專(zhuān)利名稱(chēng)：：氨基酸延長(zhǎng)的胰島素的制作方法氨基酸延長(zhǎng)的胰島素發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及與氨基酸低聚體連接的胰島素。
背景技術(shù)：
：很多肽和蛋白藥物作為藥物候選物是有吸引力的，因?yàn)樗麄兙哂懈呱锘钚院褪荏w選擇性。肽和蛋白藥物一般是通過(guò)注射給藥的，并且可導(dǎo)致低的患者配合性。因此需要另外的遞送途徑。通過(guò)肺或口服途徑遞送是可能的，但是由于低的生物利用度而很復(fù)雜，低的生物利用度是由于在相關(guān)器官中高的蛋白酶解活性，以及經(jīng)由相關(guān)組織的低吸收。此外，在人體中，肽和蛋白藥物經(jīng)常通過(guò)蛋白酶解活性或者通過(guò)經(jīng)由腎或肝臟的消除而快速?gòu)难h(huán)中消除。因此，一般希望或者必須通過(guò)配制或衍生化來(lái)操控藥物以達(dá)到合適的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明的目的是克服或改善現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)缺點(diǎn)或者提供有用特征。本發(fā)明的一個(gè)方面是改善胰島素經(jīng)由人組織的吸收。本發(fā)明的另一個(gè)方面是改善胰島素的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供具有令人滿(mǎn)意物理穩(wěn)定性的胰島素。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供具有令人滿(mǎn)意化學(xué)性質(zhì)的胰島素。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供具有令人滿(mǎn)意蛋白酶解穩(wěn)定性的胰島素。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供具有令人滿(mǎn)意溶解性的胰島素。定義本文中的術(shù)語(yǔ)"胰島素"包括來(lái)自任何物種的胰島素，例如豬胰島素、牛胰島素和人胰島素及其復(fù)合物例如鋅復(fù)合物，包括二聚體和低聚體，例如其六聚體。此外，本文中的術(shù)語(yǔ)"胰島素"包括所謂的"胰島素類(lèi)似物"。胰島素類(lèi)似物是，相對(duì)于天然人胰島素分子，具有A和/或B氨基酸鏈的一個(gè)或多個(gè)突變、取代、刪除和/或添加的胰島素分子。更具體來(lái)說(shuō)，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可能已經(jīng)與另外的氨基酸殘基交換，和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可能已經(jīng)被刪除，和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可能已經(jīng)被添加，條件是所述胰島素類(lèi)似物具有足夠的胰島素活性。胰島素類(lèi)似物優(yōu)選是這樣的，其中一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸殘基，優(yōu)選l、2或3個(gè)天然存在的氨基酸殘基已經(jīng)被另一可編碼氨基酸殘基替代。因此，B鏈的第28位可以從天然Pro殘基修飾為Asp、Lys或lie中的一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在B29位的Lys修飾為Pro;此外，在A21位的Asn可以修飾為Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val,特別是修飾為Gly、Ala、Ser或Thr，并且優(yōu)選修飾為Gly。此外，在B3位是Asn可以修飾為L(zhǎng)ys。胰島素類(lèi)似物的另外實(shí)例是desB30人胰島素和desBl人胰島素。胰島素類(lèi)似物的實(shí)例描述于下列專(zhuān)利及其同族專(zhuān)利中US5,618,913、EP254,516、EP280,534、US5,750,497和US6,011,007。具體胰島素類(lèi)似物的實(shí)例是門(mén)冬氨胰島素(即AspB28人胰島素)和賴(lài)脯胰島素(即LysB28，ProB"人胰島素)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)胰島素類(lèi)似物不包括具有A和/或B鏈的添加的胰島素分子，這是指A鏈由不超過(guò)21個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，而B(niǎo)鏈由不超過(guò)30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)胰島素類(lèi)似物不包括這樣的胰島素分子，其中與人胰島素相比，超過(guò)6個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)4個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選不超過(guò)2個(gè)氨基酸殘基被交換。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)胰島素類(lèi)似物不包括這樣的胰島素分子，其中與人胰島素相比，超過(guò)2個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)1個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被刪除。在本文中，術(shù)語(yǔ)"胰島素殘基"包括如上所定義的胰島素，其中氫原子已經(jīng)被從氨基上除去和/或羥基已經(jīng)被從羧基上除去。在本文中，使用已知且常用的1或3字母代碼來(lái)表示氨基酸。術(shù)語(yǔ)"氨基酸殘基"包括氫原子已經(jīng)被從氨基上除去和/或羥基已經(jīng)被從羧基上除去的氨基酸。在本文中，氨基酸優(yōu)選是可編碼(a)氨基酸。在本文中，術(shù)語(yǔ)"低聚體"包括單體(氨基酸殘基)的重復(fù)單位。低聚體中單體的數(shù)目可以多至800。在本文中，術(shù)語(yǔ)"氨基酸低聚體"包括相當(dāng)均勻序列的氨基酸，優(yōu)選可編碼(a)氨基酸的鏈。這樣的氨基酸低聚體的實(shí)例是例如甘氨酸的同型低聚體，或者二肽或三肽的重復(fù)單位。在本文中，術(shù)語(yǔ)"氨基酸低聚體殘基，，包括氫原子已經(jīng)被從氨基上除去和/或羥基已經(jīng)被從羧基上除去的氨基酸低聚體，即低聚體的單體。在本文中，術(shù)語(yǔ)"可編碼氨基酸"包括可通過(guò)核普酸三聯(lián)體("密碼子")編碼的氨基酸。在體內(nèi)，人胰島素是作為由具有24個(gè)氨基酸的前肽構(gòu)成的單鏈前體前胰島素(前胰島素原)合成的，接著是下列構(gòu)造的含有86個(gè)氨基酸的前胰島素前肽-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A,其中A和B分別是胰島素的A鏈和B鏈，C是具有31個(gè)氨基酸的連接肽，并且其中在Cys殘基之間具有3個(gè)二硫化物橋。在本文中，術(shù)語(yǔ)單鏈胰島素包括分子前肽-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A,其中A和B鏈分別對(duì)應(yīng)于所關(guān)注胰島素類(lèi)似物的A和B鏈。在本文中，所述連接肽還可以稱(chēng)為C肽。本文所用術(shù)語(yǔ)"治療"的意思是為了抗擊疾病、障礙或病癥而對(duì)患者進(jìn)行預(yù)防、管理和照料。該術(shù)語(yǔ)包括預(yù)防疾病，延遲疾病、障礙或病癥的進(jìn)展，緩解或減輕癥狀和并發(fā)癥，和/或疾病、障礙或病癥的治愈或排除。待治療的患者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，特別是人。在本文中，術(shù)語(yǔ)"疏水性，，是用作相對(duì)于人胰島素的疏水性，并且是通過(guò)描述為"測(cè)定V"的HPLC來(lái)測(cè)定的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及連接有一個(gè)或多個(gè)氨基酸低聚體的胰島素，在本文中，這樣的產(chǎn)物稱(chēng)為延長(zhǎng)胰島素(extendedinsulin)。所述延長(zhǎng)胰島素的生物物理性質(zhì)例如極性、溶解性和大小得以調(diào)節(jié)。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的生物物理性質(zhì)可以通過(guò)改變所連接的低聚體中的氨基酸類(lèi)型以及低聚體長(zhǎng)度來(lái)精細(xì)地調(diào)節(jié)。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的這些改變的生物物理性質(zhì)導(dǎo)致在對(duì)患者給藥后延長(zhǎng)的作用特征，并且適于口服給藥或經(jīng)肺給藥。優(yōu)選實(shí)施方案的描述已經(jīng)意料不到地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)胰島素的A-鏈或B-鏈的C-末端(和B-鏈的N-末端)的氨基酸低聚體的長(zhǎng)延長(zhǎng)-本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素-具有令人關(guān)注的特征a)它們具有高度保留的胰島素受體親和力，和b)它們?cè)隗w內(nèi)給藥后表現(xiàn)出延長(zhǎng)的作用特征。正式地，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素是由如上所定義的胰島素和一個(gè)或多個(gè)氨基酸低聚體構(gòu)建的。在本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素中，氨基酸低聚體的一個(gè)末端經(jīng)由肽鍵與胰島素殘基連接，但是所述氨基酸低聚體的另一個(gè)末端不與胰島素殘基連接。氨基酸低聚體可以例如通過(guò)重組方法與胰島素殘基連接。這樣的方法自身是已知的，并且它們是例如下述方法。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素可以例如這樣產(chǎn)生將編碼本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的DNA序列在合適的宿主細(xì)胞中通過(guò)眾所周知的技術(shù)例如在US專(zhuān)利6500645中公開(kāi)的技術(shù)來(lái)表達(dá)。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素作為包含C-肽或連接B鏈C-末端與A鏈N-末端的肽鍵的單鏈胰島素表達(dá)，或者作為還包含單鏈胰島素的前體分子來(lái)表達(dá)，該單鏈胰島素在B-鏈上也含有N-末端前體延長(zhǎng)部分。該N-末端前體延長(zhǎng)部分可以具有提高直接表達(dá)的產(chǎn)物的產(chǎn)量的功能，并長(zhǎng)度可以最高達(dá)到15個(gè)氨基酸殘基。