專利名稱：：溶菌酶-殼聚糖膜的制作方法
技術領域：
：本公開是特別適用于保護食品的抗微生物膜。
背景技術：
：在固體或半固體食品中，微生物生長主要發(fā)生在表面上。熱處理和化學防腐劑是最廣泛使用的保持微生物安全性和食物質(zhì)量的方法?？刮⑸镄约訌姷陌b膜通過抗微生物物質(zhì)從載體膜結構向食物表面的受控釋放，來確保食物表面的微生物安全性。此外，消費者對合成的化學性食物防腐劑的顧慮也導致對替代的更"有益于消費者"的可食用保護膜的關注日益增加。溶菌酶是在許多自然體系中發(fā)現(xiàn)的裂解酶，已得到了充分研究。它是小而穩(wěn)定的酶，具有已研究清楚的維度結構和序列。溶菌酶在食物防腐中具有潛在的用途，因為它在范圍很廣的pH和溫度條件下都具有穩(wěn)定性。但是，它對革蘭氏陰性菌的抗微生物效用有限，限制了它在食品工業(yè)中的應用。殼聚糖是己知的也表現(xiàn)出抗微生物活性的成膜生物聚合物。對于具有增強的抗微生物活性且機械性能沒有明顯降低的膜，存在著持續(xù)的需求。概述本公開的一個方面涉及一種復合膜，其包括結合在殼聚糖聚合物基質(zhì)內(nèi)的溶菌酶。在另一個方面，公開了一種膜，其包含殼聚糖，以及以殼聚糖的重量計大約10到大約200重量百分比的溶菌酶。還公開了制造膜的方法，包括在產(chǎn)生成膜溶液或分散液的水性介質(zhì)中溶解或分散殼聚糖和溶菌酶；將成膜溶液或分散液施加到基體表面；并將成膜溶液或分散液轉變?yōu)槟?。在特別有用的應用中，該膜是食品的抗微生物保護劑。圖1是描繪溶菌酶從溶菌酶-殼聚糖復合膜基質(zhì)向0.15M磷酸鹽緩沖液的釋放模式作為時間函數(shù)的圖。N=6;L0-0。/。溶菌酶(w/w殼聚糖)；L20=20%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L100=100%溶菌酶(w/w殼聚糖)。膜厚度為72.6±8.2pm。圖2A和2B是描繪溶菌酶-殼聚糖復合膜對抗BHI肉湯中的大腸桿菌(E.coli)(2A)和MRS肉湯中的糞鏈球菌(S.faecalis)(2B)效果的圖。N-6;對照=沒有膜；L0=0%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L20=20%溶菌酶(w/w殼聚糖)；1^60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)；LIOO-100%溶菌酶(w/w殼聚糖)。圖3A-3D是在1,000X放大倍數(shù)下觀察到的溶菌酶-殼聚糖復合膜表面的掃描電鏡照片;L0(3A)，L20(3B)，L60(3C)，L100(3D)。L0=0%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L20=20%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L100=100%溶菌酶(w/w殼聚糖)。圖4A-4D是在1,000X放大倍數(shù)下觀察到的溶菌酶-殼聚糖復合膜橫截面的掃描電鏡照片；L0(4A)，L20(4B)，L60(4C)，L100(4D)。L0=0%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L20=20%溶菌酶(w/w殼聚糖)；6L60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L100=100%溶菌酶(w/w殼聚糖)。圖5是描繪殼聚糖和殼聚糖-溶菌酶(CL)復合獨立膜在10°C保存期間對抗馬蘇里拉奶酪上的單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)效果的圖(對照未應用CL膜；L0=0%溶菌酶(W/W殼聚糖)膜；L60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)膜)。圖6是描繪殼聚糖和CL復合層合體在10°C保存期間對抗馬蘇里拉奶酪上的單核細胞增生李斯特菌效果的圖(對照未應用CL膜；L0=0%溶菌酶(w/w殼聚糖)膜；L60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)膜)。具體說明為了容易理解，下面對本文使用的下列術語加以詳細描述"環(huán)境室內(nèi)條件"是指大約10°C到大約40°C的室溫，通常為大約20。C到大約25。C，壓力約為l個大氣壓，以及含有一定量水分的氣氛。"類似物"是化學結構與母體化合物不同的分子，例如同系物(化學結構中的增量不同，例如烷基鏈的長度不同)、分子片段、一個或多個官能團不同的結構、或離子化的變化。"抗微生物有效量"是抗微生物組分或組分的混合物與缺乏該抗微生物組分的對照樣品相比，足以抑制至少一種微生物在樣品中的生長到達統(tǒng)計學顯著性程度的量，優(yōu)選抑制至少大約25%、更優(yōu)選至少大約50%和最優(yōu)選完全抑制微生物的生長。"殼聚糖"(也稱為聚-(1—4)-卩-D-葡糖胺)包括下面更詳細描述的脫乙酰幾丁質(zhì)(幾丁質(zhì)也稱為p-(l-4)-聚-N-乙?；?D-葡糖胺)及其鹽在。貝殼類和甲殼類的殼是幾丁質(zhì)的通常來源，而殼聚糖從幾丁質(zhì)衍生。"膜"包括涂層，并且膜在其施加或在其上形成的食品表面上可以是不連續(xù)的或基本連續(xù)的。例如，"膜"包括可以包裹在食品上的獨立膜以及通過噴霧、浸漬、滴落或類似的技術在食品上形成的涂層。"抑制"意指本文公開的膜將在一定時間段內(nèi)減慢或終止某些微生物的生長或增殖。"溶菌酶"是指一類酶家族，其催化細菌細胞壁某些粘多糖的水解，特別是N-乙?；谒崤cN-乙?；咸前分g的p(l-4)糖苷鍵，并導致細菌溶解?？梢栽诒疚闹惺褂玫娜芫赴ㄒ韵略斒龅奶烊淮嬖诘娜芫福铣傻娜芫敢约爸亟M的溶菌酶。"微生物"用于指顯微生物體或物質(zhì)，包括真菌和細菌生物體，其能夠感染人類或動物和/或?qū)е率澄锔瘮』蚱渌泻Φ氖澄锓纸饣蜃冑|(zhì)。