專利名稱：2－氨基酚1，6－雙加氧酶、其基因及用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領域，具體地說，它涉及一個來源于睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCCNo.1028菌株的基因，該基因大小為1770 bp堿基對，其表達一個具有活性的酶，該酶可以催化2-氨基酚進行1，6位開環(huán)裂解，也可以催化對硝基氯代苯直接開環(huán)裂解。因此，該基因可以用于構(gòu)建基因工程菌，生產(chǎn)具有活性的酶，用于含對硝基氯代苯類化合物的污水處理以及用于生物轉(zhuǎn)化加工工程。
背景技術(shù)：
氯代硝基苯類化合物(Chloronitrobenzenes，CNBs)作為重要的化工中間體被廣泛用于生產(chǎn)和制造橡膠、染料、農(nóng)藥、醫(yī)用藥品等，以對氯硝基苯為例，我國2000年產(chǎn)量為12萬噸。氯代硝基苯等芳香族化合物具有多種途徑進入環(huán)境成為污染物，例如殘留在生產(chǎn)過程中排放的廢水，或者由環(huán)境中含芳香環(huán)化合物的不徹底降解和轉(zhuǎn)化而來，例如硝基苯胺和氯代硝基苯胺是農(nóng)藥、染料、顏料等不徹底分解產(chǎn)生的；我國自來水供應多采用氯化消毒，氯代硝基苯是檢測到的氯化消毒副產(chǎn)物之一。歐共體早已宣布氯代硝基苯是一種特別有害的化合物且在環(huán)境中難以降解，其危害包括引起人和動物的高鐵血紅蛋白血癥(Methemoglobinemia)，并且是一種誘變劑和致癌劑，五氯硝基苯破壞肺、肝、腎的功能，并直接損害神經(jīng)系統(tǒng)。因此，研究氯代硝基苯類化合物的生物降解和酶促降解對于保護環(huán)境及提高人類健康具有重要意義。
目前，國內(nèi)外就氯代苯類或者硝基苯類有機物的生物降解進行了大量研究，而對芳環(huán)上同時存在氯原子和硝基的氯代硝基苯類化合物的研究報道則較少，其主要原因是當氯原子和硝基同時存在時，由于二者的吸電子特性，導致芳環(huán)裂解更加困難。許多能夠降解氯代苯或硝基苯等芳烴衍生物的菌種并不能降解對氯硝基苯。迄今，除了國外個別報道之外，單一菌種或混合菌種對氯硝基苯的降解能力、降解性質(zhì)等所知甚少。而對于氯代硝基苯類的酶促降解和轉(zhuǎn)化的研究則更少。
此外，利用酶促反應的生物加工和轉(zhuǎn)化更是近年來新興的生物工程技術(shù)，可以在常溫常壓條件下以非常經(jīng)濟、高效的方法轉(zhuǎn)化加工獲得高純度的高品質(zhì)產(chǎn)品，目前已經(jīng)在生物制藥領域、生物化工領域得到應用，如手性藥物的生產(chǎn)和丙烯酰胺的生產(chǎn)，但在氯代硝基苯類化合物的生物轉(zhuǎn)化方面尚未見到報道。
因此，研究氯代硝基苯生物降解途徑、開發(fā)酶制劑資源有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述存在問題，本發(fā)明的目的是為氯代硝基苯類及其相關(guān)衍生化合物的酶促降解和轉(zhuǎn)化提供一種新的酶的基因及其由該基因編碼的兩個不同的蛋白產(chǎn)物β-亞基和α-亞基組成的2-氨基酚1，6-雙加氧酶，該酶可以催化2-氨基酚進行1，6位開環(huán)裂解，也可以催化對硝基氯代苯開環(huán)裂解。
因此，本發(fā)明提供的基因可以用于構(gòu)建基因工程菌，生產(chǎn)具有活性的酶，用于含對硝基氯代苯類化合物的污水處理以及用于生物轉(zhuǎn)化加工工程。
2-氨基酚1，6-雙加氧酶基因大小為1770bp堿基對，含有兩個同方向的ORF開放閱讀框架，兩個開放閱讀框架分別為如序列表2NO.1所示的942bp核苷酸序列和如序列表1NO.1所示的813bp核苷酸序列，其編碼兩個不同的蛋白產(chǎn)物，如序列表2NO.2所示的314個氨基酸序列為β-亞基和如序列表1NO.2所示的271個氨基酸序列為α-亞基。兩個β-亞基和兩個α-亞基組成一個具有活性的酶分子。該酶可以催化2-氨基酚進行1，6位開環(huán)裂解，也可以催化對硝基氯代苯直接開環(huán)裂解。
2-氨基酚1，6-雙加氧酶基因來源于睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株。將該菌在LB平板上的單菌落挑到LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)，收集菌體，提總DNA，用Mbo I部分酶切至30kb左右的片斷。用SuperCos 1作為載體(購自Stratagene Company，USA)，載體先用Xba I酶切后，去磷酸化，再用BamH I酶切成6.8kb和1.1kb的兩個片段。將基因組部分酶切的片段和處理后的載體在16℃用T4 DNA連接酶連接。連接好的片段用Gigapack III XL包裝蛋白(購自StratageneCompany，USA)包裝。最終轉(zhuǎn)染至大腸桿菌XL 1-blue MR(購自StratageneCompany，USA)中，建立Cosmid基因文庫。從基因文庫中篩選到有2-氨基酚1，6-雙加氧酶活性的3個陽性克隆。將其中一個克隆的質(zhì)粒提取出來測序。從序列中分析出編碼2-氨基酚1，6-雙加氧酶α、β亞基的基因，這兩個亞基的基因的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列分別如序列表1和序列表2所示。
