專利名稱：一種賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種賴氨酸芽孢桿菌(Lysinikicillus sp.)GY32及其在降解十溴聯(lián)苯醚中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多溴聯(lián)苯醚(polybrominateddiphenyl ethers, PBDEs)是一種持久性有機污染物，因具有優(yōu)良的阻燃性能而被廣泛應(yīng)用于電子電器產(chǎn)品中。近年來隨著電子電器行業(yè)的迅猛發(fā)展，大量電子垃圾的無序拆解，具有生態(tài)生理毒性和生物積蓄毒性的PBDh釋放到水體土壤環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境和生物體健康都造成了嚴重的影響和危害。面對多溴聯(lián)苯醚污染造成的生態(tài)環(huán)境問題，人們積極探索各種解決方法。合適的微生物處理法可以實現(xiàn)污染物的徹底無毒化，是較為理想的污染物處理途徑。具有多溴聯(lián)苯醚降解功能的微生物的獲得無疑給這些污染問題的解決帶來了曙光。Lysinibacillus屬是2007年從Bacillus屬分離出來的新屬，僅有三個分類種。 該屬的菌種革蘭氏染色陽性，能形成橢圓或圓形芽孢。氧化酶和過氧化氫酶試驗陽性，硝酸鹽還原、產(chǎn)H2S和吲哚試驗陰性。主要脂肪酸類型為is0-C15:Q，主要醌型為MK-7，細胞壁肽聚糖含 Lys 和 Asp，DNA 中(G+C)mol%為；35_38%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32，該菌于2011年9月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011307。本發(fā)明的賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32是通過對廣東汕頭某電子垃圾集中處理區(qū)的河床底泥進行富集培養(yǎng)、分離、純化，得到Lysinikicillus屬的一個新種。賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32的形態(tài)學(xué)和生理生化特征該菌24h平板培養(yǎng)物菌落圓形、乳黃色，突出培養(yǎng)基，不透明，邊緣有一圈半透明刺突狀，直徑2-3mm，放大12倍觀察菌落呈半圓結(jié)晶狀。菌體革蘭氏陽性，能形成橢圓或圓形芽孢，周生鞭毛。對數(shù)生長期及穩(wěn)定期前期會呈現(xiàn)出寬0. 8-1. 34 μ m、長大于29. 87 μ m長線狀或大于5 μ m的長桿狀菌體形態(tài)，至今尚未發(fā)現(xiàn)其他多溴聯(lián)苯醚降解微生物具有如此特殊的形態(tài)特征，24h后與普通桿狀細胞無明顯差異。氧化酶和過氧化氫酶陽性，V-P試驗陰性。該菌能在好氧和兼性厭氧條件下生長，生長PH6. 0 9. 0，生長溫度15 45°C。賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32的分子分類學(xué)地位按照常規(guī)方法提取賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32的總DNA。采用 16S rRNA通用引物27F和1492R擴增其16S rRNA基因，將PCR產(chǎn)物直接測序，獲得16S rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。將該序列與NCBI的GenBank中序列進行比對，進行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32的16S rRNA基因序列與Lysinikicillus屬的已有模式菌株具有較高的相似性，其中與Lysinikicillus sphaericus的序列相似性為98%。再擴增其gyrB基因，將PCR產(chǎn)物直接測序，獲得gyrB 基因序列，其序列如SEQ ID NO. 2所示，經(jīng)BLAST分析，與其相似性最大的已公開發(fā)表序列為Lysinikicillussphaericus C3-41，但相似度僅為81 %，文獻資料顯示同一菌種的gyrB 基因序列的同源性應(yīng)大于95%。綜合上述形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子分類學(xué)結(jié)果，認為賴氨酸芽孢桿菌 (Lysinibacillussp.)GY32屬于Lysinikicillus屬的一個新種，定名為賴氨酸芽孢桿菌 (Lysinibacillus sp. )GY32，于2011年9月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 地址中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011307。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32具有降解多溴聯(lián)苯醚BDE209的能力。因此本發(fā)明的第二個目的是提供賴氨酸芽孢桿菌(Lysinikicillus sp.)GY32在降解多溴聯(lián)苯醚BDE209中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種具有降解多溴聯(lián)苯醚BDE209能力的新種賴氨酸芽孢桿菌 (Lysinibacillus sp.)GY32，為多溴聯(lián)苯醚BDE209的治理提供了降解菌。本發(fā)明的賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32于2011年9月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011307。


