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      石油污染土壤修復(fù)用固定化微球、制法及應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:2409953閱讀:238來源:國知局
      專利名稱:石油污染土壤修復(fù)用固定化微球、制法及應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種石油污染土壤修復(fù)用固定化微球、其制備方法及其應(yīng)用,屬于微生物制劑領(lǐng)域。
      背景技術(shù)
      微生物修復(fù)技術(shù)被公認(rèn)為是最有生命力的土壤清潔技術(shù),在石油污染土壤修復(fù)方面得到了廣泛和長遠(yuǎn)的發(fā)展,取得了諸多的突破與進(jìn)展。一般而言,土壤微生物修復(fù)技術(shù)是利用土壤中的土著微生物或向土壤中投入經(jīng)馴化的高效微生物,在適宜條件下通過菌的代謝活動降解石油污染物、修復(fù)污染土壤。為了克服游離菌有效濃度低、競爭力弱、抗毒性侵害能力差的問題,眾多的目光投向了微生物菌劑。目前,市面上以及實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的微生物菌劑多為液體或者粉狀,如BET BIOPETRO, MICRO-BLAZE, 0ILGAT0R等。這類制劑其有效菌負(fù)載量存在極限值,且在使用過程中易脫落失活,因而需要大量使用和多次追加,而修復(fù)效率也常常低于實(shí)驗(yàn)室研究水平。因此,需要在負(fù)載量和活性方面進(jìn)行改進(jìn)。包埋法是固定化微生物技術(shù)中常見的方法,具有方法簡便、材料易得、條件溫和、 穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。對于土壤介質(zhì)而言,投加的載體是不可回收的,但是包埋法的優(yōu)勢決定了這類材料選擇的空間較大,如海藻酸鈉、卡拉膠、瓊脂等。吸附法也是固定化微生物技術(shù)中常用的方法,且是目前已有的微生物制劑中最通用的制備技術(shù),其最大的優(yōu)勢在載體材料廉價易得、類別多樣,如活性炭、麥稈、麩皮、硅藻土等。在水體石油污染方面,已有研究將包埋法和吸附法結(jié)合制備固定化微生物微球,如,包木太等利用海藻酸鈉包埋活性炭制備固定化微生物顆粒,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,具有良好的降解性能;谷妮娜利用聚乙烯醇及活性炭作為載體固定微生物處理含油廢水,取得較好的降解效果。鑒于土壤的非均質(zhì)性及石油成分的復(fù)雜性,在土壤石油污染治理方面,二者技術(shù)的結(jié)合還不夠成熟,處于起步階段。海藻酸鈉是一種常用的固定化載體,在工業(yè)及環(huán)境領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,是天然、 無毒材料。凹凸棒土是一種具有層鏈狀結(jié)構(gòu)的含水富鎂硅酸礦物,其晶體呈棒狀活纖維狀, 長徑比大,是一種天然一維納米材料。層內(nèi)貫穿孔道,表面凹凸相見布滿溝槽,因而具有較大的比表面積和較強(qiáng)的吸附性能。利用凹凸棒土負(fù)載微生物的研究也早已起步,取得了一些階段性成果。此外,我國的凹凸棒石儲存量占世界存儲量的一半以上,但由于國內(nèi)開發(fā)利用水平較低,使得凹凸棒石得不到合理利用,出現(xiàn)資源浪費(fèi)的現(xiàn)象。

      發(fā)明內(nèi)容
      針對現(xiàn)有石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的不足及相應(yīng)微生物制劑制備技術(shù)發(fā)展緩慢的問題,本發(fā)明的目的在于提供一種可用于石油污染土壤修復(fù)的固定化微球及其制備方法。該固定化微球具有營養(yǎng)型、保護(hù)性、緩釋性、活性及穩(wěn)定性高、環(huán)保安全等優(yōu)點(diǎn)。該固定化微球的制備方法以海藻酸鈉作為包埋材料,凹凸棒土作為吸附劑,包埋可降解石油烴的降解菌及營養(yǎng)成分,經(jīng)過高濃度菌液懸浮、固定化成球、增殖再培養(yǎng)等的制備步驟,得到固定化微球。此外,制備過程中引入恒流泵,大大提高了固定化微球的產(chǎn)量。