以這兩個亞基的氨基酸序列在NCBI上進行blastx比對，發(fā)現(xiàn)α-亞基氨基酸序列與2-aminophenol-1，6-dioxygenase alpha subunit[Pseudomonas pseudoalcaligenes](登錄號為AAB71525)的序列相似性為56％；β-亞基的氨基酸序列與2-aminophenol 1，6-dioxygenase betasubunit[Pseudomonas putida](登錄號為AAK26519)的序列相似性為79％。同時，從睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1(CGMCC No.1028)細胞中純化出2-氨基酚1，6-雙加氧酶蛋白，并將酶蛋白的α、β-亞基送到北京大學蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國家重點實驗室，對兩個亞基的N端各8個氨基酸進行測序，測序結(jié)果為α亞基，TVVSAFLV；β亞基，MQGEIIAG。與得到的基因序列所編碼的N端氨基酸序列完全相同。由此可以肯定，得到的序列所編碼的蛋白具有2-氨基酚1，6-雙加氧酶的活性。
含本發(fā)明提供的基因的轉(zhuǎn)化子構(gòu)建和酶的表達將本發(fā)明提供的基因連接到載體SuperCos 1后，以Gigapack III XL包裝蛋白包裝，或也可以將該基因連接到其他表達載體，然后將包裝好的載體或連接載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌或其他細菌，經(jīng)LB培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基培養(yǎng)，含有連接基因片段的菌落就為轉(zhuǎn)化子，以SuperCos 1為載體的轉(zhuǎn)化子不需要誘導就可以表達酶活性，而以其他的表達載體為載體的轉(zhuǎn)化子則需要載體相應的誘導物誘導表達酶活性。以這些轉(zhuǎn)化子可以用于酶的生產(chǎn)或這些轉(zhuǎn)化子可以直接用于含對硝基氯代苯或鄰氨基酚廢水處理或這些底物的生物轉(zhuǎn)化工程。
本發(fā)明提供的基因所編碼的酶對硝基氯代苯開環(huán)酶活性的測定方法為對硝基氯代苯在280nm處有最大吸收峰，紫外分光光度計測定單位時間內(nèi)280nm處的光吸收值的減少量，可測得對硝基氯代苯開環(huán)酶的酶比活。反應體系包括0.3μmol對硝基氯代苯，50mmol/L磷酸鹽緩沖液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的純蛋白溶液，酶促反應總體積為3mL。
本發(fā)明提供的基因所編碼的酶2-氨基酚1，6-雙加氧酶活性的測定方法為2-氨基苯酚的反應產(chǎn)物2-氨基粘康酸半醛在380nm處有最大吸收峰，紫外分光光度計測定單位時間內(nèi)380nm處的光吸收值的增加量，可測得雙加氧酶的酶比活。反應體系包括0.3μmol 2-氨基苯酚，50mmol/L磷酸鹽緩沖液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的純蛋白溶液，酶促反應總體積為3mL。2-氨基粘康酸半醛的摩爾消光系數(shù)ε＝15.1 L mmol-1cm-1。1個單位的酶活力定義為1mg蛋白每分鐘生成1nmol的2-氨基粘康酸半醛。
本發(fā)明提供的基因所編碼的2-氨基酚1，6-雙加氧酶的純化方法為1、硫酸氨沉淀，收集65％～70％飽和濃度之間的蛋白；2、在4℃溫度下，用BufferA20mM Tris-HCl，pH8.0；10％ethanol；1mM dithiothreitol；0.5mML-ascorbic acid作為流動相，過Superdex (Pharmacia Biotech公司)分子篩，收集55～80mL處的流出液，測酶活，選擇酶活較高的蛋白溶液進行下一步實驗；3、將上一步得到的蛋白溶液過Mono Q HR 5/5(PharmaciaBiotech公司)離子交換柱，用Buffer A+NaCl洗脫，洗脫梯度為50mM～500mM NaCl，收集洗脫液，測酶活，跑SDS-PAGE，即可得到純的酶蛋白。
具體實施方案為了更好地理解本發(fā)明，通過一下實施實例予以進一步說明，但并非對本發(fā)明的限定。