在從培養(yǎng)培養(yǎng)液中分離后，N-末端前體延長(zhǎng)部分將在體外被切除，并因此具有緊接著B(niǎo)-鏈N-末端的切割位點(diǎn)(Lys或Arg)。適于本發(fā)明的類(lèi)型的N-末端前體延長(zhǎng)部分公開(kāi)在U.S.專(zhuān)利5,395,922和歐洲專(zhuān)利765,395A中。這樣的前體延長(zhǎng)部分的一個(gè)實(shí)例是EEAEAEAPK。前體延長(zhǎng)部分通過(guò)蛋白酶解，例如通過(guò)胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶而從前體單鏈胰島素上被切割下來(lái)。該切割還切掉C-肽(或者，如果沒(méi)有C-肽，切掉A鏈的N-末端(例如Al)與B鏈的C-末端(例如B30)之間的鍵)，并且由此將前體單鏈胰島素轉(zhuǎn)化成成熟雙鏈胰島素分子。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素不含有這樣的前體延長(zhǎng)部分，并且本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素是所有成熟的雙鏈胰島素分子?？梢酝ㄟ^(guò)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備編碼各延長(zhǎng)胰島素多肽的多核苦酸序列，例如Beaucage等人，(1981)TetrahedronLetters21:1859-1869所描述的亞磷酰胺法(phosphoamiditemethod)或者M(jìn)atthes等人(1984)EMBOJournal2:801-805描述的方法。根據(jù)亞磷酰胺法，合成寡核苷酸，例如在自動(dòng)DNA合成儀上合成，純化、復(fù)制(duplexed)并連接以形成合成的DNA構(gòu)建體。目前優(yōu)選的制備DNA構(gòu)建體的優(yōu)選方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。多核苦酸序列也可以是混合的基因組、cDNA和合成來(lái)源的。例如，編碼前導(dǎo)肽的基因組或cDNA序列可以連4^到編碼A和B鏈的基因組或cDNA序列上，之后，可以通過(guò)插入編碼期望氨基酸序列的合成寡核苷酸在位點(diǎn)將DNA序列修飾，用于根據(jù)眾所周知的方法進(jìn)行同源重組，或者優(yōu)選通過(guò)適當(dāng)寡核苦酸的PCR來(lái)產(chǎn)生。能夠在選擇的微生物或宿主細(xì)胞中復(fù)制并且攜帶編碼延長(zhǎng)胰島素多肽的多核苷酸序列的重組載體可以是是自動(dòng)復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴(lài)于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或者人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的工具?；蛘?，載體可以是在被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，被整合到基因組中并且與其整合的染色體共同復(fù)制的載體。此外，可以使用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或者共同含有將被引入宿主細(xì)胞基因組的總DNA的兩個(gè)或者更多個(gè)載體或質(zhì)粒，或者可以使用轉(zhuǎn)座子。載體可以是線性的或者閉環(huán)質(zhì)粒，并且優(yōu)選含有能夠使載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中并且載體不依賴(lài)基因組進(jìn)行自動(dòng)復(fù)制的元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體能夠在酵母中復(fù)制。實(shí)現(xiàn)載體在酵母中復(fù)制的序列的實(shí)例是酵母質(zhì)粒2pm復(fù)制基因REP1-3以及復(fù)制起始點(diǎn)。載體可以含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，其能夠容易選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是其產(chǎn)物提供生物殺滅劑或病毒抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型原養(yǎng)等的基因。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的例子是來(lái)自枯草芽胞桿菌(S(2"'〃wssw6/77/s)或J也衣芽孑包4干菌(Bac7'〃ws/z'c/zem/orm^s)的<ab/基因,或者提供抗生素抗性例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞中的選擇行標(biāo)記包括am必(乙酰胺酶)、"rgS(鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶)、"K7(乳清酸核苷-5，-磷酸酯脫羧酶)和fr;C(鄰氨基苯曱酸酯合成酶)。酵母宿主細(xì)胞的適當(dāng)標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。酵母的非常適當(dāng)選擇性標(biāo)記是粟酒裂殖酵母(Sc/nzcwacc/zaro附y(tǒng)c^/wm6e)TPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。在載體中，多核香酸序列被可操作地連接到適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列。啟動(dòng)子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，其包括突變、截短和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從對(duì)于宿主細(xì)胞同源或異源的編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)細(xì)菌宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的實(shí)例是從大腸桿菌(￡".co//)乳糖操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(5^ep"wyc^coe/z'co/or)瓊脂糖酶基因(^gj)、枯草芽孢桿菌(Sac/〃船w^7&)果聚糖蔗糖酶基因0"c^)、地衣芽孢桿菌(^c/〃ws/zc/zem/b^m力a-淀粉酶基因O附y(tǒng)丄)、嗜熱芽孢桿菌(Ba"'〃wsWearaf/2^mo//n7ws)麥芽糖淀粉酶基因(am少M(fèi))、解淀粉芽孢桿菌(Sac"/wamy/o/^rwe/a"'e"s)a-淀粉酶基因("wy2)和地衣芽孢桿菌0^"〃M/,c/zemybr脂力青霉素酶基因(/7e"尸)的啟動(dòng)子。用于指導(dǎo)在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的實(shí)例是從米曲霉(JwergW/wsor少zae)TAKA淀并分酶、米黑才艮毛霉(W/z/zomwcorm/e/z"')天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A^erg/〃w中性a-淀粉酶和黑曲霉(A^erg/〃M酸穩(wěn)定a-淀粉酶基因獲得的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，可以4吏用的啟動(dòng)子是酉良酒酵母(Sacc/wramycwcerevzw'"e)Mal、TPI、ADH或PGK啟動(dòng)子。多核香酸構(gòu)建體還典型地可操作地連接到適當(dāng)?shù)慕K止子上。在酵母中，適當(dāng)?shù)慕K止子是TPI終止子(Alber等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。分別用于連接編碼所需胰島素多肽、啟動(dòng)子和終止子的多核苷酸序列并將它們加入到含有在選擇的宿主中復(fù)制所必需信息的適當(dāng)載體中的程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。能夠理解，可以通過(guò)首先制備含有編碼本發(fā)明單鏈胰島素的整個(gè)DNA序列的DNA構(gòu)建體，隨后將該片段插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，或者或通過(guò)連續(xù)插入含有單獨(dú)元件的遺傳信息(例如信號(hào)肽、原肽、連接肽、A鏈和B鏈)隨后進(jìn)行連接而構(gòu)建所述載體。將含有這樣的多核苷酸序列的載體弓1入到宿主細(xì)胞中，以便載體被保持為染色體整合物，或者作為自復(fù)制染色體外載體。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞，，包括親代細(xì)胞的任何后代，其由于在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與親代細(xì)胞并不一致。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物例如原核細(xì)胞或非單細(xì)胞微生物例如真核細(xì)胞?？梢允褂玫膯魏思?xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，其包括但不限于芽孢桿菌屬(Sac,7/M)細(xì)胞、鏈霉菌屬(&^^om_ycw)細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌(￡.co/O和假單胞菌(尸w^fomo"a^sp)。真核細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。用于本發(fā)明的酵母生物體可以是任何適當(dāng)?shù)慕湍干矬w，通過(guò)培養(yǎng)，其產(chǎn)生大量本發(fā)明的單鏈胰島素。適當(dāng)?shù)慕湍干矬w的實(shí)例是選自下列的菌林酉良酒酵母(5^cc/zaramycwcerev/s/^e)、Sacc/zaramycesA:/w_yven'、粟酒裂歹直酵母(iSc/n'zc^acc/zarom少c^;om6e)、S"cc/on9^ycesrn^rww、乳酉交克魯維斯酵母(A7w少veramyces/acto)、漢遜酵母(Z/a朋e肌/(2po/，orp/za)、畢赤酵母(尸/c/z/a;(3WonV)、曱醇畢赤酵母(尸/c/z/ame"<3/7o//c")、尸/c/naA/i(yven、耶羅維亞酵母(7^raw/a/^3/(y"ca)、假絲酵母屬(C"m/z^^.)物種、產(chǎn)朊假絲酵母(Q7"d,tfo、C""t/W(3cac⑧/'、地霉屬(Geo/77'c/zwms/.)4勿種禾口Geo/rzc/zwm/en7ewf(37w。