      本發(fā)明涉及的石油污染土壤修復(fù)用固定化微球,其顆粒呈圓球狀,內(nèi)部有孔隙,直徑為2. 5 3. 0mm,所述固定化微球包含海藻酸鈉作為包埋材料,凹凸棒土作為吸附劑,其吸附有石油烴降解菌及營養(yǎng)元素。其中,所述固定化微球的海藻酸鈉和凹凸棒土的質(zhì)量比例為1-6 0.5-3,優(yōu)選比例為 2. 5-3. 5 0.5-2,更優(yōu)選 3. 5 1。本發(fā)明還涉及石油污染土壤修復(fù)用固定化微球的制備方法,其特征在于,該方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)并配制用于石油污染土壤修復(fù)的石油烴降解菌的菌懸液;(2)將海藻酸鈉與凹凸棒土混合均勻后,放入去離子水,高溫濕熱滅菌后,保持在 40-60°C,制得海藻酸鈉-凹凸棒土凝膠;(3)將步驟⑴所得菌懸液加入到步驟(2)所得凝膠液中,混合均勻;當(dāng)包埋 Paracoccus sp. HXG-D17菌時,混合物中的菌濃度優(yōu)選為0. 01-0. 04g/ml,最優(yōu)選0. 04g/ ml ;海藻酸鈉的濃度優(yōu)選為0. 01-0. 06g/ml,進(jìn)一步優(yōu)選0. 025-0. 035g/ml,最優(yōu)選0. 035g/ ml ;凹凸棒土的濃度優(yōu)選為0. 005-0. 03g/ml,進(jìn)一步優(yōu)選0. 005-0. 02g/ml,最優(yōu)選0. Olg/ ml ;(4)將步驟C3)所得混合物,滴加入氯化鈣溶液中,快速均勻混合,得到固定化微生物顆粒,然后,將浸泡有固定化微生物顆粒的氯化鈣溶液于4°C反應(yīng),當(dāng)包埋Paracoccus sp. HXG-D17菌時,其中氯化鈣溶液濃度為0. 02-0. 08g/ml,優(yōu)選0. 03-0. 05g/ml,最優(yōu)選 0.03g/ml ;(5)將步驟(4)所得顆粒清洗后,轉(zhuǎn)移入增殖培養(yǎng)基中,搖床慢速培養(yǎng),清洗,即制備得到固定化微球。所述步驟(4)混合物與氯化鈣混合時,石油烴降解菌、海藻酸鈉、凹凸棒土和氯化鈣的濃度比優(yōu)選 1-4 1-6 0.5-3 2-8,進(jìn)一步優(yōu)選 1-4 2.5-3.5 0.5-2 3-5, 最優(yōu)選 4 3. 5 1 3。其中,步驟⑴所述菌懸液的溶劑為增殖培養(yǎng)基,其成分為葡萄糖20g/L,酵母膏 3g/L,蛋白胨 2g/L,NH4NO3 lg/L,MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, KCl 0. 2g/L,其中該增殖培養(yǎng)基的 pH =7. 8。其中,所述步驟(1)培養(yǎng)并配制石油烴降解菌的菌懸液的步驟為A配制LB液體培養(yǎng)基,高溫滅菌,冷卻至室溫,獲得富集培養(yǎng)基;配制增殖培養(yǎng)基,高溫滅菌,冷卻保存;B在無菌操作臺中,在步驟A所得富集培養(yǎng)基中按5%的接種量接種石油烴降解菌,然后,于25°C -30°C恒溫?fù)u床振動培養(yǎng),收集菌液,離心得到濕菌體;C將濕菌體與增殖培養(yǎng)基混合均勻。其中,所述步驟(4)利用恒流泵滴加所述混合物至所述氯化鈣溶液中。本發(fā)明還涉及以上方法所制備得到的石油污染土壤修復(fù)用固定化微球產(chǎn)品。其中,所述固定化微球包埋的石油烴降解菌可為Paracoccus sp. D17或 Paracoccus sp.D24。本發(fā)明還涉及所述固定化微球用于降解石油烴的應(yīng)用,優(yōu)選用于在土壤中降解石油烴的應(yīng)用。