術語"抗微生物"因此用在這里指殺死或者抑制真菌和/或細菌有機體的物質(zhì)或藥劑。以上提供的術語說明只為了幫助讀者，不應解釋為具有小于本領域普通技術人員所理解的范圍或者作為對所附權利要求范圍的限制。單數(shù)術語包括復數(shù)指示物，除非文中明確地另有指示。同樣，單詞"或"旨在包括"和"，除非文中明確地另有指示。單詞"包含"指的是"包括"。除非另有指示，化學命名組分的描述是指添加到說明書中指明的任何組合中時的組分，但是不必排除混合物的組分一旦混合后之間的化學相互作用。本文中公開的膜包括至少一種殼聚糖和至少一種溶菌酶，二者都是可大量獲得的可再生材料。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于殼聚糖的膜基質(zhì)能夠有效攜帶高濃度溶菌酶，產(chǎn)生溶菌酶-殼聚糖復合膜。溶菌酶能夠以受控的方式從聚合殼聚糖膜基質(zhì)釋放，并保持其對細菌細胞壁基體的溶解8活性。例如抗微生物組分溶菌酶(和在某些情況下的殼聚糖)能夠從膜釋放并遷移到食品結構中。這樣的復合膜與單用殼聚糖或單用溶菌酶相比，對于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌具有增強的協(xié)同抗微生物活性，同時不降低膜的防潮性質(zhì)。在膜的某些實施例中，所有組分對于人類或動物的安全食用來說，都是可食的，并且可以從可再生來源獲得。此外，該膜是可生物降解的。溶菌酶基本均勻地分布在殼聚糖分子形成的整個聚合網(wǎng)絡中。溶菌酶可以分布在殼聚糖網(wǎng)絡內(nèi)的微粒形式存在，其中溶菌酶分子與殼聚糖分子形成氫鍵和/或范德華相互作用。殼聚糖是豐富的、可再生的和無毒的聚合物，其與許多其他物質(zhì)生物相容。膜可以采用任何形式或級別(例如，食品級或醫(yī)用級)的殼聚糖來制造。例如，殼聚糖的粘均分子量可以從大約20到大約2,000kDa，脫乙酰作用的程度可以從大約70到大約90%。根據(jù)生產(chǎn)膜的一個示例性方法，殼聚糖成分(或不同殼聚糖的混合物)起初溶解于水性酸溶液中，引起殼聚糖鹽的形成。在膜中存在的形成的殼聚糖鹽例子包括殼聚糖乙酸鹽、殼聚糖山梨酸鹽、殼聚糖丙酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖谷氨酸鹽、殼聚糖苯甲酸鹽、殼聚糖檸檬酸鹽、殼聚糖馬來酸鹽、殼聚糖乙醇酸鹽、殼聚糖丙烯酸鹽、殼聚糖琥珀酸鹽、殼聚糖草酸鹽、殼聚糖抗壞血酸鹽、殼聚糖酒石酸鹽、及其混合物。膜中殼聚糖的量可以根據(jù)所需的膜性質(zhì)而變化。例如，以膜的固體總重量計，膜可以含有大約25到大約90、更尤其是大約35到大約65重量％的殼聚糖。溶菌酶是天然的抗微生物多肽，其存在于各種各樣生物體中，包括病毒、鳥類、哺乳動物和植物。在人類中，溶菌酶出現(xiàn)在脾、肺、腎、白血細胞、血漿、唾液、乳汁、淚液和軟骨中。因此，溶菌酶可以從人類的乳汁、淚液、唾液和鼻粘液中分離。它出現(xiàn)在母牛的乳汁和初乳中。也可以從花椰菜汁中分離溶菌酶。但是，在工業(yè)規(guī)模上提取溶菌酶的最重要來源是雞蛋清。溶菌酶還稱為胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁酰水解酶。人類形式的也能夠以重組方式生產(chǎn)。在本文公開的膜中，溶菌酶的有效量可以根據(jù)溶菌酶的來源而變化。某些比其它的更有效，雞溶菌酶的活性小于人類溶菌酶。膜中溶菌酶的抗微生物有效量也可以根據(jù)所需的膜性質(zhì)而變化。尤其是，溶菌酶的最小量應當足以提供抗微生物活性。溶菌酶的最大量不應高到明顯降低膜的機械或透水汽性質(zhì)。例如，以殼聚糖的重量計，溶菌酶可以在膜中存在的量為大約10到大約200重量％、更特別是大約10到大約100重量％，并且最特別的是大約30到大約90重量％。換言之，膜可以包含的溶菌酶量最高為殼聚糖量的兩倍。如果溶菌酶的量超過殼聚糖重量的200%，則膜可能變得非常脆并且機械性能差。膜的任選成分是至少一種增塑劑，它可以是或不是可再生的材料。增塑劑能夠降低膜的脆性，并增加膜的撓性和抗沖擊性。示例性的增塑劑包括甘油、山梨糖醇、丙二醇(propyleneglycol)、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(例如，PEG300和PEG400)、酒石酸二丁酯、丙二醇(propanediol)、丁二醇、乙?；母视鸵货?、及其混合物。膜中增塑劑的量可以根據(jù)所需的膜性質(zhì)而變化。特別是，由于溶菌酶的成膜性質(zhì)弱，增塑劑的量應隨著溶菌酶濃度的增加而增加。例如，以殼聚糖的重量計，膜可以含有大約1到大約50、更特別是大約20到大約30重量。/。的增塑劑。膜的另一種任選成分是至少一種交聯(lián)劑，其可以是或不是可再生的材料。交聯(lián)劑能夠改進膜的防水汽性質(zhì)，并減低膜的水溶性。示例性的交聯(lián)劑包括戊二醛、甲醛、乙二醛、雙醛淀粉、含有多價離子(例如，鈣和鎂陽離子)的物質(zhì)、及其混合物。膜中交聯(lián)劑的量可以根據(jù)所需的膜性質(zhì)而變化。例如，基于殼聚糖的重量，膜可以含有大約1到大約20、更特別是大約5到大約10重量％的交聯(lián)劑。其它任選成分包括抗氧化劑、其它抗微生物劑、調(diào)味劑/著色劑、疏水劑、營養(yǎng)劑和類似的添加劑。為了改善防水性質(zhì)，疏水添加劑例如脂肪酸(即，油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸)、乙?；母视王?、蠟(即，巴西棕櫚蠟、蜂蠟和石蠟)、和油(即，礦物油和植物油)可以殼聚糖重量的大約20到大約100%的濃度范圍摻入到膜組合物中。營養(yǎng)劑，例如礦物質(zhì)和維生素可以摻入到膜基質(zhì)以提高包裹或涂層產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。