專(zhuān)利名稱(chēng)：：蛋白酶抗性的胰島素類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)蛋白酶表現(xiàn)出抗性的新型胰島素類(lèi)似物、制備這樣的胰島素類(lèi)似物的方法、制備含有本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的胰島素制劑的方法、以及應(yīng)用這些胰島素類(lèi)似物治療糖尿病的方法。
背景技術(shù)：
：口服途徑是至今最廣泛使用的給藥途徑，且普遍被患者所接受，尤其是對(duì)于慢性治療。然而由于若干障礙諸如胃腸(GI)道內(nèi)酶解、藥物外排泵、腸粘膜吸收不足和可變吸收以及肝中的首過(guò)代謝，治療性肽或蛋白常局限于胃腸外途徑給藥，而非優(yōu)選的口服給藥。人胰島素被胃中(胃蛋白酶)、腸腔中(胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶等)和胃腸(GI)道粘膜表面中(氨肽酶、羧肽酶、腸肽酶、二肽基肽酶、內(nèi)肽酶等)的各種消化酶類(lèi)降解。遺憾的是，很多肽和蛋白已被證明有臨床效果，如果其易于給予受者和可^^皮受者接受，它們的應(yīng)用則將更廣泛。糖尿病是指利用葡萄糖的能力部分或完全喪失的代謝病。所有人群中約5%患有糖尿病，該疾病接近傳染病的比例。自二十世紀(jì)二十年代？1入胰島素以來(lái)，人們一直對(duì)改善糖尿病的治療不斷作出努力。因?yàn)榛加刑悄虿〉娜私邮艹^(guò)數(shù)十年的長(zhǎng)期治療，因此存在安全、方便、改善生活質(zhì)量的胰島素制劑的較大需要。在糖尿病的治療中，已推薦和應(yīng)用許多種類(lèi)的胰島素制劑，例如常規(guī)胰島素、低精蛋白胰島素(特指中性低精蛋白鋅胰島素NPH)、胰島素鋅混懸液(諸如Semilente、Lente⑧和Ultralente⑧)和雙相低精蛋白胰島素。某些市售的胰島素制劑特點(diǎn)為速效，而其它制劑則起效相對(duì)緩慢但表現(xiàn)出或多或少的長(zhǎng)效。速效型胰島素制劑通常是胰島素溶液，而緩效的胰島素制劑可為包含晶型胰島素和/或非晶型胰島素的混懸液，所述胰島素通過(guò)單獨(dú)添加鋅鹽或添加精蛋白或添加兩者組合析出。人胰島素由兩條多肽鏈分別包含21個(gè)氨基酸殘基的A鏈和30個(gè)氨基酸殘基的B鏈組成。所述A鏈和B鏈通過(guò)兩個(gè)二硫鍵相互連接。大多數(shù)其它物種來(lái)源的胰島素是相似的，但在某些位置中可含有氨基酸的取代。近十年來(lái)已開(kāi)發(fā)了許多人胰島素類(lèi)似物。它們?yōu)榱颂囟ㄗ饔锰卣?即速效或長(zhǎng)效)而設(shè)計(jì)。包含這樣的胰島素類(lèi)似物的市售產(chǎn)品包括Levemir、NovoRapid、Humalog、Apidra和Lantus。通常胰島素制劑經(jīng)皮下注射給予。然而，由于患者的順應(yīng)性、安全性和便利性，通過(guò)口服途徑給予將是有益的。蛋白質(zhì)藥物例如胰島素的口服給藥由于酶和吸收屏障往往造成非常低的生物利用度。肽和蛋白質(zhì)遞送的常規(guī)途徑為胃腸外給藥，其是侵襲性的且不方便。因此人們不斷地深入研究非侵襲性途徑例如蛋白藥物的口服遞送。最近設(shè)計(jì)用于口服蛋白/肽遞送的制劑包括含有蛋白酶抑制劑、滲透促進(jìn)劑、基于聚合物的釋藥系統(tǒng)和胰島素綴合物的復(fù)合制劑。所述胰島素綴合物包括己基-胰島素-單綴合物-2(HIM2)(NobexCooperation和GSK),即具有連接B29的PEG7-己基基團(tuán)的人胰島素類(lèi)似物。在例如US7,030,082、US6,867,183和US6,770,625中業(yè)已報(bào)道口服用HIM2的蛋白水解穩(wěn)定性和生物利用度相對(duì)于胰島素得到增大。發(fā)明簡(jiǎn)述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了蛋白水解穩(wěn)定性增強(qiáng)和生物胰島素活性得以保留的胰島素類(lèi)似物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了胰島素類(lèi)似物，該類(lèi)似物中相對(duì)于母體胰島素分子(parentinsulinmolecule)有至少兩個(gè)氨基酸被取代和/或缺失。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，4是供了胰島素類(lèi)似物，該類(lèi)似物述母體胰島素有至少兩個(gè)疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代，其中所述取代位于所述母體胰島素的兩個(gè)以上蛋白酶切割位點(diǎn)內(nèi)部或與其緊密鄰近處，且其中這樣的胰島素類(lèi)似物任選地進(jìn)一步包含一個(gè)以上插入突變。提供本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物也是本發(fā)明的目的，其中相對(duì)于所述母體胰島素，所述胰島素類(lèi)似物的A鏈包含至少一個(gè)突變，所述胰島素類(lèi)似物的B鏈包含至少一個(gè)突變。本發(fā)明還涉及編碼要求保護(hù)的胰島素類(lèi)似物的前肽原的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有這樣的核酸序列的載體和含有這樣的核酸序列或載體的宿主細(xì)胞。還提供獲得本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的方法和其作為藥物的用途。附圖詳述圖1:在37。C下根據(jù)完整胰島素(類(lèi)似物)的百分比測(cè)量人胰島素(HI)和胰島素類(lèi)似物對(duì)胰凝乳蛋白酶的蛋白水解穩(wěn)定性。圖2:在25。C下根據(jù)完整胰島素(類(lèi)似物)的百分比測(cè)量人胰島素(HI)和胰島素類(lèi)似物對(duì)胃蛋白酶的蛋白水解穩(wěn)定性。發(fā)明詳述本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物為相對(duì)于母體胰島素分子具有A和/或B氨基酸鏈的兩個(gè)以上突變的胰島素分子。業(yè)已發(fā)現(xiàn)通過(guò)用親水性氨基酸取代位于胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)部或與其緊密接近處的兩個(gè)以上疏水性氨基酸，得到相對(duì)于母體胰島素蛋白水解穩(wěn)定的胰島素類(lèi)似物。以下是一系列非限定性的實(shí)施方案，這些實(shí)施方案在本文中的其他地方作進(jìn)一步描述實(shí)施方案1.胰島素類(lèi)似物，該類(lèi)似物中相對(duì)于母體胰島素，有至少兩個(gè)疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代，其中所述取代位于母體胰島素的兩個(gè)以上蛋白酶切割位點(diǎn)內(nèi)部或與其緊密接近處，且其中這樣的胰島素類(lèi)似物任選地進(jìn)一步包含一個(gè)以上插入突變。實(shí)施方案2.實(shí)施方案1的胰島素類(lèi)似物，其中相對(duì)于母體胰島素穩(wěn)定性得以增強(qiáng)。實(shí)施方案3.實(shí)施方案1-2中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中相對(duì)于母體胰島素，胰島素類(lèi)似物的A鏈包含至少一個(gè)突變，胰島素類(lèi)似物的B鏈包含至少一個(gè)突變。實(shí)施方案4.實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中所述胰島素類(lèi)似物進(jìn)一步包含初次修飾胰島素類(lèi)似物的蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸取代，其中所述至少一個(gè)氨基酸取代為至少一個(gè)疏水性氨基酸被至少一個(gè)親水性氨基酸所取代。實(shí)施方案5.實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中A12位的氨基酸為Glu或Asp,和/或A13位的氨基酸為His、Asn、Glu或Asp,和/或A14位的氨基酸為Asn、Gln、Glu、Arg、Asp、Gly或His，和/或A15位的氨基酸為Glu或Asp;而B(niǎo)24位的氨基酸為His,和/或B25位的氨基酸為His,和/或B26位的氨基酸為His、Gly、Asp或Thr，和/或B27位的氨基酸為His、Glu、Lys、Gly或Arg,和/或B28位的氨基酸為His、Gly或Asp;并且其任選地進(jìn)一步包含一個(gè)以上插入突變。實(shí)施方案6.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中A14位的氨基酸為Ghi、Asp或His，B25位的氨基酸為His，且其任選地進(jìn)一步包含一個(gè)以上插入突變。實(shí)施方案7.實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中A14位的氨基酸為Glu、Asp或His，B25位的氨基酸為His而B(niǎo)30位的氨基酸缺失。實(shí)施方案8.實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中A14位的氨基酸為Glu、Asp或His，B25位的氨基酸為His。實(shí)施方案9.實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中所述一個(gè)以上插入突變選自A(-3)Gly、A(-2)Gly、A(-l)Pro、A(0)Pro、A8His、A18Gln、A18Gln、A21Gln、A21Gly、B(-3)Gly、B(-2)Gly、B(-l)Pro、B(0)Pro、BlGlu、BlGln、ro、BlGlu、BlGln、B3Gln、B10Pro、B14Thr、B16Glu、B17Ser、B26Asp、DesB26、DesB27、B27Glu、B27Glu、B28Asp、desB28、desB29、desB30、B31Leu和B32Glu。實(shí)施方案10.實(shí)施方案1-6或9中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中所述插入突變?yōu)閐esB30。實(shí)施方案11.實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中A14為Glu。實(shí)施方案12.實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其相對(duì)于所述母體蛋白表現(xiàn)出對(duì)一種以上蛋白酶類(lèi)的穩(wěn)定性增強(qiáng)。實(shí)施方案13.實(shí)施方案1-12中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其相對(duì)于所述母體蛋白顯示出對(duì)兩種以上蛋白酶類(lèi)的穩(wěn)定性增強(qiáng)。實(shí)施方案14.實(shí)施方案1-13中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中所述母體氨基酸選自人胰島素；人胰島素的胰島素類(lèi)似物，其中B28位的氨基酸殘基為Pro、Asp、Lys、Leu、Val或Ala，B29位的氨基酸殘基為L(zhǎng)ys或Pro,任選B30位的氨基酸殘基缺失；des(B26-B30)人胰島素、des(B27-B30)人胰島素、des(B28-B30)人胰島素、des(B29-B30)人胰島素、des(B27)人胰島素或des(B30)人胰島素；人胰島素的胰島素類(lèi)似物，其中B3位的氨基酸殘基為L(zhǎng)ys,B29位的氨基酸殘基為Glu或Asp;人胰島素的胰島素類(lèi)似物，其中A21位的氨基酸殘基為Gly且其中所述胰島素類(lèi)似物在其C端進(jìn)一步延伸兩個(gè)Arg殘基；胰島素衍生物，其中B30位的氨基酸殘基被蘇氨酸曱酯取代；和胰島素衍生物，其中des(B30)人胰島素B29位中，賴(lài)氨酸的Ns位連有十四烷酰鏈。實(shí)施方案15.實(shí)施方案1-6、9或1-14中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中選擇一個(gè)以上插入突變以增強(qiáng)胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性。實(shí)施方案16.實(shí)施方案15的胰島素類(lèi)似物，其中所述一個(gè)以上插入突變選自A18Gln、A21Gln、A21GLy和B3Gln。實(shí)施方案17.實(shí)施方案1-4或12-14中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物包含式1的A鏈氨基酸序列XaaA(—2)-XaaA(.i)-XaaA0-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaAi3-XaaA14-XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8-Tyr-Cys-XaaA2廣X犯A22式(l)(SEQIDNo:1)和式2的B鏈氨基酸序列XaaB(.2)-XaaB(.i)-XaaBo-XaaB1-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaBi6-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB3o-XaaB3廣XaaB32式(2)(SEQIDNo:2)其中XaaA(.2)不存在或?yàn)镚ly;XaaA(.!)不存在或?yàn)镻ro;XaaAQ不存在或?yàn)镻ro;XaaA8獨(dú)立選自Thr和His;XaaA!2獨(dú)立選自Ser、Asp和Glu;XaaA!3《蟲(chóng)立選自L(fǎng)eu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa甜獨(dú)立選自Tyr、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^5》蟲(chóng)立選自Gln、Asp和Glu;Xaa雄獨(dú)立選自Asn、Lys和Gln;XaaA2i獨(dú)立選自Asn和Gln;XaaA22不存在或?yàn)長(zhǎng)ys;XaaB(.2)不存在或?yàn)镚ly;Xaasy)不存在或?yàn)镻ro;XaaBo不存在或?yàn)镻ro;XaaB1不存在或獨(dú)立選自Phe和Glu;XaaB2不存在或?yàn)閂al;XaaB3不存在或?yàn)楠?dú)立選自Asn和Gin;XaaB4獨(dú)立選自Gin和Glu;Xaa，獨(dú)立選自His、Asp、Pro和Glu;Xaam6《蟲(chóng)立選自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;XaaB24獨(dú)立選自Phe和His;XaaB25獨(dú)立選自Phe和His;XaaB26不存在或獨(dú)立選自Tyr、His、Thr、Gly和Asp;XaaB27不存在或獨(dú)立選自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaB28不存在或3蟲(chóng)立選自Pro、His、Gly和Asp;XaaB29不存在或《蟲(chóng)立選自L(fǎng)ys和Gin;XaaB3o不存在或?yàn)門(mén)hr;XaaB31不存在或?yàn)長(zhǎng)eu;Xaas32不存在或?yàn)镚lu;C端可任選衍生為酰胺；其中所述A鏈的氨基酸序列和所述B鏈的氨基酸序列通過(guò)所述A鏈7位半胱氨酸與所述B鏈7位半胱氨酸之間的二石克鍵、以及所述A鏈20位半胱氨酸與所述B鏈19位半胱氨酸之間的二石危一建連接，且其中所述A鏈6位和11位的半胱氨酸通過(guò)二硫鍵連接；其中任選所述A鏈氨基酸序列N端通過(guò)含3-7個(gè)氨基酸的氨基酸序列與所述B鏈氨基酸序列C端連接，以形成單鏈胰島素分子，其中任選以l-10個(gè)氨基酸延伸所述B鏈N端；其中若XaaA8為T(mén)hr且XaaA12為Ser且XaaA13為L(zhǎng)eu且XaaA14為T(mén)yr,則XaaA15為Glu或Asp;和其中若XaaB24為Phe且XaaB25為Phe且XaaB26為T(mén)yr且XaaB27為T(mén)hr且XaaB2s為Pro,貝UXaaB29為Gln。實(shí)施方案18.實(shí)施方案1-4或12-14中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物包含式3的A鏈氨基酸序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaAi2-XaaAi3-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA2i式(3)(SEQIDNo:3)和式4的B鏈氨基酸序列XaaBi-Val-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-Xa^B27""X犯B28-X犯B29-X犯B30式(4)(SEQIDNo:4)其中XaaA8獨(dú)立選自Thr和His;XaaA。