一株銅綠假單胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株銅綠假單胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)，其保藏編號(hào)為CGMCC?No.8727。作為玉米赤霉烯酮降解的生物材料，無論開發(fā)新的生物降解菌劑或者生物降解無菌制劑，該菌都具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株銅綠假單胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一株銅綠假單胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)由鐮刀菌在次生代謝的過程中產(chǎn)生的一種雌激素類真菌毒素。ZEN污染谷物的種類非常廣泛，如小麥、大麥、玉米、燕麥、高粱、黑麥、小米及這些谷物的相關(guān)產(chǎn)品，是世界上污染范圍最廣泛的鐮刀霉毒素之一。ZEN對(duì)動(dòng)物、人類都會(huì)產(chǎn)生毒害，主要影響動(dòng)物繁殖機(jī)能，降低懷孕動(dòng)物的胚胎成活率及新生胎兒的出生重，導(dǎo)致動(dòng)物繁殖機(jī)能紊亂。人們食用被其污染的食物會(huì)導(dǎo)致肝癌、睪丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病。此外，ZEN還具有免疫毒性、肝毒性、遺傳毒性，對(duì)腫瘤發(fā)生也有一定的影響。
[0003]ZEN去毒方法可分為物理、化學(xué)和生物三大類，其中生物法因具有效率高、特異性強(qiáng)以及對(duì)食品、飼料和環(huán)境沒有污染的特點(diǎn)，利用生物手段進(jìn)行ZEN的降解則成為近年來ZEN毒素降解研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7。
[0005]本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) NS7,其保藏編號(hào)為CGMCCN0.8727。
[0006]上述的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) NS7或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或其代謝產(chǎn)物或其菌懸液在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0007]上述的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) NS7或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或其代謝產(chǎn)物或其菌懸液在制備降解玉米赤霉烯酮產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降解玉米赤霉烯酮的方法。
[0009]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:用上述的銅綠假單胞菌NS7對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行降解處理。
[0010]上述方法中，所述降解處理為將上述的銅綠假單胞菌NS7的培養(yǎng)液和/或發(fā)酵產(chǎn)物和/或代謝產(chǎn)物和/或菌懸液與含有玉米赤霉烯酮的樣品和/或產(chǎn)品混合。
[0011]其中，含有玉米赤霉烯酮的樣品和/或產(chǎn)品具體為含有玉米赤霉烯酮的農(nóng)產(chǎn)品加工原料、飼料、食品及環(huán)境樣品和/或產(chǎn)品。
[0012]在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述降解處理為將銅綠假單胞菌NS7的培養(yǎng)液與玉米赤霉烯酮溶液混合；
[0013]所述玉米赤霉烯酮溶液的濃度為5ppm，該溶液由溶質(zhì)玉米赤霉烯酮和溶劑色譜純甲醇組成，且溶質(zhì)的終濃度為2ppm。
[0014]所述混合為混勻后28°C轉(zhuǎn)速為200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)的條件下振蕩培養(yǎng)72h。
[0015]銅綠假單胞菌NS7的培養(yǎng)液為將銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7 (CGMCC N0.8727)接種于液體NB培養(yǎng)基中，在溫度為37°C和轉(zhuǎn)速為200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)的條件下振蕩培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)產(chǎn)物為NS7培養(yǎng)液。
[0016]菌株NS7鑒定已于2014年I月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.8727，分類命名為銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa。
