專利名稱：：一種液相環(huán)境下酶促降解殘留農(nóng)藥的方法及其設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種液相環(huán)境下酶促降解殘留農(nóng)藥的方法及其設(shè)備。
背景技術(shù)：
：農(nóng)藥殘留問題是國際和國內(nèi)食品安全面臨的大問題，是制約我國蔬菜、水果、水制品、茶葉、中藥等產(chǎn)品出口的重大瓶頸問題，是生物、化學(xué)、農(nóng)業(yè)等專家研究的重要技術(shù)方向。降解農(nóng)藥殘留的方法主要有化學(xué)降解、光降解和微生物降解。常用的化學(xué)降解法有氧化法、堿水解法和酸水解法?；瘜W(xué)法雖然能有效降解農(nóng)藥，但僅適用于農(nóng)藥廠生產(chǎn)廢水的處理，且酸、堿容易腐蝕管道，成本高，具有一定危險性。光降解是利用日光降解植物表面、土壤表面和空氣中的農(nóng)藥。不同的化合物在光照下穩(wěn)定性不同，光照強(qiáng)度、土壤類型也會影響降解效果，因而光降解的作用較為有限。環(huán)境中的微生物能降解和轉(zhuǎn)化農(nóng)藥。事實上，農(nóng)藥在環(huán)境中的降解和轉(zhuǎn)化主要由微生物引起。微生物對農(nóng)藥的代謝多通過一系列酶促反應(yīng)完成，包括水解作用。不過，上述方法無一適合蔬菜、瓜果和茶葉上殘留農(nóng)藥的清除，特別是工業(yè)化處理?；瘜W(xué)法所需的酸、堿及氧化條件已足以破壞蔬菜瓜果的營養(yǎng)成分；光降解法需要很長時間；微生物處理降解農(nóng)藥，對蔬菜瓜果也有損害。即使沒有影響，這樣處理的蔬菜瓜果估計很難被人們所接受。生物化學(xué)酶促的污染物降解反應(yīng)具有專一性高和效率高的特點(diǎn)，對目標(biāo)污染物的降解效果確切，降解機(jī)理明確，降解產(chǎn)物無毒性殘留。同時，生物酶本身為蛋白質(zhì)，無毒、穩(wěn)定、使用量極低，為微克級/立升，所以不會導(dǎo)致繼發(fā)性污染，是解決農(nóng)藥殘留問題的主要技術(shù)發(fā)展方向。目前，常用的農(nóng)藥為有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，針對上述農(nóng)藥的生物水解酶如有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶和擬除蟲菊酯水解酶已有報道，這些酶的最佳酶活性pH范圍為7-9;而蔬菜瓜果、茶葉、中藥等液態(tài)產(chǎn)品的pH常呈酸性，因此，采用生物水解酶降解直接加入上述液態(tài)產(chǎn)品中，降解殘留農(nóng)藥的效果常常不佳，同時外源生物水解酶的加入也不利于保證產(chǎn)品質(zhì)量，帶來不必要的安全風(fēng)險。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為采用生物水解酶有效地降解蔬菜瓜果、茶葉、中藥等液態(tài)產(chǎn)品中殘留的農(nóng)藥，并避免外源生物水解酶的摻入。膜分離技術(shù)是一項新興分離技術(shù)，膜分離過程是基于物理篩分原理，即膜允許比其分子量小的組分透過，而截留比其孔徑大或者相近的組分。本發(fā)明將酶液循環(huán)灌注在具有一定分子量截留的膜分離柱中，酶蛋白分子較大，駐留在膜分離柱中。處理的樣品溶液循環(huán)灌注在管柱內(nèi)，樣品中的小分子物質(zhì)包括農(nóng)藥殘留由于分子量較小，可滲透到膜分離柱中。在膜層交換的界面上可迅速被柱內(nèi)的酶蛋白所降解，從而達(dá)到農(nóng)藥降解的目的。為此，本發(fā)明提供了一種液相環(huán)境下酶促降解殘留農(nóng)藥的方法，包括下列步驟具有殘留農(nóng)藥的液態(tài)產(chǎn)品和酶溶液分別通過不同管道流向膜分離系統(tǒng)交換界面的兩面，所述膜分離系統(tǒng)的孔徑截留分子量與殘留農(nóng)藥分子量比大于20倍，所述殘留農(nóng)藥通過所述膜分離系統(tǒng)的孔進(jìn)入酶溶液而被降解。在一些實施方式中，所述的膜分離系統(tǒng)由一支持層及一膜層組成，其中，膜層在膜分離系統(tǒng)的內(nèi)側(cè)，支持層在膜分離系統(tǒng)的外側(cè)。在一些實施方式中，所述膜分離系統(tǒng)的膜層結(jié)構(gòu)可為平板膜、巻式膜、管式膜或中空纖維膜。在一些實施方式中，所述膜分離系統(tǒng)包含超濾膜、納濾膜中的一種或多種。超濾膜的孔徑為0.01至1微米，孔隙率60%至90%;納濾膜的孔徑為0.1至1納米，孔隙率80%至90%。在一些實施方式中，所述殘留農(nóng)藥包括但不限于，有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。在一些實施方式中，所述液態(tài)產(chǎn)品包括但不限于，蔬菜瓜果、茶葉、中藥等的液態(tài)產(chǎn)品。所述液態(tài)產(chǎn)品的pH范圍為pH2-6，優(yōu)選pH3.5-5.5。在一些實施方式中，所述酶溶液為有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、除蟲菊酯類水解酶，或其中一種或任何兩種的組合配伍或復(fù)合酶溶液。酶溶液的pH范圍為pH7-8。有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶和擬除蟲菊酯水解酶是由來源于微生物的基因表達(dá)的，有機(jī)磷水解酶選自opd基因、opdA基因、mpd基因、ophC2基因表達(dá)產(chǎn)物的一種或組合；氨基甲酸酯水解酶選自cehA基因、caha基因產(chǎn)物中的一種或組合；擬除蟲菊酯水解酶為estP基因表達(dá)產(chǎn)物。上述水解酶的基因表達(dá)為本