獨(dú)立選自Ser、Asp禾口Glu;XaaAi3獨(dú)立選自L(fǎng)eu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^4獨(dú)立選自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^5獨(dú)立選自Gln、Asp和Glu;Xaa八i8獨(dú)立選自Asn、Lys和Gln;XaaA21獨(dú)立選自Asn和Gln;XaaB1獨(dú)立選自Phe和Glu;XaaB3獨(dú)立選自Asn和Gln;XaaB4》蟲(chóng)立選自Gin和Glu;Xaawo獨(dú)立選自His、Asp、Pro和Glu;Xaaw6獨(dú)立選自Tyr、Asp、Gln、His、Arg牙口Glu;XaaB24獨(dú)立選自Phe和His;XaaB26不存在或獨(dú)立選自Tyr、His、Hir、Gly和Asp;XaaB27不存在或獨(dú)立選自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser禾口Ghi;Xaas28不存在或獨(dú)立選自Pro、His、Gly和Asp;XaaB29不存在或獨(dú)立選自L(fǎng)ys和Gin;XaaB3o不存在或?yàn)門(mén)hr;C端可任選衍生為酰胺；其中所述A鏈的氨基酸序列和所述B鏈的氨基酸序列通過(guò)所述A鏈7位半胱氨酸與所述B鏈7位半胱氨酸之間的二硫鍵、以及所述A鏈20位半胱氨酸與所述B鏈19位半胱氨酸之間的二石克鍵連接，且其中所述A鏈6位和11位的半胱氨酸通過(guò)二硫4建連接。實(shí)施方案19.實(shí)施方案18的胰島素類(lèi)似物，其中XaaA8獨(dú)立選自Thr和His;Xaa^2獨(dú)立選自Ser和Glu;Xaa^3獨(dú)立選自L(fǎng)eu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaAM《蟲(chóng)立選自Asp、His和Glu;XaaA15獨(dú)立選自Gin和Glu;Xaa鳩獨(dú)立選自Asn、Lys和Gin;XaaA21獨(dú)立選自Asn和Gin;XaaB1獨(dú)立選自Phe和Glu;XaaB3獨(dú)立選自Asn和Gin;XaaB4獨(dú)立選自Gin和Glu;獨(dú)立選自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;XaaB24獨(dú)立選自Phe和His;Xaas26獨(dú)立選自Tyr、Thr、Gly和Asp;XaaB27獨(dú)立選自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg和Glu;XaaB28獨(dú)立選自Pro、Gly和Asp;Xaas29獨(dú)立選自L(fǎng)ys和Gin;XaaB3o不存在或?yàn)門(mén)hr;C端可任選衍生為酰胺；其中所述A鏈的氨基酸序列和所述B鏈的氨基酸序列通過(guò)所述A鏈7位半胱氨酸與所述B鏈7位半胱氨酸之間的二硫鍵、以及所述A鏈20位半胱氨酸與所述B鏈19位半胱氨酸之間的二硫鍵連接，且其中所述A鏈6位和11位的半胱氨酸通過(guò)二硫鍵連接。實(shí)施方案20.實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，其中B鏈C端通過(guò)3-15個(gè)氨基酸或3-7個(gè)氨基酸與A鏈N端連接，以形成單鏈胰島素分子，其中任選以l-10個(gè)氨基酸延伸B鏈N端。實(shí)施方案21.藥物組合物，所述藥物組合物包含生物活性量的實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的所述胰島素分子和藥學(xué)上可接受的載體。實(shí)施方案22.藥物組合物，所述藥物組合物包含實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的兩種以上胰島素類(lèi)似物，其中每種類(lèi)似物限定為具有至少一個(gè)突變，所述突變?cè)谥辽僖环N其它變體中不存在。實(shí)施方案23.實(shí)施方案11-20中任一項(xiàng)的藥物組合物，所述藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，任選包含輔藥。實(shí)施方案24.用于治療對(duì)象中的糖尿病的方法，所述方法包括給予對(duì)象實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物或?qū)嵤┓桨?1-23中任一項(xiàng)的藥物組合物。實(shí)施方案25.降低哺乳動(dòng)物中血糖水平的方法，所述方法通過(guò)向需要這種治療的患者給予治療有效劑量的實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物或?qū)嵤┓桨?1-23中任一項(xiàng)的藥物組合物來(lái)進(jìn)行。實(shí)施方案26.實(shí)施方案24或25的方法，所述方法為口服給藥方法。實(shí)施方案27.實(shí)施方案24或25的方法，所述方法為胃腸外給藥方法。實(shí)施方案28.實(shí)施方案24或25的方法，所述方法為氣管內(nèi)給藥方法。實(shí)施方案29.實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物用作治療或預(yù)防以下疾病的藥物高血糖癥、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖癥、X綜合征和血脂障礙。實(shí)施方案30.實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物用作延遲或預(yù)防II型糖尿病病程的藥物。實(shí)施方案31.實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物用作起以下作用的藥物減少食物纟聶入、減少p-細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)P-細(xì)胞功能和增大P-細(xì)胞群和/或用于恢復(fù)P-細(xì)胞的葡萄糖敏感性。實(shí)施方案32.編碼實(shí)施方案l-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的核酸序列、其衍生物、其部分序列、其降解序列或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。實(shí)施方案33.編碼實(shí)施方案l-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物前體的核酸序列、其衍生物、其部分序列、其降解序列或其在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。實(shí)施方案34.表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含實(shí)施方案32或33的核酸序列。實(shí)施方案35.宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含實(shí)施方案34的表達(dá)載體。實(shí)施方案36.制備胰島素類(lèi)似物的方法，所述方法包括培養(yǎng)實(shí)施方案35中宿主細(xì)胞的步驟。實(shí)施方案37.制備實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的方法，其中所述氨基酸的取代通過(guò)定點(diǎn)誘變實(shí)現(xiàn)。實(shí)施方案38.制備實(shí)施方案21-23中任一項(xiàng)的藥物組合物的方法，所述方法包括將實(shí)施方案1-20中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物與藥學(xué)上可接受的物質(zhì)和/或賦形劑混合。實(shí)施方案39.藥物組合物，所述藥物組合物可由實(shí)施方案38的方法獲得。胰島素是由胰臟中P-細(xì)胞分泌的多肽激素。胰島素由A和B兩條多肽鏈構(gòu)成，所述A和B兩鏈通過(guò)兩個(gè)鏈間二硫鍵連接。此外，所述A鏈特征為有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。該激素由單鏈前體胰島素原(前胰島素原(preproinsulin))合成，所述前胰島素原由24個(gè)氨基酸的前肽后接包含86個(gè)氨基酸的胰島素原組成，其結(jié)構(gòu)為前肽-B-ArgArg-C-LysArg-A，其中C為31個(gè)氨基酸的連接肽。Arg-Arg和Lys-Arg為用于從所述A鏈和B鏈切去連接肽的切割位點(diǎn)。本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可包含進(jìn)一步的突變。胰島素分子中突變的形式可為天然胰島素分子A鏈和/或B鏈中的氨基酸殘基的取代、缺失或插入。"desB30"或"B(l-29)"是指缺少B30氨基酸殘基的天然胰島素B鏈，"A(1-21)"是指天然胰島素A鏈。小C肽及其氨基酸序列以氨基酸的三字母碼表示。本文術(shù)語(yǔ)如Al、A2、A3等分別表示胰島素A鏈(從N末端算起)的1、2和3位。同樣，術(shù)語(yǔ)如B1、B2、B3等分別表示胰島素B鏈(從N末端算起)的l、2和3位。當(dāng)使用編碼氨基酸的單字母碼時(shí)，術(shù)語(yǔ)例如A21A、A21G和A21Q特指在A21位中的氨基酸分別為A、G和Q。當(dāng)使用氨基酸的三字母碼時(shí)，其相應(yīng)的表示分別為A21Ala、A21Gly和A21Gln。(0)分別表示與Al或BlN末端相鄰的位置。酸的位置。因此A(-2)和B(-2)分別表示與A(-l)和B(-l)N末端相鄰的位置，A(-3)和B(-3)分別表示與A(-2)和B(-2)N末端相鄰的位置等等。術(shù)語(yǔ)連接肽包含可以使胰島素中的B鏈C端氨基酸殘基與A鏈N端氨基酸殘基相連的肽鏈。術(shù)語(yǔ)前肽是指多肽序列，其功能是允許將表達(dá)后的多肽從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導(dǎo)到其高爾基體并進(jìn)一步引導(dǎo)到分泌小泡以分泌至培養(yǎng)基中(即所述多肽穿過(guò)細(xì)胞壁或至少穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入其酵母細(xì)胞的外周胞質(zhì)空間的輸出過(guò)程)。所述前肽可為所述酵母a-因子前肽，參閱US4,546,082和4,870,008。或者，所述前肽可為合成前肽，即在自然界中沒(méi)有的前肽。合適的合成前肽為US5,395,922、5,795,746、5,162,498和W098/32867中公開(kāi)的前肽。所述前肽優(yōu)選在C末端含有內(nèi)肽酶加工位點(diǎn)，例如Lys-Arg序列或其任何功能性類(lèi)似物。術(shù)語(yǔ)"糖尿病"包括I型糖尿病、II型糖尿病和其它引起高血糖癥的病況。術(shù)語(yǔ)疾病"治療"包括所述疾病的治療、預(yù)防或緩解。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰島素類(lèi)似物尤其適合口服給藥。疏水性氨基酸在本文理解為天然存在的氨基酸色氨酸(Trp,W)、苯丙氨酸(Phe,F)、纈氨酸(Val,V)、異亮氨酸(Ile,1)、亮氨酸(Leu，L)和酪氨酸(Tyr，Y)(括號(hào)內(nèi)帶有三字母縮寫(xiě)和單字母縮寫(xiě))。親水性氨基酸在本文理解為，不包括上述定義中的疏水性氨基酸的天然氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的親水性氨基酸選自谷氨酸(Glu,E)、天冬氨酸(Asp,D)、組氨酸(His,H)、谷氨酰胺(Gln，Q)、天冬酰胺(Asn,N)、絲氨酸(Ser,S)、蘇氨酸(Thr,T)、脯氨酸(Pro,P)、甘氨酸(Gly,G)、賴(lài)氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg,R)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的親水性氨基酸選自谷氨酸(Glu，E)、天冬氨酸(Asp,D)、組氨酸(His,H)、谷氨酰胺(Gln，Q)、天冬酰胺(Asn,N)、賴(lài)氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg，R)。本發(fā)明的"胰島素"在本文理解為人胰島素、胰島素類(lèi)似物或胰島素衍生物。本文所用術(shù)語(yǔ)"母體胰島素"意指在對(duì)其施用本發(fā)明任何突變前的胰島素。母體胰島素的非限定性實(shí)例為例如野生型胰島素如人胰島素或豬胰島素；人胰島素類(lèi)似物；或人胰島素衍生物例如PEG化或?；娜艘葝u素或胰島素類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的母體胰島素選自人胰島素；人胰島素的胰島素類(lèi)似物，其中B28位的氨基酸殘基為Pro、Asp、Lys、Leu、Val或Ala;B29位的氨基酸殘基為L(zhǎng)ys或Pro,并任選缺失B30位的氨基酸殘基；胰島素類(lèi)似物，其為des(B28-B30)人胰島素、des(B27)人胰島素或des(B30)人胰島素；人胰島素的胰島素類(lèi)似物，其中B3位的氨基酸殘基為L(zhǎng)ys，B29位的氨基酸殘基為Glu或Asp;人胰島素的胰島素類(lèi)似物，其中A21位的氨基酸殘基為Gly,且其中所述胰島素類(lèi)似物在所述C端進(jìn)一步延伸兩個(gè)精氨酸殘基；胰島素衍生物，其中B30位的氨基酸殘基被蘇氨酸曱酯取代；和胰島素衍生物，其中des(B30)人胰島素的B29位賴(lài)氨酸的Ns位連有十四烷酰鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的母體氨基酸選自人胰島素；DesB30人胰島素；AspB28人胰島素；AspB28、DesB30人胰島素；LysB3、GluB29人胰島素；LysB28、ProB29人胰島素；GlyA21、ArgB31、ArgB32人胰島素；和DesB30、ArgB31、ArgB32人胰島素。本文所用術(shù)語(yǔ)"胰島素類(lèi)似物"意指經(jīng)修飾的胰島素，其中所述胰島素的一個(gè)以上核苷酸殘基被其它核苷酸殘基所取代，和/或其中一個(gè)以上核苷酸殘基從所述胰島素中缺失，和/或其中一個(gè)以上核苷酸殘基被插入至所述胰島素中。在一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于8個(gè)修飾(取代、缺失或添加)。在一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于7個(gè)修飾(取代、缺失或添加)。在一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于6個(gè)修飾(取代、缺失或添加)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于5個(gè)修飾(取代、缺失或添加)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于4個(gè)修飾(取代、缺失或添加)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于3個(gè)修飾(取代、缺失或添加)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素包含少于2個(gè)〗務(wù)飾(取代、缺失或添加)。本文所用術(shù)語(yǔ)"胰島素衍生物"意指經(jīng)化學(xué)修飾的母體胰島素或其類(lèi)似物(即被共價(jià)修飾的母體蛋白)，所述胰島素衍生物中有至少一個(gè)取代基不在母體蛋白或其類(lèi)似物中存在。典型的修飾物為酰胺、糖類(lèi)、烷基、?；Ⅴズ蚉EG化物等。本發(fā)明的人胰島素衍生物的實(shí)例為蘇氨酸曱脂-B30人胰島素、Ns-B29-十四烷酰des(B30)人胰島素、Ns-B29-十四烷酰GlnB3des(B30)人胰島素、Ns-B29-十三烷酰人胰島素、Ne-B29-十四烷酰人胰島素、Ns-B29-癸酰人胰島素和Ns-B29-十二烷酰人胰島素。本文所用術(shù)語(yǔ)"人胰島素"意指其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)眾所周知的人激素。人胰島素有兩條多肽鏈，即A鏈和B鏈，其通過(guò)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接。所述A鏈為21個(gè)氨基酸肽，B鏈為30個(gè)氨基酸肽，所述兩條鏈由三個(gè)二硫鍵連接一個(gè)在所述A鏈6位和11位的半胱氨酸之間、第二個(gè)在所述A鏈7位的半胱氨酸和所述B鏈7位的半胱氨酸之間、第三個(gè)在所述A鏈20位的半胱氨酸和所述B鏈19位的半胱氨酸之間。胰島素分子中的突變通過(guò)指定(A或B)鏈、位置和取代天然氨基酸的氨基酸的三字母碼來(lái)表示。"desB30"是指缺少B30氨基酸的天然胰島素B鏈或其類(lèi)似物。因此，A21Gly人胰島素、B28Asp人胰島素、desB30人胰島素為A鏈21位突變?yōu)楦拾彼岬娜艘葝u素類(lèi)似物，B鏈28位突變?yōu)樘於彼岬娜艘葝u素類(lèi)似物，B鏈30位缺失的人胰島素類(lèi)似物。"蛋白酶"或"蛋白水解酶"為降解蛋白和肽的消化酶類(lèi)，存在于人體各種組織中，例如胃(胃蛋白酶)、腸腔(胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶等)和GI胃腸道的粘膜表面(氨肽酶、羧肽酶、腸肽酶、二肽基肽酶、內(nèi)肽酶等)、肝(胰島素降解酶、組織蛋白酶D等)和其它組織中。