例如，可以摻入鈣、鋅和維生素E以提高包裹或涂層產(chǎn)品的健康益處(參見，Park,S.-I.和Zhao,Y.2004.IncorporationofHighConcentrationofMineralorVitaminintoChitosan-BasedFilms.(將高濃度礦物質(zhì)或維生素摻入到基于殼聚糖的膜中)JournalofAgriculturalandFoodChemistry.2004，vol.52,pp.1933-1939)。膜可以由任何成膜技術制造，包括流延(即，形成獨立膜)、浸漬、噴霧、涂刷、降膜和類似的方法。根據(jù)一個變體，所有的膜成分在液體混合物(即，成膜混合物)中混合在一起，液體混合物接著形成膜。例如，液體混合物可以基本均勻地分布在基體表面上，然后干燥形成膜。在特定實施例中，膜的成分是水溶性的或可分散的或修飾的，以變得有水溶性或可分散(即增溶的)。成分混合在一起成為水性溶液(即，水是載體溶劑或介質(zhì))，然后在環(huán)境室溫和濕度下風干，形成膜?；蛘?，膜的成分能夠在有機溶劑載體中溶解。膜的成分可以以任何次序混合在一起。成膜混合物應當相對容易制造和使用。成膜混合物的粘度應當足夠低，以允許將混合物施加和鋪展到基體上，而不需要任何強力施加技術或設備。例如，成膜混合物的粘度范圍可以從大約10cps到大約200cps。殼聚糖在水性有機酸或無機酸中可溶。可溶的水性有機酸包括乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、檸檬酸、馬來酸、乙醇酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗壞血酸、酒石酸及其混合物。通常，11有機酸是非常稀的，例如，根據(jù)具體類型的酸，濃度為大約0.5到大約5、更特別是大約1到大約2重量％。一般來說，預定量的殼聚糖在環(huán)境室溫下溶于水性有機酸，產(chǎn)生殼聚糖鹽溶液?；旌衔锏膒H可以是大約2.5到大約6.3，更特別是大約5.0到大約6.0。基于水的重量和根據(jù)膜終產(chǎn)物中殼聚糖的所需量，殼聚糖在水性酸中的溶解量可以從大約1到大約5重量％、更特別是大約2重量％。殼聚糖鹽溶液也可以包含任何上述的任選成分，例如增塑劑。然后，將溶菌酶添加到殼聚糖鹽溶液中。溶菌酶可以得自不同供應商的純凈級、工業(yè)級、食品級或藥品級溶液的形式添加?；蛘?，溶菌酶儲存液可以通過將預定量的溶菌酶溶解在蒸餾水中而制備?；谒闹亓亢透鶕?jù)膜終產(chǎn)物中溶菌酶的所需濃度，溶菌酶溶于水的量可以從大約5到大約2015重量％、更特別是大約10到大約。如果溶菌酶的量太大，成膜溶液可能變成稀得不合格，可不利地影響膜性質(zhì)。溶菌酶儲存液也可以包含任何上述的任選成分，例如增塑劑。殼聚糖鹽溶液和溶菌酶儲存液在環(huán)境室內(nèi)條件下混合在一起，產(chǎn)生成膜溶液。或者，可以在最高大約50°C的溫度下加熱成膜溶液或?qū)⑵浼訜岬皆摐囟龋约訌娙芙?。選擇殼聚糖鹽溶液的量相對于溶菌酶儲存液的量，以提供所需濃度的溶菌酶。所產(chǎn)生的水性成膜溶液的pH可以被調(diào)整到大約5到大約6的范圍，通過提供弱酸性條件來保護食物。膜能夠以任何方法施加到食品上。通過將成膜溶液施加到基體上，從成膜溶液形成膜。例如，成膜溶液能夠噴霧或涂刷到表面上，以形成保護性涂層，或者可以將食品浸漬到成膜溶液中?；蛘?，流延膜能夠通過包裹或類似的方法，施加到食品表面上。溶液涂布的基體可以在大約25°C到大約65°C的溫度下加熱大約2小時到大約48小時，以形成膜。在涉及直接涂布食品的變體中，干燥時間通常較短(例如，強制通風下大約5到大約60分鐘)。殼聚糖-溶菌酶復合膜本身就可以作為獨立膜使用，或者能夠與其它膜組合形成多層的層合結構而使用。例如，殼聚糖-溶菌酶膜能夠被層壓或布置在用于食物包裝的其他類型膜(或膜層合體)的食物接觸表面上。其它類型的膜能夠起到殼聚糖-溶菌酶膜的支撐體的功能。這樣的層合體利用了殼聚糖-溶菌酶復合膜的抗微生物性質(zhì)以及其它類型膜的阻擋和機械性質(zhì)。其它食物包裝膜的例子包括由聚烯烴聚合物(例如，聚乙烯(高密度PE和低密度PE))、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物(例如，聚對苯二甲酸乙二醇酯)、禾口/或乙烯基聚合物(例如，乙烯乙酸乙酯，聚氯乙烯，聚偏氯乙烯)制成的單層或多層層合結構。膜的任何層可以是金屬化的膜，其中A或金屬氧化物置于膜表面。膜的抗微生物活性的持續(xù)時間取決于環(huán)境條件。在高濕條件下，涂層組分遷移到食品中的速率會增加，從而減少了抗微生物活性的有效持續(xù)時間。在某些實施例中，在環(huán)境室內(nèi)條件下，膜可以保持完整(即膜保持其顏色、維度和機械強度)最多大約四個月。在其它實施例中，抗微生物活性能夠保持最多大約三周。施加于食品表面的涂層量應當足以在表面上形成基本連續(xù)的膜。該量根據(jù)各種因素而改變，包括食品的種類、施加方法和所需的性質(zhì)，但是范圍為大約2到大約30、更特別是大約5到大約10mg/ci^基體表面積。根據(jù)某些實施例，獨立膜的厚度應當為至少大約20nm、更特別是大約30到大約80nm。低于20pm的厚度表明涂層直接在食物表面上形成(例如，通過浸漬)。設計本文公開的膜的具體目的是為了抑制食物表面上的病原性和腐敗性細菌和真菌。示例性的細菌包括植物乳桿菌(Lactobacilusplantamm)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、沙門氏菌屬(Salmonellaspp)禾口假單胞菌屬(Pseudomonass卯)。示例性的真菌包括黑曲霉菌(Aspergillusniger)、核果褐腐菌(Monoiliniafmcticola)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)禾口根霄屬(Rhizopusspp.)