專利名稱：：一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌及應(yīng)用的制作方法一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌及應(yīng)用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及應(yīng)用，特別是一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌及其應(yīng)用于降解類固醇化合物。
背景技術(shù)：
：從上世紀(jì)80年代開始，人們就已經(jīng)開始注意到了東京西郊、英國南部和美國弗羅里達(dá)州的野生動(dòng)物出現(xiàn)了生殖障礙、發(fā)育異常以及雄性個(gè)體雌性化等現(xiàn)象。目前，越來越多的研究結(jié)果表明，人類的生殖障礙、發(fā)育異常及某些癌癥，如乳腺癌、睪丸癌和卵巢癌等，與環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物的分布水平密切相關(guān)。在眾多環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)中，類固醇化合物的內(nèi)分泌干擾作用大大高于其它內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，與人工合成的化工物質(zhì)相比，對(duì)生態(tài)環(huán)境影響更為顯著，在極低的環(huán)境濃度(〈0.1ng/L)下就能對(duì)生物體造成危害，其主要來源為人體和牲畜的排泄物，另外在農(nóng)田里也發(fā)現(xiàn)有膽固醇、e-谷甾醇、麥角固醇和糞甾醇等類固醇化合物。此外木質(zhì)素和其它植物來源的分子降解后也會(huì)產(chǎn)生類固醇化合物。因此在污染控制方面不能通過禁止生產(chǎn)、減少使用和控制排放等方法進(jìn)行控制。但同時(shí)由于污水處理廠處理能力有限以及水產(chǎn)家禽養(yǎng)殖業(yè)的大量發(fā)展，使得利用生物降解類固醇類內(nèi)分泌干攏物的前景更加廣闊。睪丸酮叢毛單胞菌(Cb/Ha/ff朋ss^Wo9tero/7i)是一種土壤細(xì)菌，能夠以各種類固醇化合物作為唯一的碳源和能源，通過一系列涉及復(fù)雜代謝途徑的誘導(dǎo)酶的作用，最終將這些穩(wěn)定的化合物降解為H20和C02，對(duì)該菌的研究近年來備受歐盟、閂本、加拿大等一些國家的重視。睪丸酮叢毛單胞菌降解的關(guān)鍵酶為3a-羥類固醇脫氫酶/碳?；€原酶(3a-hydroxysteroiddehydrogenase/carbonyireductase,簡稱3a_HSD/CR)。Southern雜交揭示"基因位于睪丸酮叢毛單胞菌基因組的5.257kbfcoRI的片斷上。在-^5^/基因上游(在一個(gè)^^^I酶切片斷的0.935kb和2.568kb處)存在兩個(gè)10bp的回文操縱基因序列，這兩個(gè)序列之間的距離為1.644kb，在o-//5Z/基因的附近存在2個(gè)抑制蛋白(R印A和R印B)基因，與Jo-力5Y/D基因的方向相反，類固醇誘導(dǎo)^"-〃5Y/6y基因的表達(dá)實(shí)際上是<"-//5^/67基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的去阻遏作用。在C.teWoWer朋j'染色體上，J"-力5^/67基因上游的2.6Kb處存在一個(gè)sctirator基因，該活化因子基因的全長為564bp，其啟動(dòng)子為非典型啟動(dòng)子，-35區(qū)保守序列堿基為TTCATA，-10保守區(qū)堿基序列為TATTCG。tac啟動(dòng)子為在大腸桿菌(^sc/e^c/^co/力中具有功能的trp-7ac雜合啟動(dòng)子，其-20區(qū)上游轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的DNA序列來源于t/77啟動(dòng)子，-20區(qū)下游的DNA序列來源于7ac〃K5啟動(dòng)子。tac啟動(dòng)子比去阻遏的母本7ac〃W啟動(dòng)子有效地提高轉(zhuǎn)錄速率大約11倍；比在沒有抑制子存在的t/p啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄速率大約提高3倍。但是，已知該菌有關(guān)降解類固醇物質(zhì)的降解酶基因的表達(dá)都受環(huán)境中類固醇類物質(zhì)的誘導(dǎo)；在自然環(huán)境下，類固醇降解酶的活性較低，限制了該菌在環(huán)境修復(fù)中的大規(guī)模應(yīng)用。在對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝途徑網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定佝調(diào)控，可以最大限度地提高該菌降解酶的活性，從而提高其降解能力。因此，構(gòu)建高表達(dá)活性的睪丸酮叢毛單胞菌基因工程菌對(duì)利用該菌消化環(huán)境中的類固醇化合物就具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。目前，經(jīng)檢索應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)睪丸酮叢毛單胞菌進(jìn)行改造還未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)睪丸酮叢毛單胞菌進(jìn)行定向調(diào)控，從而獲得具有高效降解類固醇化合物能力的睪丸酮叢毛單胞菌工程菌。本發(fā)明的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌(Co歷a/z70/asz^sto"er朋iAMCa3，簡稱工程菌AMCa3)，已于2008年1月25日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.2364。