[0017]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7，經(jīng)過研究本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌NS7可高效降解玉米赤霉烯酮，該菌作為玉米赤霉烯酮降解的生物材料，無論在開發(fā)新的生物降解菌劑還是生物降解無菌制劑方面都具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為玉米赤霉烯酮降解效果的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0020]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021]NB液體培養(yǎng)基:由溶劑 和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶劑為水；蛋白胨在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為I %，牛肉膏在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.3%，NaCl在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.5%，所述％均為質(zhì)量體積百分比(g/100ml)。
[0022]NA固體培養(yǎng)基:在NB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂(瓊脂與液體培養(yǎng)基的比例為1.5g:100ml)，得到NA固體培養(yǎng)基。
[0023]MM液體培養(yǎng)基:由溶劑和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為Na2HP04、KH2PO4, MgSO4.7H20、NaNO3>(NH4)2SO4XaCl2.2Η20，溶劑為水；Na2HP04濃度為 0.16%，，KH2PO4 濃度為 0.1%,MgSO4.7Η20濃度為 0.05 %，NaNO3 濃度為 0.05 %，(NH4) 2S04 濃度為 0.05 %，CaCl2.2H20 濃度為
0.0025%，所述％均為質(zhì)量體積百分比(g/100ml)。
[0024]實(shí)施例1、菌的分離與鑒定
[0025]一、菌的分離
[0026]( 一)2013年6月，在超凈工作臺(tái)中，將采集自北京郊區(qū)的土壤樣品放在無菌蒸餾水中震蕩15分鐘制備菌懸液，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0027]( 二)將菌懸液用無菌蒸餾水進(jìn)行濃度梯度稀釋后涂布在NA培養(yǎng)基平板上，300C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，菌落布滿整個(gè)平板，用接種環(huán)挑取平板上形態(tài)、大小、顏色、透明度不同的菌株平板劃線純化，點(diǎn)接純化后的菌株應(yīng)用于玉米赤霉烯酮降解實(shí)驗(yàn)。得到的一株玉米赤霉烯酮降解能力強(qiáng)的菌株命名為NS7。
[0028]二、鑒定
[0029](一 )按照“伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)”(第八版)和“常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京:科學(xué)出版社，2001.2)中描述的方法，對(duì)菌株NS7進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下:
[0030]呈桿狀；革蘭氏陰性；硝酸還原:+ ;接觸酶:+ ;酪素水解:+ ;氧化酶:+ ;淀粉水解:-；4 % NaCl生長(zhǎng):+ ;檸檬酸利用:+ ;精氨酸雙水解酶:+ ;吲哚產(chǎn)生:_ ;色氨酸脫氫酶:_ ；H2S產(chǎn)生:-;脲酶:+ ；VP實(shí)驗(yàn):-;賴氨酸脫酸酶:_。
[0031]Biolog GEN III生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明，菌株NS7可以利用β -羥基_D，L-丁酸、甘氨酸-L-脯氨酸、N-乙酰-D-葡糖胺、a -D-葡萄糖、D-果糖、D-巖藻糖、肌苷、D-甘露醇、D-阿糖醇、甘油、D-果糖-6-磷酸、明膠、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、D-葡糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、奎寧酸、P-羥基苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、L-蘋果酸、吐溫40、Y-氨基丁酸、丙酸和乙酸。
[0032]Biolog GEN III化學(xué)敏感實(shí)驗(yàn)表明，菌株NS7對(duì)pH6.0、pH5.0、4% NaCl、二甲胺四環(huán)素、1%乳酸鈉、夫西地酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素SV、林可霉素、鹽酸胍、十四烷基硫酸鈉、萬古霉素、四唑紫、萘啶酸、亞碲酸鉀、氨曲南、丁酸鈉、四唑藍(lán)等所測(cè)定條件不敏感。
[0033](二)16S rDNA 試驗(yàn)
[0034]提取NS7的總DNA，以其為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為
1.4kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列如序列表序列I所示。
[0035]根據(jù)Gen-Bank 序列同源性比較，菌株 NS7 與 Pseudomonas aeruginosastrainfwzbl2 (GenBank登錄號(hào)KF208493.1)同源性為99%，初步判定該菌為假單胞菌屬細(xì)菌(Pseudomonas sp.)。