實施例12-氨基酚1，6-雙加氧酶基因的克隆將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株在LB平板上的單菌落挑到LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)，收集菌體，提總DNA，用Mbo I部分酶切至30kb左右的片斷。用SuperCos 1作為載體(購自Stratagene Company，USA)，載體先用XXba I酶切后，去磷酸化，再用BamH I酶切成6.8kb和1.1kb的兩個片段。將基因組部分酶切的片段和處理后的載體在16℃用T4 DNA連接酶連接。連接好的片段用Gigapack IIIXL包裝蛋白(購自Stratagene Company，USA)包裝。最終轉(zhuǎn)染至大腸桿菌XL 1-blue MR(購自Stratagene Company，USA)中，建立Cosmid基因文庫。用2-氨基苯酚作為底物篩選文庫，30℃培養(yǎng)兩天，溶液為無色的克隆為陽性克隆，從基因文庫中篩選到有2-氨基酚1，6-雙加氧酶活性的3個陽性克隆。將其中一個克隆的質(zhì)粒提取出來測序。對測序結(jié)果進行ORF分析，在NCBI上進行blastx比對，從序列中分析出編碼2-氨基酚1，6-雙加氧酶α、β亞基的基因序列。基因編碼的α-亞基氨基酸序列與2-aminophenol1，6-dioxygenase alpha subunit[Pseudomonas pseudoalcaligenes](登錄號為AAB71525)的序列相似性為56％；基因編碼的β-亞基的氨基酸序列與2-aminophenol 1，6-dioxygenase beta subunit[Pseudomonas putida](登錄號為AAK26519)的序列相似性為79％。從序列中分析出編碼2-氨基酚1，6-雙加氧酶α、β亞基的基因，這兩個亞基的基因的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列分別如序列表1和序列表2所示實施例2含本發(fā)明提供的基因的轉(zhuǎn)化子構(gòu)建和酶的表達將本發(fā)明提供的基因連接到載體SuperCos 1后，以Gigapack III XL包裝蛋白包裝，或也可以將該基因連接到其他表達載體，然后將包裝好的載體或連接載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌或其他細菌，經(jīng)LB培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基培養(yǎng)，含有連接基因片段的菌落就為轉(zhuǎn)化子，以SuperCos 1為載體的轉(zhuǎn)化子不需要誘導就可以表達酶活性，而以其他的表達載體為載體的轉(zhuǎn)化子則需要載體相應的誘導物誘導表達酶活性。以這些轉(zhuǎn)化子可以用于酶的生產(chǎn)或這些轉(zhuǎn)化子可以直接用于含對硝基氯代苯或鄰氨基酚廢水處理或這些底物的生物轉(zhuǎn)化工程。
實施例32-氨基酚1，6-雙加氧酶活性的測定2-氨基苯酚的反應產(chǎn)物2-氨基粘康酸半醛在380nm處有最大吸收峰，紫外分光光度計測定380nm處的光吸收值的增加量，可測得雙加氧酶的酶比活。反應體系包括0.3μmol 2-氨基苯酚，50mmol/L磷酸鹽緩沖液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的細胞提取液，酶促反應總體積為3mL。2-氨基粘康酸半醛的摩爾消光系數(shù)ε＝15.1L mmol-1cm-1。1個單位的酶活力定義為1mg蛋白每分鐘生成1nmol的2-氨基粘康酸半醛。
實施例42-氨基酚1，6-雙加氧酶的純化方法1)硫酸氨沉淀，收集65％～70％飽和濃度之間的蛋白；2)在4℃溫度下，用Buffer A(20mM Tris-HCl，pH8.0；10％ethanol；1mM dithiothreitol；0.5mM L-ascorbic acid)作為流動相，過Superdex(Pharmacia Biotech公司)分子篩，收集55～80ml處的流出液，測酶活，選擇酶活較高的蛋白溶液進行下一步實驗；3)將上一步得到的蛋白溶液過Mono Q HR 5/5(PharmaciaBiotech公司)離子交換柱，用Buffer A+NaCl洗脫，洗脫梯度為50mM～500mM NaCl，收集洗脫液，測酶活，跑SDS-PAGE，即可得到純的酶蛋白。
實施例5酶亞基的N端氨基酸序列測定從睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1(CGMCC No.1028)細胞中純化出2-氨基酚1，6-雙加氧酶蛋白，將10～250pmol的蛋白樣品點道聚丙烯酰胺微型凝膠上(7.5～20％梯度)，20W恒功率電泳。電泳完畢，將凝膠浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中(10mM CAPS，10％甲醇，pH11.0)，浸泡5min以除去多余的Tris和甘氨酸。將一張PVDF膜用100％甲醇浸潤，并儲存在轉(zhuǎn)移緩沖液中。將凝膠夾在PVDF膜和幾張印跡紙中間，裝到印跡裝置上，在轉(zhuǎn)移緩沖液中電洗脫20min，80V。PVDF膜在去離子水中漂洗5min，用0.1％考馬斯亮藍R-250的50％甲醇溶液染色5min(室溫)。在室溫脫色(50％甲醇，10％乙酸)5min。最后將膜用去離子水晶潤5～10min，空氣干燥，-20℃儲存。將處理好的樣品送到北京大學蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國家重點實驗室，對兩個亞基的N端各8個氨基酸進行測序，測序結(jié)果為α亞基，TVVSAFLV；β亞基，MQGEIIAG。與得到的基因序列所編碼的N端氨基酸序列完全相同。