保藏單位的地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。工程菌AMCa3的菌體呈桿狀,大小為0.8ixmX1.5nm,革蘭氏染色陰性,偏端叢生鞭毛，運(yùn)動(dòng)。工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)是應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)睪丸酮叢毛單胞菌(Cc鵬歷o朋steWoste/WLzVATCC11996(簡稱Ctest,由市場購得)的3a-〃5Z/CT基因表達(dá)調(diào)控區(qū)進(jìn)行改造而篩選獲得的，將被改造菌株ac"rator基因的啟動(dòng)子替換為tec強(qiáng)啟動(dòng)子，同時(shí)將含目的基因的沐18質(zhì)粒整合進(jìn)被改造菌株的基因組DNA上。本發(fā)明的工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)，其特征在于1、基因組DNA中具有tac啟動(dòng)子，其序列為序列表中SEQIDNO:1中所示的堿基序列；2、基因組DNA中具有沐18序列，該序列為序列表中SEQIDNO:2中所示的堿基序列；3、具有卡那霉素抗性。所述的"c啟動(dòng)子指Amanneta丄構(gòu)建的啟動(dòng)子，沐18質(zhì)粒指Pridmore構(gòu)建的質(zhì)粒載體，均由市場購得。本發(fā)明的工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)的構(gòu)建方法如下①C.tesfac"'rator基因的克隆；②含有tac強(qiáng)啟動(dòng)子的目的基因質(zhì)粒載體pKtacl-sc^的構(gòu)建；③目的質(zhì)粒載體電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌Gte^;④工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)的PCR與Southernblot篩選驗(yàn)證;⑤工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)關(guān)鍵降解酶基因的表達(dá)量檢測；工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)其它降解酶基因的表達(dá)量檢測。本發(fā)明的工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)的培養(yǎng)方法如下將工稃菌AMCa3(CGMCCNo.2364)接種于添加了60ug/mL的氨芐青霉素和30ug/mL的卡那霉素的培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180r/min,培養(yǎng)溫度30'C，培養(yǎng)812小時(shí)；所述培養(yǎng)基為M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基、或M9無機(jī)鹽培養(yǎng)基、或LB培養(yǎng)基。所述的M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制方法如下:取12.8gNa2HP04.7H20，3gKH2P04，2.5gNaCl，5.0gNH4C1，2mL1MMgS04,0.1mL1MCaCl2，0.2gYeastExtact，加蒸餾水節(jié)1L，用NaOH或HC1調(diào)節(jié)pH值至7.0，12(TC條件下滅菌18分鐘，冷卻后加入終濃度為0.27mg/L的Steriod，4。C保存?zhèn)溆?。所述M9無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制方法如下取12.8gNa2HP04.7HA3gKH2P04，2.5gNaCl,5.0gNH《1,2mL1MMgS04,0.1mL1MCaCl2，0.2gYeastExtact,5gAcetate,加蒸餾水至1L，用Na0H或HC1調(diào)節(jié)PH值至7.0，120'C條件下滅菌18分鐘，4。C保存?zhèn)溆?。M8和M9培養(yǎng)基中的氫、氧、氮、磷、鉀、硫、鈣、鎂、氯等元素為細(xì)胞生長所需，YeastExtact、Steriod和Acetate提供細(xì)胞生長的碳源和能源。所述LB培養(yǎng)基為常用培養(yǎng)基，可在市場購得。本發(fā)明所用的無機(jī)鹽試劑，以及Acetate、甘油、乙醇、睪丸酮、膽固醇、膽汁酸、孕酮、石油醚、氯仿、硫酸、乙酸酐、甲醇等均為分析純?cè)噭?。本發(fā)明的工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)顯著提高了睪丸酮叢毛單胞菌關(guān)鍵酶基因^2-必"/CT的表達(dá)量，如圖4所示，達(dá)到C.關(guān)鍵酶基因A-力5^/67表達(dá)量的40倍；同時(shí)也提高了其它已知降解酶基因的表達(dá)，參見圖5所不的4-羥基-2-氧戊酸鹽醛縮酶和2-羥基戊-2,4-二烯酸鹽水合酶等的降解酶基因表達(dá)。本發(fā)明的工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)可有效降解睪丸酮、膽固醇等類固醇化合物，對(duì)類固醇化合物污染嚴(yán)重的土壤及畜禽排泄物也具有很好的降解效果，可用于處理畜禽排泄物，也可用于食品工業(yè)中生產(chǎn)低膽固醇的食品，以及飼料添加劑、乳制品生產(chǎn)中沿類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)無公害食品。