能夠按照本文所述保護的食品通常是那些容易被微生物生長、脫水(失水)和/或由于呼吸作用而成熟導致質(zhì)量劣化的食品。通常，奶酪(片狀或塊狀)和加工過的肉制品(火腿、熱狗、香腸等)可以用制成的膜包裹或用成膜溶液涂布。容易腐爛的水果和蔬菜日用品，例如漿果、櫻桃、葡萄、蘋果、梨、油桃、李和杏可以被涂層以增強微生物安全性并延長產(chǎn)品的保存期。膜表現(xiàn)出適宜的透水汽性質(zhì)。例如，膜的透水汽性可以從大約1到大約300、更特別是大約IO到大約100gmm/m2dkPa。膜的透水汽性和機械性質(zhì)可以取決于成膜過程中的相對濕度(RH)，因為水可以作為殼聚糖膜中的增塑劑。在低RH條件下(例如，低于40%)，膜是相對良好的氣體阻擋材料，并具有改善的防水性質(zhì)。在50"/。RH下，膜可以表現(xiàn)出中等機械性質(zhì)(例如，拉伸強度10到100MPa和破裂時的延長度為10到50%)，與可商購的低密度聚乙烯(LDPE)膜相當。膜的防水性質(zhì)能夠通過加入液體材料加以改善。實施例下面描述的具體實施例是為了說明的目的，不應被視為限制了所附權利要求的范圍。實施例1材料使用VansonInc.(Redmond,WA)的蝦殼聚糖，不加以進一步純化。蝦殼聚糖的特征在于1。/。w/w水性乙酸溶液的25。C粘度為11cps并且89.9%脫乙?；?。雞蛋清溶菌酶從EiprodukteGmbHundCo.(德國)獲得。USP(美國藥典)級甘油從EMScience(Darmstadt,德國)獲得。試劑級冰乙酸從J.T.Baker(Phillipsburg,NJ)獲得。革蘭氏陽性糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)ATCC14508和革蘭氏陰性B型大腸桿菌用作試驗生物體。從SigmaChem.Co.(St.Louis,MO)獲得凍干溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)用于測量溶菌酶釋放模式。腦心浸液(BHI)肉湯、MRS肉湯和瓊脂從DifcoofBecton,DickinsonandCompany(Sparks,MD)購買。制備成膜溶液成膜溶液(FFS)通過混合殼聚糖溶液與溶菌酶溶液制成。殼聚糖溶液通過將2wt。/。殼聚糖溶解在lwt。/。乙酸溶液中并加入25。/。甘油(w/w殼聚糖)而制備。溶菌酶溶液通過將10wt%溶菌酶溶解在蒸餾水中并加入25。/。甘油(w/w溶菌酶)而制備。溶菌酶溶液以0、20、60或100%(每干重殼聚糖的溶菌酶干重百分比)的濃度混合到殼聚糖溶液中。產(chǎn)生的混合物在ModelPT10-35(KinematicaAG,瑞士)中以3,000rpm勻化60秒。成膜溶液的pH用5N氫氧化鈉調(diào)節(jié)到5.2。所有的樣品溶液通過尼龍篩過濾，以除去不溶的殘留物并在真空下脫氣(Modd0211-P204,GastMfg.Corp.,BentonHarbor,MI)。膜形成將計算好量的每種脫氣的成膜溶液流延在平坦的特氟龍涂布的玻璃板上，面積為260x260mm,以達到大約70的均勻膜厚度。室內(nèi)條件下(24±2。C和40±5%相對濕度)干燥2天后，將干燥的膜從板上剝離，并切成片用于分析。尺寸為25x25mm的膜片段進行密度和水分含量評估。尺寸為25x86mm的膜片段用于機械測試。尺寸為70x70mm的膜片段用于透水汽性測試。在所有測量之前，膜片在設定為25°C禾B50y。相對濕度的環(huán)境室中(ModelT10RS,TenneyEnvironmental,Williamsport,PA)調(diào)節(jié)至少2天。測量膜厚度、密度和水分含量在25°C和50%下調(diào)節(jié)2天后，使用No.293-766-30型千分卡尺(MytutoyoManufacturingCo.Ltd.,日本)，在每張膜樣本的5個隨機部位測量膜厚度。膜密度通過膜重量除以膜體積計算。膜的水分含量通過將膜樣本在強制通風爐(PrecisionScientificInc.,Chicago,IL)中于105。C干燥18小時而進行重量測定。水分含量的百分比濕基計算。溶菌酶釋放分析溶菌酶-殼聚糖膜樣本的大約0.03g樣品浸沒在小瓶中的20ml0.15M磷酸緩沖液(pH6.2)中，并用震蕩器(NewBrunswickScientificCo.Inc.,NewBrunswick,NJ)在室溫下以50rpm振搖。凍干溶壁微球菌的儲存底物溶液在0.15M磷酸鹽緩沖溶液中制備(450nm下的吸光度為0.65)。在O、0.25、1、4、12、24和48的時間間隔取1混合物樣品。這些樣品與2.5ml溶壁微球菌底物在比色杯中混合，并立即用ShimadzuUV-Vis2100分光光度計(ShimadzuCo.,日本)在25°C讀數(shù)40秒。溶菌酶的活性率通過測量溶液在450nm處吸光度的降低而確定，這反映了細胞壁底物的水解。光密度降低表示為每分鐘Mille-吸光度單位(Mabs/min)的變化。根據(jù)0.15M磷酸緩沖液中標準化溶菌酶濃度的回歸線，將活性單位轉化為mg/1溶菌酶，接著轉化為每g干燥膜釋放的g溶菌酶?？刮⑸锘钚源竽c桿菌和糞鏈球菌在37°C下分別于腦心浸液(BHI)肉湯和MRS肉湯中生長過夜。1ml這些微生物的樣品用99ml同樣的肉湯稀釋，獲得大約107CFU/ml的接種物。大約0.03g的每種膜樣本放在培養(yǎng)皿(直徑85mm)中，然后向其中注入10ml接種物。不暴露于膜的接種物用作對照。培養(yǎng)皿在室溫下以50RPM振搖。在0、6、12和24小時取樣，用稀釋瓶(Dilu-LockIIButterfield，sBuffer,HardyDiagnostics,SantaMaria，CA)稀釋，雙份鋪板。BHI和MRS瓊脂分別用于大腸桿菌和糞鏈球菌的鋪板。在計數(shù)菌落數(shù)量之前，每塊板在37。C下溫育48小時。