專利名稱：一種高效降解煙堿的曲霉菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種曲霉菌株，尤其涉及一種可以高效降解煙堿的米曲霉及其培養(yǎng)方 法與應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙堿是煙草中的生物堿，它對人的中樞神經(jīng)有強(qiáng)烈的刺激和麻痹作用，少量使人 興奮，大量會引起眩暈、嘔吐甚至中毒死亡。煙草中煙堿含量過高，就會嚴(yán)重危害煙民的健 康。另外煙堿也是一種環(huán)境有毒物質(zhì)，在煙草制品的生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的固體、液 體和氣體廢棄物，這些廢棄物如果不加處理就投放到環(huán)境中，會嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境，危害人 類健康。雖然目前已有一些降低煙堿的方法，如控制煙草生長過程中的施氮量等農(nóng)業(yè)措施 或化學(xué)浸提法，但這些技術(shù)在降低煙堿的同時(shí)，也會降低對香煙有貢獻(xiàn)的成分，成本高效率 低，且存在較大后續(xù)污染。微生物法降解煙堿因具有針對性、快速有效性的優(yōu)點(diǎn)，受到越來 越多的重視。通過微生物降解法可以降低煙草中煙堿的含量，降解制煙工業(yè)廢棄物中的煙 堿，保護(hù)環(huán)境，維護(hù)人類健康。因此，利用微生物法降解煙堿具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。至 今，國內(nèi)外研究者已經(jīng)從環(huán)境中分離了多種煙堿降解菌，都集中在細(xì)菌類，降解效率并不理 想，并且不能耐受較高濃度的煙堿，因而迫切需要尋求新的可以高效降解煙堿的優(yōu)良菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有降解煙堿的微生物種類有限，特別是能夠耐受較高濃度煙堿并 降低煙堿的微生物有限的不足，提供一株新分離的可產(chǎn)生較強(qiáng)煙堿降解能力的米曲霉 112822 (Aspergillus oryzae 112822)及其應(yīng)用。發(fā)明_既述本發(fā)明提供米曲霉112822的菌株、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用于降解煙堿的方法。經(jīng)文獻(xiàn) 檢索，目前國際上沒有米曲霉應(yīng)用于降解煙堿的報(bào)道。發(fā)明詳述本發(fā)明提供的米曲霉112822 (Aspergillus oryzae 112822)菌株已于2010年3 月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC NO. 3687。本發(fā)明涉及的煙堿降解菌株——米曲霉112822是從煙草煙葉上分離獲得。首先 從煙葉中分離純化微生物菌株，然后篩選具有降解煙堿能力的菌株，獲得在高濃度煙堿中 旺盛生長并可降解煙堿的菌株。本發(fā)明篩選到的米曲霉112822菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上生長2 3天，產(chǎn)生大量的 綠色孢子群，菌落鋪展；在查氏培養(yǎng)基上菌落生長迅速，4 5天產(chǎn)生大量綠色孢子群，5 7天直徑5 6厘米，厚1 2毫米，質(zhì)地絲絨狀，表面中央部分較濃密，菌落呈黃色至青綠 色。菌落反面有褶皺，中央部分顏色由黃色逐漸加深至淡褐色。無滲出液，無特殊氣味。分 生孢子梗有足細(xì)胞；頂囊球形或半球形，大部表面可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子成鏈狀生
3于小梗上，為凹陷的球形或近球形，成熟后分生孢子壁極粗糙，具小刺，也有少數(shù)近于光滑 者。該菌株的18S rDNA和5. 8S-ITS在GenBank的登錄號分別為EU583496和EU680476，在 進(jìn)化關(guān)系上與米曲霉最接近。一種米曲霉112822菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于，具體步驟如下取米曲霉112822菌株接種至新鮮斜面培養(yǎng)基活化40 48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，然后，取活化后的米曲霉112822接種于種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 40小時(shí)。本發(fā)明還提供米曲霉112822菌株在降解煙堿方面的應(yīng)用。上述米曲霉112822菌株在降解煙堿方面的應(yīng)用，具體步驟如下(1)取菌種保藏編號為CGMCC NO. 3687的米曲霉112822菌株，將該菌株接種至斜 面培養(yǎng)基活化40 48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，然后，取活化后的米曲霉112822接種 于種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 40小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，得初級培養(yǎng)液；(2)取步驟(1)制得的初級培養(yǎng)液，按體積比2% 10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)液 中，培養(yǎng)溫度為28 30°C，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)30 40小時(shí)。