蛋白水解穩(wěn)定的胰島素類(lèi)似物在本文理解為胰島素類(lèi)似物，其相對(duì)于人胰島素被一種以上蛋白酶降解得更緩慢。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白水解穩(wěn)定的胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素被一種以上蛋白酶降解得更緩慢。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物針對(duì)選自以下的一種以上酶類(lèi)的降解穩(wěn)定胃蛋白酶(例如同工型胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)、胰凝乳蛋白酶(如同工型胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B和/或胰凝乳蛋白酶C)、胰蛋白酶、胰島素降解酶(IDE)、彈性蛋白酶(如同工型胰彈性蛋白酶I或/和I1)、羧肽酶(如同工型羧肽酶A、羧肽酶A2和/或羧肽酶B)、氨肽酶、組織蛋白酶D和鼠、豬或人源的腸提取物中存在的其它酶類(lèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物針對(duì)選自以下的一種以上酶類(lèi)的降解穩(wěn)定胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰島素降解酶(IDE)、彈性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和組織蛋白酶D。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物穩(wěn)定針對(duì)選自以下的一種以上酶類(lèi)的降解穩(wěn)定胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和IDE。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物針對(duì)選自胰凝乳蛋白酶和羧肽酶的一種以上酶類(lèi)的降解穩(wěn)定。T^可根據(jù)實(shí)施例中所描述通過(guò)測(cè)量本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物對(duì)蛋白酶類(lèi)(例如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A)的蛋白水解穩(wěn)定性來(lái)確定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，TY2相對(duì)于人胰島素得以增加。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，r/2相對(duì)于母體胰島素得以增加。在又一個(gè)實(shí)施方案中，TY2相對(duì)于母體胰島素增加了至少2倍。在又一個(gè)實(shí)施方案中，P/2相對(duì)于母體胰島素增加了至少3倍。在又一個(gè)實(shí)施方案中，P/2相對(duì)于母體胰島素增加了至少4倍。在又一個(gè)實(shí)施方案中，!Y2相對(duì)于母體胰島素增加了至少5倍。在又一個(gè)實(shí)施方案中，TY2相對(duì)于母體胰島素增加了至少io倍。蛋白酶切割位點(diǎn)(在本文中也稱(chēng)為蛋白酶位點(diǎn))被理解為那些被蛋白酶識(shí)別的氨基酸殘基和/或其肽鍵被蛋白酶切割的氨基酸殘基。可通過(guò)由HPLC、MS或LC-MS分析確定切割"熱點(diǎn)"，和/或通過(guò)基于需要確定蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白酶的酶特異性的預(yù)測(cè)，來(lái)確定蛋白酶切割位點(diǎn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解如何確定蛋白酶切割位點(diǎn)，例如基于酶特異性根據(jù)例如以下出版物中所描述的來(lái)確定蛋白酶切割位點(diǎn)HandbookofProteolyticalEnzyme,第2版，Barrett，A.J.，Rawlings，N.D"Woesner,J.F.editors,ElsevierAcademicPress2004。例長(zhǎng)口月夷凝乳蛋白酶被預(yù)測(cè)為切割不后接Pro的芳香族殘基(Trp、Tyr、Phe或Leu)C端的肽鍵。同樣，胰蛋白酶被預(yù)測(cè)為切割不后接Pro的石咸性殘基(Lys或Arg)C端的肽鍵。彈性蛋白酶被預(yù)測(cè)為切割A(yù)la、Val、Gly或Ser的殘基C端，而羧肽酶A將移除除Arg、Lys和Pro之外的任何C端氨基酸。胰島素降解酶(IDE)被預(yù)測(cè)為切割人胰島素的以下位置B9-10、BlO-ll、B13-14、B14陽(yáng)15、B24-25、B25-26、A13-14和A14-15。本文所用術(shù)語(yǔ)取代"在蛋白酶切割位點(diǎn)內(nèi)部或與其緊密鄰近的"氨基酸表示取代位于母體胰島素中已確定為蛋白酶切割位點(diǎn)的位置內(nèi)部或與該位置緊密鄰近處的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)部或與其緊密鄰近處的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被取代，其中所述疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，位于胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)部的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，緊鄰胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)處的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，與胰島素中兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)相距兩個(gè)氨基酸的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，與胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)相距三個(gè)氨基酸的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，與胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)相距至多四個(gè)氨基酸的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，與胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)相距一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸或位于所述兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)部的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，與胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)相距一個(gè)或兩個(gè)氨基酸或位于所述兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)部的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，緊鄰胰島素上兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)或位于所述兩個(gè)以上蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)部的兩個(gè)以上疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可具有與母體胰島素凈電荷不同的凈電荷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的凈電荷比母體胰島素凈電荷帶更多正電。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的凈電荷比母體胰島素凈電荷帶更多負(fù)電。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均正凈電荷在水溶液中測(cè)量為0.5-5。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均正凈電荷為1-5。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均正凈電荷為1-4。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均正凈電荷為1-3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均正凈電荷為2-3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均負(fù)凈電荷在水溶液中測(cè)量為-0.5--5。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中的胰島素類(lèi)似物的平均負(fù)凈電荷為-1--5。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均負(fù)凈電荷在水溶液中測(cè)量為-1--4。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均負(fù)凈電荷為-1--3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的平均負(fù)凈電荷為-2--3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH3-9下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH4-8.5下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH4-8下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH4.5-8下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH5-8下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH5.5-8下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH6-8下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH2-4下相對(duì)于人胰島素溶解度增大。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH3-9下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH4-8.5下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH4-8下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH4.5-8下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH5-8下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH5.5-8下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH6-8下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在pH2-4下相對(duì)于母體胰島素溶解度增大。"在給定pH下溶解度增加"意指相對(duì)于與之比較的胰島素(即人胰島素或母體胰島素)，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物在該溶液的pH下以更大濃度溶解于水溶液或緩沖液中。確定溶液中所含的胰島素是否溶解的方法為本4頁(yè)i或已知。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將所述溶液在30,000g下離心20分鐘，然后可通過(guò)RP-HPLC確定上清液中的胰島素濃度。若在實(shí)驗(yàn)誤差之內(nèi)該濃度與起初用于制備該組合物中的胰島素濃度相等，則所述胰島素在本發(fā)明組合物中為完全溶解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中組合物中的胰島素的溶解度可以?xún)H僅通過(guò)肉眼觀察其中含有該組合物的容器來(lái)確定。若肉眼見(jiàn)到所述溶液澄清且無(wú)顆粒物質(zhì)懸浮或沉淀在該容器的側(cè)面/底部，則該胰島素可溶。當(dāng)比較以上測(cè)量結(jié)果時(shí)，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素效能和/或生物利用度可得以增加。測(cè)量胰島素效能或生物利用度的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，尤其包括(l)胰島素放射性受體測(cè)定法，該測(cè)定中胰島素的相對(duì)效能定義為置換50%與細(xì)胞膜(如鼠肝質(zhì)膜部分)上存在的胰島素受體特異性結(jié)合的1251-胰島素所需的胰島素對(duì)所需的胰島素類(lèi)似物的比率；(2)用例如鼠脂肪細(xì)胞進(jìn)行的脂肪生成作用測(cè)定法，該測(cè)定法中相對(duì)胰島素效能定義為實(shí)現(xiàn)[3-3司葡萄糖轉(zhuǎn)化成可有機(jī)萃取物(即脂類(lèi))的50%最大轉(zhuǎn)化所需的胰島素對(duì)所需的胰島素類(lèi)似物的比率；(3)在分離的脂肪細(xì)胞中進(jìn)行的葡萄糖氧化測(cè)定法，該測(cè)定法中胰島素類(lèi)似物的相對(duì)效能定義為實(shí)現(xiàn)葡萄糖-1-[14。轉(zhuǎn)化成[140)2]的50%最大轉(zhuǎn)化的胰島素對(duì)胰島素類(lèi)似物的比率；(4)胰島素放射性免疫測(cè)定法，該方法通過(guò)測(cè)量胰島素或胰島素類(lèi)似物與1251-胰島素竟?fàn)幗Y(jié)合特異性抗-胰島素抗體的有效性，可以確定胰島素類(lèi)似物的免疫原性；和(5)其它測(cè)定法，這些測(cè)定法測(cè)量胰島素或胰島素類(lèi)似物與動(dòng)物血漿樣品中的抗體的結(jié)合情況，例如具有特異性胰島素抗體的ELISA測(cè)定法?？扇芜x對(duì)本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物作更多蛋白酶位點(diǎn)分析，這些位點(diǎn)可進(jìn)一步經(jīng)過(guò)將一個(gè)以上疏水性氨基酸取代為親水性氨基酸。本發(fā)明胰島素類(lèi)似物可為與母體胰島素相比在蛋白酶位點(diǎn)中具有至少兩個(gè)親水性氨基酸的胰島素類(lèi)似物(初次修飾胰島素)，并且可為在初次修飾胰島素的新蛋白酶位點(diǎn)中具有另外的至少一個(gè)氨基酸取代的胰島素類(lèi)似物，所述新蛋白酶位點(diǎn)中至少一個(gè)疏水性氨基酸被至少一個(gè)親水性氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了其中B鏈C端通過(guò)3-15個(gè)氨基酸與A鏈N端連接的胰島素類(lèi)似物。這樣的胰島素類(lèi)似物在本文中稱(chēng)為"單鏈胰島素，，或"SCr，具有B-C-A的一般結(jié)構(gòu)，其中B為人胰島素B鏈或其類(lèi)似物或衍生物，A為人胰島素A鏈或其類(lèi)似物或衍生物，C為通常連接B30和Al的3-15個(gè)氨基酸殘基的連接肽鏈。若所述B鏈為desB30鏈，則該連接肽將連接B29和Al。所述單鏈胰島素含有如同在人胰島素中正確定位的二硫鍵(三個(gè))，即在CysA7與CysB7之間、CysA20與CysB19之間的二硫鍵以及CysA6與CysAl1之間的內(nèi)部二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了其中B鏈C端通過(guò)3-7個(gè)氨基酸與A鏈N端連接的胰島素類(lèi)似物。