專利名稱：熱穩(wěn)定性肌醇六磷酸酶變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生變體肌醇六磷酸酶的方法，所述變體肌醇六磷酸酶與SEQ IDNO:2具有至少70%同一性，并與SEQ ID NO:2相比包含至少一個二硫橋聯(lián)的建立，其中所述至少一個二硫橋聯(lián)不屬于SEQ ID NO: 2和緊密相關的肌醇六磷酸酶(即其變體)中規(guī)定的編號中位置77/108，133/408，178/188，和382/391的四個天然存在的二硫橋聯(lián)。本發(fā)明還涉及編碼這些肌醇六磷酸酶的DNA，其產(chǎn)生方法，及其用途，例如在動物飼料和動物飼料添加劑中的用途。大腸桿菌肌醇六磷酸酶參照的成熟部分作為SEQ ID N0:2包括在序列表中。該參照肌醇六磷酸酶是以編號A7ZK83保藏于UNIPR0T的肌醇六磷酸酶。
背景技術：
背景技術：
肌醇六磷酸酶是公知的酶，將其添加至動物包括人類的食料中的優(yōu)點也是公知的。已從多種來源，包括多種真菌和細菌菌株分離出肌醇六磷酸酶。本發(fā)明的一個目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的替代性多肽(肌醇六磷酸酶)和編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體與親本肌醇六磷酸酶相比呈現(xiàn)修飾的或改變的，優(yōu)選改善的性質(zhì)。此類性質(zhì)的非限定性實例為穩(wěn)定性(如酸穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，蒸汽穩(wěn)定性，造粒穩(wěn)定性和/或蛋白酶穩(wěn)定性，特別是胃蛋白酶穩(wěn)定性)，溫度概貌(profile)，pH概貌，比活性，底物特異性，在動物飼料中的性能(如改善的植酸(鹽)釋放和/或降解)，對糖化作用(glycation)的易感性,和/或糖基化樣式。如本文中所述，采用編碼肌醇六磷酸酶的親本多核苷酸的誘變以制備編碼相對于由親本多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶具有改善的性質(zhì)的肌醇六磷酸酶的變體(合成)DNA。已知多種組氨酸磷酸(HAP)類型的肌醇六磷酸酶的三維結構(例如Lim等Nature struct, biol. 7，108-113 (2000))。由此發(fā)現(xiàn)，其均具有位于位置對77/108133/407178/187381/390(根據(jù)本文中使用的編號)的四個二硫橋聯(lián)。通常這些橋聯(lián)占用了分子中存在的所有半胱氨酸。埃希氏菌屬(Escherichia)來自大腸桿菌的appA基因的序列由Dassa等(J. Bact. P5497-5500, 1990)公開于1990年。大腸桿菌肌醇六磷酸酶包含如上所示的四個二硫橋聯(lián)且不存在任何其它半胱氨酸。大腸桿菌肌醇六磷酸酶的變體最早公開于Ostanin等，1992 (J. Biol.Chem. 267(32)November 15，pp 22830-22836，1992)[R16A, H17N, R20A, R92A, H303A, R63A]，顯示R16和H17的替代對活性有害，以及R20、R92和H303的替代非常強烈地減少活性，而R63替代對活性提供了次要的正面作用。大腸桿菌肌醇六磷酸酶的其它變體公開于WO 2006/028684 (DiversaCorp.), WO 2009/073399 (Syngenta Part. AG), WO 2008/036916(Verenium Inc.), WO02/095003(Diversa Corp.)
