專利名稱：一種基于寡聚核苷酸-非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品學(xué)、化學(xué)等學(xué)科的交叉學(xué)科領(lǐng)域。更具體涉及一種
基于寡聚核苷酸-非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰胺的方法。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)對人和動物造成的危害已引起人們的廣泛關(guān)注，液態(tài)奶及 奶粉的假蛋白事件主要是由于一些不法人員在牛奶或奶粉中添加三聚氰胺，提高奶制品的 含氮量，以此冒充蛋白質(zhì)。然而三聚氰胺進(jìn)入人體后，發(fā)生取代反應(yīng)(水解)，生成三聚氰 酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并與尿液形成難溶性鹽造成結(jié)石，對健康構(gòu)成 嚴(yán)重威脅。2008年10月7日衛(wèi)生部、工信部、農(nóng)業(yè)部、國家工商總局以及國家質(zhì)檢總局聯(lián)合 發(fā)布《關(guān)于乳與乳制品中三聚氰胺臨時管理限量值規(guī)定的公告》，公告規(guī)定嬰幼兒配方乳 粉中三聚氰胺的限量值為lmg/kg;液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺 的限量值為2. 5mg/kg。目前三聚氰胺的檢測方法主要有液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì) 譜法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)等。但上述檢測方法均需使用大型儀器，操作 繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，成本高，無法在原料及產(chǎn)品現(xiàn)場直接對三聚氰胺進(jìn)行快速檢測。
納米金顆粒的分散與團(tuán)聚狀態(tài)有明顯的顏色變化，這一現(xiàn)象近年來已被廣泛應(yīng) 用于蛋白質(zhì)、DNA等的比色法檢測中，以納米金為探針檢測三聚氰胺的方法正是建立在 此原理的基礎(chǔ)上。雖然前不久有人利用此原理報(bào)道了一個相似的檢測方法(Kelong Ai， Yanlan Liu，and Lehui Ui，Journal of the American ChemicalSociety 2009,131(27)， 9496-9497.)，但他們報(bào)道的方法不僅需要用巰基試劑標(biāo)記納米金，且該試劑沒有商品化， 需要自己合成，不僅勞動強(qiáng)度大，費(fèi)時費(fèi)力，且其純度直接影響檢測靈敏度和選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種基于寡聚核苷酸_非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰 胺的方法，以納米金為探針檢測三聚氰胺，簡便快速，靈敏度高，選擇性好，成本低，無需大 型儀器設(shè)備即可達(dá)到國家關(guān)于乳與乳制品中三聚氰胺臨時管理限量值規(guī)定的要求，可實(shí)現(xiàn) 原料及產(chǎn)品中三聚氰胺的快速檢測。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施 —種基于寡聚核苷酸_非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰胺的方法，其步驟如下
