一株具有溶磷和降解苯酚能力的假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株具有溶磷和降解苯酚能力的假單胞菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的假單胞菌(Pseudomonas?sp.)，它的菌株編號(hào)為113443，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC?No.7840。本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonas?sp.)113443CGMCC?No.7840有較強(qiáng)的溶磷和降解有毒污染物的能力，其苯酚降解率可達(dá)100%。本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonas?sp.)113443CGMCC?No.7840適用于土壤和沉積物中難溶態(tài)磷的降解、鹽堿環(huán)境土壤中磷活性的增強(qiáng)，可以有效提高生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)磷的有效性，從而促進(jìn)植物的吸收。
【專利說明】一株具有溶磷和降解苯酚能力的假單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株具有溶磷和降解苯酚能力的假單胞菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是生物生長的主要營養(yǎng)元素之一，其在自然狀態(tài)下以可溶態(tài)和難溶態(tài)兩種形式存在。植物可吸收利用可溶態(tài)磷，而難溶態(tài)磷在生態(tài)系統(tǒng)中含量較可溶態(tài)磷高，且難被植物吸收利用。已有研究表明，微生物可降解難溶態(tài)磷，因此，開發(fā)高效的溶磷微生物，將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可被植物利用的活性磷具有重要的實(shí)用價(jià)值。
[0003]苯酚是造紙、煉焦、煉油、塑料、農(nóng)藥、醫(yī)藥合成等行業(yè)生產(chǎn)的原料或中間體。含酚廢水的排放導(dǎo)致水體污染，魚蝦死亡，農(nóng)作物減產(chǎn)，并嚴(yán)重威脅人類的健康。微生物因其豐富的代謝能力和強(qiáng)大環(huán)境適應(yīng)性可用來降解有機(jī)污染物。目前，已報(bào)道的微生物對(duì)苯酚的降解能力有限，開發(fā)能完全降解苯酚的功能微生物具有重要的社會(huì)生態(tài)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株具有溶磷能力和高效降解苯酚的假單胞菌及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的假單胞菌(Pseudomonas sp.),它的菌株編號(hào)為113443,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC N0.7840。
[0006]假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的 16s rDNA 序列如 SEQ IDN0.3所示，革蘭氏染色為陰性。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840。
[0008]所述菌劑還可包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為植物油、礦物油或水；所述有機(jī)溶劑為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養(yǎng)的活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的形式存在。所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。
[0009]根據(jù)需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、pH調(diào)節(jié)劑等。
[0010]所述菌劑可為下述Al)、A2)或A3):
[0011]Al)降解酚(如苯酚)和將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑；
[0012]A2)降解酚(如苯酚)的菌劑；
[0013]A3)將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑。
[0014]含有假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的生物膜或生物膜反應(yīng)器也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]所述生物膜或生物膜反應(yīng)器可為下述B1)、B2)或B3):
[0016]BI)降解酚(如苯酚)和將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的生物膜或生物膜反應(yīng)器；
[0017]B2)降解酚(如苯酚)的生物膜或生物膜反應(yīng)器；
[0018]B3)將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的生物膜或生物膜反應(yīng)器。
[0019]該生物膜具體是由人工填料或天然材料作為載體,所述假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840附著絮凝其表面形成的膜狀物。
[0020]所述假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 在制備 Cl)、C2)或 C3)菌劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0021]Cl)降解酚(如苯酚)和將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑；
[0022]C2)降解酚(如苯酚)的菌劑；
[0023]C3)將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑。
[0024]上述假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840、上述菌劑、上述生物膜或生物膜反應(yīng)器在降解酚(如苯酚)中的應(yīng)用，或在將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]上述應(yīng)用中，將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷可為將土壤和沉積物中難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷。上述將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)`化為可溶性磷中的應(yīng)用，所述假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840在20_40°C轉(zhuǎn)化100_200h。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在28°C轉(zhuǎn)化48小時(shí)，可溶性磷的濃度最聞。
