專利名稱：一種農(nóng)藥降解酶制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定酶制劑活性的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種農(nóng)藥降解酶制劑。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥污染所導(dǎo)致的環(huán)境安全及食品安全問題是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康面臨的重大問題。在我國，由于農(nóng)藥使用的不規(guī)范，農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境都遭受到了嚴(yán)重的農(nóng)藥污染。農(nóng)藥污染所導(dǎo)致的環(huán)境安全及食品安全等問題越來越受到關(guān)注，正成為政府和廣大消費者關(guān)注的焦點之一。 相關(guān)報導(dǎo)顯示我國農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留嚴(yán)重，居民日常膳食中的各類農(nóng)藥攝入量，高于美國、日本和歐盟等發(fā)達(dá)國家數(shù)十倍。殘留農(nóng)藥可以改變?nèi)梭w荷爾蒙，使女性內(nèi)分泌紊舌L男性少精，精子成活率低；殘留農(nóng)藥進(jìn)入人體，一部分通過腎肝轉(zhuǎn)化或排出，增加機(jī)體工作量引起病變；一部分和血液的血紅蛋白結(jié)合，降低其供氧能力。世界衛(wèi)生組織公布的調(diào)查報告表明，殘留農(nóng)藥在人體內(nèi)長期蓄積滯留會引發(fā)慢性中毒，以致誘發(fā)許多慢性病癥。如心腦血管病、糖尿病、癌癥等，農(nóng)藥殘留甚至通過胚胎和乳汁轉(zhuǎn)移給下一代，并能夠?qū)е隆叭隆?致癌、致畸、致突變，有時直接導(dǎo)致食用者死亡。環(huán)境激素是全世界公認(rèn)的造成生物異常生長發(fā)育的主要兇手。在國際組織確定的70種環(huán)境激素中，農(nóng)藥就有40種。由于農(nóng)藥的使用，蔬菜瓜果等農(nóng)產(chǎn)品經(jīng)過清洗后的水流入土壤之中，農(nóng)藥污染物仍未被最終降解，又可能通過其它途徑進(jìn)入人體。農(nóng)藥降解酶通過酶促反應(yīng)原理水解磷酸酯鍵，降解農(nóng)藥殘留，是目前解決農(nóng)藥殘留問題的最有效技術(shù)手段，具有安全、高效、無二次污染等特點。農(nóng)藥降解酶制劑的穩(wěn)定性問題是其研制過程中的關(guān)鍵問題。酶是一種生物活性物質(zhì)，受溫度、PH值影響較大，如果配方體系不佳，酶很容易失去活性。所以，研制穩(wěn)定的農(nóng)藥降解酶制劑配方，是農(nóng)藥降解酶發(fā)揮作用的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)藥降解酶制劑。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為—種農(nóng)藥降解酶制劑，農(nóng)藥降解酶制劑由農(nóng)藥降解酶劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、保護(hù)劑和水組成，其按體積百分比計，10% -20%的農(nóng)藥降解酶劑、O. 1% -O. 2%的穩(wěn)定劑、1% -5%的表面活性劑、30% -80%的保護(hù)劑余量為水。所述農(nóng)藥降解酶劑為在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)破碎。所述農(nóng)藥降解酶劑為將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)10-15小時，而后按體積比1% -5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，在37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)2-4小時后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C _25°C，誘導(dǎo)表達(dá)15-22個小時，將上述所得發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10-1/20發(fā)酵液體積的O.1mol/LpH7. O的磷酸鹽緩沖液回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體真空冷凍干燥，將凍干后的菌體用O.1mol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。、
所述穩(wěn)定劑為聚六亞甲基胍；表面活性劑為椰油酰胺丙基甜菜堿；保護(hù)劑為甘油。所述發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計，蛋白胨2% -3%、酵母粉2% -3%、甘油2% -3%,K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%,NaCl O. 05%、MgSO4 ·H2O O. 025%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體真空冷凍干燥，其真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時間8-12h。所述農(nóng)藥降解酶制劑用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。本發(fā)明所具有的優(yōu)點1.本發(fā)明的農(nóng)藥降解酶制劑酶活性高，可以有效降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，保障食品安全。2.本發(fā)明的農(nóng)藥降解酶制劑具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，酶不易失活。3.本發(fā)明的農(nóng)藥降解酶制劑降解效果迅速。4.本發(fā)明的農(nóng)藥降解酶制劑安全高效、無毒副作用。本發(fā)明制劑在4°C條件下保存，6個月內(nèi)酶活損失不高于10%;在室溫下保存，6個月內(nèi)酶活性損失不高于30%。同時本發(fā)明的農(nóng)藥降解酶制劑能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。
具體實施例方式實施例1農(nóng)藥降解酶制劑由農(nóng)藥降解酶劑、聚六亞甲基胍、椰油酰胺丙基甜菜堿、甘油和水組成，其按體積百分比計，20 %的農(nóng)藥降解酶劑(酶活力為11500U) ,0.1%的聚六亞甲基胍、I %的椰油酰胺丙基甜菜堿、75 %的甘油，余量為滅菌蒸餾水。所述農(nóng)藥降解酶劑，將保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529的基因工程菌株接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，溶氧量20%，培養(yǎng)時間10個小時。LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計，胰蛋白胨I %、酵母粉O. 5%、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50 μ g的氨芐青霉素。所述基因工程菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529，另參見申請?zhí)?00510086957. 3中的相關(guān)記載。