經(jīng)對發(fā)酵液進(jìn)行煙 堿檢測分析，發(fā)現(xiàn)煙堿降解量為1. 5 7. 8g/L。優(yōu)選的，所述斜面培養(yǎng)基成分為2%的煙草浸提液1L，葡萄糖3 7g、蛋白胨3 7g、酵母粉3 7g、瓊脂18 22g。優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)液成分為2%的煙草浸提液1L，酵母粉0. 5 lg。優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)液成分如下 8%煙草浸提液1L，酵母粉0. 5 lg。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)液成分如下8%煙草浸提液1L，酵母粉0. 5g/L。優(yōu)選的，所述步驟(2)中按體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接。上述培養(yǎng)基pH無須調(diào)整，使用前都在115°C高溫下滅菌30分鐘。所述培養(yǎng)基中1%、2%、4%、6%、8%的煙草浸提液制備方法為煙葉和水按照質(zhì) 量體積比(g/L)10 1、20 1、40 1、60 1、80 1的比例混合，煮沸30分鐘，抽濾定容， 分別制成1%、2%、4%、6%、8%的煙草浸提液。經(jīng)檢測，的煙草浸提液含有煙堿1.6g/ L，2 %的煙草浸提液含有煙堿2. 2g/L，4 %的煙草浸提液含有煙堿4. 2g/L，6 %的煙草浸提 液含有煙堿6. 5g/L，8%的煙草浸提液含有煙堿9. 5g/L。本發(fā)明提供的具有較強(qiáng)煙堿降解能力的真菌Aspergillus oryzae 112822，該菌 株培養(yǎng)簡單，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，將其應(yīng)用于煙堿降解，能使煙草浸提液中的煙堿降解量達(dá)到 7. 8g/L，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不僅限于此。實(shí)施例中所述的試劑均為市售產(chǎn)品，所述操作方法如無特別說明均為本領(lǐng)域通用 操作方法。實(shí)施例1 菌種篩選(1)煙草微生物的分離純化稱取樣品(取自山東濟(jì)南將軍集團(tuán)陳化期間的煙葉)3克，放入盛有培養(yǎng)基100mL 三角瓶中，150轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)，細(xì)菌于37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，真菌于28°C培養(yǎng)36 48 小時(shí)。將富集培養(yǎng)液分別制成川入川人川入^^各種稀釋度的菌液，分別吸取化？！^涂布平板；將平板倒置，按細(xì)菌37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，真菌28°C培養(yǎng)36 48小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)； 用平板劃線法進(jìn)行純化，重復(fù)3次。對分離菌株進(jìn)行鏡檢，確定純度細(xì)菌以金黃色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)作對照，進(jìn)行革蘭氏染色， 鏡檢可區(qū)分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌；真菌制成水浸片，鏡檢可觀察菌絲特征及孢子 產(chǎn)生方式，初步鑒定到屬。最后將鏡檢得到的純化菌株分別保存到試管斜面上，4°C儲藏。
上述分離純化過程共獲得229株菌，其中細(xì)菌189株、真菌40株。上述篩選用細(xì)菌富集選擇培養(yǎng)基(也作為斜面培養(yǎng)基)，其配方是牛肉膏3g/L、 蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、pH7. 0 7. 5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g/L。液體培養(yǎng)基接種前加制 霉菌素至終濃度為30 50 μ g/mL。上述篩選用真菌富集選擇培養(yǎng)基(也作為斜面培養(yǎng)基)，其配方是葡萄糖20g/L、 蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、自然pH，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g/L。液體培養(yǎng)基接種前加青霉 素及鏈霉素至終濃度為30 50 μ g/mL。(2)可降解煙堿菌株的篩選將上述分離得到的229株菌以體積比5%的接種量分別接種至30mL發(fā)酵培養(yǎng)液 中，細(xì)菌于37°C搖床培養(yǎng)18小時(shí)，真菌于28°C搖床培養(yǎng)40小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速均為150轉(zhuǎn)/分。 定時(shí)取樣檢測發(fā)酵液中殘留的煙堿含量，如果含量減少，則說明煙堿被降解了。上述發(fā)酵培養(yǎng)液配方是2%煙草浸提液1L，酵母粉0. 5g，pH7. 