在環(huán)境修復(fù)及農(nóng)業(yè)應(yīng)用上具有重要的意義。工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)對(duì)不同處理物的降解效果如表1所示。表1工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)對(duì)不同處理物的降解效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>":培養(yǎng)基為M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為10小時(shí)；b:將細(xì)菌直接噴施在處理物上，培養(yǎng)時(shí)間為18天；AMCa3:6bfflsyo朋sfes""ero/j'AMCa3CGMCCNo.2364;對(duì)照(Ctest):C。鵬ffl(m351tetaster。"/ATCC11996。4.圖1為Cfesf的ac"rator基因克隆的PCR電泳圖2為重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化重組菌的PCR篩選；圖3為AMCa3(CGMCCNo.2364)Southernblot雜交檢測圖4為AMCa3(CGMCCNo.2364)連續(xù)傳代培養(yǎng)關(guān)鍵酶3a-HSD/CR的表達(dá)量ELISA檢測；圖5為AMCa3(CGMCCNo.2364)已知降解酶基因的RT-PCR檢測結(jié)果；圖6為HPLC測定AMCa3(CGMCCNo.2364)對(duì)膽固醇的降解能力；圖7為分光光度法測定AMCa3(CGMCCNo.2364)對(duì)雞糞中甾休化合物的降解能力。具體實(shí)施例為充分公開本發(fā)明的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌及應(yīng)用，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例一、工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)的構(gòu)建方法，包括以下步驟1、testact/ra,w基因的克隆參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的方法從過夜培養(yǎng)的Cfe"中提取菌體的總DNA，做為PCR擴(kuò)增模板。以^"的染色體DNA為模板，根據(jù)活化因子基因序列設(shè)計(jì)引物(兩端引物中分別添加了&1和的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基)，引物由上海生物工程有限公司合成。用大連TaKaRa公司的Ex7ag酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增活化因子基因(Primer1(+)(正向引物)5，TTTCCCGGGGTGCGCGCAGTGCACTTCCAC3'30bp;Primer2(-)(反向引物)5'TT市GTACC[rCAATGCTGCAGCCGGGCCGT3'30bpPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖電泳，如圖1所示，擴(kuò)增的結(jié)果是一條約564bp的特異性條帶。用TaKaRa公司的PCRFragmentRecoveryKit回收目的片斷。2、含有tec強(qiáng)啟動(dòng)子的H的基因質(zhì)粒載體pKtacl-act/的構(gòu)建將質(zhì)粒pBBtacl2以屈sI和6ia1進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳回收tec啟動(dòng)子，然后與屈al、&昭I酶切后的沐18在1\,連接酶的作用下進(jìn)行連接，獲得。1^￡1()1質(zhì)粒。所述tsc啟動(dòng)子，其序列為序列表中SEQIDNO:1中所不的堿基序列；所述pK18，其序列為序列表中SEQIDNO:2中所不的堿基序列。將質(zhì)粒沐tacl和活化因子基因的PCR回收產(chǎn)物分別以Ap/I和5)03I酶進(jìn)行雙酶切后，T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸樸菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(由市場購得)，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物在含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上37r培養(yǎng)過夜，挑選單克隆進(jìn)行液體擴(kuò)大繁殖。用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，以引物Primerl(+)和Primer2(-)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得重組質(zhì)粒pKtacl-act/。3、目的質(zhì)粒載體電穿孔轉(zhuǎn)化C.te^將培養(yǎng)的te"細(xì)菌細(xì)胞沉淀下來，用10%冰冷的甘油制備感受態(tài)細(xì)胞，4"C保存?zhèn)溆谩ＨOuLpKtacl—sc"質(zhì)粒，力卩入190liLH20，10yL5MNaCl禾口450yL無水乙醇，13,OOOr/min離心lOmin;去除上清，加入450yL70%酒精，13,OOOr/min離心5min，去除上清液；加入450uL70%酒精，13，OOOr/min離心5min，去除上清液；將Eppendorf管倒扣在濾紙上，干燥。