本發(fā)明的目的是提供具有修飾的，優(yōu)選改善的溫度性質(zhì)的肌醇六磷酸酶。此類性質(zhì)的非限定性實例為熱穩(wěn)定性和溫度概貌。附圖
和序列表簡述圖I是SEQ ID NO: 2至6的肌醇六磷酸酶的比對。圖I中的位置參照SEQ ID NO: 2的編號。在圖(序列表)中，序列如下所示
權利要求
1.一種產(chǎn)生變體肌醇六磷酸酶的方法，所述變體肌醇六磷酸酶與SEQ IDN0:2具有至少70%同一性，并與SEQ ID NO: 2相比包含至少一個二硫橋聯(lián)的建立，其中所述至少一個二硫橋聯(lián)不屬于SEQ ID NO:2中規(guī)定的編號中位置77/108，133/408，178/188，和382/391的四個天然存在的二硫橋聯(lián)。
2.權利要求I的方法，其中所述至少一個二硫橋聯(lián)在一個或多個選自下組位置對的位置建立A) 52C/99C, B) 141C/200C, C) 31C/177C, D) 91C/46C，E) 31C/176C, F) 59C/100C,和G) 162C/248C。
3.權利要求I或2的方法，其中第一二硫橋聯(lián)建立于位置52和99的殘基之間的位置對A。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中第二二硫橋聯(lián)建立于在位置141和200的殘基之間的位置對B。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中建立的二硫橋聯(lián)的數(shù)量是1，2，3，4，5，6和/或7。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中建立的二硫橋聯(lián)的數(shù)量是2并使用下述位置對的組合 A+B, A+C, A+D, A+E, A+F, A+G, B+C, B+D, B+E, B+F, B+G, C+D, C+E, C+F, C+G, D+E, D+F, D+G,E+F, E+G,和 F+G，其中 A 意指 52C/99C, B 意指 141C/200C, C 意指 31C/177C, D 意指 91C/46C,E 意指 31C/176C, F 意指 59C/100C,而 G 意指 162C/248C。
7.權利要求1-5任一項的方法，其中建立的二硫橋聯(lián)的數(shù)量是3并使用下述位置對的組合A+B+C, A+B+D, A+B+E, A+B+F, A+B+G, A+C+D, A+C+E, A+C+F, A+C+G, A+D+E, A+D+F, A+D+G,A+E+F, A+E+G, A+F+G, B+C+D, B+C+E, B+C+F, B+C+G, B+D+E, B+D+F, B+D+G, B+E+F, B+E+G,B+F+G, C+D+E, C+D+F, C+D+G, C+E+F, C+E+G, C+F+G, D+E+F, D+E+G, D+F+G,和 E+F+G，其中 A 意指 52C/99C，B 意指 141C/200C, C 意指 31C/177C，D 意指 91C/46C，E 意指 31C/176C，F(xiàn) 意指59C/100C,而 G 意指 162C/248C。
8.權利要求1-5任一項的方法，其中建立的二硫橋聯(lián)的數(shù)量是4并使用下述位置對的組合A+B+C+D,A+B+C+E,A+B+C+F, A+B+C+G, A+B+D+E,A+B+D+F, A+B+D+G, A+B+E+F, A+B+E+G,A+B+F+G, A+C+D+E, A+C+D+F, A+C+D+G, A+C+E+F, A+C+E+G, A+C+E+H, A+C+F+G, A+D+E+F,A+D+E+G, A+D+F+G, A+E+F+G, B+C+D+E, B+C+D+F, B+C+D+G, B+C+E+F, B+C+E+G, B+C+F+G,B+D+E+F, B+D+E+G, B+D+F+G, B+E+F+G, C+D+E+F, C+D+E+G, C+D+F+G, C+E+F+G, C+E+F+H,和D+E+F+G，其中 A 意指 52C/99C，B 意指 141C/200C, C 意指 31C/177C，D 意指 91C/46C，E 意指31C/176C, F 意指 59C/100C,而 G 意指 162C/248C。
9.權利要求1-5任一項的方法，其中建立的二硫橋聯(lián)的數(shù)量是5并使用下述位置對的組合A+B+C+D+E, A+B+C+D+F, A+B+C+D+G, A+B+C+E+F, A+B+C+E+G, A+B+C+F+G, A+B+D+E+F,A+B+D+E+G, A+B+D+F+G, A+B+E+F+G, A+B+F+G+H, A+C+D+E+F, A+C+D+E+G, A+C+D+F+G,A+C+E+F+G, A+D+E+F+G, B+C+D+E+F, B+C+D+E+G, B+C+D+F+G, B+C+E+F+G, B+D+E+F+G,和C+D+E+F+G，其中 A 意指 52C/99C，B 意指 141C/200C, C 意指 31C/177C，D 意指 91C/46C，E 意指 31C/176C, F 意指 59C/100C,而 G 意指 162C/248C。
10.權利要求1-5任一項的方法，其中建立的二硫橋聯(lián)的數(shù)量是6并使用組合 A+B+C+D+E+F, A+B+C+D+E+G, A+B+C+D+F+G, A+B+C+E+F+G, A+B+D+E+F+G, A+C+D+E+F+G,和 B+C+D+E+F+G，其中 A 意指 52C/99C，B 意指 141C/200C，C 意指 31C/177C，D 意指 91C/46C，E 意指 31C/176C, F 意指 59C/100C,而 G 意指 162C/248C。