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以例如通過(guò)形成原生質(zhì)體隨后以本身已知的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于酵母生物體生長(zhǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)基。可以從培養(yǎng)基中回收分泌的胰島素多肽(其大比例將以正確處理的形式存在于培養(yǎng)基中)，這通過(guò)傳統(tǒng)的程序，包括通過(guò)離心從培養(yǎng)基分離酵母細(xì)胞，通過(guò)離子交換基質(zhì)或反相吸附基質(zhì)進(jìn)行過(guò)濾或捕獲胰島素前體，通過(guò)鹽例如石克酸銨沉淀上清液或?yàn)V液的蛋白質(zhì)組分，隨后通過(guò)各種層析程序例如離子交換層析、親和層析等進(jìn)行純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一些延長(zhǎng)胰島素的半衰期得到改善，使得它們適于每周一次給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的使得它們適于每?jī)商煲淮谓o藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的使得它們適于每天一次給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的使得它們適于每天兩次給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的使得它們適于每天三次給藥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<25。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<20。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<15。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<1。一些延長(zhǎng)胰島素的半衰期得到改善，一些延長(zhǎng)胰島素的半衰期得到改善，一些延長(zhǎng)胰島素的半衰期得到改善,一些延長(zhǎng)胰島素的半衰期得到改善,在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<0.5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<0.1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<0.05。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性<0.01。藥物組合物本發(fā)明化合物，即延長(zhǎng)胰島素可以例如皮下給藥、口服給藥或經(jīng)肺給藥。對(duì)于皮下給藥，類(lèi)似已知的胰島素制劑，配制本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素。此外，對(duì)于皮下給藥，類(lèi)似已知胰島素的給藥，給藥本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素，并且通常醫(yī)生了解該程序。對(duì)于口服給藥，類(lèi)似口服給藥的其他藥物的制劑，配制本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素。此外，對(duì)于口服給藥，類(lèi)似已知口服藥物的給藥，給藥本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素，并且通常醫(yī)生了解該程序。對(duì)于經(jīng)肺給藥產(chǎn)品，給出下列細(xì)節(jié)本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素可以通過(guò)以有效提高循環(huán)胰島素水平和/或降低循環(huán)葡萄糖水平的劑量進(jìn)行吸入給藥。這類(lèi)給藥能夠有效治療病癥例如糖尿病或高血糖癥。獲得胰島素的有效劑量需要給藥超過(guò)大約0.5pg/kg到大約50(ig/kg本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的吸入劑量。有知識(shí)的從業(yè)者通過(guò)考慮多種因素包括胰島素水平、血液葡萄糖水平、患者的身體條件、患者的肺部狀態(tài)等能夠確定治療有效量。根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)吸入遞送本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素，以達(dá)到其吸收。通過(guò)吸入給藥可帶來(lái)與胰島素的皮下給藥相差不大的藥物動(dòng)力學(xué)。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的吸入導(dǎo)致循環(huán)胰島素水平增加，之后是血糖水平的下降。當(dāng)對(duì)類(lèi)似的粒度和類(lèi)似的肺沉積水平進(jìn)行比較時(shí)，不同的吸入裝置典型地提供類(lèi)似的藥物動(dòng)力學(xué)。根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)任何多種本領(lǐng)域中已知的用于通過(guò)吸入給藥治療藥物的吸入裝置遞送本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素。這些裝置包括計(jì)量式吸入器、霧化器、干粉發(fā)生器、噴霧器等。優(yōu)選地，通過(guò)干粉吸入器或噴霧器遞送本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素。存在多種用于給藥本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素的吸入裝置的期望部件。例如通過(guò)吸入裝置的遞送有利地是可靠的、可再現(xiàn)的和精確的。吸入裝置應(yīng)當(dāng)遞送小顆粒，例如低于大約lO)iim,例如大約l-5jim,用于達(dá)到非常適合呼吸。適于實(shí)施本發(fā)明的商業(yè)可以獲得的吸入裝置的具體實(shí)例是Turbohaler(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、Spiros吸入器(Dura)、InhaleTherapeutics所銷(xiāo)售的裝置、AERxTM(Aradigm)、Ultmvent⑧噴霧器(Mallinckrodt)、Acorn11⑧噴霧器(MarquestMedicalProducts)、Ventolin計(jì)量施吸入器(Glaxo)、Spinhaler⑧粉末吸入器(Fisons)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的制劑，所遞送制劑的量以及單次劑量給藥的持續(xù)時(shí)間依賴(lài)于所采用的吸入裝置類(lèi)型。對(duì)于某些氣霧劑遞送系統(tǒng)，例如噴霧器，給藥的頻率和系統(tǒng)激活的時(shí)間長(zhǎng)度將主要依賴(lài)于氣霧劑中延長(zhǎng)胰島素的濃度。例如，對(duì)于在噴霧器溶液中較高濃度的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素，可以使用較短的給藥時(shí)間段。裝置例如計(jì)量劑量吸入器能夠產(chǎn)生較高的氣霧劑濃度，并且能夠運(yùn)行較短的時(shí)間以遞送期望量的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素。裝置例如粉末吸入器遞送活性藥物，直到從該裝置排出給定量的藥物。在這種類(lèi)型的吸入器中，給定量的粉末中本發(fā)明胰島素延長(zhǎng)胰島素的量決定了單次給藥中所遞送的劑量。在通過(guò)吸入裝置遞送的制劑中本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的粒度對(duì)于胰島素進(jìn)入肺部，優(yōu)選進(jìn)入下呼吸道或肺泡的能力是至關(guān)重要的。優(yōu)選地，本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素被這樣配制，使得至少大約10%所遞送的延長(zhǎng)胰島素沉積在肺中，優(yōu)選大約1020%,或者更多。已知對(duì)于口呼吸的人肺部沉積的最大效率是通過(guò)使用大約2)im大約3的粒度獲得的。當(dāng)粒度超過(guò)大約5時(shí)，肺部沉積顯著降低。低于大約1pm的粒度造成肺部沉積降低，并且難以遞送治療有效足夠量的顆粒。因此，通過(guò)吸入所遞送的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的顆粒具有優(yōu)選低于大約lO)nm的粒度，更有選在大約1)im大約5|im的范圍內(nèi)的粒度。對(duì)本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的制劑進(jìn)行選擇，以在所選擇的吸入裝置中產(chǎn)生期望的粒度。有利地，為了作為干粉進(jìn)行給藥，本發(fā)明化合物被制成顆粒形式，其粒度低于大約10|iim,優(yōu)選大約l至大約5|iim。優(yōu)選的粒度能夠有效地遞送到患者的肺泡。優(yōu)選地，干粉大部分由所產(chǎn)生的顆粒組成，大部分顆粒具有期望范圍內(nèi)的尺寸。有利地，至少大約50%的干粉是由直徑低于大約10pm的顆粒制成的?？梢酝ㄟ^(guò)噴霧干燥、研磨或臨界點(diǎn)冷凝含有本發(fā)延長(zhǎng)胰島素和其他所需成分的溶液來(lái)制備這樣的制劑。同樣適于產(chǎn)生可以用于本發(fā)明的顆粒的其他方法是本領(lǐng)域中已知的。通常從容器中的干粉制劑分離這些顆粒，接著經(jīng)由載體氣流轉(zhuǎn)運(yùn)到患者的肺中。典型地，在目前的干粉吸入器中，用于破碎固體的力完全是由患者的吸入提供的。一種合適的干粉吸入器是由Astra生產(chǎn)的TurbohalerTM(S0dertalje,Sweden)。在另一類(lèi)型的吸入器中，患者的吸入所產(chǎn)生的氣流驅(qū)動(dòng)了葉輪馬達(dá)，這解聚了單體胰島素類(lèi)似物顆粒。DuraSpirosTM吸入器是這樣的裝置。用于從干粉吸入器給藥的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的制劑典型地包括含有本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的精細(xì)分開(kāi)的干粉，但粉末還可以包含填充劑、載體、賦形劑、其他添加劑等。在本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的干粉制劑中可i,為;輔助加工制劑，為了對(duì)制劑提供^利的粉末性質(zhì)，為了輔助從吸入裝置分散粉末，為了穩(wěn)定制劑(例如抗氧化劑或緩沖劑)，為了為制劑提供味道等。有利地，添加劑并不負(fù)面影響患者的氣道。