取100yL感受態(tài)細(xì)胞加入到干燥的質(zhì)粒pKtacl-act7中，混合；將Eppendorf管放在冰上5min;然后將感受態(tài)細(xì)胞倒入電擊杯中(lram寬)；將電擊杯放入冰上預(yù)冷5min;然后放入電融合儀的狹縫中，500V，5次；取出電擊杯，加入lmLLB培養(yǎng)基，3CTC，llOr/min振蕩培養(yǎng)lhr;將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布在含抗生素(A卿60yg/mL，Kan30ug/mL)的固體培養(yǎng)基上，在3(TC的生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。4、工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)的PCR與Southernblot篩選驗(yàn)證根據(jù)同源整合原理，提取基因組DNA，利用設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行克隆子的篩選，Primer3(+)(正向引物):5'GACGTTGTAAAACGACGGCC3'(在質(zhì)粒沐18上)20bp;Primer4(-)(反向引物):5'CAAATGAGCAATCCCCACGC3'(在C.test的染色體上)20bp，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖2所示。以限制性內(nèi)切酶^coRI酶切質(zhì)粒pK18作為探針，提取PCR檢測陽性的細(xì)菌染色體ONA,用6bdU酶進(jìn)行酶切，酶切的產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓60v。以pKtacl的￡boRI酶切產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，ddH20作為陰性對(duì)照進(jìn)行Southernblot檢測(試劑盒為Roche公司產(chǎn)品)，結(jié)果如圖3所示。Southernblot檢測結(jié)果可見，己經(jīng)成功地改造了睪丸酮叢毛單胞菌-//5//基因上游的表達(dá)調(diào)控序列。5、工程菌旭Ca3(CGMCCNo.2364)關(guān)鍵降解酶基因的表達(dá)量檢測工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)每天傳代培養(yǎng)一次，連續(xù)傳代培養(yǎng)50d，培養(yǎng)溫度3(TC，轉(zhuǎn)速為180r/min。每隔5d，取3mL傳代培養(yǎng)的工程菌，提取細(xì)菌的總蛋白ELISA檢測lmg/mL總蛋白中的3"-/ft力/6ff基因的表達(dá)量見圖4。如圖4所示，工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)的-y/5Z0SW基因表達(dá)量平均是乙te對(duì)菌株表達(dá)量的40倍以上。細(xì)菌總蛋白的提取方法如下(1)取3mL過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，13，000r/min，離心沉淀細(xì)菌，去掉上清液；(2)用PBS洗三遍，最后加入200tiL的PBS溶液重懸沉淀；(3)加入1yL的溶菌酶(溶菌酶的濃度為5mg/mL);〔4)該溶液經(jīng)過3次(每次30min以上)反復(fù)凍融；(5)經(jīng)反復(fù)凍融的溶液在13,000r/min，20min，取上清夜進(jìn)行蛋白定量。6、工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)其它降解酶基因的表達(dá)量檢測將工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)過夜培養(yǎng)，以TotalRNAextract(RNAultra)試劑盒提取細(xì)菌的總RNA。根據(jù)已報(bào)道的序列，合成TIP4、TIP8和TIP11的PCR引物。TIP4(4-羥基-2-氧戊酸鹽醛縮酶)的引物為Priraer5(+)(正向引物)5，CCCCCCGGGATGTCCCTCAAAGGCAAGAAA3'30bp，Primer6(—)(反向引物)5，AAAGGTACCTCAGGCCGCCACAGCCTGCTG3'30bp;TIP8(2-羥基戊-2,4-二烯酸鹽水合酶)的引物為Primer7(+)(正向引物)5'CCCCCCGGGATGAGTGACAAGCAATTCATC3，30bp'Primer8(-)(反向引物)5，CCCGGTACCTTACTCCGTGAATTGAATGGA3，30bp;TIP11(3ci-HSD/CR)的引物為Primer9(+)(正向引物)5'GAGACAACATATGTCCATCATCGTGATA3'28bp，Primer10(-)(反向引物)5'GCCGGATCCGAGGTCAGAACTGTGTCGG3，28bp。將提取的總RNA定量成1ug/nL，以大連TaKaRa的mRNASelectivePCRKitVer.1.1進(jìn)行RT-PCR，取7uLRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳(附圖5)。從RT-PCR的結(jié)果可見，將tac強(qiáng)啟動(dòng)子整合入Ctest染色體上，替代"的基因上游基因的原有啟動(dòng)子，不僅提高了降解類固醇化合物關(guān)鍵酶3a-HSD/CR的基因表達(dá)，而且其他與類固醇、PHAs分解代謝相關(guān)的酶4-羥基-2-氧戊酸鹽醛縮酶和2-羥基戊-2，4-二烯酸鹽水合酶的基因表達(dá)也明顯提高。