[0026]上述應(yīng)用中，所述降解酚(如苯酚)可為降解液體中的苯酚。所述液體可為含有苯酚的任何液體，如含有苯酚的水體。上述降解酚(如苯酚)中的應(yīng)用，所述假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在 20_40°C 降解 20_60h (如 28-60 小時(shí))。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840對(duì)25mg/L的苯酚28 V降解28小時(shí)，苯酚的降解率達(dá)到82.8%_98.2%，對(duì)25mg/L的苯酚28 V降解60小時(shí)，苯酚的降解率達(dá)到100%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 對(duì) 50mg/L 的苯酚 28°C 降解 28 小時(shí)，苯酚的降解率達(dá)到20.6%-40.0%,對(duì)50mg/L的苯酚28°C降解60小時(shí)，苯酚的降解率達(dá)到93.6%-98.1%。
[0027]上文中，所述難溶態(tài)磷為難被植物吸收利用的磷，如難溶態(tài)磷酸鹽。在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述難溶態(tài)磷酸鹽為磷酸鈣。
[0028]所述假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840可在用于培養(yǎng)假單胞菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其適宜培養(yǎng)條件為:pH7.5，溫度20-40°C。
[0029]上述菌劑、上述生物膜或生物膜反應(yīng)器的制備方法，包括將所述假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 作為活性成分的步驟。
[0030]本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840有較強(qiáng)的溶磷和降解有毒污染物的能力，其苯酚降解率可達(dá)100%。本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840適用于土壤和沉積物中難溶態(tài)磷的降解、鹽堿環(huán)境土壤中磷活性的增強(qiáng)，可以有效提高生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)磷的有效性，從而促進(jìn)植物的吸收。本發(fā)明的假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840同時(shí)適用于含苯酌.有機(jī)廢水的處理,可以使廢水中苯酚殘留含量符合排放標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明解決了自然狀態(tài)下磷元素的利用效率低和廢水中苯酚去除效果不高的問題，降低了生產(chǎn)和使用成本，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境及人類健康具有重要的意義。
[0031]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
[0032]保藏說明
[0033]菌種名稱:假單胞菌(Pseudomonas sp.)
[0034]菌株編號(hào):113443
[0035]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心[0036]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0037]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)
[0038]保藏日期:2013年07月02日
[0039]保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.7840
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在磷酸鈣固體培養(yǎng)基形成的解磷圈。
[0041]圖2 為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在磷酸鈣，“磷酸鈣 +磷酸二氫鉀”，磷酸二氫鉀三種不同磷源處理培養(yǎng)基中溶磷比較分析(可溶性磷酸鹽濃度按K2HPO4的量計(jì)算)。
[0042]圖3 為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在磷酸鈣，“磷酸鈣 +
磷酸二氫鉀”，磷酸二氫鉀三種不同磷源處理培養(yǎng)基中的生長量。
[0043]圖2 和圖 3 中，Ca3 (PO3) 2 表示 Pl 培養(yǎng)基，Ca3 (PO3) 2+ΚΗ2Ρ03 表示 P2 培養(yǎng)基，KH2PO3表不P3培養(yǎng)基。
[0044]圖4為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在溶液A中對(duì)苯酚的降解和菌體生長分析?！氨椒印北硎疚唇臃N假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液A，“苯酚+菌”表示接種假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液A，“菌生長曲線”表示接種假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液A中假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 的生長情況。
[0045]圖5 為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在碳源為 5Omg/L苯酹時(shí)對(duì)苯酹的降解和菌體生長分析。“苯酹”表示未接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液B，“苯酚+菌”表示接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液B，“菌生長曲線”表示接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的溶液 B 中假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的生長情況。
[0046]圖6 為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在碳源為“25mg/L苯酌.+5g/L葡萄糖”時(shí)對(duì)苯酹的降解和菌體生長分析?！氨锦北硎疚唇臃N假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液C，“苯酚+菌”表示接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液C，“菌生長曲線”表示接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的溶液 C 中假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的生長情況。
[0047]圖7 為假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在碳源為“50mg/L 苯酚+5g/L葡萄糖”時(shí)對(duì)苯酹的降解和菌體生長分析?！氨锦北硎疚唇臃N假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液D，“苯酚+菌”表示接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液D，“菌生長曲線”表示接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的溶液 D 中假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的含量。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049]下述實(shí)施例中的磷酸鈣固體培養(yǎng)基均按照如下方法配制:取IOg葡萄糖、
0.5g (NH4)2SO4^0.3g NaCl、0.3g KCl、0.3g MgSO4.7Η20、0.03g FeSO4.7Η20、0.03gMnSO4.Η20、5.0g Ca3 (PO4) 2、15_20g 瓊脂，用 H2O 定容至 1000mL,調(diào)整培養(yǎng)基 pH 至 7.0-7.5，105°C滅菌 30min。