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素可以在分子水平上與添加劑混合，或者固體制劑可以包括本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的顆粒，所述本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的顆粒與添加劑混合或者涂布在顆粒上。典型的添加劑包括單糖、雙糖和多糖；糖醇和其他多元醇例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖醇、麥芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、淀粉或其組合；表面活性劑例如山梨糖醇、二磷酯酰膽石咸或卵磷脂；等。典型地，添加劑例如填充劑以有效達(dá)到上述目的的量存在，通常占制劑的大約50重量％大約90重量％。在制劑中還可以包含其它他本領(lǐng)域中已知用于蛋白質(zhì)例如胰島素類(lèi)似物蛋白質(zhì)制劑的試劑?？梢酝ㄟ^(guò)迫使本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的懸浮液或溶液在壓力下通過(guò)噴嘴而產(chǎn)生包含本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的噴霧?？梢詫?duì)噴嘴尺寸和結(jié)構(gòu)、所采用的壓力以及液體供給速度進(jìn)行選擇以達(dá)到期望的輸出和粒度。可以產(chǎn)生電噴射，例如通過(guò)與毛細(xì)管或噴嘴供給連接的電場(chǎng)。有利地，通過(guò)噴霧器遞送的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的顆粒具有低于大約10|iim的粒度，優(yōu)選在大約lpm至大約5^im的范圍內(nèi)。適用于噴霧器的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的制劑典型地在水溶液中包含本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素，其濃度為每毫升溶液大約1mg至大約500mg本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素。制劑可以包含試劑例如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑以及優(yōu)選鋅。制劑還可以包含賦形劑或者用于穩(wěn)定本發(fā)明胰島素的試劑，例如緩沖劑、還原劑、填充蛋白質(zhì)(bulkprotein)或糖類(lèi)?？梢杂糜谂渲票景l(fā)明胰島素的填充蛋白質(zhì)包括白蛋白、魚(yú)精蛋白等?？梢杂糜谂渲票景l(fā)明胰島素的典型糖類(lèi)包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。本發(fā)明胰島素制劑還可以包含表面活性劑，其降低或者防止在形成氣霧劑中由于溶液的霧化而造成的表面誘導(dǎo)的本發(fā)明胰島素聚合。可以采用各種傳統(tǒng)的表面活性劑，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制劑的大約0.001至大約4重量％之間。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本領(lǐng)域中已知用于配制蛋白例如胰島素類(lèi)似物蛋白的另外的物質(zhì)也可以包括在制劑中。本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素可以通過(guò)噴霧器，例如噴射式噴霧器或超聲噴霧器來(lái)給藥。通常，在噴射式噴霧器中，使用壓縮空氣源來(lái)經(jīng)由孔口產(chǎn)生高速空氣噴射。當(dāng)氣體擴(kuò)散出噴嘴時(shí)，產(chǎn)生了低壓區(qū)域，這將本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的溶液經(jīng)由與液體貯庫(kù)連接的毛細(xì)管抽出。從毛細(xì)管抽出的液流在離開(kāi)管時(shí)被剪切成不穩(wěn)定的液絲和液滴，產(chǎn)生噴霧?？刹捎枚喾N構(gòu)造、流速和擋板類(lèi)型來(lái)從給定的噴射式噴霧器獲得所需性能特征。在超聲噴霧器中，使用高頻電能來(lái)產(chǎn)生振動(dòng)機(jī)械能，通常采用壓電轉(zhuǎn)換器。將該能量直接或經(jīng)由耦合液體傳遞給本發(fā)明胰島素制劑，產(chǎn)生包含本發(fā)明胰島素的氣霧劑。有利地，通過(guò)噴霧器遞送的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素顆粒具有小于約10|Lim，優(yōu)選約1pm至約5(im的粒度。適于通過(guò)噴射式噴霧器或超聲噴霧器使用的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素制劑包括在水溶液中的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素，其中本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的濃度為約1mg至約20本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素每ml溶液。制劑可以包括試劑例如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑以及優(yōu)選鋅。制劑還可以包含賦形劑或者用于穩(wěn)定本發(fā)明胰島素的試劑，例如緩沖劑、還原劑、填充蛋白質(zhì)(bulkprotein)或糖類(lèi)?？梢杂糜谂渲票景l(fā)明胰島素的填充蛋白質(zhì)包括白蛋白、魚(yú)精蛋白等?？梢杂糜谂渲票景l(fā)明胰島素的典型糖類(lèi)包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。本發(fā)明胰島素制劑還可以包含表面活性劑，其降低或者防止在形成氣霧劑中由于溶液的霧化而造成的表面誘導(dǎo)的本發(fā)明胰島素聚合?？梢圆捎酶鞣N傳統(tǒng)的表面活性劑，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制劑的大約0.001至大約4重量％之間。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本領(lǐng)域中已知用于配制蛋白例如胰島素類(lèi)似物蛋白的另外的物質(zhì)也可以包括在制劑中。在計(jì)量劑量吸入器(MDI)中，推進(jìn)劑、本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素和任何賦形劑或其他添加劑作為包括液化壓縮氣體的混合物包含在罐中。啟動(dòng)計(jì)量閥門(mén)釋放出作為氣霧劑的混合物，所述混合物優(yōu)選包含粒度為小于約10優(yōu)選為約1|Lim至約5pm的顆粒。所需氣霧劑粒度可以通過(guò)采用由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法，包括噴磨、噴霧干燥、臨界點(diǎn)冷凝等產(chǎn)生的本發(fā)明胰島素制劑來(lái)獲得。優(yōu)選的計(jì)量劑量包括由3M或Glaxo生產(chǎn)的并且采用六氟烴推進(jìn)劑的那些。用于通過(guò)計(jì)量劑量吸入器裝置使用的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的制劑一般包括細(xì)分散的粉末，所述粉末包含本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素作為在非水介質(zhì)中的懸浮液，例如借助于表面活性劑懸浮在推進(jìn)劑中。推進(jìn)劑可以是用于該目的的任何常規(guī)材料，例如氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟曱烷、二氯二氟曱烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氫氟烷烴-134a)、HFA-227(氫氟烷烴-227)等。優(yōu)選地，推進(jìn)劑是氫氟烴?？梢赃x擇表面活性劑來(lái)穩(wěn)定作為在推進(jìn)劑中的懸浮液的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素，以保護(hù)活性劑不發(fā)生化學(xué)降解等。合適的表面活性劑包括脫水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情況下，使用溶劑例如乙醇的溶液氣霧劑是優(yōu)選的。本領(lǐng)域中已知用于配制蛋白例如胰島素類(lèi)似物蛋白的另外的物質(zhì)也可以包括在制劑中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明方法可以通過(guò)經(jīng)由本文沒(méi)有描述的裝置來(lái)經(jīng)肺給藥本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素，并且適于通過(guò)吸入給藥的藥物組合物或制劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素可以用于制備適于通過(guò)吸入給藥的制劑或藥物。本發(fā)明還涉及制備包含本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的呈適于通過(guò)吸入給藥的形式的制劑的方法。例如，可以使用常規(guī)技術(shù)，通過(guò)幾種方法來(lái)生產(chǎn)干粉制劑?？梢酝ㄟ^(guò)微粉化、研磨、噴霧干燥等來(lái)制備具有適于在下呼吸道中達(dá)到最大沉積的粒度范圍的顆粒。并且可以通過(guò)將本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素溶解在具有適當(dāng)pH，包括緩沖劑或其他賦形劑的合適的溶劑例如水中來(lái)制備。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及給藥本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的方法，所述方法包括通過(guò)肺裝置給有此需要的患者施用有效量的所述化合物；并且優(yōu)選地，所述化合物經(jīng)由患者的嘴吸入。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的藥物制劑，其中本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素以0.1mg/ml至500mg/ml的濃度存在，并且其中所述制劑具有2.0至10.0的pH。所述制劑還可以包含蛋白酶抑制劑、緩沖系統(tǒng)、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑是水制劑，即包含水的制劑。這樣的制劑通常是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑是水溶液。術(shù)語(yǔ)"水制劑"定義為包含至少50%(重量/重量)水的制劑。