測量透水汽性按照ASTME96(ASTM2000a)，透水汽性(WVP)在25°C和100/50%RH梯度下用杯法測定。Plexiglas⑧制成的測試杯，內(nèi)徑為57mm，內(nèi)部深度為15mm，每個中放入llml蒸餾水。水和膜之間的距離為10.7mm，有效膜面積為25.5cm2。測試杯組件放在溫度和濕度控制室中(25。C和50%RH)。每個杯組件用電子天平(精確度為0.0001g)每小時稱重，共計6小時，以記錄水分隨時間的丟失。然后用WVP校正方法(Gennadios等1994)，將WVP針對膜和水表面之間的停滯空氣間隙阻力進行校正。機械性質(zhì)膜的機械性質(zhì)用質(zhì)構分析儀(TA.XT2i，TextureTechnologiesCorp.,Scarsdale,NY)來測定。在將膜樣本從室中取出后，立即進行所有性質(zhì)的測量，使水分變化最小。用ASTMD882法(ASTM2000b)測量拉伸強度(TS)和破裂時的延長百分比(EL)。每個膜樣本安裝在質(zhì)構分析儀的夾具(TA96)之間，測試時夾具(grip)最初分開50mm且十字頭速度為1mm/s。TS值報告為測量到的最大負荷(N)除以膜橫截面積(mm2)，單位為MPa。EL值通過記錄到的破裂時的延長除以樣本的最初長度并乘以100。微結構膜的表面和內(nèi)部結構用掃描電子顯微鏡(AmRay3300FEfieldemissionSEM,AmRay,Bedford,MA)評估。膜片安裝到鋁短棒(stub)上并用濺射鍍膜儀(EdwardsmodelS150BSputterCoater;BOCEdwardsVacuum,Ltd,UK)涂覆金-鈀合金。每個涂層的樣品用5kV電壓和與樣品呈法向方向的電子束來檢査。統(tǒng)計分析17所有試驗都三份重復進行。在每次重復中，兩種膜樣本用于溶菌酶釋放和抗微生物活性測量；5個膜樣品用于密度、水分含量和WVP測量；以及10個膜樣品用于機械性質(zhì)測量。在用SAS(StatisticalAnalysisSystemInstituteInc.,Cary，NC)檢測不同膜之間的差異時，應用一般線性模型(GLM)程序。所有的處理都進行用于方差分析(ANOVA)的PROCGLM。進行PROCREG以發(fā)現(xiàn)對所測量的反應的擬合回歸模型。Duncan多范圍檢驗用于多個平均值的比較。差異的顯著性規(guī)定為p<0.05。結果-膜形成和基本物理性質(zhì)當將溶菌酶摻入殼聚糖溶液中時，在任何成膜溶液中均未觀察到沉淀。這表明乙酸溶解的殼聚糖溶液與水溶性溶菌酶的相容性良好。所有干燥的膜容易從流延板上剝離。通過流延計算好量的成膜溶液，所有類型膜的厚度被認真控制在72士11pm范圍內(nèi)。這確保了沒有發(fā)現(xiàn)膜厚度的統(tǒng)計學差異(p〈0.05)。下表1顯示了每個測試膜(11=15)的密度和水分含量。純殼聚糖膜(LO)的密度和水分含量都最高。所有膜之間的密度都沒有統(tǒng)計學差異。隨著溶菌酶濃度升高，水分含量趨于降低。盡管不受任何理論的約束，但是這可能是因為殼聚糖和溶菌酶都含有大量-OH和-NH2基團而產(chǎn)生的。氫鍵是這些基團之間主要的吸引力。向殼聚糖鏈中加入溶菌酶分子，通過增加殼聚糖和溶菌酶分子之間的相互作用，例如氫鍵和范德華相互作用，而改變了殼聚糖分子的結構構型。溶菌酶同時含有親水和疏水氨基酸。在成膜期間，可以通過在溶菌酶折疊中發(fā)揮重要作用的相同疏水相互作用，用親水性氨基酸側鏈朝著水性成膜溶液突出而形成溶菌酶的疏水核心(Proctor和Cunningham1988)。膜基質(zhì)中的這些疏水側鏈可以影響溶菌酶-殼聚糖復合膜的水分含量。18表1:溶菌酶-殼聚糖復合膜的組成和物理性質(zhì)_<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>膜厚度=72.6±8.2(mi;L0=0%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L20=20%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L100=100%溶菌酶(w/w殼聚糖)2甘油的重量％是以成膜溶液中殼聚糖重量和溶菌酶重量之和計結果-溶菌酶的釋放從膜基質(zhì)釋放的溶菌酶量顯示在圖1中。沒有溶菌酶的殼聚糖膜(LO)沒有顯示出任何對凍干溶壁微球菌的溶胞活性，而這些活性隨著結合到膜基質(zhì)中的溶菌酶濃度的增加而成比例增加。當溶菌酶-殼聚糖復合膜放在磷酸鹽緩沖溶液中時，由于水分子擴散進入聚合的膜結構，導致膜溶脹，引起結合的溶菌酶從膜基質(zhì)釋放到水性環(huán)境中。溶菌酶從膜基質(zhì)隨時間對數(shù)釋放。溶菌酶從膜基質(zhì)的釋放與聚合物基質(zhì)中的初始溶菌酶濃度呈線性相關。48小時后，溶菌酶從每種膜樣本釋放量的百分比，L20、L60和L100膜分別為大約65%、79%和76%。24小時后，溶菌酶從每種膜樣本釋放量的百分比，L20、L60和L100膜分別為大約48%、75%和71%。12小時后，溶菌酶從每種膜樣本釋放量的百分比，L20、L60和L100膜分別為大約43%、60%和56%。1小時后，溶菌酶從每種膜樣本釋放量的百分比，L20、L60和L100膜分別為大約14%、26%和25%。在半潮濕食物中，微生物生長主要發(fā)生在食物表面上。因此，將食物表面上抗微生物劑的所需水平保持受控和延遲的擴散，對于延長食物的保存期是有益的。這些結果表明結合到殼聚糖膜中的溶菌酶能夠以受控的方式從膜基質(zhì)釋放，并保持對細菌細胞壁底物的溶解活性。例如，在大約24小時后，多達大約30%的溶菌酶尚未從膜釋放。在大約48小時后，多達大約20%的溶菌酶尚未從膜釋放。結果-抗微生物活性圖2A和2B顯示了大腸桿菌和糞鏈球菌在用菌酶-殼聚糖膜處理的肉湯中的存活。溶菌酶-殼聚糖復合膜對大腸桿菌的抗微生物功效隨著溶菌酶濃度的增加而增加，L100膜除外。