實(shí)施例二、工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)菌懸液的制備及應(yīng)用于降解類固醇化合物的方法，包括以下歩驟1、工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)活化培養(yǎng)及菌懸液的制備取200uL保存于-70'C的AMCa3(CGMCCNo.2364)的甘油細(xì)胞，接種于3mL的LB培養(yǎng)基中，添加60ug/mL的氨芐青霉素和30ug/mL的卡那霉素進(jìn)行搖床振蕩過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)溫度30°C。將過夜培養(yǎng)物按1:100的比例接種于含有相應(yīng)抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至006。=1.0，10,000r/min離心5rain,收集菌體，懸浮于不添加任何類固醇化合物的M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基、或M9無機(jī)鹽培養(yǎng)基、或LB培養(yǎng)基中，就制得AMCa3(CGMCCNo.2364)菌懸液。所述類固醇化合物如睪丸酮、膽固醇、膽汁酸、孕酮、……。2、高效液相色譜法(HPLC)測定工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)對(duì)膽固醇的降解能力①色譜條件色譜柱C18柱，檢測器Waters2996二極管陣列檢測器，流動(dòng)相100%甲醇，柱溫3(TC，流速lmL/min，進(jìn)樣量20叱。②膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品100mg，無水乙醇溶解后定容至100mL容量瓶中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為1.Omg/mL。用無水乙醇將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.050、0.100、0.200、0.400、0.600mg/mL，分別取20yL進(jìn)行色譜測定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，膽固醇濃度為橫坐標(biāo)(C，mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y二7.8332x+0.0616,R2=0.9992。③樣品中膽固醇含量的測定取上述制備的菌懸液lmL加入到裝有20tnL的M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，添加終濃度為0.liBgZmL的膽固醇，30°C，180r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至8小時(shí)和10小時(shí)分別取900yL培養(yǎng)液，加入900ixL石油醚，充分混勻，靜置分層，吸取上層液體，37t:水浴鍋中蒸干，然后加入1.8mL無水乙醇，充分混勾。過0.45tim微孔濾膜，HPLC測定膽固醇含量，以Cte"作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。HPLC測定結(jié)果來看(附圖6)，AMCa3(CGMCCNo.2364)對(duì)膽固醇的降解能力有很大的提高，平均降解能力是對(duì)照菌株(C.ta9t)的兩倍。3、分光光度法測定工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)對(duì)雞糞中甾體化合物的降解能力①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制甾體化合物具有共同的結(jié)構(gòu)環(huán)戊垸多氫菲(甾體母核)，可以發(fā)生Liebermann-Barcharad反應(yīng)，產(chǎn)生顏色。膽固醇是甾體化合物的一種，是動(dòng)物體內(nèi)^體化合物的主要存在形式，具有甾體母核，因此可以用膽固醇作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。精確稱取膽固醇100rag,溶于氯仿中，并定容至100mL，配制成lmg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。測定不同濃度的膽固醇(膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液O.O、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，硫酸一乙酸酐顯色劑2.0mL，氯仿補(bǔ)至總體積5.0mL,混勻后5(TC恒溫水浴顯色40niin，冷卻至室溫后用分光光度計(jì)測定OD，)在A柳的0D值，以膽固醇的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的0D柳為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=79.954x-0.0257，R2=0.9974。②樣品中甾體化合物含量的測定將雞糞樣品破碎，除雜風(fēng)干，將充分風(fēng)干后的雞糞樣品研磨，稱取5g雞糞添加lmL上述制備的菌懸液和10mL無菌水(同時(shí)制備10份樣品)，3(TC暗培養(yǎng)；每隔3天隨機(jī)抽取一份樣品從中稱取樣品2g，加入15mL氯仿，超聲波提取一小時(shí)，靜止分層后，過濾并定容。吸取樣品3mL，加入硫酸一乙酸酐顯色劑2mL，50。C恒溫水浴顯色40niin，冷卻至室溫后用分光光度計(jì)測定樣品在460nm的吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甾體化合物的含量，測定細(xì)菌對(duì)雞糞中甾體化合物的降解情況，結(jié)果如圖7所示。由此可見，工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)的降解能力有很大的提高，平均降解能力也是對(duì)照菌株(C.test)的兩倍。