同樣，術(shù)語(yǔ)"水溶液"定義為包含至少50%(重量/重量)水的溶液，并且術(shù)語(yǔ)"水懸浮液"定義為包含至少50%(重量/重量)水的懸浮液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑是冷凍干燥制劑，其中在使用之前醫(yī)生或患者加入溶劑和/或稀釋劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑是在溶解之間沒(méi)有任何溶解的干燥制劑(例如凍干或噴霧干燥的)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素和緩沖劑的水溶液，其中所述延長(zhǎng)胰島素以0.1mg/ml或更高的濃度存在，并且其中所述制劑具有約2.0至約10.0的pH。用于口服給藥的制劑可通過(guò)任何已知方法來(lái)制備，并且這樣的制劑可包含一種或多種選自下列的物質(zhì)調(diào)味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑，以提供藥物美觀和適口制劑。片劑可以含有與適于制備片劑的無(wú)毒可藥用賦形劑混合的活性組分。這些賦形劑可以是例如惰'性稀釋劑例如甘露醇、麥芽糖糊精、高嶺土、碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸4丐或磷酸鈉；制粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉；粘合劑，例如淀粉、明膠、聚酯或阿拉伯膠；和潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是未包衣的，或者可以通過(guò)已知技術(shù)將其包衣以延遲治療活性多肽的崩解或釋放。可以根據(jù)藥物化學(xué)中眾所周知的方法制備和給藥本發(fā)明的口服給藥制劑,參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences,17thed.(A.Osoled.,1985)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物制劑可以通過(guò)固體劑型例如片劑和膠嚢來(lái)給藥。片劑可以通過(guò)濕法制粒、干法制粒、直接壓片或熔化制粒來(lái)制備。本發(fā)明片劑可以使用常規(guī)制片技術(shù)來(lái)制備。一般制備方法涉及將延長(zhǎng)胰島素、水溶性稀釋劑、親水性粘合劑和任選一部分崩解劑混合。然后將混合物與親水性粘合劑水溶液或親水性粘合劑與表面活性劑的水溶液制粒，并且如果需要的話(huà)進(jìn)行研磨。將顆粒干燥，并且降至合適的尺寸。將任何其他組分例如潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂)和另外的崩解劑加到顆粒中，并且混合。然后將該混合物壓縮成合適的尺寸，并且使用常規(guī)制片機(jī)例如旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)制片。可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將片劑進(jìn)行膜包衣。用于口服使用的制劑還可以作為硬或軟明膠膠嚢遞送，其中將活性組分與惰性固體稀釋劑例如甘露醇、麥芽糖糊精、碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、高嶺土、磷酸4丐或磷酸鈉混合，或者作為軟明膠膠嚢遞送，其中將活性組分與水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。用于本發(fā)明的膠嚢可以使用常規(guī)方法來(lái)制備。制備方法一般包括將治療活性肽、藻酸鹽、水溶性稀釋劑、親水性粘合劑以及任選一部分崩解劑混合。然后將該混合物用親水性粘合劑水溶液或親水性粘合劑與表面活性劑的水溶液制粒，并且如果需要的話(huà)進(jìn)行研磨。將顆粒干燥，并且降至合適的尺寸。將任何其他組分例如潤(rùn)滑劑加到顆粒中，并且混合。然后使用常規(guī)膠嚢填充機(jī)器將使得混合物填充到適當(dāng)尺寸的硬殼明膠膠嚢中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰基甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、磷酸二氬鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥基甲基)-氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、麥黃酮、蘋(píng)果酸、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖劑中的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的另外的實(shí)施方案。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含可藥用防腐劑。防腐劑以足以獲得保護(hù)作用的量存在。藥物制劑中防腐劑的量是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以由例如本領(lǐng)域中的文獻(xiàn)和/或例如市售產(chǎn)品中防腐劑的已知量確定。這些具體防腐劑中的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的另外的實(shí)施方案。防腐劑在藥物組合物中的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。方便起見(jiàn)，請(qǐng)參見(jiàn)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含螯合劑。螯合劑在藥物組合物中的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。方便起見(jiàn)，請(qǐng)參見(jiàn)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含穩(wěn)定劑。本文所用術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定劑"是指加到含有多肽的藥物制劑中以穩(wěn)定肽，例如增加這樣的制劑的儲(chǔ)存期和/或使用時(shí)間的化學(xué)物質(zhì)。穩(wěn)定劑在藥物組合物中的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。方便起見(jiàn)，請(qǐng)參見(jiàn)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含表面活性劑。本文所用術(shù)語(yǔ)"表面活性劑"是指由水溶性(親水性)部分、頭以及脂溶性(親脂性)部分構(gòu)成的任何分子或離子。表面活性劑優(yōu)選在界面聚集，在界面，親水性部分朝向水(親水相)，親脂性部分朝向郵或疏水相(即玻璃、空氣、油等)。表面活性劑開(kāi)始形成膠束的濃度稱(chēng)為臨界膠束濃度或CMC。此外，表面活性劑降低液體的表面張力。表面活性劑還稱(chēng)為兩親化合物。術(shù)語(yǔ)"洗滌劑，，是常用于表面活性劑的同義詞。表面活性劑在藥物組合物中的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。方便起見(jiàn)，請(qǐng)參見(jiàn)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含蛋白酶抑制劑。其他組分也可以存在于本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素藥物制劑中。這樣的另外組分可包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、抗氧化劑、增量劑、張力調(diào)節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油性載體、蛋白(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白)和兩性離子(例如氨基酸如甜菜堿、?；撬?、精氨酸、甘氨酸和組氨酸)。當(dāng)然，這樣的另外組分對(duì)于本發(fā)明藥物制劑的整個(gè)穩(wěn)定性應(yīng)當(dāng)沒(méi)有不利影響。更精確地，本發(fā)明還涉及下列實(shí)施方案a)本文所述的方法，其中本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素遞送到患者的下氣道中。b)本文所述的方法，其中本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素沉積在肺泡中。C)本文所述的方法，其中本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素作為藥物制劑給藥，所述藥物制劑在可藥用載體中包含本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素。d)本文所述的方法，其中所述制劑選自在水介質(zhì)中的溶液以及在非水介質(zhì)中的懸浮液。e)本文所述的方法，其中所述制劑作為氣霧劑給藥。f)本文所述的方法，其中制劑呈干粉形式。g)本文所述的方法，其中制劑具有小于約IO微米的粒度。h)本文所述的方法，其中制劑具有約1至約5微米的粒度。i)本文所述的方法，其中所述制劑具有約2至約3微米的粒度。j)本文所述的方法，其中至少約10%的遞送的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素沉積在肺中。k)本文所述的方法，其中本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素從適于經(jīng)肺給藥并且能夠?qū)⒁葝u素類(lèi)似物沉積在患者肺中的吸入裝置中遞送。l)本文所述的方法，其中裝置選自霧化器、計(jì)量劑量吸入器、干粉吸入器和噴霧器。m)本文所述的方法，其中所述裝置是干粉吸入器。n)本文所述的方法，其中所述裝置是霧化器。o)本文所述的方法，其中所述裝置是計(jì)量劑量吸入器。p)本文所述的方法，其中所述裝置是噴霧器。q)本文所述的方法，其中啟動(dòng)所述裝置施用了約3pg/kg至約20|Lig/kg本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素，優(yōu)選約7^ig/kg至約14pg/kg本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素。r)本文所述的方法，其中所述本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素是在本文任何實(shí)施例中具體提及的任何胰島素。s)用于治療糖尿病的本文所述方法，所述方法包括通過(guò)經(jīng)肺方法給有此需要的患者施用有效劑量的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素。t)本文所述的方法，其中本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素是本文中具體提及的任何本發(fā)明具體延長(zhǎng)胰島素，尤其是在本文具體實(shí)施例中的具體延長(zhǎng)胰島素。