0 7. 5 (細(xì)菌)或 自然PH(真菌)。上述篩選過程共獲得27株菌具有降解煙堿的能力，煙堿降解量為0. 14 2. lg/L ； 其中15株細(xì)菌和12株真菌，經(jīng)初步鑒定，所篩微生物分別為8株革蘭氏陽性菌，7株革蘭氏 陰性菌，8株曲霉和4株青霉；其中降解煙堿能力最強(qiáng)的為米曲霉112822。菌株112822由形態(tài)學(xué)特性和18S rDNA與5. 8S-ITS同源序列比較鑒定為米曲霉， 菌種鑒定詳見實(shí)施例2。經(jīng)檢索，目前國際上沒有本發(fā)明所涉及的米曲霉降解煙堿的報(bào)道。上述煙堿含量分析所用設(shè)備及條件分析型高壓液相色譜儀(Agilent 1 IOOSeries)，美國安捷倫公司；樣品經(jīng)煮沸5分鐘、12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后，用 同體積甲醇稀釋，4°C冰箱靜置30分鐘，0.22μπι Millipore膜過濾待檢測。分析柱為 TC-C18 (150 X 4. 6mm)，流動相為體積比為15 85的甲醇甲酸(濃度0. 05 % )，流速 0. 5mL/min,柱溫30°C，紫外檢測波長254nm。實(shí)施例2 菌種鑒定米曲霉112822菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保 藏編號為 CGMCC N0. 3687。(1)形態(tài)學(xué)特征觀察用接種環(huán)挑取米曲霉CGMCC N0. 3687孢子分別接到馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)平板和查 氏培養(yǎng)基平板上，置30°C培養(yǎng)。在PDA平板上，2 3天，產(chǎn)生大量的綠色孢子群，菌落鋪展； 在查氏平板上，菌落生長迅速，4 5天產(chǎn)生大量綠色孢子群，5 7天直徑5 6厘米，厚 1 2毫米，質(zhì)地絲絨狀，表面中央部分較濃密，菌落呈黃色至青綠色。菌落反面有褶皺，中 央部分顏色由黃色逐漸加深至淡褐色。無滲出液，無特殊氣味。分生孢子梗有足細(xì)胞；頂囊 球形或半球形，大部表面可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子成鏈狀生于小梗上，為凹陷的球形 或近球形，成熟后分生孢子壁極粗糙，具小刺，也有少數(shù)近于光滑者。
上述馬鈴薯培養(yǎng)基成分是馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L、自然pH。馬 鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1L，115°C 滅菌30分鐘。上述查氏培養(yǎng)基成分是NaNO32g/L、K2HPO4 lg/L、KCl 0. 5g/L、MgSO4 0. 5g/L、 FeSO4 0. 01g/L、蔗糖30g/L、瓊脂20g/L、蒸餾水1L、自然pH，115°C滅菌30分鐘。
(2) 18S rDNA 和 5· 8S-ITS rDNA 序列測定和分析采用基因組提取試劑盒(BioFlux)提取米曲霉(Aspergillus oryzae) 112822基 因組DNA，采用真菌18S rDNA通用上游引物NSl (5，-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3，)和下游引 物 FS2(5，-TAGGNATTCCTCGTTGAAGA-3，) ；5. 8S-ITS rDNA 通用上游引物 18SrDNA1406f (5，-TGTACACACCGCCCGT-3，)和下游引物 28SrDNA3126r (5，-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3，)，以基 因組DNA為模板PCR擴(kuò)增18S rDNA和5. 8S-ITS rDNA序列。PCR反應(yīng)體系50 μ L 10 X PCR buffer 5 μ L，25mmol/LMgCl23 μ L, 2. 5mmol/L dNTP 混合物 4 μ L, 20 μ mol/L 引物各 1 μ L，模 板1 μ L，rTaq酶1 μ L，無菌水35 μ L。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒， 50°C退火30秒，720C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物由上海英 駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，18S rDNA序列大小為1524堿基，5. 8S-ITS rDNA序列 大小為724堿基。將該兩組序列于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST核苷酸比對分析，其18S rDNA序列 與一株米曲霉的 18S rDNA序列(GenBank accession NO. D63698)同源性為 100%，5. 8S-ITS rDNA序列與一株米曲霉的 5. 8S-ITS rDNA序列(GenBank accession NO. AY373857)同源性 為 99%。米曲霉112822 (菌種保藏號 CGMCC N0. 3687) 18S rDNA 的 GenBank 登錄號為 EU583496 ；5. 8S-ITS 的 GenBank 登錄號為 EU680476。實(shí)施例3 利用米曲霉112822 (菌種保藏號CGMCCN0. 3687)降解煙堿。