Untitledl.ST25SEQUENCELISTING<110〉福建農(nóng)林人學(xué)〈120>—種蘋丸酮從毛單胞菌丁程菌及應(yīng)用<130><160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211〉244〈212〉DNA<213>大腸桿菌(Escherichiacoli)〈400〉1cgactgcacggtgaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggct60gtgcaggtcgtaaatcactgcat犯ttcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggata120atgttttttgcgccgacatcat犯cggttctggca肌tattctgaaatgsgctgttgaca180att:aatC3tcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggcacacaggaa2403C3g244〈210〉2<211〉2256<212〉DNA<213>人腸桿菌(Escherichiacoli)<■〉2cgataagctagcttcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcg60gascacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactg120ggctatctgg3c肌ggga朋acgcaagcgccaggtagcttgcagtgggct180tacatggcgatagctagactgggcggtmatggacagcaagcg^ccggaattgccagc240tggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgcc300gccaaggatctgatggcgcaggggatca3gatctgatcaag聊caggatgaggatcgtt360tcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttggg"tgg卿ggct420attcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggct480gtcagcgcaggggcgcccggttctmtgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatga540actccaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgUccttgcgcagc600tgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggg660gcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgc720aatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcg犯aca780tcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctgga840cgaagsgcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcggatgcc900cgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtgga960aaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatca1020ggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccg1080cttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatxgccttctatcgcct1140tcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttCg3￡L￡ltgaccgaccaagcgacgccc1200aacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttxtatgaaaggttgggcttcgga1260Untitledl.ST25atcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctxatgctggagttc1320ttcgcccaccccaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaa^tc1380ccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgca犯ggatct1440tcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgca^caaaa^accaccgcta1500ccagcggtggtttgtttgccggatc犯gagctaccaactctttttccgaaggtaactggc1560ttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgt3gccgtagttaggccaccac1620ttca3gaa,ctctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggct1680gctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggat1740aaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcg幼cg1800acctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaa1860gggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacagg卿gcgcacgagg1920gagcttccagggggs獄gcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctga1980cttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagc2040aacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcct2100gcgttatcccctgat"tctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgct2160cgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcg3gg犯gCgg3agagcgccca2220cgcctctccccgcgcgttggccgatt225權(quán)利要求1、一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，其特征在于該菌為睪丸酮叢毛單胞菌工程菌(ComamonastestosteroniAMCa3)CGMCCNo.2364。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，其特征在于①基因組DNA中具有^c啟動(dòng)子，其序列為序列表中SEQIDNO:1中所示的堿基序列；②基因組DNA中具有pK18序列，該序列為序列表中SEQIDNO:2中所示的堿基序列。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，其特征在于具有卡那霉素抗性。4、一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建步驟如下①CtestacWrator基因的克隆；②含有強(qiáng)啟動(dòng)子的目的基因質(zhì)粒載體pKtacl-ac^的構(gòu)建；③目的質(zhì)粒載體電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌Ctest;睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的PCR與Southernblot篩選驗(yàn)證；◎睪丸酮叢毛單胞菌工程菌關(guān)鍵降解酶基因的表達(dá)量檢測；睪丸酮叢毛單胞菌工程菌其它降解酶基因的表達(dá)量檢測。5、一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的培養(yǎng)方法，其特征在于將睪丸酮叢毛單胞菌工程菌接種于添加了60ug/mL的氨芐青霉素和30ug/mL的卡那霉素的培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)812小時(shí)；所述培養(yǎng)基為M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基、或M9無機(jī)鹽培養(yǎng)基、或LB培養(yǎng)基。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所述M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制方法如下取12.8gNa^POi.7H20，3gKH2P04,2.5gNaCl，5.0gNH4C1，2mL1MMgS04,0.1mL1MCaCU0.2gYeastExtact，加蒸餾水至1L，用NaOH或HC1調(diào)節(jié)pH值至7.0，12(TC條件下滅菌18分鐘，冷卻后加入終濃度為0.27mg/L的Steriod，4。C保存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所述M9無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制方法如下取12.8gNa2HP04.7H20，3gKH2P04，2.5gNaCl，5.OgNH(l，2mL1MMgS(^，0.1mL1MCaCl2，0.2gYeastExtact，5gAcetate,加蒸餾水至1L，用NaOH或HC1調(diào)節(jié)pH值至7.0，12(TC條件下滅菌18分鐘，4'C保存?zhèn)溆谩?、一種如權(quán)利要求1所述的睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，在降解類固醇化合物上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明通過DNA重組技術(shù)對(duì)睪丸酮叢毛單胞菌進(jìn)行定向調(diào)控，從而獲得具有高效降解類固醇化合物能力的睪丸酮叢毛單胞菌工程菌AMCa3(CGMCCNo.2364)，本發(fā)明的工程菌可有效降解睪丸酮、膽固醇等類固醇化合物，對(duì)類固醇化合物污染嚴(yán)重的土壤及畜禽排泄物也具有很好的降解效果。可用于處理畜禽排泄物，也可用于食品工業(yè)中生產(chǎn)低膽固醇的食品，以及飼料添加劑、乳制品生產(chǎn)中甾類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)無公害食品。在環(huán)境修復(fù)及農(nóng)業(yè)應(yīng)用上具有重要的意義。文檔編號(hào)A62D101/28GK101302489SQ20081007102公開日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年5月8日優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日發(fā)明者周以飛,潘大仁,陳建秋申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)