專利名稱：紅綬曲霉sgfa1及其在降解甲醛中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅綬曲霉SGFAl及其在降解甲醛中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲醛在常溫下是一種無色，有強(qiáng)烈刺激性氣味的氣體，易溶于水、醇和醚，通常以水溶液的形式出現(xiàn)。甲醛易發(fā)生加成、氧化、還原、聚合等化學(xué)反應(yīng)，具有高度的水溶性，能夠與生物大分子高度反應(yīng)，甲醛在接觸部位吸收或降解，進(jìn)入人體后，主要與人體的蛋白質(zhì)和核酸反應(yīng)引起細(xì)胞核基因突變、DNA單鏈內(nèi)交連、DNA與蛋白質(zhì)交連、抑制DNA損傷的修復(fù)，與氨基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)并凝固，擾亂人體細(xì)胞的正常代謝，從而產(chǎn)生殺傷力。長時(shí)間吸入甲醛氣體，可損傷肝臟、腎臟、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，婦女、孕婦長時(shí)間接觸低濃度甲醛氣體，能導(dǎo)致月經(jīng)紊舌L、胎兒畸形、新生兒免疫力降低、體質(zhì)下降，智力發(fā)育產(chǎn)生障礙。甲醛有毒，致畸，同時(shí)甲醛也具有強(qiáng)烈的致癌作用，在我國有毒化學(xué)品優(yōu)先控制的名單上居第2位。甲醛是一種重要的化工原料和有機(jī)溶劑。常用于制造樹脂、塑料、藥品、油漆、合成纖維和各種黏合劑等工業(yè)品，也可用作消毒、防腐等(Hesham R. Lotfy, Rashed I. G. . A method for treating waste water containing form aldehyde [J], Water Research, 2002, 36 :633-637)。環(huán)境中甲酸的主要來源是甲酸生產(chǎn)企業(yè)以及以甲醛為原料的有機(jī)合成、木材加工、染料、制漆等行業(yè)排放的廢水。目前對(duì)甲醛廢水的處理方法主要有化學(xué)反應(yīng)法(軟錳礦催化氧化、次氯酸鈉、亞氯酸鈉、二氧化氯、高錳酸鉀等的氧化作用)、電化學(xué)法、電解氧化、氧化吸附法、物理吸附技術(shù)、臭氧負(fù)離子技術(shù)、納米光催化技術(shù)、低溫等離子技術(shù)和生物降解等方法。但是，化學(xué)方法的反復(fù)使用會(huì)造成二次污染；物理方法普遍存在成本較高，操作復(fù)雜和處理效果不理想等問題。相對(duì)的，微生物法則以生態(tài)環(huán)境中的有益菌為材料，成本低，效果好，而且無二次污染。微生物以污染物中的有機(jī)物、富營養(yǎng)元素為食物，大量生長繁殖，加速消耗污染物中有機(jī)物、污染物、營養(yǎng)成份，從而徹底治理污染。特選的微生物能保持長久的活性，它們以各自針對(duì)分解的有毒物質(zhì)為“食物”，快速、大量繁殖，在污染物表面及淺表層形成菌群保護(hù)膜，隨時(shí)截殺從污染源滲透或揮發(fā)出的污染物，從而能長久地起作用由于它能滲入到污染源中，在不破壞原始材料的情況下，有效分解有害物質(zhì)從而治標(biāo)治本，杜絕后患。無毒無害， 不會(huì)危害人體和造成環(huán)境二次污染。目前常用的生物方法多是應(yīng)用篩選自各類不同生境的甲醛降解細(xì)菌和酵母，這類微生物對(duì)不良環(huán)境，如紫外輻射、低營養(yǎng)、低PH值等適應(yīng)性不佳，繁殖傳播能力較差，且不易保存。絲狀真菌普遍存在于水體和土壤環(huán)境中，其菌絲體能提供較大的表面積與污染物接觸，有利于污染物的充分降解；其孢子能夠適應(yīng)各類不良環(huán)境。因此，亟待開發(fā)一種能夠有效降解廢水中甲醛，且安全、環(huán)保、高效的真菌菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl。
本發(fā)明所提供的紅綬曲霉(Aspergi 1 Ius nomius) SGFAl，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4538。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl在降解甲醛中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種降解甲醛的菌劑。本發(fā)明所提供的降解甲醛的菌劑，其活性成分為所述紅綬曲霉(Aspergillus nomius)SGFAl0所述菌劑在降解甲醛中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl可在好氧條件下將甲醛作為唯一碳源進(jìn)行生長，同時(shí)將其降解。在純培養(yǎng)條件下，能將濃度為80mmol/L的甲醛在7 天內(nèi)降解完全。該菌株有望在工業(yè)廢水的生物處理中發(fā)揮重要作用。