圖1是賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY325小時培養(yǎng)物的普通光學(xué)顯微鏡照片(1000X)；圖2是賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY3223小時培養(yǎng)物的透射電鏡照片。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。一、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32的分離和鑒定實施例1 取20g廣東汕頭某電子垃圾集中處理區(qū)的河床底泥，加入SOmL無菌水?dāng)噭虼蛏⒑螅^篩去掉植物殘渣及大顆粒物；濾液再經(jīng)過2000X g，常溫，離心2min，去掉小顆粒物； 得到的上清液經(jīng)過6000X g，常溫，離心lOmin，收集沉淀物；沉淀物加入SOmL無菌水，洗滌、離心處理三次。最后獲得的沉淀物作為種源，接種到無機鹽培養(yǎng)基中(Na2HP045. 7mM， KH2P043. 3mM, NH4Cl 18. OmM,酵母抽提物lg/L，琥珀酸鈉20mM，甲酸鈉20mM，乳酸鈉20mM， 微量元素和維生素，微量元素1.01mmol/L MgS04、0. 5g/L MnS04、0. lg/L ZnS04、0. Olg/ LCuSO4,0. Olg/L AlK(SO4)2U. Og/L NaCl、0. lg/L FeCl2、0. lg/L CaCl2 禾口 CoCl2O. lg/L。維生素2mg/L生物素、2mg/L葉酸、lOmg/L維生素B6、5mg/L維生素B2、5mg/L維生素Bl、5mg/ L煙酸、5mg/L泛酸、0. lmg/L維生素B12、5mg/L對氨基苯甲酸和5mg/L硫辛酸《參考文獻 Wolin et al.，1963》)，培養(yǎng)基中同時加入1 μ mol/L BDE209。固體培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂。培養(yǎng)物置于30°C靜置避光培養(yǎng)，每月經(jīng)過6000 X g，常溫，離心lOmin，收集沉淀物，重新轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)6個月以后，將富集培養(yǎng)物在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)， 得到單菌落。由此獲得菌株GY32。將菌株GY32進行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，其形態(tài)學(xué)和生理生化特征如下該菌24h平板培養(yǎng)物菌落圓形、乳黃色，突出培養(yǎng)基，不透明，邊緣有一圈半透明刺突狀，直徑2-3mm，放大12倍觀察菌落呈半圓結(jié)晶狀。菌體革蘭氏陽性，能形成橢圓或圓形芽孢，周生鞭毛。對數(shù)生長期及穩(wěn)定期前期會呈現(xiàn)出寬0. 8-1. 34 μ m、長大于29. 87 μ m長線狀或大于5 μ m的長桿狀菌體形態(tài)，至今尚未發(fā)現(xiàn)其他多溴聯(lián)苯醚降解微生物具有如此特殊的形態(tài)特征，24h后與普通桿狀細胞無明顯差異。氧化酶和過氧化氫酶陽性，V-P試驗陰性。該菌能在好氧和兼性厭氧條件下生長，生長PH6. O 9. 0，生長溫度15 45°C。按照常規(guī)方法提取菌株GY32的總DNA。采用16S rRNA通用引物27F和1492R擴增其16S rRNA基因，引物27F :5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3'1492R 5' GGTACCTTGTTACGACTT 3'選擇如下PCR 反應(yīng)體系和 PCR 反應(yīng)程序=IOxbuffer 5 μ L，dNTP 1 μ L，27F 1 μ L， 1492R 1 μ L, DNA 模板 0. 5 μ L，Taq 酶 0. 5 μ L，去離子水 41 μ L, 94 "C 5min, 94 "C lmin, 57°C lmin，72°C 2min，72°C lOmin，34 個反應(yīng)循環(huán)擴增其 16S rRNA 基因。將PCR產(chǎn)物直接測序，獲得的16S rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。將該序列與NCBI的GenBank中序列進行比對，進行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株GY32 的16SrRNA基因序列與Lysinikicillus屬的已有模式菌株具有較高的相似性，其中與 Lysinibacillussphaericus 的序列相似性為 98%。采用引物UP-I 5‘ GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA3 ‘；UP-2r :5，AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT3 ‘，并選擇如下 PCR 反應(yīng)體系和 PCR 反應(yīng)程序IOx buffer 5 μ L, dNTP 1 μ L, UP-I 1 μ L, UP-2r 1 μ L, DNA 模板 1 μ L，Taq 酶 0· 5 μ L,去離子水 40. 5 μ L, 94°C 3min, 94°C lmin, 60°C lmin, 72°C 2min, 72°C 10min,34個反應(yīng)循環(huán)擴增其gyrB基因，將PCR產(chǎn)物直接測序，獲得的gyrB基因序列，其序列如SEQ ID NO. 2所示，經(jīng)BLAST分析，與其相似性最大的已公開發(fā)表序列為 Lysinibacillus sphaericus C3-41，但相似度僅為81 %，文獻資料顯示同一菌種的gyrB基因序列的同源性應(yīng)大于95 %。綜合上述形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子分類學(xué)結(jié)果，認為菌株GY32屬于 Lysinibacillus屬的一個新種，定名為賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32，于 2011年9月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為 CCTCC NO :M 2011307。二、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32 降解 BDE209實施例2 賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32兼性厭氧條件下對 5 μ mol/LBDE209脫溴降解實驗。