1)納米金的合成以氯金酸(HAuCl4 *4H20)、擰檬酸三鈉、超純水為原料，通過磁力 攪拌、加熱(100°C )、回流、冷卻操作技術(shù)，制備粒徑為10nm 40nm、濃度為10—"M 10—8M 反應(yīng)液A，所述的反應(yīng)液A為納米金溶膠，所述的氯金酸與檸檬酸三鈉的摩爾比為1 : l 1 : 5，較佳的反應(yīng)溫度為80°C IO(TC，反應(yīng)時間為25 60min。 2)將特定序列寡聚核苷酸溶于緩沖溶液中，得反應(yīng)液B。所述的特定序列寡聚核 苷酸為單鏈寡聚核苷酸(上海生工)，其中的堿基均為T堿基或是含不同個數(shù)T堿基的寡聚核苷酸，堿基個數(shù)為1 200，其濃度為10—6M 10—4M ;所述的緩沖溶液為常規(guī)的Tris、 PBS 緩沖溶液，其濃度為5 20mM ;所述的緩沖溶液中含有氯化鈉，其濃度為0. 05 0. 5M。
3)在反應(yīng)液B中加入三聚氰胺或經(jīng)過預(yù)先處理的被測樣品，充分混勻，靜置。所述 的反應(yīng)液B為步驟2)中的特定序列寡聚核苷酸的緩沖溶液；所述的預(yù)先處理的被測樣品為 經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)方法預(yù)處理的樣品；所述的三聚氰胺濃度為10—9M 10—6M ;靜置時間為1 10min。
4)以反應(yīng)液A作為探針，通過比色法，即可檢測三聚氰胺。所述的反應(yīng)液A為步驟 1)中的納米金溶膠，所述的反應(yīng)液A與特定序列寡聚核苷酸(上海生工)的較佳摩爾比為
i : ioo i : iooo;所述的比色法為目視比色法或可見分光光度法，可見分光光度法檢測
波長為400 750nm。 本檢測方法用于原料奶、液態(tài)奶制品、奶粉、飼料等樣品中三聚氰胺的檢測，可在 IO分鐘內(nèi)完成。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果 與液相色譜法(HPLC)、液相色譜_質(zhì)譜法(HPLC-MS)、氣相色譜_質(zhì)譜法(GC-MS) 等技術(shù)相比，無需大型儀器設(shè)備，檢測人員無需專門培訓(xùn)，僅憑裸眼即可判斷結(jié)果；可用于 現(xiàn)場檢測；直接采用商品化的寡聚核苷酸，即可實(shí)現(xiàn)對三聚氰胺的比色檢測，其檢測靈敏度 可達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)，具有簡便快速、靈敏度高、選擇性好、成本低，無需大型儀器，可對原料 及產(chǎn)品進(jìn)行三聚氰胺的現(xiàn)場檢測。 此法檢測快速(10分鐘內(nèi))，操作簡易，靈敏度高，選擇性好，通用性強(qiáng)。


圖1以非標(biāo)記的納米金為探針，結(jié)合寡聚核苷酸檢測三聚氰胺原理示意圖
圖2堿基T與三聚氰胺形成氫鍵示意圖
圖3A合成的納米金溶膠電鏡圖 圖3B以反應(yīng)液A為探針，加入三聚氰胺后剛剛開始團(tuán)聚的納米金電鏡圖
圖3C以反應(yīng)液A為探針，加入稍過量三聚氰胺后團(tuán)聚的納米金電鏡圖
圖4A寡聚核苷酸_非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰胺的紫外光譜及線性關(guān)系圖
圖4B寡聚核苷酸_非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰胺目視比色法示意圖
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 : 以原料奶中三聚氰胺的檢測為例具體說明檢測方法，其步驟如下 1)合成納米金所用的儀器均需用新配制的王水(1 : 3， V濃硝酸/V濃鹽酸)浸泡24h
后，超純水洗凈備用。 2)將lOOmL超純水加熱煮沸，加入1.88mL氯金酸(2%， w/w)，沸騰后在加熱 (IO(TC )及攪拌條件下加入10. OmL檸檬酸三鈉(檸檬酸三鈉質(zhì)量為0. 1141g) 。 10. 0分鐘 后停止加熱，繼續(xù)攪拌15. 0分鐘，自然冷卻至室溫(20-25°C )。所述的氯金酸與檸檬酸三 鈉的摩爾比為l : 3.88。制備得納米金溶膠粒徑為13nm、濃度為4.86X10—9M。
3)將特定序列寡聚核苷酸溶于緩沖溶液中，得反應(yīng)液B。所述的特定序列寡聚核 苷酸為單鏈寡聚核苷酸，其中的堿基均為T堿基或是含T堿基較多的寡聚核苷酸，其濃度為