而后按體積比1%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，在37°C，溶氧量20%，培養(yǎng)2小時后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到25°C，誘導(dǎo)表達(dá)20個小時后將發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10發(fā)酵液體積的O.1mol/LpH 7. O的磷酸鹽緩沖液(稱取Na2HPO4 ·2Η20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O.1cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高于菌體表面O. 5cm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體置于真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，其中真空冷凍干燥真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時間12h，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計，蛋白胨2%、酵母粉2%、甘油2 %、K2HPO4O. 25 %,KH2PO4 0. 016%, NaCl 0. 05%, MgSO4 · H2O 0. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50 μ g的氨芐青霉素。上述農(nóng)藥降解酶制劑的酶活力的測定將上述制劑在4°C或者室溫放置，而后分別測定其酶活穩(wěn)定性，吸取980 μ I O. lmol/L ρΗ7· O的磷酸鹽緩沖液，10 μ I 10mg/mL的對硫磷溶液(稱取對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL),充分混勻,加入10 μ I上述農(nóng)藥降解酶劑，30°C反應(yīng)I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應(yīng)，吸取0. 5ml加入4. 5mL0. 05mol/LpH10. O的NaOH-甘氨酸緩沖液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計加以校正。)，充分混勻，于410nm波長下測定產(chǎn)物對硝基苯酚的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C, pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對硫磷所需要的酶量定義為一個酶活力單位U。測定結(jié)果參見表1，由上述測定酶活力可知制備所得制劑能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。表I酶活穩(wěn)定性
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于農(nóng)藥降解酶制劑由農(nóng)藥降解酶劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、保護(hù)劑和水組成，其按體積百分比計，10% -20%的農(nóng)藥降解酶劑、O. 1% -O. 2%的穩(wěn)定劑、I % _5%的表面活性劑、30% -80%的保護(hù)劑余量為水。
2.按權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于所述農(nóng)藥降解酶劑為在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)破碎。
3.按權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于所述農(nóng)藥降解酶劑制備為將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)10-15小時，而后按體積比1% _5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，在37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)2-4小時后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C -25°C，誘導(dǎo)表達(dá)15-22個小時，將上述所得發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10-1/20發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O.1-ο. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體真空冷凍干燥，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。
4.按權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于所述穩(wěn)定劑為聚六亞甲基胍；表面活性劑為椰油酰胺丙基甜菜堿；保護(hù)劑為甘油。
5.按權(quán)利要求3所述的農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計，蛋白胨 2%-3%、酵母粉 2%-3%、甘油 2%-3%、K2HP04 O. 25%,KH2PO4 O. 016%,NaClO.05%,MgSO4 · H2O O. 025%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。
6.按權(quán)利要求3所述的農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于所述LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計，胰蛋白胨I %、酵母粉O. 5 %、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121 °C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。
7.按權(quán)利要求3所述的農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體真空冷凍干燥，其真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時間8-12h。
8.按權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥降解酶制劑，其特征在于所述農(nóng)藥降解酶制劑用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定酶制劑活性的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種農(nóng)藥降解酶制劑。農(nóng)藥降解酶制劑由農(nóng)藥降解酶劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、保護(hù)劑和水組成，其按體積百分比計，10％-20％的農(nóng)藥降解酶劑、0.1％-0.2％的穩(wěn)定劑、1％-5％的表面活性劑、30％-80％的保護(hù)劑余量為水。本發(fā)明制劑在4℃條件下保存，6個月內(nèi)酶活損失不高于10％；在室溫下保存，6個月內(nèi)酶活性損失不高于30％。同時本發(fā)明農(nóng)藥降解酶制劑能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。
文檔編號A62D3/02GK102994488SQ201110431638
公開日2013年3月27日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者謝建飛, 石元亮, 盧宗云, 張惠文, 李鵬程, 邢云鵬 申請人:遼寧中科生物工程有限公司