11.權利要求1-5任一項的方法，其中建立的二硫橋聯(lián)的數(shù)量是7并使用下述位置對的組合 A+B+C+D+E+F+G,其中 A 意指 52C/99C，B 意指 141C/200C, C 意指 31C/177C，D 意指91C/46C, E 意指 31C/176C, F 意指 59C/100C,而 G 意指 162C/248C。
12.權利要求1-11任一項的方法，進一步在選自下組的至少一個位置包含修飾25，37，38，75，77，108，114，123，126，127，133，137，141，142，146，157，173，178，188，204，211，233，235，253，267，286，287，317，318，327，367，382，391，和 408。
13.權利要求12的方法，其包含至少一個下述修飾25F，37F，38Y，75K，75V，75E，77A，108A, 114H, 123E, 126Y,127L,127V,133A,137E,137V,141R,142R,146R,157R,173Y,178A,188A,204N,204D，211W，233E,235Y,253V,267A,286F,287Y,317L,318Y,327Y,367F,382A,391A，和 408A。
14.權利要求1-13任一項的方法，其中建立所述二硫橋聯(lián)的取代是A’. G52C/A99CB’. T141C/V200CC，· D31C/L177CD’. E91C/W46CE’ · D31C/N176CF，· G59C/F100CG’ · A162C/S248C。
15.權利要求1-14任一項的方法，其包含選自下組的一個進一步修飾A25F, W37F, P38Y, C75K, C75V, C75E, C77A, C108A, T114H, P123E, N126Y, P127L, P127V,C133A, N137E, N137V, T141R, D142R, E146R, G157R, P173Y, C178A, C188A, C204N, C204D,V211W, G233E, G235Y, Q253V, R267A, K286F, Q287Y, N317L, W318Y, T327Y, S367F, C382A,C391A, C408A,和 / 或選自下述組合W37F/P38Y，P123E/P127L, N126Y/P127V, G233E/G235Y,K286F/Q287Y, N317L/W318Y, W37F/P38Y/P123E/P127L, W37F/P38Y/N126Y/P127V, P173Y/N317L/W318Y, C75K/C204N, C75K/C204N/C178A/C188A, C75K/C204N/C382A/C391A, C75K/C204N/C178A/C188A/C382A/C391A, C75K/C204N/C77A/C108A,C75K/C204N/C133A/C108AA25F/C75V/T114H/N137E/T141R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327Y/C178A/C188AA25F/C75V/T114H/N137E/T141R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327Y/C382A/C391AA25F/C75V/T114H/N137E/T141R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327Y/C178A/C188A/C382A/C391AA25F/C75V/T114H/N137E/T141R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327Y/C77A/C 108AA25F/C75V/T114H/N137E/T141R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327Y/C133A/C408AA25F/C75E/T114H/N137V/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/C75E/N137V/T141R/D142R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327Y·A25F/T114H/N137V/T141R/D142R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/T114H/N137V/T141R/D142R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/C75V/T114H/N137V/T141R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327Y·A25F/C75V/T114H/N137V/T141R/D142R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/T114H/N137V/T141R/D142R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/C75E/T114H/N137V/T141R/D142R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/C75E/T114H/N137V/T141R/D142R/E146R/G157R/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/C75E/T114H/N137E/T141R/D142R/G157R/V211W/Q253V/R267A/T327Y/L341PA47F/C97V/T136H/N159V/T163R/D164R/G179R/V233W/Q275V/R289A/T349YA25F/C75E/T114H/N137V/T141R/D142R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