選擇本發(fā)明分離篩選出的菌株米曲霉112822，接種至新鮮斜面培養(yǎng)基活化40小 時(shí)，培養(yǎng)溫度為28°C，然后，取活化后的米曲霉112822接種于種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)30小時(shí)，培 養(yǎng)溫度為28°C，得初級培養(yǎng)液；將此初級培養(yǎng)液，按體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)溫度為28°C，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分。培養(yǎng)40小時(shí)后，分析該發(fā)酵液中煙堿含量的 變化，其煙堿降解量為7. 8g/L。上述斜面培養(yǎng)基配方為2%的煙草浸提液1L，葡萄糖3g、蛋白胨5g、酵母汁3g、瓊 脂 20g。上述種子培養(yǎng)基配方為2%煙草浸提液1L，酵母粉0. 5g。上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為8%煙草浸提液1L，酵母粉0. 5g。所述的煙草浸提液制備方法為煙葉和水按照質(zhì)量體積比(g/L) 20 1和80 1 的比例混合，煮沸30分鐘，抽濾定容，分別制成2%和8%的煙草浸提液。上述培養(yǎng)基pH無須調(diào)整，使用前都在115°C高溫下滅菌30分鐘。樣品煙堿檢測方法如實(shí)施例1所述。
權(quán)利要求
一種高效降解煙堿的米曲霉(Aspergillus oryzae)112822，該菌株已于2010年3月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.3687。
2.權(quán)利要求1所述的米曲霉112822的培養(yǎng)方法，其特征在于，具體步驟如下取米曲霉112822菌株接種至新鮮斜面培養(yǎng)基活化40 48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，然后，取活化后的米曲霉112822接種于種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 40小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1所述的米曲霉112822菌株在降解煙堿方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，具體步驟如下(1)取菌種保藏編號為CGMCCNO. 3687的米曲霉112822菌株，將該菌株接種至斜面培 養(yǎng)基活化40 48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，然后，取活化后的米曲霉112822接種于種 子培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 40小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，得初級培養(yǎng)液；(2)取步驟(1)制得的初級培養(yǎng)液，按體積比2% 10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)液中， 培養(yǎng)溫度為28 30°C，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)30 40小時(shí)。
5.如權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基成分如下2%的煙草 浸提液1L，葡萄糖3 7g、蛋白胨3 7g、酵母粉3 7g、瓊脂18 22g，pH自然。
6.如權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述種子培養(yǎng)液成分如下2%的煙草 浸提液1L，酵母粉0.5 lg，pH自然。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)液成分如下 8%煙草浸 提液1L，酵母粉0.5 lg，pH自然。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)液成分如下8%煙草浸提液 1L，酵母粉0. 5g，pH自然。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中按體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種曲霉菌株，尤其涉及一種可以高效降解煙堿的米曲霉及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的米曲霉112822(Aspergillus oryzae 112822)菌株已于2010年3月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為CGMCC NO.3687。該菌株培養(yǎng)簡單，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，將其應(yīng)用于煙堿降解，能使煙草浸提液中的煙堿降解量達(dá)到7.8g/L，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號A62D101/26GK101864368SQ20101017364
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者盧麗麗, 孟祥璟, 肖敏 申請人:山東大學(xué)