      圖Ι-a為本發(fā)明的實(shí)施例4的固定化微球的表觀形態(tài)圖。圖Ι-b為本發(fā)明的對照組的固定化微球表觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖。圖I-C為本發(fā)明的實(shí)施例4制備的固定化微球表觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖(添加凹凸棒土)。圖Ι-d為本發(fā)明的實(shí)施例4制備的固定化微球包埋菌株的掃描電鏡圖。圖2為本發(fā)明和對照組制備的固定化微球?qū)Ω邼舛仁臀廴就寥赖慕到庑阅艿谋容^,其中橫坐標(biāo)依次對應(yīng)于空白樣,游離菌,對照組的固定化微球,實(shí)施例4的固定化微球。本發(fā)明菌株的保藏信息菌株P(guān)aracoccus sp.,該菌株于2010年4月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,中國科學(xué)院微生物研究所; 郵政編碼100101)保藏,保藏編號為CGMCC No. 3718,分類學(xué)命名為副球菌(Paracoccus sp.) ο菌株Halomonas sp.,該菌株于2010年4月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,中國科學(xué)院微生物研究所;郵政編碼=100101)保藏,編號為CGMCC No. 3717,分類學(xué)命名為鹽單孢菌(Halomonas sp.) ο
      具體實(shí)施例方式本發(fā)明的石油烴降解菌可泛指所有能夠降解石油烴的菌種,例如申請人的申請?zhí)枮?201010239621. 7 的專利申請中所涉及的 Paracoccus sp. D17 和 Paracoccus sp. D24 菌株等,以下實(shí)施例僅以Paracoccus sp. D17為例。本發(fā)明將申請?zhí)枮?01010239621. 7的專利申請全文引用。以上兩種降解菌是從天津大港油田附近石油污染土壤中,經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到的耐低溫石油烴降解菌。本發(fā)明實(shí)施例中包埋的兩種石油烴降解菌的具體制備步驟為(1)馴化步驟將石油污染土樣利用生理鹽水溶解,接入原油無機(jī)鹽含油廢水液體培養(yǎng)基中,在 10°C搖床培養(yǎng)10-20天,后取定量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10-20天,得到菌液,在上述培養(yǎng)過程中分批加入共5-10ml滅菌原油;(2)分離純化步驟對步驟(1)中所得菌液進(jìn)行梯度稀釋,涂布至原油無機(jī)鹽含油廢水固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3-5天,劃線培養(yǎng);(3)反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng)反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng),直至得到多株純菌。本發(fā)明所涉及的用于石油污染土壤微生物修復(fù)的固定化微球的具體制備步驟如下
      (1)菌懸液的制備A培養(yǎng)基的配制富集培養(yǎng)基用于接種石油烴降解菌,按微生物學(xué)常規(guī)方法配制LB液體培養(yǎng)基, 利用常規(guī)方法進(jìn)行高溫滅菌處理,可在121°C下高溫滅菌30min,冷卻至室溫,獲得富集培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基用于給石油烴降解菌提供營養(yǎng),包含葡萄糖20g/L,酵母膏3g/L,蛋白胨 2g/L,NH4NO3 lg/L MgSO4 · 7H20 0. 2g/L,KCl 0. 2g/L,pH = 7. 8,利用常規(guī)方法進(jìn)行高溫滅菌處理,可在115°C下高溫滅菌20min,冷卻備用。