本發(fā)明還涉及編碼要求保護(hù)的胰島素類(lèi)似物的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有這樣的核酸序列的載體和含有這樣的核酸序列或載體的宿主細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備胰島素類(lèi)似物的方法，所述方法包括(i)培養(yǎng)包含編碼胰島素前體的核酸序列的宿主細(xì)胞；(ii)從培養(yǎng)基中分離所述胰島素前體，和(iii)通過(guò)體外酶轉(zhuǎn)化將所述胰島素前體轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備胰島素類(lèi)似物的方法，所述(i)培養(yǎng)包含編碼胰島素前體的核酸序列的宿主細(xì)胞；(ii)從培養(yǎng)基中分離所述胰島素前體，和(iii)將所述胰島素前體轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為酵母宿主細(xì)胞，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞選自酵母CSacc/mram^c&s)屬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞選自S良酒酵母(Sacc/aramj;cesCW6W57'"6)種。本文所用"胰島素類(lèi)似物"意指通過(guò)缺失和/或取代在天然存在的胰島素中存在的至少一個(gè)氨基酸殘基和/或通過(guò)插入至少一個(gè)氨基酸殘基，從天然存在的胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)(例如人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu))衍生而來(lái)的多肽。所述插入的和/或取代的氨基酸殘基可以為可編碼的氨基酸殘基或其它天然存在的氨基酸殘基。本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可為在一個(gè)以上位置突變的人胰島素或其類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于已確定的蛋白酶切割位點(diǎn)根據(jù)蛋白酶穩(wěn)定性增強(qiáng)來(lái)設(shè)計(jì)所述胰島素類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)經(jīng)過(guò)突變的切割位點(diǎn)在人胰島素的選自以下的位置中B2-3、B6-7、B9-10、BlO畫(huà)ll、B13-14、B14畫(huà)15、B16-17、B22-23、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15和A19-20。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)經(jīng)過(guò)突變的切割位點(diǎn)在人胰島素的選自以下的位置中B2-3、B6-7、B16-17、B22-23、B24-25和/或A19-20。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)經(jīng)過(guò)突變的切割位點(diǎn)在B22-23位中。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)經(jīng)過(guò)突變的切割位點(diǎn)在選自以下的位置中B9-10、BlO-ll、B13-14、B14-15、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)突變的切割位點(diǎn)在人胰島素的兩個(gè)以上選自以下的位置中B2-3、B6-7、B9-10、BlO誦ll、B13-14、B14曙15、B16-17、B22-23、B24-25、B25-26、A13誦14、A14-15和A19-20。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)突變的切割位點(diǎn)在人胰島素的兩個(gè)以上選自以下的位置中B2-3,B6-7，B16-17、B22-23、B24-25和/或A19-20。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)突變的切割位點(diǎn)在兩個(gè)以上選自以下的位置中B9-10、BlO-ll、B13-14、B14-15、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得了本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物，其中相對(duì)于母體胰島素，所述胰島素類(lèi)似物的A鏈包含至少一個(gè)突變而所述胰島素類(lèi)似物的B鏈包含至少一個(gè)突變，其中所述A鏈中的至少一個(gè)突變位于一個(gè)以上選自以下的切割位點(diǎn)中A13-14、A14-15和A19-20,而所述B鏈中的至少一個(gè)突變位于一個(gè)以上選自以下的切割位點(diǎn)中B2-3、B6隱7、B9-10、BlO-ll、B13-14、B14陽(yáng)15、B16畫(huà)17、B22-23、B24-25和B25-26。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得了本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物，其中相對(duì)于母體胰島素，所述胰島素類(lèi)似物的A鏈包含一個(gè)突變而所述胰島素類(lèi)似物的B鏈包含至少一個(gè)突變，其中所述A鏈中的一個(gè)突變位于切割位點(diǎn)A19-20中，而所述B鏈中的至少一個(gè)突變位于一個(gè)以上選自以下的切割位點(diǎn)中B2-3、B6-7、B16-17、B22-23和B24國(guó)25。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得了本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物，其中相對(duì)于母體胰島素，所述胰島素類(lèi)似物的A鏈包含至少一個(gè)突變而所述胰鳥(niǎo)素類(lèi)似物的B鏈包含至少一個(gè)突變，其中所述A鏈中的至少一個(gè)突變位于一個(gè)以上選自以下的切割位點(diǎn)中A13-14和A14-15，而所述B鏈中的至少一個(gè)突變位于一個(gè)以上選自以下的切割位點(diǎn)中B9-10、BlO-ll、B13-14、B14誦15、B24-25和B25-26。適用于取代的氨基酸殘基以消除切割位點(diǎn)為目的來(lái)選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，以增大溶解度為另外目的來(lái)選擇氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述增大的溶解度在pH范圍3-9之內(nèi)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述增大的溶解度在pH范圍4-8之內(nèi)。所述胰島素或胰島素類(lèi)似物可在一個(gè)以上位置被任何天然氨基酸取代，或任何天然氨基酸可插入母體胰島素或胰島素類(lèi)似物中。為了方便，此處可編碼的天然氨基酸名稱(chēng)后接括號(hào)內(nèi)的常用三字母碼和單字母碼甘氨酸(Gly&G)、脯氨酸(Pro&P)、丙氨酸(Ala&A)、纈氨酸(Val&V)、亮氨酸(Leu&L)、異亮氨酸(Ile&I)、甲硫氨酸(Met&M)、半胱氨酸(Cys&C)、苯丙氨酸(Phe&F)、酪氨酸(Tyr&Y)、色氨酸(Trp&W)、組氨酸(His&H)、賴(lài)氨酸(Lys&K)、精氨酸(Arg&R)、谷氨酰胺(Gln&Q)、天冬酰胺(Asn&N)、谷氨酸(Glu&E)、天冬氨酸(Asp&D)、絲氨酸(Ser及S)和蘇氨酸(Thr&T)。若由于打字錯(cuò)誤而與通常使用的代碼有所偏差，則采用通常使用的代碼。在本發(fā)明胰島素中存在的氨基酸優(yōu)選為可以4皮核苷酸編碼的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素或胰島素類(lèi)似物#皮Gly、Glu、Asp、His、Gln、Asn、Ser、Thr、Lys、Arg和/或Pro所取代，和/或Gly、Glu、Asp、His、Gln、Asn、Ser、Thr、Lys,Arg和/或Pro被插入至胰島素或胰島素類(lèi)似物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素或胰島素類(lèi)似物被Glu、Asp、His、Gln、Asn、Lys和/或Arg取代，和/或Glu、Asp、His、Gln、Asn、Lys和/或Arg被插入至胰島素或胰島素類(lèi)似物中。所述胰島素類(lèi)似物可為這樣的胰島素類(lèi)似物其中B鏈的25位可從天然Phe殘基修飾成His,并且A14位的天然Tyr取代為Glu、Asp或His。一種以上插入突變可包括desB30且所述胰島素類(lèi)似物可通過(guò)A鏈和/或B鏈的N端延伸或C端延伸來(lái)進(jìn)一步修飾，例如用GGP、GGPP、GP或GPP延伸所述胰島素類(lèi)似物的A鏈N端和/或B鏈N端。進(jìn)一步的實(shí)例包括但不限于插入突變，其中可插入一個(gè)或兩個(gè)Pro殘基至AO和/或B0位，可插入Leu至Bl位和/或可插入Glu至B32位。一種以上插入突變可從以下中選擇A8位修飾為His、A21位修飾為Gly、Bl位修飾Glu或Gln、B16位修飾為Glu、B26位修飾為Asp、B27位修飾為Glu和/或B28位修飾為Asp。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物可選自A14E、B25H、desB30人胰島素；A14H、B25H、desB30人胰島素；A14E、B1E、B25H、desB30人胰島素；A14E、B16E、B25H、desB30人胰島素;A14E、B25H、B28D、desB30人胰島素;A14E、B25H、B27E、desB30人胰島素；A14E、B1E、B25H、B27E、desB30人胰島素;A14E、B1E、B16E、B25H、B27E、desB30人胰島素;A8H、A14E、B25H、desB30人胰島素；A8H、A14E、B25H、B27E、desB30人胰島素;A8H、A14E、B1E、B25H、desB30人胰島素;A8H、A14E、B1E、B25H、B27E、desB30人胰島素;A8H、A14E、B1E、B16E、B25H、B27E、desB30人胰島素;A8H、A14E、B16E、B25H、desB30人胰島素;A14E、B25H、B26D、desB30人胰島素；A14E、B1E、B27E、desB30人胰島素；A14E、B27E、desB30人胰島素；A14E、B28D、desB30人胰島素；A14D、B25H、desB30人胰島素；A(-1)P、A(O)P、A14E、B25H、desB30人胰島素；A14E、B(畫(huà)1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰島素；A(國(guó)1)P、A(O)P、A14E,B(-1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰島素;A14E、B25H、B30T、B31L、B32E人胰島素；A14E、B25H人胰島素；A14E、B16H、B25H、desB30人胰島素；A14E、B10P、B25H、desB30人胰島素;A14E、B10E、B25H、desB30人胰島素;A14E、B4E、B25H、desB30人胰島素;A14H、B16H、B25H、desB30人胰島素;A14H、B10E、B25H、desB30人胰島素;A14E、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素;A13H、A14E、B10E、B25H、desB30人胰島素;A13H、A14E、B25H、desB30人胰島素；A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30人胰島素;A14E、B24H、B25H、desB30人胰島素;A8H、A14E、B10D、B25H、B26G、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A8H、A14E、B10D、B25H-酰胺、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、B25H、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、B25H、B26G、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素、A14E、B25H-酰胺、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、B25H、B26G、B27G、B28G、desB30人胰島素；A14E、B26G、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素、A14E、B25H、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、A18Q、A21Q、B3Q、B25H、desB30人胰島素;A14E、A18Q、A21Q、B3Q、B25H、B27E、desB30人胰島素；A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30人胰島素；A13H、A14E、B1E、B25H、desB30人胰島素;A13N、A14E、B25H、desB30人胰島素；A13N、A14E、B1E、B25H、desB30人胰島素;A(-2)G、A(曙1)P、A(O)P、A14E、B25H、desB30人胰島素；A14E、B(-2)G、B(-1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰島素;A(曙2)G、A(-1)P、A(O)P、A14E、B(-2)G、B(-1)P、B(O)P、B25H、desB30人胰島素；A14E、B27R、B28D、B29K、desB30人胰島素;A14E、B25H、B27R、B28D、B29K、desB30人胰島素；A14E、B25H、B26T、B27R,B28D、B29K、desB30人胰島素;A14E、A18K、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、A22K、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、A22K、B25H、desB30人胰島素；A14E、desBl、desB2、desB3、B25H-酰胺、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、desBl、desB2、desB3、B25H、desB27、desB28、desB29,desB30人胰島素；A14E、desBl、desB2、desB3、B16H、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30人胰島素；A14E、B25H、B27R、desB30人胰島素；A14E、B25H、B27H、desB30人胰島素；A14E、B25H、B27R、desB28-B30人胰島素；A14E、B25H、B27H、desB28-B30人胰島素；A14E、B25H、B27E、desB28-B30人胰島素；A14E、B25H、B27K、desB28-B30人胰島素；A14E、B27K、desB28-B30人胰島素；A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30人胰島素;A13E、A14E、B25H、desB30人胰島素；A14E、B25H、desB30人胰島素；A15E、A14E、B25H、desB30人胰島素；A13E、B25H、desB30人胰島素；A12E、B25H、desB30人胰島素；A15E、B25H、desB30人胰島素；A14E、B25H、desB27、desB30人胰島素；A14E、B25H、B26D、B27E、desB30人胰島素;EEAEAEAPK-B(1-29)-B25H-AAK-A(1曙21)-A14E人胰島素；EEAEPK-B(l-29)-B25H-DGK-A(l-21)-A14E人胰島素；B(1-29)-B25H-AAK-A(1-21)-Al4E人胰島素；B(1-29)-B1E、B25H-AAK-A(1國(guó)21)-A14E人胰島素；B(l-29)-B25H、B27E-AAK-A(1-21)-A8H、A14E人胰島素；B(l-29)-BlE、B25H、B27E-AAK-A(1-21).A8H、A14E人胰島素；EEAEAEAPK-B(l-29)-B16E、B25H-AAK-A(1-21)-A8H.A14E人胰島素；B(l-29)-B25H、B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E人胰島素；B(l-29)-B16E、B25H、B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E人胰島素；B(l-29)-B25H、B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)畫(huà)A8H,A14E人胰島素；A14E、B25H、B27R、desB30人胰島素A14E、B25H、B27N、desB30人胰島素A14E、B25H、B27D、desB30人胰島素A14E、B25H、B27Q、desB30人胰島素A14E、B25H、B27E、desB30人胰島素A14E、B25H、B27G、desB30人胰島素A14E、B25H、B27H、desB30人胰島素A14E、B25H、B27K、desB30人胰島素A14E、B25H、B27P、desB30人胰島素A14E、B25H、B27S、desB30人胰島素A14E、B25H、B27T、desB30人胰島素A13R、A14E、B25H、desB30人胰島素A13N、A14E、B25H、desB30人胰島素A13D、A14E、B25H、desB30人胰島素A13Q、A14E、B25H、desB30人胰島素A13E、A14E、B25H、desB30人胰島素A13G、A14E、B25H、desB30人胰島素A13H、A14E、B25H、desB30人胰島素A13K、A14E、B25H、desB30人胰島素A13P、A14E、B25H、desB30人胰島素A13S、A14E、B25H、desB30人胰島素A13T、A14E、B25H、desB30人胰島素A14E、B16R、B25H、desB30人胰島素A14E、B16D、B25H、desB30人胰島素A14E、B16Q、B25H、desB30人胰島素A14E、B16E、B25H、desB30人胰島素A14E、B16H、B25H、desB30人胰島素A14R、B25H、desB30人胰島素;A14N、B25H、desB30人胰島素A14D、B25H、desB30人胰島素A14Q、B25H、desB30人胰島素A14E、B25H、desB30人胰島素;A14G、B25H，desB30人胰島素；A14H、B25H、desB30人胰島素；A8H、B10D、B25H人胰島素和A8H、A14E、B10E、B25H、desB30人胰島素。