培養(yǎng)體系組成5.7mmol/L Na2HPO4. 12H20, 3. 3mmol/LKH2PO4,18. Ommol/LNH4C1, 20mmol/L 甲酸鈉，20mmol/L 乳酸鈉，40mmol/L 琥珀酸鈉，0. 1 %酵母汁，5 μ mol/L BDE209, 余量為水，PH7.0。將賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.) GY32菌液按5 %的接種量接入上述培養(yǎng)體系，避光搖床培養(yǎng)21d后，用離子色譜儀DIONEX ICS-1500測定BDE209 脫溴量。培養(yǎng)體系中檢測到的溴離子濃度平均達351. 9 μ g/L，由此說明賴氨酸芽孢桿菌 (Lysinibacillussp. )GY32 具有降解 BDE209 的能力。實施例3 賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32厭氧條件下對5 μ mol/ LBDE209脫溴降解實驗。培養(yǎng)體系組成5.7mmol/L Na2HP0412H20, 3. 3mmol/L KH2PO4,18. Ommol/L NH4Cl, 20mmol/L 甲酸鈉，20mmol/L 乳酸鈉，40mmol/L 琥珀酸鈉，0. 1 %酵母汁，5 μ mol/L BDE209, 余量為水，PH7.0。將賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32菌液按5%的接種量接入上述培養(yǎng)體系，鋁蓋封口，避光靜置培養(yǎng)21d后，用離子色譜儀DIONEX ICS-1500測定 BDE209脫溴量。培養(yǎng)體系中檢測到的溴離子濃度平均達觀.7μ g/L，由此說明賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32 具有降解 BDE209 的能力。實施例4 賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32在兼性厭氧條件下對 5. 49mg/LBDE209脫溴降解實驗。培養(yǎng)體系組成5.7mmol/L Na2HPO4. 12Η20，3· 3mmol/L KH2PO4,18. Ommo 1/L NH4Cl, 20mmol/L 甲酸鈉，20mmol/L 乳酸鈉，40mmol/L 琥珀酸鈉，0. 1 %酵母汁，5. 49mg/L BDE209, 余量為水，PH7. 0。將賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.) GY32菌液按5%的接種量接入上述培養(yǎng)體系，避光搖床培養(yǎng)，每隔4d在無菌條件下從培養(yǎng)體系取出4mL培養(yǎng)液，同時補加等量新鮮培養(yǎng)基進入體系中，20d后用二氯甲烷萃取所有培養(yǎng)液中的BDE209，二氯甲烷和培養(yǎng)液的體積比約1 2，經(jīng)離心后收集含BDE209的有機相，濃縮，定容至1. 5mL，0. 22 μ m 有機相膜過濾后進行HPLC測定，培養(yǎng)體系中BDE209降解率達37. 2%。由此說明賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32具有降解BDE209的能力實施例5 賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32在厭氧條件下對2. 74mg/ LBDE209脫溴降解實驗。培養(yǎng)體系組成5.7mmol/L Na2HPO4. 12Η20，3· 3mmol/L KH2PO4,18. Ommo 1/L NH4Cl, 20mmol/L 甲酸鈉，20mmol/L 乳酸鈉，40mmol/L 琥珀酸鈉，0. 酵母汁，2. 74mg/L BDE209, 余量為水，PH7.0。將賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp. )GY32菌液按5%的接種量接入上述培養(yǎng)體系，鋁蓋封口，避光靜置培養(yǎng)，每隔4d在無菌條件下從培養(yǎng)體系取出4mL培養(yǎng)液，同時補加等量新鮮培養(yǎng)基進入體系中，20d后用二氯甲烷萃取所有培養(yǎng)液中的BDE209， 二氯甲烷和培養(yǎng)液的體積比約1 2，經(jīng)離心后收集含BDE209的有機相，濃縮，定容至 1. 5mL，0. 22 μ m有機相膜過濾后進行HPLC測定，培養(yǎng)體系中BDE209降解率達43. 0%，由此說明賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32具有降解BDE209的能力。上述試驗表明，賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32能降解BDE209，具有十溴聯(lián)苯醚脫溴能力，為環(huán)境中多溴聯(lián)苯醚的處理提供了新型的降解微生物。
權(quán)利要求
1.一種賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011307。
2.權(quán)利要求1所述的賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussp.)GY32在降解多溴聯(lián)苯醚 BDE209中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32及其應(yīng)用。該菌于2011年9月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NOM 2011307。本發(fā)明提供了一種具有降解多溴聯(lián)苯醚BDE209能力的新種賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)GY32，為多溴聯(lián)苯醚BDE209的治理提供了降解菌。
文檔編號A62D3/02GK102363756SQ20111030090
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者孫國萍, 朱春節(jié), 許玫英, 郭俊, 陳杏娟 申請人:佛山市環(huán)保技術(shù)與裝備研發(fā)專業(yè)中心, 廣東省微生物研究所