在溫育24小時后，在有L0、L20或L60膜的BHI肉湯中，細胞數(shù)量分別減少了大約1.8、2.3禾口2.7個對數(shù)級(logcycle)。同時，用L100膜和對照，細胞數(shù)量分別增加了大約0.1和2.3對數(shù)級。L100膜抑制生長最多6小時，然后細胞群恢復。含有低濃度溶菌酶(L0和L20膜)的溶菌酶-殼聚糖復合膜沒有有效抑制糞鏈球菌生長。對于L0和L20膜，在24小時暴露期間，糞鏈球菌菌群輕度增加。反之，在包含L60和L100膜的肉湯中，觀察到糞鏈球菌的對數(shù)分別降低了3.3和3.8。在對照樣品的24小時之后，出現(xiàn)大約1.1對數(shù)級的增加。對革蘭氏陽性糞鏈球菌的抗微生物活性隨著溶菌酶濃度的增加而增加，可能表示溶菌酶對于這種效應起主要作用。殼聚糖對大腸桿菌的抗微生物活性已由Shahidi(1999)進行綜述。純殼聚糖膜(LO)顯示出對革蘭氏陰性的大腸桿菌的殺菌作用，但抑制革蘭氏陽性糞鏈球菌生長的作用很少。在L60膜中觀察到了對這兩種細菌的最穩(wěn)定的抑制趨勢。L100膜恢復大腸桿菌菌群令人疑惑，可以通過溶菌酶-殼聚糖相互作用的增加來解釋。從膜基質(zhì)釋放的殼聚糖分子可堆疊在細胞表面上，或與溶菌酶相互作用以形成溶菌酶-殼聚糖復合體。當過量的溶菌酶暴露于細胞懸液時，溶菌酶-殼聚糖相互作用的概率可能增加。這些相互作用的增加可能干擾殼聚糖與細胞表面之間的反應。在含有最高溶菌酶濃度的殼聚糖膜(L100)中，展現(xiàn)出針對糞鏈球菌的最強抗微生物活性，而對于大腸桿菌則是帶有60%溶菌酶濃度(w/w殼聚糖)的膜抗微生物活性最強。這些結果表明，通過將溶菌酶結合到殼聚糖膜基質(zhì)中，能夠增強殼聚糖的抗微生物活性。此外，溶菌酶與殼聚糖分子的比例是影響溶菌酶-殼聚糖復合膜的抗微生物性能的重要因素。結果-透水汽性膜的透水汽性(WVP)沒有受到摻入試驗濃度水平溶菌酶的顯著影響(p〈0.05)(見下表2)。雖然不受任何理論的局限，但該結果可以通過兩個相反因素的作用來解釋。殼聚糖膜和許多其它蛋白或多糖可食膜一樣，由于它們的親水性質(zhì)，表現(xiàn)出相對低的防水性質(zhì)。殼聚糖膜的防水性質(zhì)能夠通過加入疏水材料例如脂肪酸來改善。由于溶菌酶含有疏水氨基酸側鏈。溶菌酶-殼聚糖復合膜的親水性隨著溶菌酶的加入而降低。但是，殼聚糖的緊湊結構，特別是其結晶部分，可能被溶菌酶分子破壞，導致透過膜基質(zhì)的WVP增加。這兩種相反的因素可以使帶有不同溶菌酶濃度的溶菌酶-殼聚糖復合膜的WVP性質(zhì)中的改變被抵消或最小化。表2.溶菌酶-殼聚糖復合膜的透水汽性<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結果-機械性質(zhì)膜的拉伸強度(TS)和破裂時的延長百分比(EL)隨著溶菌酶加入而明顯降低(pX).05)(見下表3)。隨著溶菌酶濃度增加，TS和EL均降低，這能夠通過下面的線性方程來描述TS=-O.lOd+16.70，R2=0.96EL=-0.32'd+59.89，R2=0.99其中Q是溶菌酶-殼聚糖膜基質(zhì)中的溶菌酶濃度百分比(％,w/w殼聚糖)。此外，還發(fā)現(xiàn)EL和TS之間有線性關系EL=3.07TS+8.30,R2=0.98。在殼聚糖和溶菌酶比例1:1(L100)下，TS和EL值分別降低了43%和48%。但是，這種降低對于阻止使用該膜作為食物保護劑來說，還沒有那么嚴重。殼聚糖是帶有剛性骨架結構的上好成膜線性聚合物，而溶菌酶是成膜能力較低的正電荷酶。TS和EL均降低表明摻入溶菌酶削弱了膜的結構和完整性。將溶菌酶分子導入殼聚糖膜基質(zhì)可能破壞結晶結構形成和削弱殼聚糖分子之間的分子間氫鍵。膜基質(zhì)中殼聚糖和溶菌酶分子之間的相互作用增加可能對溶菌酶-殼聚糖復合膜的TS和EL改變起作用。TS和EL值降低也可能歸于溶菌酶對殼聚糖分子的降解，溶菌酶是幾丁質(zhì)水解酶。使用高度脫乙酰殼聚糖(例如，脫乙酰的程度至少大約95%)，能夠減少溶菌酶對殼聚糖分子的降解。另外，溶菌酶-殼聚糖復合膜的機械性質(zhì)和防水性可以通過在膜基質(zhì)中使用交聯(lián)劑例如戊二醛而加以改善。表3.溶菌酶-殼聚糖復合膜的機械性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>'L0二0。/。溶菌酶(w/w殼聚糖)；L20=20%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L60=60%溶菌酶(w/w殼聚糖)；L100=100%溶菌酶(w/w殼聚糖)結果-微結構殼聚糖與溶菌酶之間的出色生物相容性以及溶菌酶遍及殼聚糖基質(zhì)的均勻分布被SEM顯微照片所證實。圖3A-3D顯示了成膜期間，暴露于空氣的溶菌酶-殼聚糖復合膜的外表面，放大倍數(shù)1000X。如SEM顯微照片所示，膜的表面結構是緊湊和一致的。所有的膜具有均勻外觀，表明是基質(zhì)中沒有任何孔或裂縫的連續(xù)結構。L60(3C)和L100(3D)膜的顯微照片顯示出膜表面上明亮的大理石樣花紋。這種大理石樣花紋分布均一并隨著溶菌酶濃度的增加而增加。白色區(qū)域可能呈現(xiàn)溶菌酶微粒在殼聚糖基質(zhì)中的沉積。圖4A-4D顯示出溶菌酶-殼聚糖復合膜橫截面的顯微照片。銳緣是用液氮冷凍膜然后碎裂它們而產(chǎn)生的。如圖4A-4D所示，殼聚糖和溶菌酶之間沒有垂直的裂紋或相分離。橫截面結構是緊湊而連續(xù)的，除了某些與表面平行的裂縫，這些裂縫可能是在膜碎裂時形成的。溶菌酶遍及膜基質(zhì)的均一分布由具有高溶菌酶濃度的膜的均勻外觀來指示(4C和4D)。L20膜(4B)的顯微照片顯示出可能是在干燥過程中落到膜上的外來材料。這種類型的污染可能是溶劑蒸發(fā)成膜方法的一個不利之處，尤其是如果膜在開放的空氣環(huán)境中進行流延和干燥的話。預示性實施例2備選的成膜溶液可以通過在65。C下將2wt%殼聚糖溶解在lwt%乙酸溶液中并加入50wt。/。月桂酸、25wt。/。甘油和100wt%溶菌酶(w/w殼聚糖)而制備。然后按照實施例1中所述制備膜。