胰島素是由胰臟中P-細(xì)胞分泌的多肽激素，由A和B兩條多肽鏈構(gòu)成，所述A鏈和B鏈由兩個(gè)鏈間二碌u鍵連接。此外，所述A鏈特征為有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。該激素由單鏈前體胰島素原(前胰島素原)合成，所述前胰島素原由24個(gè)氨基酸的前肽后接包含86個(gè)氨基酸的胰島素原組成，其結(jié)構(gòu)為前肽-B-ArgArg-C-LysArg-A，其中C為31個(gè)氨基酸的連接肽。Arg-Arg和Lys-Arg為用于從A鏈和B鏈切去連接肽的切割位點(diǎn)。主要有三種方法用于在微生物中制備人胰島素。兩種涉及大腸桿菌(Esc/ien'c/n'aco")，其一通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)大融合蛋白(Frank等(1981)Peptides:Proceedingsofthe7thAmericanPeptideChemistrySymposium(Rich&Gross編輯),PierceChemicalCo.,Rockford,III.第729-739頁(yè))，或使用信號(hào)肽以使之能夠分泌至周質(zhì)空間(Chan等(1981)PNAS78:5401-5404)。第三種方法利用釀酒酵母CSacc/ara/wj;cMcerev^ae)使胰島素前體分泌到培養(yǎng)基中(Thim等(1986)PNAS83:6766-6770)?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了許多在大腸桿菌(￡".co/Z)或釀酒酵母(&cc/mram;;c&scerev&ae)中表達(dá)的胰島素前體，參閱美國(guó)專(zhuān)利第5,962,267號(hào)、WO95/16708、EP0055945、EP0163529、EP0347845和EP0741188。通過(guò)正如例如美國(guó)專(zhuān)利第6500645號(hào)中所公開(kāi)的眾所周知的技術(shù)，通過(guò)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所討論的胰島素類(lèi)似物的DNA序列來(lái)制備所述胰島素類(lèi)似物。所述胰島素類(lèi)似物或者直接表達(dá)，或者作為在B鏈有N端延伸部分的前體分子表達(dá)。所述N端延伸部分可具有提高直接表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的功能，并且可具有至多15個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度。所述N端延伸部分將在從液體培養(yǎng)基分離后于體外被切割，因此緊鄰B1處具有切割位點(diǎn)。適于本發(fā)明的這類(lèi)N端延伸部分在美國(guó)專(zhuān)利第5，395，922號(hào)和歐洲專(zhuān)利第765，395A號(hào)中公開(kāi)。經(jīng)過(guò)分離的胰島素類(lèi)似物可通過(guò)熟知的酰化方法在所需位置?；@樣的胰島素類(lèi)似物的實(shí)例在例如公布號(hào)為EP214826、EP375437和EP383472的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)中已有描述。編碼的各胰島素類(lèi)似物多肽的核酸序列可由已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)合成來(lái)制備，例如由Beaucage等(1981)TetrahedronLetters22:1859-1869中所描述的亞磷酰胺法(phosphoamiditemethod)、或Matthes等(1984)EMBOJournal3:801-805中描述的方法。根據(jù)所述亞磷酰胺法，寡核苷酸經(jīng)合成(例如在自動(dòng)DNA合成儀中)、純化、復(fù)性和連接以形成合成DNA構(gòu)建體。當(dāng)前制備所述DNA構(gòu)建體的優(yōu)選方法是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。所述核酸序列還可為混合的基因組、cDNA和合成起點(diǎn)的核酸序列。例如，可使編碼前導(dǎo)肽的基因組序列或cDNA序列與編碼A鏈和B鏈的基因組序列或cDNA序列連接，之后可依照熟知方法通過(guò)插入編碼用于同源重組的所需氨基酸序列的合成寡核苷酸來(lái)對(duì)DNA序列的位點(diǎn)進(jìn)行修飾，或者優(yōu)選使用合適的寡核苷酸通過(guò)PCR制備所需序列。能夠在所選的微生物或宿主細(xì)胞中復(fù)制且攜帶有編碼所討論的胰島素類(lèi)似物多肽的核酸序列的重組載體中可為自主復(fù)制型載體，即作為染色體外的實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制之外，例如有質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。所述載體可包含任何確保自主復(fù)制的元件?；蛘?，所述載體可在引入所述宿主細(xì)胞中時(shí)整合進(jìn)基因組并隨它所整合的染色體一同復(fù)制。此外，可使用單個(gè)載體或質(zhì)粒、或者共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組中的總DNA的兩個(gè)以上載體或質(zhì)粒、或者轉(zhuǎn)座子。所述載體可為線(xiàn)型的或閉合環(huán)狀質(zhì)粒，優(yōu)選含有允許栽體穩(wěn)定整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組或允許所述載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制的元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組表達(dá)載體能在酵母中復(fù)制。使所述載體能在酵母中復(fù)制的序列的實(shí)例為酵母質(zhì)粒2pm復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起點(diǎn)。所述載體可含有一個(gè)以上允許易于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記為基因，該基因產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、原養(yǎng)型轉(zhuǎn)換為營(yíng)養(yǎng)缺陷型等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的實(shí)例有枯草芽孢桿菌(jBad〃wssi/6rifo)或地衣芽孑包桿菌(5acz7/ws//c/em》rmh)中的t/a/基因、或賦予抗生素抗性如青霉素、慶大霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞中的選擇標(biāo)記包括aw必(乙酰胺酵)、wg萬(wàn)(鳥(niǎo)氨酸氨曱酰基轉(zhuǎn)移酶)、(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)和(鄰氨基苯曱酸合成酶)。適用于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。非常適用于酵母的選擇標(biāo)記為粟酒裂殖酵母(Sc/n'zosaccAaram少casTPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。在載體中，所述核酸序列可操作地與合適的啟動(dòng)子序列連接。所選包括突變啟動(dòng)子、截短啟動(dòng)子和雜合啟動(dòng)子，且可從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞內(nèi)或胞外多肽的基因中獲得。用于引導(dǎo)細(xì)菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例為從以下基因中獲得的啟動(dòng)子大腸桿菌乳糖操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(&^ptom少cescoe/z'co/or)瓊脂糖酶基因(&gj)、枯草芽孢桿菌(^^7/wswZ^'fc)果聚糖蔗糖酶基因Csac5)、地衣芽孢桿菌CSac/〃w"cAem/omH》a淀粉酶基因(amjA)、嗜熱脂肪芽孢桿菌C5ad〃船WearaAermo//n7w》麥芽糖淀粉酶基因(aw少A/)、解淀粉芽孑包桿菌(5aa'〃1^am少/o/z々t^/acz.ews)a淀粉酶基因(am少g)、和地衣芽孢桿菌(5ac/〃tw/z'cAem/om^)青霉素酶基因(pe"尸)。用于引導(dǎo)絲狀真菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例從基因?yàn)閺囊韵禄蛑蝎@得的啟動(dòng)子米曲霉(As;^^〃wsoo^ae)TAKA淀粉酶基因、曼赫根毛菌CR/^omwcorm/e/^')天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉04s;wgz7/1^中性a淀粉酶基因和黑曲霉(J^ergZ〃ws酸穩(wěn)定性a淀粉酶基因。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子為釀酒酵母OSaccAaram戸scere由ae)Mal、TPI、ADH或PGK啟動(dòng)子。所述核苷酸構(gòu)建體也通?？刹僮鞯嘏c合適的終止子連接。在酵母中，合適的終止子為T(mén)PI終止子(Alber等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。用于分別連接表達(dá)載體中所含的單獨(dú)核酸序列(例如編碼所需胰島素類(lèi)似物多肽的DNA、啟動(dòng)子和終止子)，并將它們插入含有在所選宿主中復(fù)制的必需信息的合適載體中的方法已為本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知。應(yīng)能理解的是，構(gòu)建所述載體可通過(guò)首先制備含有編碼本發(fā)明胰島素類(lèi)似物多肽的全DNA序列的DNA構(gòu)建體，再將該片斷插入至合適的表達(dá)載體中；或者通過(guò)先后插入含有單獨(dú)元件(如信號(hào)肽、前肽、連接肽、A和B鏈)遺傳信息的DNA片斷，并隨后連接。包含這樣的核酸序列的載體被《1入所述宿主細(xì)胞，由此所述載體作為染色體整合體纟皮保留，或作為之前所描述的染色體外自主復(fù)制載體被保留。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包含親代細(xì)胞的任何后代，后者由于復(fù)制中發(fā)生突變而與所述親代細(xì)胞不同。所述宿主細(xì)胞可為單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物?？捎玫膯渭?xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌細(xì)胞C8ac"/t^cell)、鏈霉菌細(xì)胞(&^ptom;;c^cell);或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌(五.co/0和假單胞菌(尸sewcbmowcws;)。真核細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。用于本發(fā)明方法的酵母生物體可為任何在培養(yǎng)中產(chǎn)生大量本發(fā)明單鏈胰島素的合適酵母生物體。合適的酵母生物體的實(shí)例為選自以下的酵母種釀酒酵母0focc/mra附7casce"vWae)、克魯弗酵母(Sacc/arawy;cesA:/w_yvw')、粟酒裂殖酵母(/Sc/^msacc/ar簡(jiǎn);;cespom6e)、葡萄汁酵母(Sacc/joram;;ceswvan/m)、乳酸克魯維酵母(A7w_yveram_yc^s/acris)、多形漢遜酵母(7/a"se"M/a;o(y附or;^")、巴斯德畢赤酵母(尸/c/n'a/a^on》、曱醇畢赤酵母(/Vc/n'ameAa"o/z'ca)、克魯弗畢赤酵母(尸Zc/^射矽ven')、亞羅解脂酵母(7amnW"/^o/Wc")、假絲酵母(OwJzWas/.)、產(chǎn)朊假絲酵母(Cam/Wawrifc)、可可^(叚絲酵母(Cflm/Wflcacao/)、；也霉((7eo^7'c/mm5^.)和發(fā)酵地霉((7eoWc/wmy^7wewtow力的菌林。舉例來(lái)說(shuō)可通過(guò)制備原生質(zhì)體，隨后用本身已知的方法轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)施所述酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可為適用于培養(yǎng)酵母生物體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。被分泌的胰島素類(lèi)似物多肽(大部分以恰當(dāng)加工的形式存在于該培養(yǎng)基中)可利用常規(guī)方法從所述培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括以下步驟通過(guò)離心、過(guò)濾從培養(yǎng)基分離出酵母細(xì)胞或者通過(guò)離子交換基質(zhì)或反相吸附基質(zhì)捕獲胰島素前體；用鹽例如硫酸銨沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)組分；隨后通過(guò)諸如離子交換層析、親和層析等多種層析方法純化。藥物組合物本發(fā)明的另一目的是提供包含濃度為0.1mg/ml-500mg/ml的本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的藥物制劑，其中所述制劑的pH為2.0-10.0。所述制劑可進(jìn)一步包含蛋白酶抑制劑、緩沖系統(tǒng)、防腐劑、張度劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為水性制劑，即含水制劑。這樣的制劑通常為溶液或混懸液。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為水溶液。術(shù)語(yǔ)"水性制劑"定義為包含至少50%重量比水的溶液。同樣地，術(shù)語(yǔ)"水溶液"定義為包含至少50%重量比水的溶液，而術(shù)語(yǔ)"水混懸液"定義為包含至少50%重量比水的混懸液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為醫(yī)師或患者在^f吏用前向其中加入溶劑和/或稀釋劑的凍干制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為無(wú)需預(yù)先溶解《更可^f吏用的干燥制劑(例如冷凍干燥或噴霧干燥)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的水溶液及緩沖液的藥物制劑，其中所述胰島素類(lèi)似物的濃度為0.1mg/ml或以上，且其中所述制劑的pH為約2.0-約10.0。意欲用于口服的制劑可依照任何已知方法制備，這樣的制劑可含有一種以上選自以下的作用劑甜^^未劑、賴(lài)^木劑、著色劑和防腐劑，以便提供藥學(xué)上精致適口的制劑。片劑可含有與適于制備片劑的、無(wú)毒且藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可為例如惰性稀釋劑，例如甘露醇、麥芽糊精、高嶺土、碳酸鉤、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；造粒劑和崩解劑例如玉米淀粉；粘合劑，例如淀粉、明膠、聚合物或阿拉伯膠；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。所述片劑可為未包衣片劑，或可通過(guò)已知技術(shù)包衣以延遲所述藥物活性多肽的崩解或釋放?？