雖然關(guān)于方法具體描述了上述實(shí)施方案，但是它們也類(lèi)似地適用于待使用的產(chǎn)品或制劑。本發(fā)明的優(yōu)選特征總而言之，本發(fā)明的特征如下1.延長(zhǎng)胰島素，所述延長(zhǎng)胰島素是通過(guò)酰胺鍵，優(yōu)選通過(guò)肽鍵與一個(gè)或多個(gè)氨基酸低聚體殘基連接的胰島素殘基(如上所定義)，所述氨基酸低聚體殘基包含至少5個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸殘基，并且不超過(guò)800個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)300個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)50個(gè)氨基酸殘基。2.前一子句的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體殘基由可編碼氨基酸殘基組成。3.前一子句的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體殘基不包含賴(lài)氨酸殘基。4.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體殘基由選自Gly、Glu、Pro和Ser殘基的氨基酸殘基組成。這些氨基酸殘基可相同或不同，并且可以以任何順序排列。5.前述子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體殘基由Gly殘基組成。6.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基中Gly殘基的量是至少80%(重量/重量)。7.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基中Gly殘基的量是至少80%(按數(shù)量計(jì))。8.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體中Gly殘基的量是至少85%(按數(shù)量計(jì))。9.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基中Gly殘基的量是至少90%(按數(shù)量計(jì))。10.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基中Gly殘基的量是至少95%(按數(shù)量計(jì))。11.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基是(Gly)n、(Gly-Pro-Pro)n、(Pro-Pro-Gly)n、(Gly-Ser)n、(Ser-Gly)n、(Gly-Glu)n或(Glu-Gly)n,其中n為給出氨基酸殘基的適當(dāng)數(shù)目的整數(shù)。12.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基在胰島素的一個(gè)位置Bl、A21、B29或B30上與氨基酸殘基連接，條件是所述氨基酸位于在低聚體殘基的連接位點(diǎn)前面的末端位置上。如果所迷Bl、A21、B29或B30位上的氨基酸不位于末端位置，則氨基酸低聚體殘基在一個(gè)下述位置連接氨基酸殘基胰島素的B0、B(-l)、A22、A23、B31或B32位。13.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中連接在B鏈的C-末端上的任何低聚體的末端都是精氨酸殘基。14.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基在胰島素的一個(gè)位置B29或B30上與氨基酸殘基連接，條件是所述氨基酸位于在低聚體殘基的連接位點(diǎn)前面的末端位置上，并且其中所述低聚體的末端是精氨酸殘基。15.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述胰島素殘基包含不超過(guò)51個(gè)氨基酸殘基。16.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述胰島素殘基是具有一個(gè)或多個(gè)下列任選修飾的人胰島素A14:E或D;A21:G、A或Q;B3:Q、S或T;B25:H;B28:D或E;B30:des(即desB30)。17.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述胰島素殘基是人胰島素、desB30人胰島素、門(mén)冬氨胰島素、A21Gly人胰島素、A21GlydesB30人月夷島素、Lispro或glulisine的殘基。18.前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述胰島素殘基上僅連接一個(gè)低聚體殘基。19.除最后一個(gè)前述子句之外的前述可能子句任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述胰島素殘基上恰好連接著兩個(gè)低聚體殘基。本文所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)和專(zhuān)利通過(guò)參照整體并入本文，達(dá)到將通過(guò)參照所并入本文的參考文獻(xiàn)單獨(dú)和具體地描述、并將其在本文中整體列出的相同程度(達(dá)到法律允許的最大程度)。本文所使用的所有標(biāo)題(heading)和亞標(biāo)題(sub-heading)僅是為了方便，而不應(yīng)該以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。除非以其他方式說(shuō)明，使用本文所提供的任何和全部實(shí)施例或示范性語(yǔ)言(例如"例如")僅僅是為了更好地舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不會(huì)對(duì)本發(fā)明的范圍造成限制。說(shuō)明書(shū)中的所有語(yǔ)言都不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為表示實(shí)施本發(fā)明所必需的任何非要求保護(hù)成分。在本文中引用和并入專(zhuān)利文件僅僅是為了方便而進(jìn)行的，并不會(huì)反應(yīng)任何有效性、專(zhuān)利性和/或這些專(zhuān)利文件的可實(shí)施性。本文所提到的文獻(xiàn)不承認(rèn)它們構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。在本文中，詞語(yǔ)"包含"需要被寬廣地解釋為意味著"包括"、"含有"或"包含"(EPO審查指南C4.13)。本發(fā)明包括所使用法律允許的所附權(quán)利要求中所引用的對(duì)象的所有修飾和等同。提供下列實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明，而不是限制。一屏殳方法構(gòu)建表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及表達(dá)本發(fā)明的胰島素前體所有的表達(dá)質(zhì)粒都是C-POT型的，這與EP171142中所描述的類(lèi)似，其特4正在于含有粟酒裂殖酵母(Sc/zz'zcw"cc/zaramycM/wm6e)丙4唐石舞酸異構(gòu)酶基因(POT)用于質(zhì)粒選擇和在釀酒酵母(S.中穩(wěn)定化的目的。這些質(zhì)粒還含有釀酒酵母(S.丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動(dòng)子和終止子。這些序列與質(zhì)粒pKFN1003(WO90/10075中所描述的)的相應(yīng)序列類(lèi)似，并且是除了編碼前導(dǎo)肽和胰島素產(chǎn)物融合蛋白的EcoRI-;^al片段之外的全部序列。為了表達(dá)不同的融合蛋白，僅僅將pKFN1003的EcoRI-A^al片段替換為感興趣的編碼前導(dǎo)肽-胰島素融合蛋白的￡c0jR/-A7)"I片段?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用合成的寡肽和PCR合成這些5"coRKWal片段。通過(guò)轉(zhuǎn)化宿主菌株釀酒酵母(S.ce"vzw^)菌林MT663(M4ra/M4ra^/^-3/>印4-3///W/7nWCir+)而制備酵母轉(zhuǎn)化體。在提交WO92/11378時(shí)，將酵母菌林MT663保藏在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,并提供了保藏號(hào)DSM6278。將MT663在YPGaL(1%Bacto酵母提取物、2%Bacto蛋白胨、2%半乳糖、1%乳酸鹽)上生長(zhǎng)，達(dá)到600nm處的O.D.為0.6。通過(guò)離心收集100ml培養(yǎng)物，使用10ml水進(jìn)行洗滌，重離心并重懸浮在10ml含有1.2M山梨醇、25mMNa2EDTApH=8.0和6.7mg/ml二石克蘇糖醇的溶液中。將懸浮液在30。C下培養(yǎng)15分鐘，離心，并將細(xì)胞重懸浮在10ml含有1.2M山梨醇、10mMNa2EDTA、0.1M檸檬酸鈉pH05.8和2mgNovozym234的溶液中。將懸浮液在30。C培養(yǎng)30分鐘，通過(guò)離心收集細(xì)胞，在10ml1.2M山梨醇和10mlCAS(1.2M山梨醇、10mMCaCl2、10mMTrisHCl(pH=7.5)中進(jìn)行洗滌，并重懸浮在2mlCAS中。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將1mlCAS-懸浮的細(xì)胞與大約O.lmg質(zhì)粒DNA混合，并在室溫保持15分鐘。加入1ml(20%聚乙二醇4000、10mMCaCl2、10mMTrisHClpH=7.5),并將該混合物在室溫再保持30分鐘。對(duì)混合物進(jìn)行離心，并將沉淀重懸浮在O.lmlSOS(1.2M山梨醇，33%v/vYPD,6.7mMCaCl2)中，并在30。C培養(yǎng)2小時(shí)。接著離心懸浮液，并將沉淀重懸浮在0.5ml1.2M山梨醇中。接著，在52。C加入6ml含有1.2M山梨醇+2.5%瓊脂的頂層瓊脂(Sherman等人(1982)MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory中的SC培養(yǎng)基)，并將懸浮液倒在含有相同瓊脂固化、含有山梨醇的培養(yǎng)基的平板的頂部。將用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的釀酒酵母(S.菌林MT663于3CTC在YPD中生長(zhǎng)72小時(shí)。延長(zhǎng)的胰島素前體(單鏈前體)在B-鏈末端具有以下延長(zhǎng)部分EEAEAEAPK，并且含有以下C-肽DGK。通過(guò)固定在Sepharose(EC3.4.21.50)上的Achromobacterlyticus賴(lài)氨酸特異性蛋白酶(ALP)將延長(zhǎng)的胰島素前體轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的雙鏈desB30胰島素類(lèi)似物。