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的公知常識。在一些實施方式中，所述酶溶液為有機(jī)磷水解酶溶液時，所述膜分離系統(tǒng)的孔徑截留分子量為5，000-15，000道爾頓。在一些實施方式中，所述具有殘留農(nóng)藥的液態(tài)產(chǎn)品和酶溶液可同向流入或雙向流入，其中優(yōu)選雙向流。另一方面，本發(fā)明還公開實施上述方法的設(shè)備，包括主體，該主體含有中空容室，其上下壁各設(shè)有一溶液的出入口；容室內(nèi)裝置有若干中空纖維管膜并與上下兩個溶液出入口相連；所述的中空纖維管膜由一支持層及一功能選擇層組成，其中，功能層在膜管的內(nèi)側(cè)，支持層在膜管的外側(cè)。本發(fā)明所提供方法和設(shè)備可使酶液循環(huán)使用并可保持酶反應(yīng)的最適pH，對處理樣品的pH改變不大，特別在果汁、速溶茶加工過程中農(nóng)藥殘留處理時，能減少有效成分的破壞。該方法降解效率高，工藝宜放大，成本較低，并避免外源生物水解酶的摻入，無污染，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。圖l.本發(fā)明一實施例里中空纖維柱系統(tǒng)示意圖。圖2.本發(fā)明一實施例里中空纖維柱系統(tǒng)膜內(nèi)外pH值的變化。圖3.本發(fā)明一實施例里中空纖維柱系統(tǒng)膜內(nèi)外pH值的變化。圖4.本發(fā)明一實施例里中空纖維柱系統(tǒng)膜內(nèi)外pH值的變化c圖5.本發(fā)明一實施例里中空纖維柱系統(tǒng)膜內(nèi)外pH值的變化c圖6.本發(fā)明一實施例里中空纖維柱系統(tǒng)膜內(nèi)外pH值的變化c圖7.本發(fā)明一實施例里中空纖維柱系統(tǒng)膜內(nèi)外pH值的變化c具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。實施例1、膜分離系統(tǒng)，工作狀態(tài)下，膜內(nèi)外pH值的變化速率膜分離系統(tǒng)以中空纖維系統(tǒng)為例，參見圖1:中空纖維系統(tǒng)主要包括主體1，該主體1含有圓柱形容室2，其上下壁各設(shè)有一溶液的出入口11、12。容室2內(nèi)裝置有若干中空纖維管膜3孔徑截留分子量為5，000-15，000道爾頓，并與上下兩個溶液出入口4、5相連。所述的中空纖維管膜3由一支持層31及一功能選擇層32組成，其中，功能選擇層32在中空纖維管膜3的內(nèi)側(cè)，支持層31在中空纖維管膜3的外側(cè)。模擬中空纖維素膜應(yīng)用條件下，膜內(nèi)酶液體系接蠕動泵，通過蠕動泵泵入纖維素膜管，膜內(nèi)酶液體系為不加酶的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH8.0，pH7.5，pH7.0各2L);膜外樣本液接蠕動泵，通過蠕動泵泵入柱內(nèi)的膜外空間。柱內(nèi)樣本體系分別使用pH5.5，pH5.0，pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液各2L。每隔三分鐘取溶液出口溶液，觀察其pH變化。結(jié)果參見圖2-6，結(jié)論在酶促反應(yīng)15分鐘內(nèi)，酶液pH變化范圍為0.01_1.2，樣本處理液pH變化范圍為O.06-0.48。其中，酶液pH7.0，樣本處理液pH5.5時，pH變化最小，為系統(tǒng)優(yōu)選的緩沖PH條件。實施例2、選擇性通透膜系統(tǒng)降解茶葉提取液中農(nóng)藥殘留稱取100g速溶茶粉末，加入300ml水，沸水浴20min使其完全溶解，定容至400ml，得25%速溶茶溶液，測其pH為5.0。膜內(nèi)酶溶液選擇pH8.0的Tris-CL緩沖液，在500mlpH8.0的Tris-CL緩沖液加入10ml有機(jī)磷水解酶溶液。有機(jī)磷水解酶溶液為中國專利申請200710093807.4中所描敘的有機(jī)磷水解酶，酶溶液的比活為1000-1200IU/mg。酶液和速溶茶溶液分別通過蠕動泵泵入實施例1所述中空纖維素膜柱，酶液在膜內(nèi)，速溶茶溶液在膜內(nèi)，處理l5分鐘。高效液相色譜儀(HPLC)檢測，實驗結(jié)果如下(mg/kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注1為上柱處理后樣品，2為無處理對照。結(jié)果表明，通過該膜分離系統(tǒng)，處理后速溶茶溶液中殘留的農(nóng)藥指標(biāo)均達(dá)到歐盟食品安全檢測監(jiān)控的安全范圍(參見歐盟農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)76/895/EEC，86/362/EEC，86/363/EEC，90/642/EEC)。本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發(fā)明各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻(xiàn)皆全文列入本文作為參考。