中所述銀杏黃酮的含量測(cè)定方法，其特征在于用下述高效液相色譜法測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇∶水∶磷酸52∶48∶0.1為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm；理論塔板數(shù)以斛皮素峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000；對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg異鼠李素對(duì)照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得儲(chǔ)備液；精密吸取儲(chǔ)備液用甲醇或流動(dòng)相稀釋配成濃度分別為斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，異鼠李素1μg/ml的對(duì)照品溶液；供試品溶液的制備精密稱(chēng)取銀杏黃酮提取物50mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5ml于錐形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％鹽酸緩慢加熱至回流，回流1小時(shí)，冷卻，溶液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得；測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。
29.權(quán)利要求1或13中所含銀杏黃酮的鑒別方法，其特征在于該方法包括取銀杏黃酮提取物溶于5ml甲醇，取1滴滴于濾紙上吹干后噴灑10％三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置365nm紫外燈下觀(guān)察，呈黃色熒光。
30.根據(jù)權(quán)利要求8或12所述的藥物組合物，其特征在于所說(shuō)的銀杏酸的含量檢查方法是按照高效液相色譜法檢查，供試品溶液峰面積不得大于對(duì)照品溶液峰面積；色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇∶水∶冰醋酸83∶17∶0.5為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)243nm，理論塔板數(shù)按銀杏酸計(jì)應(yīng)不低于7000；對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取銀杏酸對(duì)照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，精密量取該溶液5.0ml，定量轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，混勻，作為對(duì)照溶液，濃度為25μg/ml；供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小時(shí)，回收溶媒，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?mL，該溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得；測(cè)定法精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種藥物組合物，由銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯按照一定比例組成，還公開(kāi)了該組合物制備的制劑及其制備方法、鑒別方法和有效成分含量測(cè)定方法。該組合物及其制劑可用于缺血性中風(fēng)、腦梗塞的治療，具有增加心率，增加冠脈流量，改善微循環(huán)，增加局部血流量的作用。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1520814SQ03102700
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者肖偉, 戴翔翎, 凌婭, 李明慧, 曹淑波, 廖正根, 肖 偉 申請(qǐng)人:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司