410—5M ;所述的緩沖溶液為PBS緩沖溶液，其濃度為10mM ;所述的緩沖溶液中含氯化鈉，其濃 度為0. 3M。 4)在反應(yīng)液B中加入經(jīng)過預(yù)先處理的原料奶樣品，充分混勻，靜置。所述的反應(yīng) 液B為步驟3)中的特定序列寡聚核苷酸緩沖溶液；所述的預(yù)先處理的原料奶樣品須先經(jīng) 過三氯乙酸或乙腈沉淀蛋白質(zhì)，然后經(jīng)過自制固相萃取整體柱預(yù)處理的樣品；靜置時間為 5min。 5)以反應(yīng)液A作為探針，通過比色法，即可檢測原料奶中三聚氰胺。所述的反應(yīng) 液A為步驟2)中的納米金溶膠，所述的反應(yīng)液A與特定序列寡聚核苷酸的較佳摩爾比為 1 : IOO;所述的比色法為目視比色法或可見分光光度法，可見分光光度法檢測波長范圍 400 700nm。
結(jié)果 以520nm處的吸光度值表征三聚氰胺的濃度變化，其線性范圍是4. 17X10—8 4. 17X10—7] ，檢測限為41. 7nM。
權(quán)利要求
一種基于寡聚核苷酸-非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰胺的方法，其步驟是1)納米金的合成以氯金酸、檸檬酸三鈉、超純水為原料，通過磁力攪拌、加熱100℃、回流、冷卻操作，制備粒徑為10nm～40nm、濃度為10-11M～10-8M反應(yīng)液A，所述的反應(yīng)液A為納米金溶膠，所述的氯金酸與檸檬酸三鈉的摩爾比為1∶1～1∶5，反應(yīng)溫度為80℃～100℃，反應(yīng)時間為25～60min；2)將特定序列寡聚核苷酸溶于緩沖溶液中，得反應(yīng)液B，所述的特定序列寡聚核苷酸為單鏈寡聚核苷酸，其中的堿基均為T堿基或是含不同個數(shù)T堿基的寡聚核苷酸，堿基個數(shù)為1～200，其濃度為10-6M～10-4M；所述的緩沖溶液為Tris或PBS緩沖溶液，其濃度為5～20mM；所述的緩沖溶液中含有氯化鈉，其濃度為0.05～0.5M；3)在反應(yīng)液B中加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液或經(jīng)過預(yù)先處理的被測樣品，混勻，靜置，所述的反應(yīng)液B為步驟2)中的特定序列寡聚核苷酸的緩沖溶液；所述的預(yù)先處理的被測樣品為經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)方法預(yù)處理的樣品；所述的三聚氰胺濃度為10-9M～10-6M；靜置時間為1～10min；4)以反應(yīng)液A作為探針，通過目視比色法或紫外-可見分光光度法，檢測三聚氰胺，所述的反應(yīng)液A為步驟1)中的納米金溶膠，所述的反應(yīng)液A與特定序列寡聚核苷酸的摩爾比為1∶100～1∶1000；紫外-可見分光光度法檢測波長為400～750nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于寡聚核苷酸-非標(biāo)記的納米金檢測三聚氰胺的方法。依次包括以下步驟1)制備一定粒徑的納米金溶膠，即反應(yīng)液A；2)將特定序列寡聚核苷酸溶于緩沖溶液中，得反應(yīng)液B；3)在反應(yīng)液B中加入待測溶液進(jìn)行反應(yīng)；4)在步驟3)的反應(yīng)液中加入反應(yīng)液A，通過比色法，檢測三聚氰胺。本發(fā)明的檢測方法簡便快速(檢測過程不超過10min)、靈敏度高、選擇性好、成本低、無需大型儀器設(shè)備即可達(dá)到國家關(guān)于乳及乳制品中三聚氰胺臨時管理限量值規(guī)定的檢測要求，可實(shí)現(xiàn)對原料及產(chǎn)品的現(xiàn)場快速檢測。
文檔編號G01N21/31GK101701260SQ20091027245
公開日2010年5月5日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者何治柯, 李麗, 黃暉 申請人:武漢大學(xué)