B富集培養(yǎng)從保藏石油烴降解菌的斜面培養(yǎng)基上用無菌水沖洗菌液至普通LB液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)1 后得到種子液;在無菌操作臺中,在富集培養(yǎng)基中按5% (ν/ν)的接種量接種至石油烴降解菌的種子液中;完畢后,將其置于恒溫?fù)u床中,調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速150rpm, 25°C -30°C下培養(yǎng),優(yōu)選24-60h ;收集菌液,4000rpm離心lOmin,收集沉淀,即得到濕菌體, 可置于4°C保存。C菌懸液的配制將濕菌體稀釋,溶劑可采用無菌水,優(yōu)選采用可補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)的前述增殖培養(yǎng)基, 將濕菌體與增殖培養(yǎng)基混合均勻,可在4°C保存?zhèn)溆谩?2)海藻酸鈉-凹凸棒土凝膠液的配制將海藻酸鈉與凹凸棒土混合均勻,投放入去離子水,利用常規(guī)的高溫濕熱滅菌進(jìn)行處理,可在121°C高溫濕熱滅菌30min,然后置于40-60°C水浴鍋中保溫。(3)菌懸液投加在步驟( 所得凝膠液中,加入步驟(1)所得菌懸液,用渦旋儀混合效果更好?;旌衔镏械臐窬w濃度如果過小,最終制得的固定化微球的活性不夠,如果過大, 則會堵塞固定化微球的孔隙,且會引起菌體浪費(fèi);海藻酸鈉的濃度少于一定濃度,無法成球,但超過一定濃度時,制備的固定化微球會有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象,而且操作過程中凝膠液太黏稠,制備起來比較困難;凹凸棒土的濃度如果過低,起不到改善固定化微球性能的效果, 但當(dāng)其濃度超過一定程度時,制備的海藻酸鈉-凹凸棒土-菌混合物中有較多沉淀,成分難以均一。需要說明的是,包埋的菌不同,其所優(yōu)選的物料濃度和比例也會不同。當(dāng)包埋 Paracoccus sp. HXG-D17菌時,混合物中,石油烴降解菌的濃度優(yōu)選為0. 01-0. 04g/ml,最優(yōu)選0. 04g/ml ;海藻酸鈉的濃度優(yōu)選為0. 01-0. 06g/ml,進(jìn)一步優(yōu)選0. 025-0. 035g/ml,最優(yōu)選0. 035g/ml ;凹凸棒土的濃度優(yōu)選為0. 005-0. 03g/ml,進(jìn)一步優(yōu)選0.005-0. 02g/ml,最優(yōu)選 0.01g/ml ;(4)固定化成球?qū)⒉襟EC3)所得混合物,滴入氯化鈣溶液中,液滴與氯化鈣接觸瞬間即成球。 其中,氯化鈣溶液的濃度如果過低,無法成球,但氯化鈣溶液的濃度太高的話,其鈣離子會對菌體產(chǎn)生毒害,影響菌的活性。當(dāng)包埋Paracoccus Sp.HXG-D17菌時,濃度優(yōu)選為 0. 02-0. 08g/ml,進(jìn)一步優(yōu)選 0. 03-0. 05g/ml,最優(yōu)選 0. 03g/ml。其中,所述步驟(4)混合物與氯化鈣混合時,為了使反應(yīng)物比例適當(dāng),
      7且反應(yīng)順利進(jìn)行,優(yōu)選石油烴降解菌、海藻酸鈉、凹凸棒土和氯化鈣的濃度比= 1-4 1-6 0. 5-3 2-8,更優(yōu)選 1-4 2.5-3.5 0.5-2 3-5,最優(yōu)選4 3. 5 1 3。 優(yōu)選利用恒流泵進(jìn)行滴加操作,這樣做的目的是使反應(yīng)的成球速度和質(zhì)量提高。在操作中, 在氯化鈣溶液中設(shè)置磁力攪拌器,以保證混合物液體與氯化鈣的接觸面積。反應(yīng)結(jié)束后,將浸泡有固定化微球顆粒的氯化鈣溶液放于4°C冰箱反應(yīng),該反應(yīng)溫度的控制主要是為了保證菌的活性最大,反應(yīng)時間優(yōu)選18-24h。(5)增殖再培養(yǎng)將步驟⑷得到的固定化微生物顆粒清洗后,轉(zhuǎn)移入增殖培養(yǎng)基,清洗可進(jìn)行多次。