/C75E/N137V/D142R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/C75E/N137E/T141R/D142R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/C75V/T114H/N137E/T141R/D142R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/C75E/T114H/N137V/T141R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/C75E/T114H/N137V/T141R/D142R/E146R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/T114H/N137E/T141R/D142R/G157R/C204D/V211W/Q253V/R267A/T327YA25F/T114H/N137V/D142R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/C75V/T114H/N137V/D142R/G157R/C204D/V211W/Q253V/T327YA25F/C75V/T114H/N137V/D142R/G157R/V211W/Q253V/T327YA25F/T114H/N137V/C204D/V21lff/T327Y0
16.權利要求1-15任一項的方法，其中使用SEQID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6的肌醇六磷酸酶的成熟部分作為親本/骨架以供產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體。
17.一種由權利要求1-16任一項的任意方法產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶變體，其具有改善的熱穩(wěn)定性，改善的溫度概貌，改善的pH概貌,改善的比活性，改善的在動物飼料中的性能，和/或并入潛在的蛋白酶切割位點的改變。
18.一種多核苷酸，其包含編碼權利要求17的肌醇六磷酸酶變體的核苷酸序列。
19.一種核酸構建體，其包含權利要求18的多核苷酸可操作地連接于一個或多個指導所述多肽在表達宿主中產(chǎn)生的調(diào)控序列。
20.一種重組表達載體，其包含權利要求19的核酸構建體。
21.—種重組宿主細胞，其包含權利要求19的核酸構建體和/或權利要求20的表達載體。
22.—種產(chǎn)生權利要求17的肌醇六磷酸酶變體的方法，其包括 (a)培養(yǎng)權利要求21的宿主細胞以產(chǎn)生包含所述肌醇六磷酸酶的上清；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶。
23.一種轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其能夠表達權利要求17的肌醇六磷酸酶變體。
24.一種組合物，其包含至少一種權利要求17的肌醇六磷酸酶變體，和 (a)至少一種脂溶性維生素； (b)至少一種水溶性維生素；和/或 (C)至少一種痕量礦物質(zhì)。
25.權利要求24的組合物，其進一步包含至少一種選自下組酶的酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，α -半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶和/或β -葡聚糖酶。
26.權利要求24和25任一項的組合物，其為動物飼料添加劑。
27.一種動物飼料組合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并包含權利要求17的肌醇六磷酸酶變體。
28.—種改善動物飼料營養(yǎng)價值的方法，其中將權利要求17的肌醇六磷酸酶變體添加至飼料。
29.—種降低動物糞便中植酸水平的方法，其包括用有效量的權利要求27的飼料組合物飼喂動物。
30.一種處理植物蛋白的方法，其包括將權利要求17的肌醇六磷酸酶變體添加至至少一種植物蛋白的步驟。
31.權利要求17的肌醇六磷酸酶變體或權利要求24-27任一項的組合物在動物飼料，在動物飼料的制備，在改善動物飼料的營養(yǎng)價值，在減少動物糞便中植酸(鹽)水平，在處理植物蛋白，或在從肌醇六磷酸酶底物釋放磷中的用途。
32.—種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括在權利要求17的肌醇六磷酸酶變體的存在下發(fā)酵糖類材料。
33.一種產(chǎn)生乙醇的方法，其包括在權利要求17的肌醇六磷酸酶變體的存在下發(fā)酵糖類材料并產(chǎn)生乙醇。
34.權利要求17的肌醇六磷酸酶變體在使用發(fā)酵工藝制備乙醇中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及肌醇六磷酸酶，其與來源于大腸桿菌的肌醇六磷酸酶具有至少70%同一性并與該肌醇六磷酸酶相比包含至少一個修飾。這些肌醇六磷酸酶變體具有修飾的，優(yōu)選改善的性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性、溫度概貌、pH概貌、比活性、在動物飼料中的性能、減少的蛋白酶敏感性和/或修飾的糖基化樣式。本發(fā)明亦涉及編碼這些肌醇六磷酸酶的DNA，其產(chǎn)生方法，及其例如在動物飼料和動物飼料添加劑中的用途。
文檔編號C12N15/82GK102906255SQ201180025984
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權日2010年3月26日
發(fā)明者L.德瑪利亞, L.K.斯科夫, M.斯科喬伊特 申請人:諾維信公司