诜o藥的本發(fā)明制劑可根據(jù)藥物化學(xué)上的熟知方法來(lái)制備和給予，參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences,第17版(A.Osol編輯，1985)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)固體劑型如片劑或膠嚢的方式給予。所述片劑可通過(guò)濕法制粒、千法制粒、直接壓片法或熔融法制粒來(lái)制備。可利用常規(guī)壓片技術(shù)制備本發(fā)明的片劑。常規(guī)制備方法包括將胰島素類(lèi)似物、水溶性稀釋劑、親水粘合劑和任選的一部分崩解劑共混。然后該共混物用親水粘合劑的水溶液或親水粘合物和表面活性劑的水溶液來(lái)制粒，必要時(shí)碾磨該混合物。干燥并減小所述顆粒至合適尺寸。其它任何成分，比如潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂)和附加的崩解劑被加入該顆粒中并混合。然后利用常規(guī)壓片機(jī)如旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)將該混合物壓縮至合適尺寸和形狀。所述片劑可通過(guò)本領(lǐng)域熟知技術(shù)進(jìn)行膜包衣?？谠翸吏用的制劑可為硬明膠膠嚢或軟明膠膠嚢，其中活性成分與惰性固態(tài)稀釋劑混合，所述固體稀釋劑例如甘露醇、麥芽糊精、碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、高嶺土、磷酸4丐或磷酸鈉；或軟明膠膠嚢，其中活性成分與水或油性介質(zhì)混合，所述油性介質(zhì)如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油?？衫贸Ｒ?guī)技術(shù)制備本發(fā)明的膠嚢。常規(guī)制備方法包括將治療活性肽、藻酸鹽、水溶性稀釋劑、親水性粘合劑和任選的一部分崩解劑共混。然后該共混物用親水性粘合劑的水溶液或親水粘合劑和表面活性劑的水溶液來(lái)制粒，必要時(shí)碾磨該混合物。干燥并減少所述顆粒至合適尺寸。其它任何成分比如潤(rùn)滑劑被加入該顆粒中并混合。然后利用常規(guī)膠嚢填充機(jī)將得到的混合物填入合適大小的硬皮明膠膠嚢中。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、磷酸二氬鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥曱基)氨基曱烷、N,N-二(羥乙基)甘氨酸、麥黃酮、蘋(píng)果酸、丁二酸鹽、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些特定緩沖液中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選的實(shí)施方案。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。所述防腐劑以足以獲得防腐效果的含量存在。藥物制劑中防腐劑的量為技術(shù)人員所熟知且可通過(guò)例如本領(lǐng)域的文獻(xiàn)和/或例如市售產(chǎn)品中的防腐劑的已知量來(lái)確定。這些特定防腐劑中的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的備選實(shí)施方案。藥物組合物在防腐劑中的應(yīng)用為技術(shù)人員所熟知。為了方i更，作出對(duì)Remington:77eSdewceam/尸rac"ce0/尸/zamac;;,第19版，1995的引用。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含螯合劑。螯合劑在藥物組合物中的應(yīng)用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對(duì)Remington:5Wewceawc/尸rac"ce0/尸Aaw^c3;，第19片反,1995的引用。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。本文所用術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定劑"意指向含有多肽的藥物制劑添加的化學(xué)藥品，目的為了使所述肽穩(wěn)定，即為了延長(zhǎng)這樣的制劑的貯存期和/或使用時(shí)間。穩(wěn)定劑在藥物組合物中的應(yīng)用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出只于.Remington:TAe^SWewceawdi^ac/z'ce。/尸Aanwaqy,第19片反，1995的引用。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含表面活性劑。本文所用術(shù)語(yǔ)"表面活性劑"意指由水溶性(親水)部分(頭部)和脂溶性(親脂的)片斷組成的任何分子或離子。表面活性劑優(yōu)選在界面堆積，在該界面中所述親水性部分朝向水(親水相)而所述親脂性部分朝向油相或疏水相(即玻璃(glass)、大氣、油等)。表面活性劑開(kāi)始形成膠束時(shí)的濃度稱(chēng)為臨界膠束濃度或CMC。此外，表面活性劑降低了液體的表面張力。表面活性劑也稱(chēng)為兩親化合物。術(shù)語(yǔ)"去垢劑"通常用作表面活性劑的同義詞。表面活性劑在藥物組合物中的應(yīng)用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，參見(jiàn)為了方便，作出對(duì)Remington:7Tze5Wewce朋J/V。c"ce0/尸/^rmac乂第19版，1995的引用。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含蛋白酶抑制劑?？赡艿氖?，本發(fā)明胰島素類(lèi)似物藥物制劑中可存在其它成分。這樣的另外的成分可包括濕潤(rùn)劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張度改性劑、螯合劑、金屬離子、.油質(zhì)溶媒(oleaginousvehicle)、蛋白質(zhì)(如人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))和兼性離子(例如氨基酸如甜菜堿、?；撬?、精氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)。顯然這樣的另外的成分不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的藥物制劑的總體穩(wěn)定性有不利影響。含有本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物的藥物組合物可給予到需要這樣的治療患者的若干位點(diǎn)，例如給予到局部位點(diǎn)，例如皮膚和粘膜位點(diǎn)；旁路吸收位點(diǎn)，例如給予到主動(dòng)脈中、血管中、心臟中；和涉及吸收的位點(diǎn)，例如給予到皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹內(nèi)。本發(fā)明的藥物制劑的給予可通過(guò)幾種途徑向需要這樣的治療的患者給藥，所述途徑例如舌部給藥、舌下給藥、含化給藥、口腔內(nèi)給藥、口服給藥、胃腸內(nèi)給藥、鼻部給藥、肺部給藥如通過(guò)細(xì)支氣管和肺泡或其組合、表皮給藥、皮膚給藥、透皮給藥、陰道給藥、直腸給藥、眼部給藥如通過(guò)結(jié)膜、輸尿管給藥和胃腸外給藥。本發(fā)明的組合物可以以若干劑型給予，例如作為溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù)合型乳劑、泡沫劑、藥膏、糊劑、硬膏、軟膏、片劑、包衣片劑、沖洗劑、膠嚢如硬明膠膠嚢和軟明膠膠嚢、栓劑、直腸用膠嚢、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、粉劑、氣溶膠、吸入劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏、注射液、原位轉(zhuǎn)化溶液劑如原位膠凝劑、原位沉降劑、原位沉淀劑、原位結(jié)晶劑、專(zhuān)命液劑和埋纟直劑。本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步如通過(guò)共價(jià)、疏水和靜電相互作用化合或附著于藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和改良藥物遞送系統(tǒng)，以便進(jìn)一步增強(qiáng)胰島素類(lèi)似物化合物的穩(wěn)定性，提高生物利用度，增大溶解度，減少不良作用，實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的按時(shí)療法和提高患者順應(yīng)性或其任何組合。本發(fā)明組合物的可用于固體制劑、半固體制劑、粉狀制劑和溶液制劑，通過(guò)使用例如定量吸入器、干粉吸入器和霧化吸入器來(lái)肺部給予胰島素類(lèi)似物，所有這些儀器都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明組合物的可用于受控、持續(xù)、延長(zhǎng)、延遲和緩慢釋放遞藥系統(tǒng)的制劑。更具體地但不限于，組合物可用于本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知的胃腸外控釋系統(tǒng)和緩釋系統(tǒng)的制劑(兩種系統(tǒng)均導(dǎo)致給藥次數(shù)成倍減少)。更優(yōu)選的是，控釋系統(tǒng)和緩釋系統(tǒng)經(jīng)皮下給予。在不限制本發(fā)明范圍下，有用的控釋系統(tǒng)和組合物的實(shí)例為水凝膠、油凝膠、液晶、聚合物膠束、微球和納米微粒。制備用于本發(fā)明組合物的控釋系統(tǒng)的方法包括但不限于結(jié)晶、冷凝、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓均質(zhì)化、包嚢化、噴霧干燥、微膠嚢化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以制備微球、擠壓和超臨界流體法。對(duì)以下文獻(xiàn)作出全面參考HandbookofPharmaceuticalControlledRelease(Wise,D.L.編輯MarcelDekker,NewYork,2000)和DrugandthePharmaceuticalSciences第99巻ProteinFormulationandDelivery(MacNally,E.J.,ed.MarcelDekker,NewYork,2000)。胃腸外給藥可通過(guò)注射器、任選筆型注射器經(jīng)皮下注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或靜脈注射來(lái)進(jìn)行。或者，胃腸外給藥可以依靠輸注泵進(jìn)行。另一個(gè)選擇為以下組合物其可為以鼻用噴霧或肺部噴霧形式給予所述胰島素類(lèi)似物化合物的溶液劑或混懸劑。作為又一個(gè)選擇，含有本發(fā)明胰島素類(lèi)似物化合物的藥物組合物還可以適合透皮給藥，例如通過(guò)無(wú)針注射或貼劑(任選離子導(dǎo)入貼劑)來(lái)進(jìn)行；或經(jīng)粘膜給藥，例如口腔含化給藥。本發(fā)明胰島素類(lèi)似物可以在溶媒或載體中作為溶液、混懸液或干粉，通過(guò)使用適合肺部遞藥的任何已知類(lèi)型i殳備經(jīng)肺部途徑給予。這些肺部途徑給藥的實(shí)例包括但不限于用于肺部遞藥的三種常規(guī)類(lèi)型的氣溶膠發(fā)生器，可包括噴射或超聲霧化吸入器、定量吸入器或干粉吸入器(Cf.YuJ,ChienYW.Pulmonarydrugdelivery:PhysiologicandmechanisticaspectsCritRevTherDrugCarrSys14(4)(1997)395-453)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)任何已知的霧化技術(shù)例如噴霧作用，使氣溶膠微粒的MMAD達(dá)到少于lO)im，更優(yōu)選l-5pm，最優(yōu)選l-3pm，來(lái)使該制劑氣霧化。優(yōu)選粒度是基于遞藥至肺深部的最有效尺寸，在該部位中蛋白吸收最好(參考EdwardsDA,Ben-JebriaA,LangerA,運(yùn)用多孔性吸入大^[效粒的肺部遞藥的最新進(jìn)展(Recentadvancesinpulmonarydrugdeliveryusinglarge,porousinhaledparticles).JApplPhysiol84(2)(1998)379-385)。包含所述胰島素類(lèi)似物化合物的肺部制劑在肺深部的沉積可任選通過(guò)改良吸入技術(shù)來(lái)進(jìn)一步最優(yōu)化，例如但不限于放慢吸入流速(如30L/min)、閉氣和定時(shí)刺激。術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定制劑"意指物理穩(wěn)定性提高、化學(xué)穩(wěn)定性提高或物理和化學(xué)穩(wěn)定性提高的制劑。本文所用術(shù)語(yǔ)蛋白制劑的"物理穩(wěn)定性"意指蛋白形成生物失活和/或不溶性蛋白凝聚物的趨向，所述趨向由以下原因引起所述蛋白暴露在熱-機(jī)械壓力下和/或與去穩(wěn)定的界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用。水性蛋白制劑的物理穩(wěn)定性依靠以下方法來(lái)評(píng)估使裝在合適容器(如藥筒或小瓶)內(nèi)的所述制劑在不同溫度下接受不同時(shí)間的機(jī)械/物理壓力(如攪動(dòng))后目測(cè)和/或測(cè)定濁度。所述制劑的目測(cè)在暗背景下集中的銳光中進(jìn)行。制劑的濁度是通過(guò)目測(cè)評(píng)定混濁程度的等級(jí)來(lái)表征，例如按0-3的等級(jí)(不顯示混濁的制劑與目測(cè)得分0相對(duì)應(yīng)，而在日光下顯示可見(jiàn)混濁的制劑與目測(cè)得分3相對(duì)應(yīng))。當(dāng)制劑在曰光下顯示出可見(jiàn)混濁時(shí)，其歸類(lèi)為與蛋白質(zhì)凝聚有關(guān)的物理不穩(wěn)定?；蛘撸苿┑臐岫瓤赏ㄟ^(guò)技術(shù)人員所熟知的簡(jiǎn)單濁度測(cè)定法來(lái)評(píng)估。水性蛋白制劑的物理穩(wěn)定性還可以通過(guò)使用所述蛋白構(gòu)象態(tài)的光譜因子或探針來(lái)評(píng)估。所述探針優(yōu)選為優(yōu)先與蛋白的非天然構(gòu)象異構(gòu)體結(jié)合的小分子。蛋白結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的實(shí)例為碌J黃素T。減磺素T是熒光染料，已廣泛用于^r測(cè)淀粉狀原纖維。在原纖維的存在下，以及還有可能存在其它蛋白構(gòu)型下，當(dāng)疏磺素T與原纖維蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合時(shí)，在約450nm處產(chǎn)生新的激發(fā)最大值，并在約482nm處激發(fā)增強(qiáng)。未結(jié)合的磁磺素T在所述波長(zhǎng)基本無(wú)焚光。其它小分子也可用作蛋白結(jié)構(gòu)從天然狀態(tài)至非天然狀態(tài)變化的探針。舉例來(lái)說(shuō)，"疏水補(bǔ)丁"探針優(yōu)先與外露的蛋白疏水補(bǔ)丁結(jié)合。所述疏水補(bǔ)丁通常包埋在天然狀態(tài)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，但當(dāng)?shù)鞍组_(kāi)始展開(kāi)或變性時(shí)變得外露。這些小分子光鐠探針的實(shí)例為芳香族疏水性染料如蒽、吖啶或菲咯啉等。其它光譜探針為金屬-氨基酸絡(luò)合物，如疏水性氨基酸的鈷金屬絡(luò)合物、所述氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸和纈氨酸等。本文所用術(shù)語(yǔ)蛋白制劑的"化學(xué)穩(wěn)定性"意指蛋白結(jié)構(gòu)的化學(xué)共價(jià)變化，導(dǎo)致形成相對(duì)于天然蛋白結(jié)構(gòu)潛在生物效能降低和/或潛在免疫原性增強(qiáng)的化學(xué)降解產(chǎn)物。各種化學(xué)降解產(chǎn)物的形成取決于天然蛋白的類(lèi)型和性質(zhì)以及該蛋白所暴露的環(huán)境。消除化學(xué)降解幾乎不可能完全避免，在蛋白制劑儲(chǔ)藏和使用中往往見(jiàn)到化學(xué)降解產(chǎn)物量的增加，這正如本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知。大部分蛋白容易脫酰胺，即谷氨酰胺?；鶜埢蛱於０孵；鶜埢械膫?cè)鏈酰胺基被水解形成游離羧酸的過(guò)程。其它降解途徑包括高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個(gè)以上蛋白分子彼此通過(guò)轉(zhuǎn)酰胺作用和/或二硫鍵相互作用共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致共價(jià)結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物形成0Sto&7^q/"尸TOW"。