對(duì)于每種胰島素類(lèi)似物前體，將3ml酵母培養(yǎng)物上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中，并且轉(zhuǎn)移到新的管中，加入666pl溶解在0.2MNaHC03pH9.1中的ALP。該溶液具有大約8.1的pH值，其在該酶的pH最佳范圍內(nèi)，并且將該混合物在輕微攪拌下培養(yǎng)1.5小時(shí)。本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的制備、純化和表征如上所述制備多種胰島素前體，并從培養(yǎng)基中分離和純化。測(cè)試這些延長(zhǎng)胰島素的生物胰島素活性，其中是通過(guò)如下所述，測(cè)定相對(duì)于人胰島素，對(duì)人胰島素受體的結(jié)合親和力來(lái)進(jìn)行測(cè)試的。在純化之前評(píng)估胰島素的結(jié)合親和力可能是有利的。這可通過(guò)分析培養(yǎng)物上清液來(lái)進(jìn)行。可以通過(guò)采用下列本領(lǐng)域中典型的方法中的一種或者更多種來(lái)純化本發(fā)明的延長(zhǎng)胰島素。如果需要，在梯度、pH、鹽、濃度、流速、柱等方面，這些程序可以被改動(dòng)。根據(jù)多種因素例如雜質(zhì)特征、所關(guān)注胰島素的溶解度等，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到并進(jìn)行這些改動(dòng)。在酸性HPLC或脫鹽之后，通過(guò)將純級(jí)份冷凍干燥來(lái)分離化合物。在中性HPLC或離子交換色譜之后，將化合物脫鹽，在等電pH沉淀，或通過(guò)酸性HPLC純化。典型純化方法HPLC系統(tǒng)是由以下部件構(gòu)成的Gilson系統(tǒng)Model215液體控制器，Model322-H2泵，和Model155UV檢測(cè)器。檢測(cè)通常在210nm和280nm進(jìn)行。AktaPurifierFPLC系統(tǒng)(AmershamBiosciences)是由以下部件構(gòu)成的ModelP-900泵，ModelUV-900UV檢測(cè)器，ModelpH/C-900pH和電導(dǎo)檢測(cè)器，ModelFrac-950級(jí)份收集器。UV檢測(cè)通常在214nm、254nm和276nm進(jìn)行。酸性HPLC:柱Macherey-NagelSP250/21Nucleusil300-7C4流速8ml/min,緩沖液A:0.P/。TFA在乙腈中的溶液緩沖液B:0.P/。TFA在水中的溶液梯度0,0-5.0min:10%A5.00-30.0min:10%A至90%A30.0—35.0min:90%A35.0—40.0min:100%A中性HPLC:柱Phenomenex,Jupiter,C45,250x10,00mm,300A流速6ml/min緩沖液A:5mMTRIS，7,5mM(NH4)2S04,pH=7,3，20%CH3CN緩沖液B:60%CH3CN,40%水梯度0-5min:10%B,5-35min:10-60%B35-39min:60%B,39-40min:70%B40-43.5min:70%B離子交換色譜柱RessourceQ,6ml流速6ml/min緩沖液A:0.09%NH4HCO3,0.25%NH4OAc,42.5。/o乙醇pH8.4緩沖液B:0.09%NH4HCO3，2.5%NH4OAc,42.5。/。乙醇pH8.4梯度100%A至100%B，30倍柱體積期間脫鹽柱HiPrep26/10流速10ml/min,64咅柱體積緩沖液10mMNH4HCO3已經(jīng)如上所述制備了下列本發(fā)明胰島素實(shí)施例l.A22-27GdesB30人胰島素hGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGGGohSSI/ssh-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-ohMALDI-MS(基質(zhì):芥子酸)；m/z:6048.8,計(jì)算值6050。實(shí)施例2.A22-33GdesB30人胰島素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>DGK-單鏈前體MALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:7628,計(jì)算值7629。實(shí)施例3.A22-39GdesB30人胰島素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>MALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:6765，計(jì)算值6734。實(shí)施例4.A22-45GdesB30人胰島素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>MALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:7074，計(jì)算值7075。實(shí)施例5.A21QA22-39[GPP]6desB30人胰島素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>MALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:7228,計(jì)算值7228,實(shí)施例6.A21QA22-39[GS]9desB30人胰島素h<3iveqcctsicslyqlenyc66§6§6s6s6§6s6§6S6Sohh-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-ohMALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:707，計(jì)算值7017<實(shí)施例7.A21QA22-39[GE]9desB30人胰島素hoiveqcctsicslyqlenyc66色6色6e6&g色6色6e6色6E"(iiss'h-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-ohMALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:7394，計(jì)算值7395,實(shí)施例8.A21Q,A22畫(huà)A45G,desB30人胰島素hGIVEQCCTSICSLYQLENYCQGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG'h-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-°hMALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:7060,計(jì)算值7090'實(shí)施例9.A21Q，A22陽(yáng)A51G，desB30人胰島素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>s-shGIVEQCCTSICSLYQLENYc6666d66666666。hssi/ssh666666666666fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpk-ohMALDI-MS(單鏈前體B-鏈N-末端延長(zhǎng)部分EEAEAEAPK,C-肽:DGK.基質(zhì)芥子酸)；m/z:9012,計(jì)算值9011。實(shí)施例13.A21Q,A22-A45G，B(-18)-(-l)G,desB30人胰島素'GIVEQCCTSICSLYQLENYCQGGGGGGGGGGGGMALDI-MS(單鏈前體B-鏈N-末端延長(zhǎng)部分EEAEAEAPK,C-肽DGK.基質(zhì)芥子酸)；m/z:9354，計(jì)算值9353。實(shí)施例14.A14E,A21Q,A22-A45G,B(-6)國(guó)(-l)G,B25H,desB30人胰島素s-shgiveqcctsicsLEQLEN丫c666666666666666666666d666。hh666666fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk.ohMALDI-MS(單鏈前體B-鏈N-末端延長(zhǎng)部分EEAEAEAPK,C-肽:DGK.基質(zhì)芥子酸)；m/z:8598,計(jì)算值8596。實(shí)施例15.A14E,A21Q,A22-A45G,B(-12)-(-l)G,B25H,desB30人胰島素<image>imageseeoriginaldocumentpage29</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>h-fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk。hMALDI-MS(基質(zhì)芥子酸)；m/z:7390,計(jì)算值7388。實(shí)施例19.A14E，A21Q,A22-A57G，B25H,desB30人胰島素s-shgivEQccpTsicsLiQLENYcp66666666d6d6666666666666666d666666666'。Hss"-fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk.。h實(shí)施例20.A14E，A21Q,A22-A62G,B25H,desB30人胰島素s-s"-fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk-w可類(lèi)似地制備的其他優(yōu)選的本發(fā)明胰島素包括A21GA22-27GdesB30人胰島素A21GA22-33GdesB30人胰島素A21GA22-39GdesB30人胰島素A21GA22-45GdesB30人胰島素A21GA22-51GdesB30人胰島素A21GA22-57GdesB30人胰島素A21GA22-61GdesB30人胰島素A21QA22-27GdesB30人胰島素A21QA22-33GdesB30人胰島素A21QA22-39GdesB30人胰島素A21QA22-45GdesB30人胰島素A21QA22-51GdesB30人胰島素A21QA22-57GdesB30人胰島素A21QA22-61GdesB30人胰島素Al4EA21GA22畫(huà)27GB25HdesB30人胰島素A14EA21GA22-33GB25HdesB30人胰島素A14EA21GA22-39GB25HdesB30人胰島素A14EA21GA22-45GB25HdesB30人胰島素A14EA21GA22-51GB25HdesB30人胰島素A14EA21GA22誦57GB25HdesB30人胰島素A14EA21GA22畫(huà)61GB25HdesB30人胰島素Al4EA21QA22-27GB25HdesB30人胰島素A14EA21QA22誦33GB25HdesB30人胰島素A14EA21QA22-39GB25HdesB30人胰島素A14EA21QA22-45GB25HdesB30人胰島素A14EA21QA22-51GB25HdesB30人胰島素A14EA21QA22-57GB25HdesB30人胰島素A14EA21QA22-61GB25HdesB30人胰島素A21GA22-39[GPP]6desB30人胰島素A14E,A21GA22-39[GPP]6B25H,desB30人胰島素A21GA22-39[GPP]9desB30人胰島素A14E,A21GA22-39[GPP]9B25H，desB30人胰島素A21GA22-39[GS]9desB30人胰島素A14E，A21GA22-39[GS]9B25H,desB30人胰島素A21GA22-39[GE]9desB30人胰島素A14E,A21GA22-39[GE]9B25H,desB30人胰島素A14E,A21Q,A22-39[GPP]6B25H，desB30人胰島素A21Q,A22-39[GPP]9desB30人胰島素A14E,A21QA22-39[GPP]9B25H,desB30人胰島素A21Q,A22-39[GS]9desB30人胰島素A14E,A21Q,A22-39[GS]9B25H,desB30人胰島素A21Q,A22-39[GE]9desB30人胰島素A14E,A21Q,A22-39[GE]9B25H,desB30人胰島素實(shí)施例21.