[0050]下述實(shí)施例中的培養(yǎng)基均為無菌培養(yǎng)基。
[0051]實(shí)施例1、假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 的分離和鑒定
[0052]一、菌株的分離
[0053]取Ig采集的北京官廳水庫底泥，加入IOOmL無菌水震蕩5min,將懸濁液倒入250mL裝有十顆玻璃珠無菌 三角瓶中，25°C搖床振蕩30min，取上清液逐級(jí)稀釋至10_4，各取
0.1mL涂布于磷酸鈣固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3皿，29.(TC培養(yǎng)5d，篩選具有溶磷圈的菌株，將分離純化所得的一株具有明顯溶磷圈的菌株命名為菌株113443。
[0054]二、菌株的鑒定
[0055]菌株113443的革蘭氏染色為陰性。
[0056]利用PCR對(duì)菌株113443的16s rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物為8F (序列如SEQ IDN0:1所示)，下游引物為1492R (序列如SEQ ID NO: 2所示)，擴(kuò)增條件為95°C，5min ;95°C，111^11，501:，1111丨11，721:，2111丨11，25個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin0 菌株 113443 的 16s rRNA 的 DNA 序列如SEQ ID N0.3所示。將該序列在Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST(網(wǎng)址:http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)，結(jié)果該序列與假單胞菌(Pseudomonas veronii)菌株 PH-5的相似性為99%。
[0057]根據(jù)菌株113443的16s rDNA序列同源性分析結(jié)果，將菌株113443鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas),本發(fā)明中稱其為假單胞菌(Pseudomonas sp.)。假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443已于2013年07月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7840。
[0058]實(shí)施例2、假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840溶憐能力的研究
[0059]一、假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在固體培養(yǎng)基中溶磷能力的測試。[0060]將假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840用接種針接種到磷酸鈣固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5d，同時(shí)以沒有接種假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCCN0.7840的磷酸鈣固體培養(yǎng)基為對(duì)照，觀察測量菌落直徑及溶磷圈直徑，根據(jù)公式(I)計(jì)算其溶磷效果。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。
[0061]溶解磷系數(shù)=(溶磷圈直徑/菌落直徑)X 100 (I)
[0062]結(jié)果表明假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840可以在憐酸鈣固體培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈見圖1，溶磷能力評(píng)估見表1，未接種假單胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的磷酸鈣固體培養(yǎng)基上沒有溶磷圈。
[0063]表1 假單胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 解憐能力的評(píng)價(jià)
[0064]
【權(quán)利要求】
1.假單胞菌(Pseudomonassp.),它的菌株編號(hào)為113443,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC N0.7840。
2.菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述的假單胞菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于:所述菌劑為下述Al)、A2)或A3): Al)降解酚和將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑； A2)降解酚的菌劑； A3)將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑。
4.含有權(quán)利要求1所述的假單胞菌的生物膜或生物膜反應(yīng)器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物膜或生物膜反應(yīng)器，其特征在于:所述生物膜或生物膜反應(yīng)器為下述B1)、B2)或B3): BI)降解酚和將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的生物膜或生物膜反應(yīng)器； B2)降解酚的生物膜或生物膜反應(yīng)器； B3)將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的生物膜或生物膜反應(yīng)器。
6.權(quán)利要求1所述的假單胞菌在制備C1)、C2)或C3)菌劑中的應(yīng)用: Cl)降解酚和將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑； C2)降解酚的菌劑； C3)將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的菌劑。
7.權(quán)利要求1所述的假單胞菌、權(quán)利要求2或3所述的菌劑、權(quán)利要求4或5所述的生物膜或生物膜反應(yīng)器在降解酚中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的假單胞菌、權(quán)利要求2或3所述的菌劑、權(quán)利要求4或5所述的生物膜或生物膜反應(yīng)器在將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷中的應(yīng)用。
9.培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的假單胞菌的方法，包括將所述權(quán)利要求1所述的假單胞菌在用于培養(yǎng)假單胞菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
10.權(quán)利要求2或3所述的菌劑、權(quán)利要求4或5所述的生物膜或生物膜反應(yīng)器的制備方法，包括將權(quán)利要求1所述的假單胞菌作為活性成分的步驟。
【文檔編號(hào)】A62D101/20GK103820365SQ201410058179
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】吳曉磊, 陳衛(wèi)民, 孫艷梅, 池昌橋 申請(qǐng)人:北京鐵漢生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院有限公司, 北京大學(xué)