[0036]基于以上特 征，將菌株NS7鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。該菌株已于2014年I月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.8727,分類命名為銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa。
[0037]實(shí)施例2、銅綠假單胞菌NS7在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用
[0038]一、銅綠假單胞菌NS7培養(yǎng)活化
[0039]將銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) NS7 (CGMCC N0.8727)接種于液體 NB培養(yǎng)基中，在溫度為37°C和轉(zhuǎn)速為200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)的條件下振蕩培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)產(chǎn)物為NS7培養(yǎng)液，用于后續(xù)的玉米赤霉烯酮降解實(shí)驗(yàn)。
[0040]二、銅綠假單胞菌NS7對(duì)玉米赤霉烯酮降解作用
[0041]1、玉米赤霉烯酮的配制:
[0042]將5mg玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma- aldrich? ,貨號(hào)Z2125)溶解于25ml色譜純甲醇中獲得濃度為200ppm的玉米赤霉烯酮溶液。
[0043]2、降解玉米赤霉烯酮
[0044]實(shí)驗(yàn)組:取10 μ I濃度為200ppm的玉米赤霉烯酮溶液置于IOml離心管中，加入975 μ I新鮮麗培養(yǎng)基，使其終濃度為2ppm。加入10 μ I上述二得到的NS7培養(yǎng)液，充分混勻在28°C轉(zhuǎn)速為200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)的條件下振蕩培養(yǎng)72h，1000Og離心10min去除
細(xì)胞，收集上清液。
[0045]對(duì)照組:取10 μ I不接菌的NB培養(yǎng)基加入體積為Iml的含2ppm玉米赤霉烯酮的MM培養(yǎng)基作為對(duì)照組。
[0046]3、玉米赤霉烯酮的檢測(cè)[0047]首先使用甲醇:水(；6:4)溶液對(duì)上清液進(jìn)行萃取,然后使用免疫親和凈化柱對(duì)樣品殘留毒素進(jìn)行凈化提取(方法參照免疫親和柱使用說明書)；最后用HPLC-T0F-MS對(duì)凈化提取得到的樣品進(jìn)行檢測(cè)。
[0048]HPLC檢測(cè)條件為流動(dòng)相乙腈:水=50:50 ;流速0.2ml/min ;色譜柱C18150mmX4.6mm，0.5 μ m ;激發(fā)波長(zhǎng) 274nm，檢測(cè)波長(zhǎng) 316nm ;柱溫 30°C ;進(jìn)樣量 20 μ I。
[0049]玉米赤霉烯酮降解率(％ )=(對(duì)照組殘留玉米赤霉烯酮含量-處理組殘留玉米赤霉烯酮含量)/對(duì)照組玉米赤霉烯酮含量X100。
[0050]結(jié)果如圖1所示，A:玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品；Β:對(duì)照組；C:實(shí)驗(yàn)組；
[0051]對(duì)照組殘留玉米赤霉烯含量為1.92±0.08ppm ；
[0052]實(shí)驗(yàn)組殘留玉米赤霉烯含量0.14±0ppm ；
[0053]結(jié)果表明，N S7對(duì)玉米赤霉烯酮有較好的降解效果，降解率92.75±0.33%。
【權(quán)利要求】
1.一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7,其保藏編號(hào)為 CGMCCN0.8727。
2.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) NS7或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或其代謝產(chǎn)物或其菌懸液在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) NS7或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或其代謝產(chǎn)物或其菌懸液在制備降解玉米赤霉烯酮產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.一種降解玉米赤霉烯酮的方法，包括如下步驟:用權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌NS7對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行降解處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特性在于:所述降解處理為將權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌NS7的培養(yǎng) 液和/或發(fā)酵產(chǎn)物和/或代謝產(chǎn)物和/或菌懸液與含有玉米赤霉烯酮的樣品和/或產(chǎn)品混合。
【文檔編號(hào)】A62D3/02GK103981134SQ201410204176
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】趙月菊, 劉陽, 婭娃·米妮·埃爾迪·富麗, 蘭茨納·桑格, 邢福國(guó), 周露, 王龑 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所