此處的增殖培養(yǎng)基的作用在于促進(jìn)吸附在微球上的菌株再生長,可以選用常規(guī)的任意增殖培養(yǎng)基,本發(fā)明為了方便,選用了步驟(1)所述的增殖培養(yǎng)基。所用的增殖培養(yǎng)基的量,如果太少,所附加的營養(yǎng)物質(zhì)不足,可以根據(jù)所制得的固定化顆粒的多少選擇,一般使用固定化微生物顆粒體積2-5倍的增殖培養(yǎng)基量進(jìn)行再培養(yǎng)即可。然后,于 25°C不大于IOOrpm搖床培養(yǎng),優(yōu)選采用常規(guī)的搖床慢速培養(yǎng)48-7池,再清洗幾次,即制備得到固定化微球,可將微球置于4-20°C封存。以上的兩次清洗步驟目的是除去固定化微球上吸附的氯化鈣溶液或增殖培養(yǎng)基雜質(zhì),均可用無菌水和生理鹽水清洗。上述內(nèi)容描述了本發(fā)明所述的固定化微球及其制備方法。本發(fā)明所制備的固定化微球既可用于原位土壤修復(fù)也可用于異位土壤修復(fù),其明顯的特點(diǎn)是凹凸棒土的引入,大大改善了微球的孔隙與吸附性能,進(jìn)而改善了微球的負(fù)載能力;營養(yǎng)物質(zhì)的引入,使得固定化微球內(nèi)部生存環(huán)境得到改善,進(jìn)而耐環(huán)境沖擊力增強(qiáng)。此外,微球制備過程中恒流泵的引入,大大提高成球速度與質(zhì)量,具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。所采用材料的天然性與可降解性, 決定了制備的固定化微球環(huán)保安全與生物相容性好。本發(fā)明在石油污染土壤的生物修復(fù)過程中廣闊的應(yīng)用前景。下面的實(shí)施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的闡述,但不應(yīng)被理解為對本發(fā)明范圍的限制。以下實(shí)施例中所用的主要儀器及設(shè)備的情況如下表所示
      權(quán)利要求
      1.一種石油污染土壤修復(fù)用固定化微球,其特征在于顆粒呈圓球狀,內(nèi)部有孔隙,直徑為2. 5 3. 0mm,所述固定化微球包含海藻酸鈉作為包埋材料,凹凸棒土作為吸附劑,其吸附有石油烴降解菌及營養(yǎng)元素。
      2.如權(quán)利要求1所述的固定化微球,其特征在于,所述海藻酸鈉和凹凸棒土的質(zhì)量比例為1-6 0. 5-3,優(yōu)選比例為2. 5-3. 5 0. 5-2,更優(yōu)選3. 5 1。
      3.一種石油污染土壤修復(fù)用固定化微球的制備方法,其特征在于,該方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)并配制用于石油污染土壤修復(fù)用石油烴降解菌的菌懸液;(2)將海藻酸鈉與凹凸棒土混合均勻后,放入去離子水,高溫濕熱滅菌后,保持在 40-60°C,制得海藻酸鈉-凹凸棒土凝膠;(3)將步驟⑴所得菌懸液加入到步驟(2)所得凝膠液中,混合均勻;其中,混合物中的菌濃度優(yōu)選為0.01-0. 04g/ml,最優(yōu)選0. 04g/ml ;海藻酸鈉的濃度優(yōu)選為 0. 01-0. 06g/ml,進(jìn)一步優(yōu)選0. 025-0. 035g/ml,最優(yōu)選0. 035g/ml ;凹凸棒土的濃度優(yōu)選為 0. 005-0. 03g/ml,進(jìn)一步優(yōu)選 0. 005-0. 02g/ml,最優(yōu)選 0. 01g/ml ;(4)將步驟C3)所得混合物,滴加入氯化鈣溶液中,快速均勻混合,得到固定化微生物顆粒,然后,將浸泡有固定化微生物顆粒的氯化鈣溶液于4°C反應(yīng),其中氯化鈣溶液濃度為 0. 02-0. 08g/ml,優(yōu)選 0. 03-0. 05g/ml,最優(yōu)選 0. 03g/ml ;(5)將步驟(4)所得顆粒清洗后,轉(zhuǎn)移入增殖培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng),清洗,即制備得到固定化微球。