圖1為紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl在孟加拉紅培養(yǎng)基上的生長狀況。圖2為紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl的分生孢子囊。圖3為將紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl在含有80mmol/l甲醛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)甲醛含量的變化。圖4為將紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl在含有不同濃度甲醛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)菌絲體干重的的變化。圖5為將紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl在含有不同濃度甲醛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)甲醛含量的變化。圖6為將紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl在含有不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)菌絲體干重的的變化。圖7為將紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl在含有不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)甲醛含量的變化。圖8為不同濃度甲醛標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl的分離和鑒定一、紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl 的分離紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl的分離分為取樣和富集培養(yǎng)，篩選和純化兩個(gè)步驟，具體方法如下1、取樣和富集培養(yǎng)取黑龍江省某家具廠未處理的出水口處淤泥樣后立即富集培養(yǎng)。在超凈工作臺(tái)上，取IOg淤泥樣置于90mL無菌水中，180r · mirT1，置于30°C的條件下震蕩培養(yǎng)5天。2、篩選和純化篩選用的是含甲醛的PDA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配制方法如下
取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g葡萄糖和2%的瓊脂，定容至lOOOmL，121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入lOmmol/L甲醛貯存?zhèn)溆谩⑸鲜霾襟E1震蕩培養(yǎng)5天后生長起來的霉菌經(jīng)多次用含有l(wèi)Ommol/L甲醛的PDA 培養(yǎng)基平板劃線，直至分離得到單菌落為止。將菌絲頂端移接到PDA培養(yǎng)基上連續(xù)重復(fù)純化3次，既獲得純培養(yǎng)菌株。二、紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl 的鑒定對(duì)上述實(shí)驗(yàn)一得到的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行一系列形態(tài)特征鑒定，并進(jìn)行DNA提取，ITS 保守區(qū)序列的擴(kuò)增和測(cè)序。該菌株在孟加拉紅培養(yǎng)基上呈環(huán)狀生長，菌落黃綠色，反面蛋殼黃色，菌體平薄，粗糙，內(nèi)部為黃色，最外緣為白色，后期稍呈綠色。干燥無滲出液，表面無輻射狀紋，基質(zhì)有不規(guī)則的輻射皺折溝紋(圖1)。分生孢子穗圓筒狀，淡黃色。分生孢子梗平滑帶黃色。分生孢子囊為球形，孢子呈葡萄狀(圖2)。孟加拉紅培養(yǎng)基的配制方法如下將蛋白胨5g、葡萄糖10g、KH2P04 lg、MgS04 ·7Η20 0. 5g和瓊脂20g加入蒸餾水中溶解后，加1/3000孟加拉紅溶液(取孟加拉紅30克，加蒸餾水1000毫升，加熱至全部溶解，即得到1/3000孟加拉紅溶液)IOOmL和氯霉素0. Ig,定容至 IOOOmL,分裝，121°C滅菌20min，用于分離霉菌及酵母。利用通用引物ITSl和ITS4進(jìn)行ITS保守區(qū)序列的擴(kuò)增，引物序列如下ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘，ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘。PCR 擴(kuò)增條件為94 "C 3min ；94 "C 30s, 50 "C 30s, 72 "C 1. 5min, 25 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如序列表中序列1所示。將上述獲得的純培養(yǎng)菌株中的一株命名為紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl。該紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl已于2011年01月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4538。實(shí)施例2、紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl對(duì)甲醛的生物降解效果檢測(cè)紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl 一級(jí)種子的制備方法如下將從上述實(shí)施例1中PDA斜面上沖洗下的孢子懸液接入PD培養(yǎng)基中，接種量為 2% (體積比)，在30°C，180r · mirT1，培養(yǎng)4天，即得到一級(jí)種子液。PD培養(yǎng)基除不加瓊脂外，其余成分均與上述PDA培養(yǎng)基相同。(一 )紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl對(duì)甲醛的生物降解效果檢測(cè)將得到的一級(jí)種子液按體積比為2%的比例接種于含80mmol/l甲醛的PD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速180r · mirT1，溫度30°C，培養(yǎng)7天。同時(shí)，設(shè)不接種一級(jí)種子液的對(duì)照。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取加菌處理和對(duì)照的培養(yǎng)液， 每天測(cè)量甲醛剩余量，共測(cè)量7天。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖3所示，加菌處理的培養(yǎng)液中，接種7天內(nèi)甲醛濃度呈下降趨勢(shì)，且第7天甲醛全部降解；而對(duì)照的培養(yǎng)液中，接種7天內(nèi)甲醛濃度沒有明顯的變化。此結(jié)果說明，紅綬曲霉(Aspergillus nomius)SGFAl可降解甲醛。( 二 )紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl對(duì)不同濃度甲醛的降解效果檢測(cè)將得到的一級(jí)種子液按體積比為2%的比例分別接種于含有30mmOl/l、50mmOl/L 和80mmol/L甲醛的PD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速180r · mirT1，溫度30°C，培養(yǎng)7天。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取不同甲醛濃度處理培養(yǎng)液，每天測(cè)量菌絲干重和甲醛剩余量，共測(cè)量7天。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖4所示，即SGFAl在30mmol/L、50mmol/L和80mmol/L甲醛處理下的生長狀況和甲醛降解狀況。從圖中可見，SGFAl在30mmol/L甲醛處理下，第7天菌絲體干重達(dá)到0. 748g，在 50mmol/L甲醛處理下，第7天菌絲體干重達(dá)到0. 418g，在80mmol/L甲醛處理下，第7天菌絲體干重達(dá)到0. 346g。此結(jié)果說明甲醛濃度越高，同等質(zhì)量的菌生長同樣時(shí)間，生長狀況越差。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取不同甲醛濃度處理培養(yǎng)液， 每天測(cè)量甲醛剩余量，共測(cè)量7天。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖5所示。從圖中可見，不同甲醛濃度處理的培養(yǎng)液中甲醛濃度均顯著下降，且SGFA13天內(nèi)可將30mmol/L 甲醛全部降解，6天內(nèi)可將50mmol/L甲醛全部降解，7天內(nèi)可將80mmol/L甲醛全部降解。(三)不同碳源處理的培養(yǎng)基對(duì)紅綬曲霉(Aspergillusnomius) SGFAl降解甲醛的影響選取4種碳源葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉，按體積比2%的比例添加到PD培養(yǎng)基中，設(shè)置5種不同處理的碳源，分別為甲醛(處理1)、甲醛+2%葡萄糖(處理2)、甲醛+2%乳糖(處理幻、甲醛+2%蔗糖(處理4)和甲醛+2%可溶性淀粉(處理幻，其余成分相同。5種不同處理的培養(yǎng)基的配制方法如下(1)以甲醛為碳源的培養(yǎng)基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加2%的瓊脂，定容至1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為80mmol/L貯存?zhèn)溆谩?2)以甲醛+2 %葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g葡萄糖和2 %的瓊脂，定容至1000mL。 121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為80mmol/L貯存?zhèn)溆谩?3)以甲醛+2%乳糖為碳源的培養(yǎng)基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g乳糖和2%的瓊脂，定容至1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為80mmol/L貯存?zhèn)溆谩?4)以甲醛+2%蔗糖為碳源的培養(yǎng)基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g蔗糖和2%的瓊脂，定容至1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為80mmol/L貯存?zhèn)溆谩?5)以甲醛+2%可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g可溶性淀粉和2%的瓊脂，定容至 1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為80mmol/L貯存?zhèn)溆?。將紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl 一級(jí)種子液按體積比為2%的比例接種到上述五種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。搖床轉(zhuǎn)速180r · mirT1，溫度30°C，培養(yǎng)7天。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取不同處理培養(yǎng)液，每天取2瓶測(cè)量菌絲干重和甲醛剩余量，共測(cè)量7天，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖6 和圖7。圖6和圖7的結(jié)果顯示紅綬曲霉(Aspergillus nomius) SGFAl能利用甲醛作為唯一碳源生長繁殖，7天能夠?qū)?0mmol/L甲醛全部降解。同時(shí)，該菌能夠在不同碳源的條件下代謝甲醛。甲醛含量測(cè)量方法為乙酰丙酮法，具體方法為根據(jù)不同濃度的甲醛水溶液，在乙酸銨溶液介質(zhì)中，與乙酰丙酮加熱反應(yīng)生成黃色化合物(3，5 —二乙?；鵢1，4氫盧剔啶)。 該化合物對(duì)可見光有選擇性吸收，并且對(duì)波長414nm的可見光吸收最多，其對(duì)可見光的吸收值與甲醛溶液成正比。依據(jù)這一原理，分別對(duì)幾種已知濃度的甲醛溶液進(jìn)行吸光度的測(cè)量，繪出不同甲醛濃度對(duì)應(yīng)OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)線方程。具體步驟如下取6支IOml容量瓶編號(hào)，分別加入0，2，4，6，8，IOml濃度為 100mmol/l的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液(甲醛分析純?nèi)芤嘿徸試幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CAS RN 50-00-0濃度為37%-40% (體積百分比濃度))，取9. 959ml該溶液加水定容到1L)，加水至IOml搖勻(不同編號(hào)的容量瓶中甲醛濃度見表1所示)。將ImL乙酰丙酮溶液加入4mL水中，然后加入不同濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液1μ 1，65°C反應(yīng)lOmin。當(dāng)溶液冷卻到室溫時(shí)，測(cè)量其OD值。采用IOmm比色皿，在波長414nm處，以0號(hào)為參比測(cè)量吸光度，OD值測(cè)定結(jié)果見表2。繪制不同甲醛濃度對(duì)應(yīng)OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖8所示)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 0. 0065x+0. 0034 (R2 = 0. 9998)。表1配制不同濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液
權(quán)利要求
1.紅綬曲霉(Aspergillusnomius) SGFAl，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 4538。
2.權(quán)利要求1所述的紅綬曲霉(Aspergillusnomius) SGFAl在降解甲醛中的應(yīng)用。
3.一種降解甲醛的菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述的紅綬曲霉(Aspergillus nomius)SGFAl0
4.權(quán)利要求3所述的菌劑在降解甲醛中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了紅綬曲霉SGFA1及其在降解甲醛中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的紅綬曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1，其保藏號(hào)為CGMCC No.4538。本發(fā)明所提供的紅綬曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1可在好氧條件下將甲醛做為唯一碳源進(jìn)行生長，同時(shí)將其降解。在純培養(yǎng)條件下，能將濃度為80mmol/L的甲醛在7天內(nèi)降解完全。該菌株有望在工業(yè)廢水的生物處理中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)A62D3/02GK102220245SQ20111012236
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者于典司, 宋麗莉, 宋鴿, 林海龍, 董蕊, 郭長虹 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)