向成膜溶液中加入脂肪酸(即月桂酸)，可以改善膜的防水性質(zhì)且不會明顯影響其抗微生物活性。實施例3涂層溶液通過將殼聚糖溶液與溶菌酶溶液混合而制備。殼聚糖溶液通過將3%殼聚糖溶解在1%乙酸溶液中并加入25。/。甘油(w/w殼聚糖)而制備。溶菌酶溶液通過將10%溶菌酶溶解在蒸餾水中并加入25%甘油(w/w溶菌酶)而制備。溶菌酶溶液混合到殼聚糖溶液中，達到60%的濃度(每干重殼聚糖的溶菌酶干重百分比)。產(chǎn)生的混合物用勻化器(PT10-35，Kinematica,瑞士)以3,000rpm勻化60秒。單核細胞增生李斯特菌ATCC15313和植物乳桿菌用作試驗微生物，評價食物表面進行涂層處理的抗微生物功效。單核細胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌分別在腦心浸液(BHI)肉湯和MRS肉湯中37°C下生長過夜。在無菌條件下，獲得商業(yè)制造的牛肉腸(beeffranks)(Bun-Length,OscarMayerFoodsCorp.,Madison,WI)并切成26mm長(約10g)。切片的牛肉腸浸在涂層溶液中30秒并在垂直空氣層流臺(100-plus,EnvircoCorp.,Albuquerque,NewMexico)中干燥30分鐘。將未涂層的對照和涂層的樣品接種100)Lll單核細胞增生李斯特氏菌或植物乳桿菌(2x103CFU/ml)，放入200mmx150mm真空塑料袋(FoodSaverRolls:Tilia，Inc.,SanFrancisco,CA)，并用熱密封器(FoodSaverVac1075，Tilia,Inc.,SanFrancisco,CA)真空包裝。在22.5±1°C儲存4天后，每個牛肉腸樣品放在無菌Stomacher袋中。真空塑料袋用90ml0.1%蛋白胨水沖洗，并轉移到同一個Stomacher袋中。樣品用Stomacher型粉碎機(Stomacher400Circulator,24Seward,London,UK)以230RPM粉碎(macerated)2分鐘。懸液雙份計數(shù)微生物菌群。BHI瓊脂和MRS瓊脂分別用于單核細胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌。在對微生物集落數(shù)量進行計數(shù)之前，含有微生物培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)皿在37oC溫育48小時。涂層處理對接種到涂層或未涂層的牛肉腸表面上的單核細胞增生李斯特氏菌或植物乳桿菌生長的作用顯示在表4中。溶菌酶-殼聚糖復合物涂層處理產(chǎn)生單核細胞增生李斯特氏菌在牛肉腸表面上的生長抑制。但是，在同樣條件下，觀察到植物乳桿菌細胞數(shù)量的輕度增長。表4:涂層對接種了單核細胞增生李斯特氏菌或植物乳桿菌的牛肉腸上微生物生長的作用.<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例4商業(yè)制造的中等成熟的切達奶酪(Cheddarcheese)(TillamookCountyCreameryAssociation,Tillamook,OR)用作另一個食物體系，用于證明應用溶菌酶-殼聚糖復合物涂層的抗微生物性質(zhì)。奶酪塊無菌切成60mmx26mmx5mm的尺寸(~10g)，并用實施例3所述的涂層溶液涂層。所有的步驟與實施例3—致。如表5所示，單核細胞增生李斯特氏菌和植物乳桿菌在奶酪切片表面上的生長均受到抑制。表5.涂層對接種了單核細胞增生李斯特氏菌或植物乳桿菌的切片切達奶酪上微生物生長的作用.微生物處理單核細胞增生李斯特氏菌未涂層涂層植物乳桿菌未涂層涂層LogCFU/g奶酪o天4天4.994.994.354.0906.064.604.06實施例5溶菌酶殼聚糖溶液按照實施例1中描述的方法制備，只是用2%殼聚糖代替3%殼聚糖。成膜溶液流延在平坦的特氟龍涂布的玻璃板上，面積為260mmx260mm，并在環(huán)境條件下(22.5±1°C和40±5%相對濕度(RH))干燥2天。干燥的膜從板上取下，切成65x30mm尺寸的片。產(chǎn)生的膜厚度為85±9pm。膜片保存在設定為25°C和50%RH的環(huán)境室中(T10RS,TenneyEnvironmental,Williamsport,PA)2天。切達奶酪(TillamookCountyCreameryAssociation,Tillamook,OR)無菌切成尺寸為60mmx26mmx5mm的長方形，并接種100pi單核細胞增生李斯特氏菌或植物乳桿菌(2x1()SCFU/ml)。每個接種的奶酪切片夾在兩個同等處理的膜片之間。取來商業(yè)制造的牛肉腸(Bun-Length，OscarMayerFoodscorp.,Madison,WI)并在無菌條件下切成26mm長(~10g)，真空包裝在200mmx150mm真空塑料袋中(FoodSaverRolls,Tilia,Inc.,SanFrancisco,CA)。保存條件和微生物計數(shù)與實施例3描述的程序相同。如表6所示，溶菌酶-殼聚糖復合膜減少奶酪表面上的微生物生長。植物乳桿菌比單核細胞增生李斯特氏菌對膜更敏感。膜處理顯示出比奶酪表面實施例的涂層處理更強的抗微生物活性。26表6.膜的應用對接種了單核細胞增生李斯特氏菌或植物乳桿菌的切片切達奶酪上微生物生長的作用微生物單核細胞增生李斯特氏菌植物乳桿菌處理LogCFU/g奶酪0天4天未涂層4.994.994.353.60未涂層涂層;.06;.064.601.39實施例6殼聚糖溶菌酶(CL)溶液通過采用與上面實施例3的描述相同的程序，將0或60%溶菌酶(固體重量)摻入到殼聚糖溶液而制備。商業(yè)馬蘇里拉奶酪(mozzarellacheese)切片(70x43x3mm)接種104CFU/g的單核細胞增生李斯特氏菌，然后用兩種類型的CL膜包裝1)獨立CL膜；2)與薄CL層層合的電暈處理膜(Saranex15)。