實施例62-氨基酚1，6-雙加氧酶的功能鑒定用按照實施例4得到的純酶做酶催化反應實驗，分別以鄰氨基酚和對氯硝基苯為底物，表明純酶具有將鄰氨基酚和對氯硝基苯開環(huán)的能力，其結(jié)果見表1。反應條件如下0.3μmol 2-氨基苯酚或?qū)β认趸剑?0mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的純蛋白溶液，酶促反應總體積為3mL，于380nm處檢驗光吸收值的變化速率。
表1本發(fā)明提供的基因所編碼的酶的底物范圍底物酶比活(U/mg蛋白)鄰苯二酚 ++3-甲基鄰苯二酚 +4-甲基鄰苯二酚 +4-氯鄰苯二酚 +2，4-二羥苯甲酸 +原兒茶酸 +對氯硝基苯(對硝基氯代苯) ++鄰氨基酚 29.41
序列表1(alpha-subunit)<110>中國科學院微生物研究所<120>一種降解對硝基氯代苯的開環(huán)酶基因及其用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>813<212>DNA<213>Comamonas testosteroni CNB1<400>1atgaccgttg tatctgcttt cctcgtgccc ggcacgcccc tgccacaact caagcccgag60gtcccgtcct gggggcaact tgccgccgcc acggagcgcg ccgggaaggc gctcgcggct120tcgcgccccg atgtggtctt ggtctactcg acccaatggc ttgccgtgct tgaccagcag180tggctgacgc gccctcgcag tgaaggcgtt catgtcgacg agaactggta cgagttcggc240gacctggcat atgacatccg agcggacact gcattggccg aggcctgtgt gacgagttct300ccgctccatg gcgtccatgc ccggggcgtt aactacgatg gatttccgat cgacaccgga360acgatcactg catgcactct gatgggaatc ggcaccgatg cattcccatt ggtggttggt420tccaacaatc tttaccacag cggcgagatc accgagaagt tggccgcact ggcggtcgac480tgcgccaagg atcaaaacaa acgtgtggcg gtcgtcggtg ttggtggcct gtcgggctcg540ctcttccgtg aggagattga tccgcgcgaa gatcgaattg ccaatgaaga agacgacaag600tggaatcggc gtgttctgaa gctcattgaa gcgggtgacg tgagcgccct gcgcgaggcg660atgccagtct atgcaaaaga ggctcgtgtc gatatggggt tcaagcacct ccactggatc720cttggtgcgc tcaagggcaa gttctcgggc gccaacgtgc ttggttacgg gccttcctat780ggctccggtg ccgccgtgat cgagttccga ctc 813<210>2<211>271
<212>PRT<213>Comamonas testosteroni CNB1<400>2Met Thr Val Val Ser Ala Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Leu Pro Gln1 5 10 15Leu Lys Pro Glu Val Pro Ser Trp Gly Gln Leu Ala Ala Ala Thr Glu20 25 30Arg Ala Gly Lys Ala Leu Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Val Leu Val35 40 45Tyr Ser Thr Gln Trp Leu Ala Val Leu Asp Gln Gln Trp Leu Thr Arg50 55 60Pro Arg Ser Glu Gly Val His Val Asp Glu Asn Trp Tyr Glu Phe Gly65 70 75 80Asp Leu Ala Tyr Asp Ile Arg Ala Asp Thr Ala Leu Ala Glu Ala Cys85 90 95Val Thr Ser Ser Pro Leu His Gly Val His Ala Arg Gly Val Asn Tyr100 105 110Asp Gly Phe Pro Ile Asp Thr Gly Thr Ile Thr Ala Cys Thr Leu Met115 120 125Gly Ile Gly Thr Asp Ala Phe Pro Leu Val Val Gly Ser Asn Asn Leu130 135 140Tyr His Ser Gly Glu Ile Thr Glu Lys Leu Ala Ala Leu Ala Val Asp145 150 155 160Cys Ala Lys Asp Gln Asn Lys Arg Val Ala Val Val Gly Val Gly Gly165 170 175