氧化作用(例如曱硫氨酸殘基的氧化作用)可被認(rèn)為是化學(xué)降解的另一變體。蛋白制劑的化學(xué)穩(wěn)定性可通過(guò)以下方法來(lái)評(píng)估，經(jīng)暴露于不同環(huán)境條件(降解產(chǎn)物的形成可通常由于如溫度的增加而加快)后，測(cè)量在不同時(shí)間點(diǎn)的化學(xué)降解產(chǎn)物的量。各種單獨(dú)降解產(chǎn)物的量通常通過(guò)運(yùn)用各種色譜技術(shù)(如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)依照分子大小和/或電荷分離降解產(chǎn)物來(lái)確定。因此，如上文所概述，"穩(wěn)定制劑"意指物理穩(wěn)定性提高、化學(xué)穩(wěn)定性提高或物理和化學(xué)穩(wěn)定性提高的制劑。通常，制劑在使用和儲(chǔ)藏期間(遵照推薦的使用和儲(chǔ)藏條件)，直到有效期前必須保持穩(wěn)定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含所述胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò)6周的使用期和超過(guò)3年的儲(chǔ)藏期內(nèi)穩(wěn)定。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含所述胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò)4周的使用期和超過(guò)3年的儲(chǔ)藏期內(nèi)穩(wěn)定。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含所述胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò)4周的使用期和超過(guò)兩年的儲(chǔ)藏期內(nèi)穩(wěn)定。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，包含所述胰島素類(lèi)似物化合物的藥物制劑在超過(guò)2周的使用期和超過(guò)兩年的儲(chǔ)藏期內(nèi)穩(wěn)定。水性混懸劑可含有與適用于制備水性混懸劑的賦形劑混合的活性化合物。油性混懸劑可通過(guò)使活性成分懸浮在植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油；或礦物油如液體石蠟中來(lái)配制。所述油性混懸劑可包含增稠劑，例如蜂臘、固體石蠟或鯨蠟醇?？商砑尤缟衔乃龅奶鹞秳┮约俺C味劑以提供適口的口服制劑。這些制劑可通過(guò)添加抗氧化劑例如抗壞血酸來(lái)保存。適用于通過(guò)加入水制備水性混懸劑的可分散粉劑和顆粒劑提供與分散劑或濕潤(rùn)劑、懸浮劑和一種以上防腐劑混合的活性化合物。合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑已通過(guò)上述的來(lái)舉例說(shuō)明。還可存在附劑、矯味劑和著色劑。包含本發(fā)明化合物的藥物制劑還可以以油包水型乳劑的形式。油相可為植物油如橄欖油、花生油；或礦物油如液狀石蠟；或其混合物。合適的乳化劑可為天然存在的樹(shù)膠，例如阿拉伯膠或西黃蓍膠；天然存在的磷脂如大豆磷脂、卵磷脂；和酯類(lèi)或衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏S旨，例如脫水山梨醇單油酸酯；和所述偏酯與乙二醇的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯。所述乳劑還可含有甜味劑和矯味劑。糖漿劑和酏劑可用甜味劑來(lái)配制，所述甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。這樣的制劑也可包含緩和劑、防腐劑、矯味劑和著色劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含滲透促進(jìn)劑。膽鹽和脂肪酸最常被認(rèn)為用以增大胃腸道中上皮細(xì)胞襯里的脂質(zhì)雙層膜的口服滲透性。一般而言，滲透促進(jìn)劑通過(guò)可逆改變膜整體性以增加大分子的細(xì)胞旁路運(yùn)輸(paracellulartransport)和跨細(xì)胞運(yùn)輸。所述膽鹽選自膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、?；悄懰猁}、甘氨膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、熊去氧膽酸鹽、牛磺熊去氧膽酸鹽和鵝去氧膽酸鹽。所述脂肪酸選自短、中和長(zhǎng)鏈脂肪酸，例如正辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸和硬脂酸等。其它增強(qiáng)劑可為表面活性劑例如單酸甘油酯、聚氧乙烯酯、山梨坦表面活性劑(非離子型)和硫酸鹽(陰離子型)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含粘膜粘附聚合物(mucoadhesivepolymer)。通過(guò)使用這樣的粘膜粘附聚合物，可使得所述遞藥系統(tǒng)與胃腸道粘膜緊密接觸。劑型與所述膜的緊密接觸似乎是有利的，因?yàn)榭杀苊庠谶f送系統(tǒng)和吸收膜途中治療活性多肽受酶解。此外，可以提供吸收膜上的階段濃度梯度以向藥物的被動(dòng)吸收帶來(lái)驅(qū)動(dòng)力。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含蛋白水解酶抑制劑，以進(jìn)一步克服酶的障礙并實(shí)現(xiàn)所述治療活性多肽的遞送，所氨肽酶抑制劑、阿馬他定(amastatin)、貝他汀(bestatin)、硼亮氨酸(boroleusine)和嘌呤霉素(puromycin)。蛋白酶抑制劑的實(shí)例為羥乙酸鈉、曱磺酸卡莫司他(camostatmesilate)、桿菌肽(bacitracin)、大豆胰蛋白酶抑制劑和抑肽酶(aprotinin)。包埋和包嚢化是用于治療活性多肽的遞藥系統(tǒng)以?xún)?yōu)化遞送性質(zhì)(包括針對(duì)酶解的保護(hù)作用)的技術(shù)。包埋或包嚢化的形式可以為聚合物釋藥制劑系統(tǒng)例如水凝膠和納米膠嚢/微球體，和脂類(lèi)遞藥系統(tǒng)如脂質(zhì)體和微乳劑。本發(fā)明的制劑可以幾種劑型給予，例如作為溶劑劑、混懸劑、微米級(jí)和納米級(jí)混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù)合型乳劑、泡沫劑、藥膏、糊劑、軟膏、片劑、包衣片劑、泡騰片劑、舌下片劑、頰含片、膠嚢如硬明膠膠嚢和軟明膠膠嚢、粉劑、顆粒劑、原位轉(zhuǎn)化溶液劑如原位膠凝劑、原位沉降劑、原位沉淀劑、原位結(jié)晶劑、胃漂浮制劑如漂浮混懸劑、漂浮片劑等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用作藥物的本發(fā)明胰島素類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物用作制備治療或預(yù)防以下疾病的藥物高血糖癥、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖癥、X綜合征、血脂障礙、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風(fēng)、冠心病和其它心血管病癥、腸炎綜合癥、消化不良和胃潰瘍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物用作延遲或預(yù)防II型糖尿病病程的藥物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類(lèi)似物用作起以下作用的藥物減少食物攝入、減少(3-細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)(3-細(xì)胞功能和增大卩-細(xì)胞群和/或用于恢復(fù)(3-細(xì)胞的葡萄糖敏感性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用作以下藥物的本發(fā)明衍生物用于治療或預(yù)防以下疾病的藥物高血糖癥、II型糖尿病、葡萄、I型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂障礙、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病癥、腸炎綜合癥、消化不良和胃潰瘍；或者用于延遲或預(yù)防n型糖尿病病程的藥物；或者用于起以下作用的藥物減少食物攝入、減少(3-細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)(3-細(xì)胞功能和增大p-細(xì)胞群和/或恢復(fù)p-細(xì)胞的葡萄糖敏感性。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療或預(yù)防以下疾病的方法高血糖癥、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、月巴胖癥、高血壓、X綜合征、血脂障礙、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病癥、中風(fēng)、腸炎綜合癥、消化不良和胃潰瘍；或用于延遲或預(yù)防II型糖尿病病程的方法；或起以下作用的方法減少食物攝入、降低(3-細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)(3-細(xì)胞功能和增大卩-細(xì)胞數(shù)量、和/或恢復(fù)提供的p-細(xì)胞葡萄糖敏感性，所述方法包括向需要這樣治療的患者給予有效量的用于這種治療的本發(fā)明胰島素類(lèi)似物。本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的治療還可與第二種或更多種有藥理活性的物質(zhì)聯(lián)合，例如所述物質(zhì)選自抗糖尿病藥、抗肥胖癥藥、食名欠調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、用于治療和/或預(yù)防由糖尿病引起或與之相關(guān)的并發(fā)癥的藥物和用于治療和/或預(yù)防由肥胖癥^1起或與之相關(guān)的并發(fā)癥和病癥的藥物。這些有藥理活性的物質(zhì)的實(shí)例為GLP-1和GLP-1衍生物及類(lèi)似物、GLP-2和GLP-2衍生物及類(lèi)似物、Exendin-4和Exendin-4衍生物及類(lèi)似物、胰島素淀粉樣多肽和胰島素淀粉樣多肽衍生物及類(lèi)似物、磺脲、雙胍類(lèi)、氯茴苯酸類(lèi)、葡糖苷酶抑制劑、高血糖素拮抗劑、DPP-IV(二肽酰肽酶IV)抑制劑、參與葡萄糖異生和/或糖原分解刺激的肝酶抑制劑、葡萄糖攝取調(diào)節(jié)劑、修飾脂類(lèi)代謝作用的化合物例如抗高血脂藥物(如HMGCoA抑制劑(他汀類(lèi)藥物))、減少食物攝入的化合物、RXR激動(dòng)劑和作用于p-細(xì)胞中ATP依賴(lài)性鉀通道的藥物；考來(lái)烯胺(Cholestyramine)、考來(lái)替泊(colestipol).氯貝丁酯(clofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普羅布考(probucol)、右旋曱狀腺素(dextrothyroxine)、那格列奈(neteglinide)、瑞格列奈(repaglinide);P-阻斷劑諸如阿普洛爾(alprenolol)、阿替洛爾(atenolol)、瘞嗎洛爾(timolol)、吲哚洛爾(pindolol)、普萘洛爾(propranolol)和美托洛爾(metoprolol);ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)抑制劑例如貝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、賴(lài)i若普利(lisinopril)、alatriopril、p奎那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril);鋅通道阻斷劑例如硝苯地平(nifedipine)、非洛地平(felodipine)、尼卡地平(nicardipine)、j尹拉地平(isradipine)、尼莫地平(nimodipine)、；也爾石危草(diltiazem)和維才立帕米(verapamil);和a曙阻斷劑諸如多沙峻口秦(doxazosin)、烏拉地爾(urapidil)、旅哇口秦(prazosin)和特拉峻溱(terazosin);CART(可卡因安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物)激動(dòng)劑、NPY(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、MC4(黑皮質(zhì)素4)激動(dòng)劑、阿立新拮抗劑、TNF(腫瘤壞死因子)激動(dòng)劑、CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動(dòng)劑、CRFBP(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮素激動(dòng)劑、P3激動(dòng)劑、MSH(促黑素細(xì)胞激素)激動(dòng)劑、MCH(黑素細(xì)胞聚集激素)拮抗劑、CCK(膽嚢收縮素)激動(dòng)劑、血清素重再攝取抑制劑、血清素和去曱腎上腺素再攝取抑制劑5-羥色胺和去曱腎上腺素化合物的混合物、5HT(血清素)激動(dòng)劑、鈴蟾肽激動(dòng)劑、甘丙肽拮抗劑、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素釋放化合物、TRH(促曱狀腺素釋放激素)激動(dòng)劑、UCP2或3(解偶聯(lián)蛋白2或3)調(diào)節(jié)物、瘦蛋白激動(dòng)劑、DA激動(dòng)劑(溴隱亭(bromocriptine)、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(類(lèi)視黃醇X受體)調(diào)節(jié)劑、TRP激動(dòng)劑、組胺H3拮抗劑、胃泌素和胃泌素類(lèi)似物及書(shū)1"生物。應(yīng)能理解的是，具有一種以上上述化合物的本發(fā)明的衍生物與任選一種以上有藥理活性的物質(zhì)的任意適合組合被認(rèn)為落入本發(fā)明范圍之內(nèi)。本x/y舉^摩才參者jt妖r逸括力^參、爭(zhēng)W詐請(qǐng)關(guān)>爭(zhēng),以^奎謬力容遞i2^/^7潛合到本jt#，^提凌就如吝參孝Jt妖卓^舁謬^;《效遞^//^7潛合封本^:—并i^全命^容^本X^被激迷〈法/，摩譯^T^處義程^j。本jt摩^^摩f標(biāo)趟和^標(biāo)眾乂^才4'虔對(duì)本發(fā)效。眾眾力7爿if必賴(lài)迷該發(fā)銀而^不炎A力^:發(fā)'效志厲W虔斜，餘#^說(shuō)效。說(shuō)效力'*芋不^理y^成《努舉要求'^W力,為本發(fā)'效^婆減'摩必;T。本jt^爭(zhēng)《/jt伴^/y舉^^/^眾^^7便^/,而并不義鍵這些爭(zhēng)W義伴^/^^^"效^、^"昔^y授農(nóng)'/么和/4'資賴(lài)^應(yīng)^。本發(fā)'效白括在摩餘歡;^^^/舉^趟迷的摩才/#歡^爭(zhēng)^7力容。實(shí)施例實(shí)施例1:B25H、A14E、A14E—B25H和人胰島素對(duì)胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A的蛋白水解穩(wěn)定性(半衰期)的比較分別在lOOmMNH4HC03,pH8.1或10mMHC1，pH2.0和25°C下lOOitiL的終體積中溫育后，測(cè)量人胰島素和胰島素類(lèi)似物(0.06mM,10pL)對(duì)胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶(0.34-3.4嗎)的蛋白水解穩(wěn)定性。在不同時(shí)間(O、5、15、30和60min)用等體積的0.5%TFA或0.1MTrisHCl，pH8.0(終pH7.7)淬滅樣品，將其轉(zhuǎn)移至5°C。立即通過(guò)RP-HPLC于214nm處對(duì)人胰島素和胰島素類(lèi)似物進(jìn)行分析，確定相應(yīng)于完整蛋白的峰面積。在5mMNaP、140mMNaCl、70ppmTween20、pH7.4和37。C下400|iL的終體積中溫育后，測(cè)量人胰島素和胰島素類(lèi)似物(0.06mM,13.9pg)對(duì)羧肽酶A(工作液6.8jiL、20mg/ml、53單位/mg、Sigma、30、60min)用等體積的0.2%TFA淬滅樣品，將其轉(zhuǎn)移其至5。C。制備沒(méi)加入酶的參比樣品(Omin)。立即通過(guò)RP-HPLC在中性緩沖體系中于214nm處對(duì)人胰島素和胰島素類(lèi)似物進(jìn)行分析，確定相應(yīng)于完整蛋白的峰面積。以相同的保留時(shí)間對(duì)人胰島素和desB30進(jìn)行觀察。根據(jù)曲線(xiàn)可確定半衰期(T！/2)，計(jì)算出相對(duì)于人胰島素的倍增/減時(shí)間(穩(wěn)定性相對(duì)倍數(shù))。