      4.如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(4)混合物與氯化鈣混合時, 石油烴降解菌、海藻酸鈉、凹凸棒土和氯化鈣的濃度比為1-4 1-6 0.5-3 2-8,優(yōu)選 1-4 2.5-3.5 0. 5-2 3-5,更優(yōu)選 4 3. 5 1 3。
      5.如權(quán)利要求3或4所述的固定化微球的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述菌懸液的溶劑為增殖培養(yǎng)基,其成分為葡萄糖20g/L,酵母膏3g/L,蛋白胨2g/L,NH4N03lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L,KCl 0. 2g/L,其中該增殖培養(yǎng)基的 pH = 7. 8。
      6.如權(quán)利要求5所述的固定化微球的制備方法,其特征在于,所述步驟(1)培養(yǎng)并配制石油烴降解菌的菌懸液的步驟為A配制LB液體培養(yǎng)基,高溫滅菌,冷卻至室溫,獲得富集培養(yǎng)基;配制增殖培養(yǎng)基,高溫滅菌,冷卻保存;B在無菌操作臺中,在步驟A所得富集培養(yǎng)基中按5%的接種量接種石油烴降解菌,然后,于25°C -30°C恒溫?fù)u床振動培養(yǎng),收集菌液,離心得到濕菌體;C將濕菌體與增殖培養(yǎng)基混合均勻。
      7.如權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的固定化微球的制備方法,其特征在于,所述步驟(4)利用恒流泵滴加所述混合物至所述氯化鈣溶液中。
      8.一種石油污染土壤修復(fù)用的固定化微球產(chǎn)品,通過權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的固定化微球的制備方法制備得到。
      9.如權(quán)利要求1或2或8所述的固定化微球或權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的固定化微球的制備方法,其特征在于,所述固定化微球包埋的石油烴降解菌為保藏編號為CGMCC No. 3718 的 Paracoccus sp. D17 或保藏編號為 CGMCC No. 3717 的 Paracoccus sp. D24。
      10.權(quán)利要求1或2所述固定化微球用于降解石油烴的應(yīng)用,優(yōu)選用于在土壤中降解石油烴的應(yīng)用。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及石油污染土壤修復(fù)用固定化微球、制法及應(yīng)用。該固定化微球顆粒呈圓球狀,內(nèi)部有孔隙,直徑為2.5~3.0mm,所述固定化微球包含海藻酸鈉作為包埋材料,凹凸棒土作為吸附劑,其吸附有石油烴降解菌及營養(yǎng)元素。該固定化微球的制備方法以海藻酸鈉作為包埋材料,凹凸棒土作為吸附劑,包埋可降解石油烴的降解菌及營養(yǎng)成分,經(jīng)過高濃度菌液懸浮、固定化成球、增殖再培養(yǎng)等的制備步驟,得到固定化微球。本發(fā)明的方法大大改善了微球的孔隙與吸附性能,進(jìn)而改善了微球的負(fù)載能力,使得固定化微球內(nèi)部生存環(huán)境得到改善,進(jìn)而耐環(huán)境沖擊力增強(qiáng),制備的固定化微球環(huán)保安全與生物相容性好,在石油污染土壤的生物修復(fù)過程中有廣闊的應(yīng)用前景。
      文檔編號A62D3/02GK102199589SQ201010607060
      公開日2011年9月28日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
      發(fā)明者熊櫻, 王倩, 王璇, 王紅旗, 花菲 申請人:北京師范大學(xué)
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