權(quán)利要求一種液相環(huán)境下酶促降解殘留農(nóng)藥的方法，包括下列步驟含有殘留農(nóng)藥的液態(tài)產(chǎn)品和酶溶液分別通過不同管道流向膜分離系統(tǒng)交換界面的兩面，所述膜分離系統(tǒng)的孔徑截留分子量與殘留農(nóng)藥分子量比大于20倍，所述殘留農(nóng)藥通過所述膜分離系統(tǒng)的孔進(jìn)入酶溶液而被降解。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的膜分離系統(tǒng)由一支持層及一膜層組成，其中，膜層在膜分離系統(tǒng)的內(nèi)側(cè)，支持層在膜分離系統(tǒng)的外側(cè)。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述膜分離系統(tǒng)的膜層結(jié)構(gòu)可為平板膜、巻式膜、管式膜或中空纖維膜。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述膜分離系統(tǒng)包含超濾膜、納濾膜中的一種或多種，超濾膜的孔徑為0.01至1微米，孔隙率60%至90%;納濾膜的孔徑為0.1至1納米，孔隙率80%至90%。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述殘留農(nóng)藥包括可為有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中之一或它們的任何組合。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述液態(tài)產(chǎn)品可為蔬菜瓜果、茶葉、中藥的液態(tài)產(chǎn)品中之一或它們的任意組合。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述液態(tài)產(chǎn)品的pH范圍為pH2-6。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述液態(tài)產(chǎn)品的pH范圍為pH3.5-5.5。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酶溶液為有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、擬除蟲菊酯類水解酶中一種或任何兩種的組合配伍或復(fù)合酶溶液。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述酶溶液的pH范圍為pH6-9。11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述有機(jī)磷水解酶選自叩d基因、opdA基因、mpd基因、ophC2基因表達(dá)產(chǎn)物的一種或組合；氨基甲酸酯水解酶選自cehA基因、caha基因產(chǎn)物中的一種或組合；擬除蟲菊酯水解酶為estP基因表達(dá)產(chǎn)物。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酶溶液為有機(jī)磷水解酶溶液時，所述膜分離系統(tǒng)的孔徑截留分子量為5，000-15，000道爾頓。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述具有殘留農(nóng)藥的液態(tài)產(chǎn)品和酶溶液可同向流入或雙向流入。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述具有殘留農(nóng)藥的液態(tài)產(chǎn)品和酶溶液為雙向流入。15.實施權(quán)利要求l所述方法的設(shè)備，包括主體，該主體含有中空容室，其上下壁各設(shè)有一溶液的出入口；容室內(nèi)裝置有若干中空纖維管膜并與上下兩個溶液出入口相連；所述的中空纖維管膜由一支持層及一功能選擇層組成，其中，功能層在膜管的內(nèi)側(cè)，支持層在膜管的外側(cè)。全文摘要本發(fā)明涉及到生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種液相環(huán)境下酶促降解殘留農(nóng)藥的方法及其設(shè)備。本發(fā)明提供了一種液相環(huán)境下酶促降解殘留農(nóng)藥的方法，包括下列步驟具有殘留農(nóng)藥的液態(tài)產(chǎn)品和酶溶液分別通過不同管道流向膜分離系統(tǒng)交換界面的兩面，所述膜分離系統(tǒng)的孔徑截留分子量與殘留農(nóng)藥分子量比大于20倍，所述殘留農(nóng)藥通過所述膜分離系統(tǒng)的孔進(jìn)入酶溶液而被降解。本發(fā)明還公開了實施上述方法的設(shè)備。本發(fā)明所提供方法和設(shè)備可使酶液循環(huán)使用并可保持酶反應(yīng)的最適pH，對處理樣品的pH改變不大，能有效地減少樣品中有效成分的破壞。該方法降解農(nóng)藥效率高，工藝宜放大，成本較低，并避免外源生物水解酶的摻入，無污染，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。文檔編號A62D3/02GK101716409SQ20081004382公開日2010年6月2日申請日期2008年10月9日優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日發(fā)明者朱浩,楊伯成,熊乾斌,蘇勇申請人:上海普天欣生物技術(shù)有限公司