人胰島素，T1/2=6.9min和desB30人胰島素，T1/2=6.7確定到相近的半衰期。人胰島素的突變位點(diǎn)T,。[Min](倍)胃蛋白酶T1/2(Min)Af#胰凝乳蛋白酶T1/2(Min)/倍羧肽酶AB25H17.8(16.2)25.7(5.1)25.7(2.1)無(wú)U(1.0)5.0(1.0)6.9(1.0)A14E、DESB303.7(3.4)33.2(6.6)15.7(2.3)無(wú)U(1.0)5.0(1.0)6.9(1.0)A14E、B25H、DESB3042.4(38.5)62.4(12.5)61.9(9.0)無(wú)1.1(1.0)5.0(1.0)6.9(1.0)實(shí)施例2:通過(guò)MS分析和酶特異性鑒定胰島素內(nèi)的蛋白酶切割位點(diǎn)通過(guò)LC-MS利用胰島素和胰島素類(lèi)似物被各種酶類(lèi)(胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A)限制性蛋白水解的時(shí)程分析，來(lái)對(duì)蛋白酶切割位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。產(chǎn)生的肽片段由MS或MS/MS鑒定，并在214nm處定量以確定次要和主要切割位點(diǎn)(熱點(diǎn))。在人胰島素中鑒定出以下熱點(diǎn)胃蛋白酶(B24-25、B25-26、B26-27)和胰凝乳蛋白酶(B16-17、B24-25、B25-26、B26-27、A14-15和A19-20)。有趣的是，所述熱點(diǎn)與胰島素降解酶(IDE)(見(jiàn)下文)和組織蛋白酶D(HanneRefsgaard,NovoNordiskA/S,私人通信)重疊。還基于胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胰島素降解酶(IDE)的酶特異性對(duì)胰島素序列內(nèi)的切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如以下實(shí)施例3所示。以下蛋白酶的切割位點(diǎn)已在若干生物化學(xué)手冊(cè)中描述胰蛋白酶(堿性殘基，C端至Lys、Arg)、彈性蛋白酶(月旨肪族殘基，C端直Ala、Val、Gly、Ser)、羧肽酶A(廣特異性，但不包括Arg、Lys&Pro)、胃蛋白酶A(芳香族殘基，N端至Trp、Tyr、Phe和Leu和各種其它殘基)、和胰凝乳蛋白酶(芳香族殘基，C端至Trp、Tyr、Phe和Leu，但不包括Xxx-Pro)。胰島素內(nèi)IDE的切割位點(diǎn)最近已公開(kāi)B9-10、B10-11、B13-14、B14-15、B24隱25、B25-26、A13-14、A14-l5(Duckworth等，2006)，有報(bào)道顯示以下取代抑制IDE對(duì)胰島素的降解作用B10D和B4E—B16Q一B17F(Bennett等，2003)。實(shí)施例3:A14E、B25H、desB30人胰島素內(nèi)的熱點(diǎn)鑒定的重復(fù)循環(huán)(repeatedcycle)根據(jù)實(shí)施例2中描述的方法鑒定A14E、B25H、desB30人胰島素中胰凝乳蛋白酶切割的主要熱點(diǎn)(B16-17、B24-25、A19-20)和次要切割位點(diǎn)(Bl-2、B6-7)?；诟鶕?jù)酶特異性所鑒定的切割位點(diǎn)和所預(yù)測(cè)的切割位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)胰島素類(lèi)似物。選擇用以被取代的氨基酸殘基以去除切割位點(diǎn)并增大溶解度。胰凝乳蛋白酶，根據(jù)由LC-MS法所鑒定的A14E、B25H、desB30人胰島素水解液中的熱點(diǎn)對(duì)類(lèi)似物的設(shè)計(jì)A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B16X6B24X8A19X11XI-E/D/H/Q扁/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸注釋人胰島素中B24和/或A19的取代可能顯著降低受體親和A14X1B25PdesB30X12HIB1X2B6X3B16X6B24X8A19X11Xl=E/D/H/Q/N/S/窗/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸注釋B25取代為Pro可能顯著減少胰凝乳蛋白酶在B24-25的切割。胰凝乳蛋白酶，根據(jù)所鑒定和預(yù)測(cè)的熱點(diǎn)設(shè)計(jì)A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B11X4B15X5B16X6B17X7B24X8A13X9A16X10A19X11XI-E/D/H/Q/N/S/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X4=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X7=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X9=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸注釋人胰島素中Bll、B15、B24、A13、A16和/或A19的取代可能顯著降低受體親和力。胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶，根據(jù)所鑒定和預(yù)測(cè)的熱點(diǎn)設(shè)計(jì)A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B11X4B15X5B16X6B17X7B24X8A13X9A16X10A19X11B22X13Xl=E/D/H/Q纖/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X4=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X7=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X9=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X10=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q扁/T/M/P/天然氨基酸XI2=desB30/天然氨基酸XI3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶+胰島素降解酶(IDE)，根據(jù)所鑒定和預(yù)測(cè)的熱點(diǎn)設(shè)計(jì)A14X1B25HdesB30X12HIB1X2B6X3B11X4B15X5B16X6A19X11B22X13B4X14B9X15B10X16B13X17B14X18Xl=E/D/H/Q鹿/T/M/PX2=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X3=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X4=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X7=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X9=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI0=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X12=desB30/天然氨基酸X13=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X14=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI5=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI6=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸X17=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸XI8=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/天然氨基酸實(shí)施例4:人胰島素類(lèi)似物對(duì)胰凝乳蛋白酶的蛋白水解穩(wěn)定性(半衰期)在穩(wěn)定性測(cè)定中檢驗(yàn)胰島素類(lèi)似物，根據(jù)實(shí)施例1中所描述的方法通過(guò)半衰期增加來(lái)鑒定類(lèi)似物所表現(xiàn)的對(duì)蛋白水解抗性的增強(qiáng)。結(jié)果表明了進(jìn)一步改良的胰島素類(lèi)似物由于對(duì)蛋白水解的抗性增強(qiáng)以及溶解度增大所導(dǎo)致的生物利用度增強(qiáng)的潛在性。已對(duì)下列胰島素類(lèi)似物相對(duì)于人胰島素的對(duì)胰凝乳蛋白酶的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)施例5:胰島素類(lèi)似物對(duì)鼠腸(十二指腸腔)提取物的蛋白水解穩(wěn)定性根據(jù)胰島素類(lèi)似物在腸提取物中對(duì)于蛋白分解的穩(wěn)定性來(lái)對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。所述提取物通過(guò)洗出空腹動(dòng)物的腔內(nèi)容物來(lái)制備。在37°C，pH=7.4下使胰島素類(lèi)似物與稀釋的提取物溫育，經(jīng)過(guò)20h的溫育后，通過(guò)RP-HPLC確定所述完整化合物的濃度。比較完整胰島素類(lèi)似物和完整人胰島素的相對(duì)量。發(fā)現(xiàn)人胰島素與類(lèi)似物A14EB25HdesB30人胰島素之間在穩(wěn)定性上有約5-10倍的差異。權(quán)利要求1.胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物中相對(duì)于母體胰島素有至少兩個(gè)疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代，其中所述取代位于所述母體胰島素的兩個(gè)以上蛋白酶切割位點(diǎn)內(nèi)部或與其緊密鄰近處，其中這樣的胰島素類(lèi)似物任選進(jìn)一步包含一個(gè)以上插入突變。2.權(quán)利要求1的胰島素類(lèi)似物，其中相對(duì)于母體胰島素，所述胰島素類(lèi)似物的A鏈包含至少一個(gè)突變，所述胰島素類(lèi)似物的B鏈包含至少一個(gè)突變。3.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物相對(duì)于母體胰島素表現(xiàn)出對(duì)一種以上蛋白酶的穩(wěn)定性提高。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物包含式1的A鏈氨基酸序列XaaA(.2)-XaaAy)-XaaAo-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys曙XaaAi2-XaaAi3-XaaAi4-XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8-Tyr-Cys-XaaA2i-Xaa22式(1)(SEQIDNo:1)和式2的B鏈氨基酸序列XaaB(-2)-XaaBw)-XaaBo-XaaBi-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB3(rXaaB31-XaaB32式(2)(SEQIDNo:2)式中XaaA(.2)不存在或?yàn)镚ly;Xaa八(—i)不存在或?yàn)镻ro;XaaAQ不存在或?yàn)镻ro;XaaA8獨(dú)立選自Thr和His;XaaA!2獨(dú)立選自Ser、Asp和Glu;XaaAu獨(dú)立選自L(fǎng)eu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaAw獨(dú)立選自Tyr、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;Xaa^5獨(dú)立選自Gln、Asp和Glu;Xaa雄獨(dú)立選自Asn、Lys和Gln;XaaA21獨(dú)立選自Asn和Gin;Xaaw不存在或?yàn)長(zhǎng)ys;XaaB(.2)不存在或?yàn)镚ly;XaaB(.!)不存在或?yàn)镻ro;Xaa加不存在或?yàn)镻ro;XaaB1不存在或獨(dú)立選自Phe和Glu;Xaas2不存在或?yàn)閂al;XaaB3不存在或獨(dú)立選自Asn和Gin;XaaB4獨(dú)立選自Gin和Glu;Xaawo獨(dú)立選自His、Asp、Pro和Glu;Xaa引6獨(dú)立選自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;XaaB24獨(dú)立選自Phe和His;XaaB25獨(dú)立選自Phe和His;XaaB26不存在或獨(dú)立選自Tyr、His、Thr、Gly和Asp;XaaB27不存在或獨(dú)立選自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;XaaB28不存在iU蟲(chóng)立選自Pro、His、Gly和Asp;XaaB29不存在或《蟲(chóng)立選自L(fǎng)ys和Gin;XaaB3。不存在或?yàn)門(mén)hr;XaaB31不存在或?yàn)長(zhǎng)eu;XaaB32不存在或?yàn)镚lu;C端可任選衍生為酰胺；其中所述A鏈的氨基酸序列和所述B鏈的氨基酸序列通過(guò)所述A鏈7位半胱氨酸與所述B鏈7位半胱氨酸之間的二硫鍵，以及所述A鏈20位半胱氨酸與所述B鏈19位半胱氨酸之間的二硫鍵連接，且其中所述A鏈6位和11位的半胱氨酸由二硫鍵連接；其中任選所述A鏈氨基酸序列N端通過(guò)含3-7個(gè)氨基酸的氨基酸序列與所述B鏈氨基酸序列C端連接，以形成單鏈胰島素分子，其中任選所述B鏈N端延伸1-10個(gè)氨基酸；其中若XaaA8為T(mén)hr且XaaA12為Ser且XaaA13為L(zhǎng)eu且XaaA14為T(mén)yr,則XaaA15為Glu或Asp;且其中若XaaB24為Phe且XaaB25為Phe且XaaB26為T(mén)yr且XaaB27為T(mén)hr且XaaB28為Pro,則XaaB29為Gln。5.藥物組合物，所述藥物組合物包含生物活性量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受的載體。6.治療、預(yù)防或緩解對(duì)象中以下疾病的方法高血糖癥、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖癥、X綜合征或脂血障礙，所述方法包括給予對(duì)象權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物或權(quán)利要求5中任一種的藥物組合物。7.權(quán)利要求6的方法，所述方法為口服給藥。8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物用作治療或預(yù)防以下疾病的藥物高血糖癥、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖癥、X綜合征和脂血障礙。9.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物用作延遲或預(yù)防II型糖尿病病程的藥物。10.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物，所述胰島素類(lèi)似物用作起以下作用的藥物減少食物攝入、減少P-細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)(3-細(xì)胞功能和增大P-細(xì)胞群、和/或用于恢復(fù)(3-細(xì)胞的葡萄糖敏感性。11.編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物的核酸序列。12.制備權(quán)利要求5的藥物組合物的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素類(lèi)似物與藥學(xué)上可接受的物質(zhì)和/或賦形劑混合。全文摘要本發(fā)明涉及對(duì)蛋白酶表現(xiàn)出抗性的新型胰島素類(lèi)似物，該胰島素類(lèi)似物中相對(duì)于母體胰島素分子，有至少兩個(gè)氨基酸被取代和/或缺失。本發(fā)明還提供了制備這樣的胰島素類(lèi)似物的方法，制備包含本發(fā)明胰島素類(lèi)似物的胰島素制劑的方法以及應(yīng)用這些胰島素類(lèi)似物治療糖尿病的方法。文檔編號(hào)C07K14/62GK101541830SQ200780043130公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2007年9月20日優(yōu)先權(quán)日2006年9月22日發(fā)明者F·休巴萊克,I·勞特魯普-拉森,P·K·尼爾森,P·巴爾施米特,P·諾加爾德,S·盧德維格森,S·哈夫倫,U·里貝爾-馬德森申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司