至于形成獨立膜，每種脫氣成膜溶液(FFS)大約200ml流延在在平坦的特氟龍涂布的玻璃板上，面積為260mmx260mm，并在垂直空氣層流臺(100-plus,EnvircoCorp.,Albuquerque,NM)中干燥過夜。為了制備殼聚糖或CL層合膜表面。將涂層溶液施加在多層的共擠出膜表面上(SaranexTM15,3mil,獲自Filcon,Clare，MI)，一側施加電暈處理。SaranexTM15是五層層合膜，具有低密度聚乙烯/乙烯-乙酸乙烯酯聚合物/聚氯乙烯聚合物/乙烯-乙酸乙烯酯聚合物/低密度聚乙烯的結構。大約50ml涂層溶液鋪展到支撐膜上，面積為260mmx260mm，并在垂直空氣層流臺中干燥過夜。奶酪切片的一側接種104CFU/g的單核細胞增生李斯特氏菌，并覆蓋獨立膜或薄CL層層合膜。然后該組件放入無菌stomacher袋(178mmx305mm，VWRInternational,WestChester,PA)，用熱密封器(FoodSaverVac1075,Tilia，Inc.,SanFrancisco,CA)真空包裝，并保存在10°C。單核細胞增生李斯特氏菌在1、7和14天進行差分計數(shù)。微生物菌群的最大減少發(fā)生在保存的第一天，其中在用含有0或60%溶菌酶的獨立CL膜包裝的奶酪上，分別觀察到大約0.63或1.26對數(shù)級的減少，如圖5所示。在接下來的14天保存期間，這種減少水平?jīng)]有明顯改變(pX).05)。CL層合膜具有與獨立CL膜相似的抗微生物功效，如圖6所示。該研究表明，使用CL復合物抗微生物處理對抗單核細胞增生李斯特氏菌的可能性。參考幾個實施例，對所公開的方法、膜和食品的原則進行了闡述和說明，顯然，這些方法、膜和食品可以在細節(jié)上加以修改，同時不背離這樣的原則。權利要求1.多層層合體膜結構，包括至少一層復合膜和至少一層另一種類型的膜，所述復合膜包含結合在殼聚糖聚合物基質(zhì)內(nèi)的溶菌酶。2.權利要求l的多層層合體，其中所述另一種類型的膜選自聚烯烴聚合物、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物或乙烯基聚合物。3.權利要求1或2的多層層合體，其中另一種類型的膜鄰接復合膜布置。4.權利要求1-3任一項的多層層合體，其中殼聚糖的脫乙酰水平至少約70%。5.權利要求l-4任一項的多層層合體，其中殼聚糖包括殼聚糖乙酸鹽、殼聚糖山梨酸鹽、殼聚糖丙酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖谷氨酸鹽、殼聚糖苯甲酸鹽、殼聚糖檸檬酸鹽、殼聚糖馬來酸鹽、殼聚糖乙醇酸鹽、殼聚糖丙烯酸鹽、殼聚糖琥珀酸鹽、殼聚糖草酸鹽、殼聚糖抗壞血酸鹽、殼聚糖酒石酸鹽，或其混合物。6.權利要求1-5任一項的多層層合體，其中溶菌酶以抗微生物有效量存在。7.權利要求1-5任一項的多層層合體，其中溶菌酶的量足以使得將復合膜施加于基體后大約24小時，高達大約30%的溶菌酶尚未從復合膜釋放，并且在大約48小時后，高達大約20%的溶菌酶尚未從復合膜釋放。8.權利要求l-7任一項的多層層合體，其中以殼聚糖重量計，復合膜包含大約10到大約200重量％的溶菌酶。9.膜的制造方法，包括將殼聚糖和溶菌酶溶解或分散在水性介質(zhì)中，產(chǎn)生成膜溶液或分散液；將成膜溶液或分散液施加于另一種類型的膜上；和使成膜溶液或分散液轉變成復合膜。10.權利要求9的方法，其中殼聚糖溶解于水性有機酸中。11.權利要求10的方法，其中水性有機酸選自乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、檸檬酸、馬來酸、乙醇酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗壞血酸、酒石酸或其混合物。12.權利要求9-11任一項的方法，其中溶菌酶溶于水產(chǎn)生溶菌酶溶液，然后溶菌酶溶液與殼聚糖溶液混合。13.權利要求12的方法，其中溶菌酶溶液包括大約5到大約20重量％的溶菌酶。14.權利要求9-13任一項的方法，其中所述另一種類型的膜選自聚烯烴聚合物、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物或乙烯基聚合物。15.食品，其包括在所述食品至少一部分表面上的抗微生物膜，其中抗微生物膜包含結合在殼聚糖聚合物基質(zhì)內(nèi)的溶菌酶，并且所述食品還包含與所述抗微生物膜相鄰布置的至少一種其它膜。16.權利要求15的食品，其中所述溶菌酶在抗微生物膜中的存在量，以殼聚糖重量計，為大約10到大約200重量％。17.權利要求15或16的食品，其中所述另一種類型的膜選自聚烯烴聚合物、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物或乙烯基聚合物。18.權利要求15-17任一項的食品，其中殼聚糖包括殼聚糖乙酸鹽、殼聚糖山梨酸鹽、殼聚糖丙酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖谷氨酸鹽、殼聚糖苯甲酸鹽、殼聚糖檸檬酸鹽、殼聚糖馬來酸鹽、殼聚糖乙醇酸鹽、殼聚糖丙烯酸鹽、殼聚糖琥珀酸鹽、殼聚糖草酸鹽、殼聚糖抗壞血酸鹽、殼聚糖酒石酸鹽或其混合物。全文摘要本公開一方面涉及一種復合膜，其包含結合在殼聚糖聚合物基質(zhì)內(nèi)的溶菌酶。另一方面，公開了一種膜，其包含殼聚糖和以殼聚糖重量計大約10到大約200重量％的溶菌酶。還公開了制造該膜的方法，包括將殼聚糖和溶菌酶溶解或分散在水性介質(zhì)中，產(chǎn)生成膜溶液或分散液；將成膜溶液或分散液施加于基體表面；和使成膜溶液或分散液轉變成膜。在特別有用的應用中，該膜是用于食品的抗微生物保護劑。文檔編號B32B9/04GK101535041SQ200780041873公開日2009年9月16日申請日期2007年9月17日優(yōu)先權日2006年9月18日發(fā)明者樸首一,趙艷云,馬克·A·達埃舍爾申請人:俄勒岡州，由高等教育州委員會代表俄勒岡州立大學