Leu Ser Gly Ser Leu Phe Arg Glu Glu Ile Asp Pro Arg Glu Asp Arg180 185 190Ile Ala Asn Glu Glu Asp Asp Lys Trp Asn Arg Arg Val Leu Lys Leu195 200 205Ile Glu Ala Gly Asp Val Ser Ala Leu Arg Glu Ala Met Pro Val Tyr210 215 220Ala Lys Glu Ala Arg Val Asp Met Gly Phe Lys His Leu His Trp Ile225 230 235 240Leu Gly Ala Leu Lys Gly Lys Phe Ser Gly Ala Asn Val Leu Gly Tyr245 250 255Gly Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ala Ala Val Ile Glu Phe Arg Leu260 265 270
序列表2(beta-subunit)<110>中國科學院微生物研究所<120>一種降解對硝基氯代苯的開環(huán)酶基因及其用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>942<212>DNA<213>Comamonas testosteroni CNB1<400>1gtgaaaatgc aaggtgaaat catcgcggga tttttggctc cccatccccc tcacttggtg 60tacggtgaaa atccaccgca gaacgagccc cgctcccaag ggggctggga ggtgcttcgt120tgggcttacg agcgcgcacg cgaacgcttg gatgccatga agcccgacgt cctgctcgtg180cactcgcccc attggatcac ctcggttggt catcacttct tgggcgtgcc cgagctgagt240ggcaagtcgg tggatcccat tttcccgaac gtgttccgct acgacttctc gttgaacgtg300gacgtggaac tggctgaggc ctgcgccgag gaaggcagaa aagcgggtct tgtgaccaag360atgatgcgta acccgaagtt ccgcgtcgac tacggcacga tcaccactct gcacctgatt420cgtccgcagt gggacattcc tgtggtgggt atctctgcca acaactcgcc gtactacctc480aataccaaag agggtatgtc ggagatggat gtcttgggca aggcgacgcg cgaggcgatt540cgtaagacgg ggcgcaaggc cgtgctgctc gcctcgaaca cgctatccca ctggcatttc600catgaggagc cgacgatccc cgaggacatg tccaaggagt atcccgcgac catggctggc660tatcaatggg acatccgaat gattgagctc atgaggcagg gcaagaccag cgaggtgttc720aagttgctgc cgcaattcat tgatgaagcc tttgcggaag tgaaatccgg tgcgttcacc780tggatgcacg ccgcgatgca gtacccggaa ctggccgcag aactgtttgg ctatggcacg840gtgatcggta cgggcaacgc cgttatggag tgggatttgc gaaaggccgg gctgtcgatg900cttggcgctg ccgatcaaaa acaacgcagc gcagctgttg cc 942