圖1中給出了大鼠氣管內(nèi)滴注上面實(shí)施例8的胰島素的結(jié)果。藥理方法測(cè)定(I)本發(fā)明胰島素的胰島素受體結(jié)合可通過(guò)SPA測(cè)定(閃爍親近測(cè)定)微量滴定板抗體捕獲分析來(lái)測(cè)定本發(fā)明胰島素對(duì)于人胰島素受體的親和力。將SPA-PVT抗體-結(jié)合珠，抗小鼠試劑(AmershamBiosciences,CatNo.PRNQ0017)與25ml結(jié)合緩沖液(IOOmMHEPESpH7.8;100mM氯化鈉，10mMMgS04,0.025%Tween-20)混合。用于單PackardOptiplate的試劑混合物(PackardNo.6005190)由以下成分組成2.4(il1:5000稀釋的純化的重組人胰島素受體-(負(fù))外顯子11，相當(dāng)于5000cpm每100(al試劑混合物的一定量的A14Tyr[125I]-人胰島素貯備液，12pi1:1000稀釋的F12抗體，3mlSPA-珠以及結(jié)合緩沖液至總共12ml。然后加入總共100(il,并且將合適的樣本進(jìn)行系列稀釋。然后向稀釋液中加入100pi試劑混合物，并且將樣本在輕微搖動(dòng)下培養(yǎng)16小時(shí)。通過(guò)離心1分鐘來(lái)分離各相，并且將平板在Topcounter中計(jì)數(shù)。在GraphPadPrism2.01(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)中使用非線性回歸算法來(lái)將結(jié)合數(shù)據(jù)擬合。32<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>測(cè)定(II)本發(fā)明胰島素相對(duì)于人胰島素的效力使用Wistar大鼠來(lái)測(cè)定在靜脈內(nèi)快速濃注之后本發(fā)明胰島素降低血糖的效力。給藥本發(fā)明胰島素或人胰島素之后，檢測(cè)血糖濃度。測(cè)定0mo在豬中測(cè)定本發(fā)明胰島素的T50%丁50%是當(dāng)50%的注射量的受試胰島素的A14Tyr[125I]標(biāo)記的衍生物已經(jīng)從注射位點(diǎn)消失時(shí)的時(shí)間，是用外置"計(jì)數(shù)器測(cè)定的。遵循實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物養(yǎng)護(hù)原則，使用特定無(wú)病原體的LYYD非糖尿病雌性豬，DanishLandrace,Yorkshire和Duroc雜交品種(Holmenlund,Haarloev,Denmark)來(lái)進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)實(shí)"瞼。豬是意識(shí)清醒的，4-5月齡，并且重70-95kg。在實(shí)驗(yàn)之前將動(dòng)物禁食過(guò)夜18小時(shí)。將在TyrA14上用1251標(biāo)記的延長(zhǎng)胰島素的制劑按照現(xiàn)有技術(shù)描述的方法給豬皮下注射(Ribel，U.,J0rgensen,K,Brange,J,和Henriksen,U.用于人中皮下胰島素吸收模型的豬.Serrano-Rios,MandLefdbvre,P.J.891-896.1985.Amsterdam;NewYork;Oxford,ElsevierSciencePublishers.1985(ConferenceProceeding))。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將60nmol劑量的本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素(受試化合物)和60nmol胰島素(都是在TyrA14上1251標(biāo)記的)在每頭豬頸部的兩個(gè)單獨(dú)位點(diǎn)注射。使用傳統(tǒng)外置Y-計(jì)數(shù)方法的變型(Ribel,U.胰島素類(lèi)似物的皮下吸收.Berger,M.andGries,F.A.70-77(1993).Stuttgart;NewYork,GeorgThimeVerlag(ConferenceProceeding))來(lái)沖企測(cè)》文射性標(biāo)記/人皮下注射位點(diǎn)的消失。在該改善方法中，能夠使用無(wú)線手提式裝置在幾天內(nèi)連續(xù)測(cè)定放射性從皮下貯庫(kù)的消失(ScancysLaboratorieteknik,V^rl0se，DK-3500,Denmark)。以l分鐘的間隔進(jìn)行測(cè)定，并且將計(jì)數(shù)值針對(duì)背景活性進(jìn)行校正。測(cè)定(IV)給大鼠經(jīng)肺遞送延長(zhǎng)胰島素通過(guò)滴注法對(duì)肺部給藥測(cè)試物質(zhì)。簡(jiǎn)言之，將雄性Wistar大鼠(大約250g)在大約60ml芬太尼/dehydrodenzperidolZ-多美康中進(jìn)行麻醉，其是以6.6ml/kg皮下啟動(dòng)劑量提供的，并且隨后以30分鐘的間隔提供3次維持劑量的3.3ml/kgsc。在誘導(dǎo)麻醉之后10分鐘，從尾部靜脈獲得基礎(chǔ)樣品(t=-20分鐘)，接著在給藥測(cè)試物質(zhì)之前立即獲得基礎(chǔ)樣品(1=0)。在1=0時(shí)，將測(cè)試物質(zhì)氣管內(nèi)給藥到一個(gè)肺中。將具有圓末端的特殊導(dǎo)管固定在含有200^1空氣和測(cè)試物質(zhì)(lml/kg)的注射器上。通過(guò)孔，將套管引入到氣管內(nèi)，并向前進(jìn)入主要支氣管之一-剛剛通過(guò)分叉(bifurcature)。在插入的過(guò)程中，從外部對(duì)頸部進(jìn)行觸診，以確認(rèn)氣管內(nèi)的定位。隨后注射注射器的內(nèi)含物，接著停頓2秒。之后，將套管緩慢向后拉。在測(cè)試的過(guò)程中，將大鼠保持麻醉(血液樣品持續(xù)最高達(dá)到4小時(shí))，并在實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行安樂(lè)死。測(cè)定(V)本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素的疏水性通過(guò)以下方法測(cè)定本發(fā)明延長(zhǎng)胰島素相對(duì)于人胰島素的疏水性(疏水性指數(shù))k'rel:在LiChrosorbRP18(5pm,250x4mm)HPLC柱上，于40。C使用A)和B)的混合物作為洗脫劑進(jìn)行等度洗脫，A)0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.3,含有10%乙腈，和B)50o/。乙腈在水中的混合物。通過(guò)洗脫液在214nm的UV吸收來(lái)一全測(cè)洗脫。通過(guò)注射0.1mM硝酸鈉來(lái)確定空白時(shí)間t0。通過(guò)改變A與B溶液的比例來(lái)將人胰島素的保留時(shí)間t人調(diào)節(jié)至至少2t0。kW=(t胰島素-t。)/(t人畫(huà)to)。權(quán)利要求1.延長(zhǎng)胰島素，所述延長(zhǎng)胰島素是通過(guò)酰胺鍵，優(yōu)選通過(guò)肽鍵與一個(gè)或多個(gè)氨基酸低聚體殘基連接的胰島素殘基，所述氨基酸低聚體殘基包含至少5個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸殘基，并且不超過(guò)800個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)300個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選不超過(guò)50個(gè)氨基酸殘基。2.前述權(quán)利要求的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體殘基由可編碼氨基酸殘基組成。3.前述權(quán)利要求的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體殘基由選自Gly、Glu、Pro和Ser殘基的氨基酸殘基組成。4.前述權(quán)利要求的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體中Gly殘基的量是至少80%(重量/重量)。5.前述權(quán)利要求的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體由Gly殘基組成。6.前述可能權(quán)利要求任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中所述氨基酸低聚體是(Gly)n、(Gly-Pro曙Pro)n、(Pro-Pro-Gly)n、(Gly-Ser)n、(Ser-Gly)n、(Gly-Glu)n或(Glu-Gly)n，其中n為給出氨基酸殘基的適當(dāng)數(shù)目的整數(shù)。7.前述可能權(quán)利要求任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中氨基酸低聚體殘基在胰島素的一個(gè)位置Bl、A21、B29或B30上與氨基酸殘基連接，條件是所述氨基酸位于在低聚體的連接位點(diǎn)前面的末端位置上。8.前述可能權(quán)利要求任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中胰島素是具有一個(gè)或多個(gè)下列任選修飾的人胰島素在A14位E或D;在A21位G、A或Q;在B3位Q、S或T;在B25位H;在B28位D或E;以及在B30位des。9.前述可能權(quán)利要求任一項(xiàng)的延長(zhǎng)胰島素，其中胰島素是人胰島素、desB30人胰島素、門(mén)冬氨胰島素、A21Gly人胰島素、A21GlydesB30人胰島素、Lispro或glulisine。10.本文中描述的任何新特征或特征組合。全文摘要與氨基酸低聚體連接的胰島素具有令人滿(mǎn)意的性質(zhì)。文檔編號(hào)C07K14/435GK101528773SQ200780039880公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2007年10月29日優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日發(fā)明者J·馬庫(kù)森,T·B·謝爾德森,T·霍格-詹森申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司