本申請(qǐng)屬于生物制劑領(lǐng)域和蛋白領(lǐng)域，具體地，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N膠原蛋白凍干纖維的制備方法。

背景技術(shù)：

1、iii型膠原蛋白為人體中主要的成纖維膠原，其由α1（iii）肽鏈形成，在人體中有促進(jìn)血管生成，維護(hù)肺功能，促進(jìn)皮膚生長(zhǎng)和損傷修復(fù)等功效。iii型膠原蛋白是制備具有修復(fù)功能的化妝品、填料、輔料的良好材料。目前已經(jīng)有大量重組表達(dá)iii型膠原蛋白并將其制備為各種美容用、醫(yī)用產(chǎn)品的研究。

2、出于保存和使用方便的考慮，iii型膠原蛋白最好可以制備為凍干形式，但如何保證凍干過程中iii型膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)和效果不丟失，復(fù)水后可以再現(xiàn)原蛋白的功能，本領(lǐng)域的研究尚較為匱乏，基本集中在使用常見的糖類、糖醇類、氨基酸類保護(hù)劑保證凍干產(chǎn)品的基本形貌、物理性質(zhì)方面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述情況，一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N膠原蛋白凍干纖維的制備方法，所述膠原蛋白為iii型膠原蛋白，所述方法包括：

2、（1）重組表達(dá)生產(chǎn)iii型膠原蛋白；

3、（2）將步驟（1）生產(chǎn)的iii型膠原蛋白純化；

4、（3）將純化后的iii型膠原蛋白配制為凍干原料液：所述凍干原料液的ph為7.0-7.5，所述凍干原料液為水溶液，其包含iii型膠原蛋白0.5-2mg/ml，海藻糖5-10mg/ml，甘露糖醇10-15mg/ml，褐藻提取物10-15mg/ml；

5、（4）將步驟（3）得到的凍干原料液凍干。

6、進(jìn)一步地，所述iii型膠原蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

7、進(jìn)一步地，步驟（1）中使用畢赤酵母重組表達(dá)生產(chǎn)iii型膠原蛋白。

8、進(jìn)一步地，步驟（2）中使用選自硫酸銨沉淀、親和層析、離子交換層析、分子篩層析中的一種或多種的方法來純化步驟（1）生產(chǎn)的iii型膠原蛋白。

9、進(jìn)一步地，所述凍干原料液的ph為7.2，所述凍干原料液為水溶液，其包含iii型膠原蛋白1mg/ml，海藻糖8mg/ml，甘露糖醇10mg/ml、泡葉藻（ ascophyllum?nodosum）提取物10mg/ml。

10、進(jìn)一步地，所述凍干過程為：

11、將凍干原料液置于4℃下30分鐘以上；

12、將溫度從4℃降低至-40℃，在-40℃溫度下預(yù)凍180分鐘；

13、將溫度從-40℃升溫至-20℃，在20pa真空度和-20℃的溫度下升華干燥900分鐘；

14、將溫度從從-20℃升溫至-5℃，在20pa真空度下和-5℃溫度下解析干燥240分鐘。

15、進(jìn)一步地，所述凍干過程為：

16、將凍干原料液置于4℃下30分鐘以上；

17、以1℃/分鐘的速度從4℃降低至-40℃，在-40℃溫度下預(yù)凍180分鐘；

18、以5℃/分鐘的速度從-40℃升溫至-20℃，在20pa真空度和-20℃的溫度下升華干燥900分鐘；

19、以5℃/分鐘的速度從-20℃升溫至-5℃，在20pa真空度下和-5℃溫度下解析干燥240分鐘。

20、另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松鲜鲋苽浞椒ǖ玫降哪z原蛋白凍干纖維。

21、另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松鲜瞿z原蛋白凍干纖維在制備具有皮膚修復(fù)功能的化妝品中的應(yīng)用。

22、另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松鲜瞿z原蛋白凍干纖維在制備醫(yī)用膠原蛋白填充材料或敷料中的應(yīng)用。

23、配制凍干原料液時(shí)，可直接溶解各種成分制備，并調(diào)整ph至所需；可選地，可先使用低濃度醋酸溶液，如0.5-1%w/v的醋酸溶液溶解膠原蛋白后再加入適量的水和其他成分，最后并調(diào)整ph至所需。

24、在已知蛋白序列的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以查詢其相關(guān)基因序列，并可選地可以使用已知的密碼子優(yōu)化方法進(jìn)一步加工來獲得適用于不同宿主的基因序列，可選的宿主包括但不限于畢赤酵母、大腸桿菌。

25、在發(fā)酵產(chǎn)物中純化蛋白的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員在表達(dá)蛋白時(shí)可以在其上加入適合的his或鏈霉素標(biāo)簽，進(jìn)一步清河純化蛋白；或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過硫酸銨沉淀以及后續(xù)的離子交換或分子篩層析步驟和純化蛋白。蛋白的純化程度依據(jù)不同的用途要求而定，例如電泳純。

26、有益效果：

27、本申請(qǐng)的方法使用較簡(jiǎn)單的凍干保護(hù)劑配方和凍干程序即可有效維持膠原蛋白凍干纖維的生物活性，為化妝品、醫(yī)用填料、醫(yī)用輔料提供了良好的原料。

技術(shù)特征：

1.一種膠原蛋白凍干纖維的制備方法，其特征在于，所述膠原蛋白為iii型膠原蛋白，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述iii型膠原蛋白的氨基酸序列如seqid?no.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟（1）中使用畢赤酵母或cho重組表達(dá)生產(chǎn)iii型膠原蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟（2）中使用選自硫酸銨沉淀、親和層析、離子交換層析、分子篩層析的一種或多種的方法來純化步驟（1）生產(chǎn)的iii型膠原蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述凍干原料液為水溶液，其包含iii型膠原蛋白1mg/ml，海藻糖8mg/ml，甘露糖醇10mg/ml、泡葉藻提取物10?mg/ml；所述凍干原料液ph為7.2。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4）的凍干過程為：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（4）的凍干過程為：

8.?iii型膠原蛋白凍干纖維，其特征在于，所述iii型膠原蛋白凍干纖維使用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的iii型膠原蛋白凍干纖維在制備具有皮膚修復(fù)功能的化妝品中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的iii型膠原蛋白凍干纖維在在制備醫(yī)用膠原蛋白填充材料或敷料中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N膠原蛋白凍干纖維的制備方法，所述膠原蛋白為III型膠原蛋白，所述方法包括：（1）重組表達(dá)生產(chǎn)III型膠原蛋白；（2）將步驟（1）生產(chǎn)的III型膠原蛋白純化；（3）將純化后的III型膠原蛋白配制為凍干原料液；所述凍干原料液為水溶液，其包含III型膠原蛋白0.5?2mg/mL，海藻糖5?10mg/mL，甘露糖醇10?15mg/mL以及褐藻提取物10?15mg/mL；所述凍干原料液pH為7.0?7.5；（4）將步驟（3）得到的凍干原料液凍干。本申請(qǐng)的方法使用較簡(jiǎn)單的凍干保護(hù)劑配方和凍干程序即可有效維持膠原蛋白凍干纖維的生物活性，為化妝品、醫(yī)用填料、醫(yī)用輔料提供了良好的原料。

技術(shù)研發(fā)人員：張健,查正其,樂龍,盧春陽,宋睿
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京東萬生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/4