<210>2<211>314<212>PRT<213>Comamonas testosteroni CNB1<400>2Val Lys Met Gln Gly Glu Ile Ile Ala Gly Phe Leu Ala Pro His Pro1 5 10 15Pro His Leu Val Tyr Gly Glu Asn Pro Pro Gln Asn Glu Pro Arg Ser20 25 30Gln Gly Gly Trp Glu Val Leu Arg Trp Ala Tyr Glu Arg Ala Arg Glu35 40 45Arg Leu Asp Ala Met Lys Pro Asp Val Leu Leu Val His Ser Pro His50 55 60Trp Ile Thr Ser Val Gly His His Phe Leu Gly Val Pro Glu Leu Ser65 70 75 80Gly Lys Ser Val Asp Pro Ile Phe Pro Asn Val Phe Arg Tyr Asp Phe85 90 95Ser Leu Asn Val Asp Val Glu Leu Ala Glu Ala Cys Ala Glu Glu Gly100 105 110Arg Lys Ala Gly Leu Val Thr Lys Met Met Arg Asn Pro Lys Phe Arg115 120 125Val Asp Tyr Gly Thr Ile Thr Thr Leu His Leu Ile Arg Pro Gln Trp130 135 140Asp Ile Pro Val Val Gly Ile Ser Ala Asn Asn Ser Pro Tyr Tyr Leu145 150 155 160
Asn Thr Lys Glu Gly Met Ser Glu Met Asp Val Leu Gly Lys Ala Thr165 170 175Arg Glu Ala Ile Arg Lys Thr Gly Arg Lys Ala Val Leu Leu Ala Ser180 185 190Asn Thr Leu Ser His Trp His Phe His Glu Glu Pro Thr Ile Pro Glu195 200 205Asp Met Ser Lys Glu Tyr Pro Ala Thr Met Ala Gly Tyr Gln Trp Asp210 215 220Ile Arg Met Ile Glu Leu Met Arg Gln Gly Lys Thr Ser Glu Val Phe225 230 235 240Lys Leu Leu Pro Gln Phe Ile Asp Glu Ala Phe Ala Glu Val Lys Ser245 250 255Gly Ala Phe Thr Trp Met His Ala Ala Met Gln Tyr Pro Glu Leu Ala260 265 270Ala Glu Leu Phe Gly Tyr Gly Thr Val Ile Gly Thr Gly Asn Ala Val275 280 285Met Glu Trp Asp Leu Arg Lys Ala Gly Leu Ser Met Leu Gly Ala Ala290295 300Asp Gln Lys Gln Arg Ser Ala Ala Val Ala305 310
權(quán)利要求
1.一種新2-氨基酚1，6-雙加氧酶，其氨基酸組成具有如序列表2 NO.2所示的314個氨基酸序列為β-亞基和如序列表1 NO.2所示的271個氨基酸序列為α-亞基，酶是由兩個β-亞基和兩個α-亞基組成。
2.編碼權(quán)利要求1所述酶的基因，其核苷酸長度為1770堿基對，含有兩個同方向的ORF開放閱讀框架，分別為如序列表2 NO.1所示的942bp核苷酸序列和如序列表1 NO.1所示的813bp核苷酸序列。
3.一種含有權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)化子。
4.權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化子在2-氨基酚、對硝基氯代苯類化合物的生物降解和生物轉(zhuǎn)化工程中應用。
5.權(quán)利要求1所述的酶在2-氨基酚、對硝基氯代苯類化合物的酶促降解和生物轉(zhuǎn)化工程中應用。
6.權(quán)利要求2所述的基因在2-氨基酚、對硝基氯代苯類化合物的生物降解和生物轉(zhuǎn)化工程中應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個降解對硝基氯代苯開環(huán)酶基因及其表達產(chǎn)物，該基因來源于一株睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株。該基因大小為1770bp堿基對，含有兩個同方向的ORF開放閱讀框架，兩個開放閱讀框架分別為942bp和813bp，中間相隔15bp，編碼兩個不同的蛋白產(chǎn)物，為β－亞基和α－亞基。兩個β－亞基和兩個α－亞基組成一個具有活性的酶分子。該酶可以催化2－氨基酚進行1，6位開環(huán)裂解，也可以催化對硝基氯代苯直接開環(huán)裂解。因此，該基因可以用于構(gòu)建基因工程菌，生產(chǎn)具有活性的酶，用于含對硝基氯代苯類化合物的污水處理以及用于生物轉(zhuǎn)化加工工程。
文檔編號A62D3/00GK1621520SQ20031011881
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者劉雙江, 吳建峰, 劉志培 申請人:中國科學院微生物研究所